Morphologische und DNA-analytische Untersuchungen am - OPUS ...

Methoden 56
Art Temperatur Dauer
Denatuierung 94 °C 60 sec
Annealing 60 °C 60 sec
Extension 72 °C 60 sec
Zyklendauer 35 ---
Geschlechtsbestimmungssystem HumAMEL X/Y
3.4.5 Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE)
Die PCR-Produkte aus Kapitel 3.4.4 wurden direkt in die niedrigauflösende horizontale
Polyacrylamidgelelektrophorese eingesetzt. Die Größe der Amplifikate wurde anhand
einer 100 bp-Leiter abgeschätzt. Für die 21 ml Gel-Lösung wurden in 16 ml Aqua dest.
2,7 ml Acrylamid/Bisacrylamidlösung, 2,1 ml 10xTris-Borat-Puffer, 200 ml APS
(Ammoniumperoxidsulfat) und 1,5 ml TEMED pipettiert. Bevor die Gellösung mit einer
50 ml Spritze zwischen zwei Glasplatten der Größe 124 x 258 mm gegossen werden
konnte, musste zwischen beiden Platten ein Gel-Bond-Film (GelBond PAG-film,
Amersham/Pharmacia, Freiburg) aufgebracht werden. Nach etwa einer Stunde war die
Gelpolymerisation abgeschlossen und die Glasplatten konnten entfernt werden. Die
PCR-Produkte wurden in der Menge von 5 ml auf die dafür vorgesehenen
Auftragsplättchen pipettiert. Flankierend wurden 5 ml der 100 bp-Vergleichsleiter
aufgetragen. Sowohl am anodischen als auch am kathodischen Gelände wurden 0,5 cm
breite Filterpapierstreifen aufgelegt, die zuvor in 2 x TBE mit 0,01 % Bromphenolblau
getränkt worden waren. Die Elektrophorese erfolgte auf einer Kühlplatte der
Elektrophoresekammer bei einer konstanten Temperatur von 15 °C. Die
Laufbedingungen betrugen 1.000 V, 20-30 mA, 10 W bei einer Dauer von 30 Minuten.
Zum Sichtbarmachen der Banden wurde das Gel mit Silbernitrat gefärbt (vgl. Kapitel
3.4.5.1).