陳思諺

生化科技學系微生物與細胞專題討論
題目: The actin-bundling protein palladin is an Akt1-specific substrate that regulates
breast cancer cell migration.
作者:Y. Rebecca Chin and Alex Toker
文章來源:Molecular Cell 38(3):333-44, 2010.
演講人:Szu-Yen Chen 陳思諺 B97B02026
指導老師:Chin-Tin Chen, PhD 陳進庭 博士
演講日期:December 6 th , 2011
演講地點:The 6 th Classroom
摘要
Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)訊息傳遞路徑在癌症細胞中常失去調控
能力,導致傳遞路徑下游 Akt1 和 Akt2 的活化,並在癌細胞轉移中扮演非常重要
的角色。Akt1 和 Akt2 皆會促進癌細胞存活與生長,但兩者卻對癌轉移能力的調
控有相反的效果。根據過去研究指出,Palladin 是一個 actin-binding 的蛋白質,
會調控細胞中 actin 的排列,因此在本研究中,作者進一步探討 palladin 在乳癌
細胞中與 Akt 的關係,並研究其對於細胞移動能力的調控機制,作者利用 shRNA
減少細胞中 palladin 的表現量,發現乳癌細胞的移動能力因此上升;此外,作者
利用免疫染色法確定 palladin 為 Akt1 的專一性受質,而非 Akt2,並且指出 Akt1
是對 palladin 上 Ser507 進行磷酸化,而此磷酸化作用對於調控細胞遷移能力是相
當必要的。
本研究之重要性
前言
癌細胞轉移是人類腫瘤的特徵之一,並且是造成病人死亡的一大原因,而癌細
胞轉移被許多訊息傳遞路徑精密的調控,這些訊息傳遞路徑調控了癌細胞的增
生、存活能力、代謝、移動及血管增生等。Akt 在癌細胞中所扮演的調控角色,
可以當作抗癌藥物的目標,藉此進行治療 [1] ,因此若是能夠更確定 PI3K 訊息
傳遞路徑中 Akt 及 palladin 之間與調控癌轉移的關係,將對未來抗癌治療上有
一大助益。
前人作過的研究
過去研究顯示,PI3K 訊息傳遞路徑下游的 Akt1、Akt2 對癌細胞轉移能力的調
控扮演相當重要的角色 [2, 3] ,其中 Akt1 會抑制癌細胞轉移,而 Akt2 卻會相反
地促進癌細胞的轉移 [4] 。另外,研究顯示 palladin 在人類乳癌細胞中會大量表
現,可能會促進乳癌細胞對其他組織的入侵能力 [5] 。

作者為何要作本研究
過去研究指出,palladin 可能與癌細胞轉移有所關聯,但 palladin 對於細胞骨
架的重新排列及對細胞移動能力的調控機制仍不清楚,因此作只希望能夠透過
研究 Akt 和 palladin 之間的關係,讓我們對 palladin 在 PI3K signaling pathway
中所扮演的角色及其對癌轉移調控機制有進一步的了解。
本研究欲完成之項目
作者欲探討在 Akt family members 中,何者扮演磷酸化 palladin 的角色,並解
了解此磷酸化對於 palladin 調控細胞轉移能力是否有直接的影響。
細胞株
材料與方法
HeLa:人類上皮癌細胞,由子宮頸癌中分離出。
MCF7:人類乳腺癌細胞,estrogen receptor (ER) positive
MDA-MB-231:人類乳腺癌細胞,ER negative
MDA-MB-468:人類乳腺癌細胞,less tumorigenic
BT-549:人類乳腺癌細胞
SUM-159-PT:人類乳癌細胞,ER negative
MCF10A:人類乳腺上皮細胞,nontumorigenic
SKBR4:人類乳腺癌細胞,tumorigenic
免疫螢光染色(Immunofluorescence Analysis)
利用專一性抗體對 palladin、actin 及細胞核進行免疫染色,利用螢光顯微鏡觀
察並將影像疊合觀察 palladin 與 actin 在細胞中的分布情形。
免疫染色與免疫沉澱 (Immunoblots and immunoprecipitation)
利用專一性抗體與目標蛋白質結合,觀察 palladin 在不同環境下的磷酸化與否。
Transwell Migration and Ivasion Assay
利用 transwell filter 模擬細胞在生物體內 invasion 的情形,用來計算細胞的遷
移能力。
Time-lapse Microscopy
利用顯微鏡觀察正常細胞與 palladin 移除的細胞之移動能力與細胞型態。
結果與討論
Akt 在 in vitro 和細胞中磷酸化 Palladin 的 Ser507
為了確定 Palladin 是 Akt 的受質,作者將會表達 hemagglutinin (HA)-tagged
palladin 的質體轉染到 Hela 細胞中,並且利用 insulin-like growth factor-1 (IGF-1)
促進細胞活化 PI3K 及 Akt,由免疫染色結果可知,加入 PI3K 的抑制劑
Wortmannin 及 Akt 抑制劑 SN30978 會使 palladin 的磷酸化現象下降,並且發

