呂承鴻 - 黃慶璨研究室
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生化科技研究所微生物與細胞專題討論<br />
題目:Effects of pre- and pro-sequence of thaumatin on the secretion by<br />
Pichia pastoris<br />
作者:Nobuyuki Ide, Tetsuya Masuda, Naofumi Kitabatake<br />
文章來源:Biochemical and Biophysical Research Communications<br />
363: 708-714, 2007<br />
演講人:Cheng-Hung Lu 呂承鴻 R00B22041<br />
指導老師:Ching-Tsan Huang, PhD 黃慶璨 博士<br />
演講日期:December 26, 2011<br />
演講地點:The 6th Classroom<br />
摘要<br />
索馬甜(Thaumatin)是一種植物甜味蛋白質,當以 Pichia pastoris 作為異源表<br />
現系統,利用 Saccharomyces cerevisiae 的 α-factor 訊息胜肽作為蛋白質外泌訊號<br />
生產 thaumatin,得到的重組 thaumatin 其 N 端序列無法正確加工。而從 thaumatin<br />
cDNA 序列,和成熟的 thaumatin 相比,前者 N 端多了一段 pre-sequence、C 端多<br />
了一段 pro-sequence。為了探討這樣的 cDNA 在 P. pastoris 異源表現時,對於其<br />
產量、外泌的影響,作者建構四種不同的表現載體,發現以 pre-seqence 作為外<br />
泌訊號的轉形株,重組 thaumatin N 端序列可正確加工並順利外泌表現,而<br />
pro-sequence 無法切除,並不影響外泌及產量。<br />
Keywords : Recombinant protein; Secretion signal; Pichia pastoris<br />
本研究之重要性<br />
前言<br />
Thaumatin 是植物甜味蛋白質,為常用的食品甜味劑,然而要從植物<br />
Thaumatococcus daniellii 萃取純化 thaumatin,其回收率太低。若能利用基因<br />
工程,以異源表達系統生產 thaumatin,可大幅提升產量,降低生產成本。<br />
前人作過的研究<br />
1972 年科學家首次從 T. daniellii 純化出 thaumatin【1】,目前純化出 5<br />
種的 thaumatin,其中含量較多的為 thaumatin I、II,它們皆是由 207 個胺基<br />
酸【2】和 8 個雙硫鍵構成【3】,其 cDNA 序列也已知【4】,本篇作者曾以<br />
Pichia pastoris 及 α-factor 作為外泌訊號表現 thaumatin,但外泌效率不佳【5】。<br />
作者為何要做本研究<br />
由先前研究知道,thaumatin 以 α-factor 作為外泌訊號,無法有效外泌,<br />
因此作者想研究 thaumatin N 端的訊號序列 pre-sequence 及 C 端的
pro-sequence,對 P. pastoris 表現時外泌的影響。<br />
本研究欲完成之項目<br />
本篇研究建構四種不同的表現載體,探討 P. pastoris 異源表達 thaumatin<br />
最有效率的載體,以期望這樣的表現系統,能夠提供更多樣的選擇。<br />
材料與方法<br />
菌株<br />
1. P. pastoris X-33:用於表現 thaumatin 的宿主。<br />
2. Escherichia coli strain XL1-Blue:用於本實驗的分子選殖。<br />
Prepro-thaumatin cDNA 的選殖<br />
從 T. daniellii 純化出的 mRNA,反轉錄成 cDNA,以 sense primer,<br />
ThPre-SfuI 和 antisense primer, ThPro-XbaI 進行 PCR,使用的聚合酶為 Pfu<br />
Turbo Hotstart DNA polymerase,反應溫度:94 o C、55 o C、72 o C,最後得到<br />
的 PCR 產物經定序確認後,接到 TA vector 上,將這載體命名為<br />
“pCR2.1-PPTh"。<br />
Thaumatin 表現載體的構築<br />
1. pPIC6α-TH:pCR2.1-Th 以限制酶酵素截切,得到 mature thaumatin<br />
cDNA,再將其接到 pPIC6α。<br />
2. pPIC6α-proTH:pCR2.1-PPTh 以限制酶酵素截切,得到 pro-thaumatin<br />
cDNA,再將其接到 pPIC6α。<br />
3. pPIC6-preTH:pCR2.1-PPTh 以限制酶酵素截切,得到 pre-thaumatin<br />
cDNA,再將載體 pPIC6 上的 α-factor sequence,以限制酶酵素切除,最<br />
後將 pre-thaumatin cDNA 接到 pPIC6。<br />
4. pPIC6-preproTH : pCR2.1-PPTh 以限制酶酵素截切,得到<br />
<br />
prepro-thaumatin,再將載體 pPIC6α 上的 α-factor sequence,以限制酶酵<br />
素切除,最後將 prepro-thaumatin cDNA 接到 pPIC6。<br />
轉形<br />
建構好的表現載體,以限制酶酵素截切後,再以電穿孔轉形到 P.<br />
pastoris X-33。<br />
以搖瓶表現重組 thaumatin<br />
P. pastoris 先以 BMG medium 小量培養到 OD600 約 2-6 後,將菌液以<br />
15000 g、4 o C 離心 5 min,收集 pellet 以 BMM 重新懸浮培養,在 28 o C 培養<br />
96 h,每 24 h 添加甲醇使其最終濃度為 1%,最後離心收集上清液。<br />
分離酵母菌內的蛋白質<br />
Pellet 以 breaking buffer (50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, 1 mM<br />
EDTA, 1 mM PMSF, and 5% glycerol) 重新懸浮,混以等量的玻璃球震盪破<br />
菌,並以 15000 g、4 o C 離心 10 min,收集的上清液含有可溶於細胞質的蛋
白質,留下的 pellet 含有膜蛋白的部分,此時以含 2% SDS breaking buffer<br />
重新懸浮後離心,收集上清液可得到膜蛋白。<br />
SDS-PAGE 及西方墨點<br />
得到的樣品分別進行蛋白質電泳分析,以確定目標蛋白質的生成及分子<br />
量的正確,並以西方墨點法偵測。<br />
N-terminal sequence analysis<br />
以Edman degradation method 進行 N 端序列分析。<br />
結果與討論<br />
Pre-sequence 對 thaumatin 外泌的影響<br />
以帶有 pre-sequence 的 pPIC6-preTH 表現重組 thaumatin,其上清液以<br />
Western-blotting 分析,可得到明顯的條帶,而未帶有 pre-sequence 的<br />
pPIC6α-TH 的上清液,則無法偵測到產物,因此可知,以 pre-sequence 作為<br />
訊號序列,可以使 thaumatin 順利外泌表現,造成這樣的差別是因為 α-factor<br />
作為外泌訊號表現 thaumatin 時,P. pastoris 無法正確切除訊號序列。<br />
C 端 pro-sequence 對 thaumatin 外泌的影響<br />
以帶有 C 端 pro-sequence 的 pPIC6α-proTH 表現重組 thaumatin,其上清<br />
液無法偵測到產物,而同時帶有 pre-及 pro-sequence 的 pPIC6-preproTH 可在<br />
其上清液偵測到產物,由此可知,pro-sequence 並不會影響外泌情況。比較<br />
pPIC6-preTH、pPIC6-preproTH 外泌量,結果並無差異,但 pPIC6-preproTH<br />
表現的重組 thaumatin 分子量較大,顯示 P. pastoris 無法順利切除<br />
pro-sequence。<br />
胞內 thaumatin 分析<br />
從上述結果得知,pPIC6α-TH、pPIC6α-proTH 外泌量極低,胞內蛋白質<br />
分析發現 pPIC6α-TH、pPIC6α-proTH 亦無法偵測到 thaumatin,推測是因為<br />
不正確的序列,使得目標蛋白質在外泌過程被送到 proteasome 降解,而<br />
pPIC6-preTH、pPIC6-preproTH 雖在胞內可偵測到,卻無法外泌是因為蛋白<br />
質不正確的折疊,在外泌路徑上,無法順利通過內質網、高基氏體的膜,而<br />
聚積在膜上。
參考文獻<br />
1. H. Van der Wel, K. Loeve. Isolation and characterization of thaumatin I and II,<br />
the sweet-tasting proteins from Thaumatococcus daniellii , Eur. J. Biochem. 31<br />
(1972) 221–225.<br />
2. R.B. Iyengar, et al. The complete amino-acid sequence of the sweet protein<br />
thaumatin I, Eur. J. Biochem. 96 (1979) 193–204.<br />
3. H. Van der Wel, et al. Assignment of the disulphide bonds in the sweet-tasting,<br />
Eur. J. Biochem. 144 (1984) 41–45.<br />
4. L. Edens, et al. Cloning of cDNA encoding the sweet-tasting plant protein<br />
thaumatin and its expression in Escherichia coli. Gene. 18 (1982) 1–12.<br />
5. N. Ide, et al. Cloning of the thaumatin I cDNA and characterization of<br />
recombinant thaumatin I secreted by Pichia pastoris. Biotechnol Prog. 23 (2007)<br />
1023-30.
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