現 Ser507Ala 突變的 palladin 無法被 Akt1 磷酸化,說明 Alt1 對 palladin 的 Ser507
進行磷酸化作用(圖一)。
為了確定在乳癌細胞中 palladin 磷酸化與 Akt 的關係,作者利用乳癌相關細胞
MDA-MB-231、SKBR3、BT-549 及非乳癌細胞 MCF-10A 細胞,發現在這些細
胞中 palladin 皆會被 Akt 磷酸化(圖二)。
Palladin 是 Akt1 的專一性受質
為了確定 palladin 是 Akt1 而非 Akt2 的專一性受質,作者將 GFP-palladin 及
HA-Myr-Alt1 或 HA-Myr-Alt2 轉染至細胞中,發現只有 Akt1 會和 palladin 免疫
沉澱,此外,作者也利用 Akt1、Akt2 的 siRNA 證明 palladin 確實是 Akt1 的專
一性受質,而非 Akt2。另一方面,作者利用 Akt1 與 Akt2 的嵌合體證實 Akt1
上的 PH 和 linker domain 對於 palladin 的磷酸化扮演重要的角色(圖三)。
Palladin 會抑制乳癌細胞的侵入轉移能力
利用免疫螢光染色發現,在 IGF-1 的刺激下,細胞中的 palladin 和 actin 會集中
在 membrane ruffling,而加入 PI3K 訊息傳遞的抑制劑 LY294002 會使 palladin
和 actin 的集中現象下降,,另外,作者利用 palladin shRNA 減少細胞中 palladin
的表現量,使細胞移動能力上升,同時也使細胞型態產生不正常的突出,說明
palladin 確實與抑制細胞轉移能力有關(圖四)。
Aky1 對 Palladin 的磷酸化會抑制乳癌細胞的轉移
作者首先確認活化的 Myr-Akt1 會抑制 MDA-MB-231 的移動能力,但移動能力
受抑制的 MDA-MB-231 卻因 palladin 降低而回復,另外,作者藉由比較 wild-
type palladin 和 Ser507Ala 突變的 palladin 對細胞移動能力的影響,證實 palladin
的 Ser507 必須受到 Akt1 磷酸化才具有抑制移動能力的效果(圖五)。
另外,在顯微鏡下觀察到抑制細胞 palladin 的表現會造成細胞型態呈現放射狀
(stellate),有較多不規則突出並且具有移動能力,有 palladin 表現的則否(圖六)。
參考文獻
1. Hennessy, B.T., Smith, D.L., Ram, P.T., Lu, Y., and Mills, G.B. (2005). Exploiting
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Natesan, S., and Brugge, J.S. (2005). Distinct roles of Akt1 and Akt2 in regulating
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5. Goicoechea, S.M., Bednarski, B., Garcı´a-Mata, R., Prentice-Dunn, H., Kim, H.J.,
and Otey, C.A. (2009). Palladin contributes to invasive motility inhuman breast
cancer cells. Oncogene 28, 587–598.
圖表
圖一、Alt1 對 palladin 的 Ser507 進行磷酸化作用
藉由 Phosphoproteomic 研究顯示出 palladin 的 Akt phosphorlytion motif Ser507,
並且利用 PI3K、Akt 抑制劑及 Ser507Ala 突變的 palladin 證實 palladin 在 Ser507
處受 Akt 磷酸化。

圖二、在乳癌相關細胞中,Palladin 受到磷酸化調控
在乳癌相關細胞中利用 PI3K、Akt 抑制劑同樣也證實 palladin 會被 Akt 磷酸化。

圖三、Palladin 是 Akt1 的專一性受質
利用轉染 Myr-Akt1、Myr-Akt2 及加入 Akt1、Akt2 的 siRNA 證實 Palladin 會被
Akt1 磷酸化,而非 Akt2。

圖四、Palladin 可抑制乳癌細胞的侵入式遷移
藉由免疫螢光與 transwell assay 分析指出,Palladin 可以幫助抑制乳腺癌細胞的
移動能力。

圖五、Aky1 對 Palladin 的 Ser507 磷酸化會抑制乳癌細胞的轉移
利用轉染 HA-myr-Akt1 的 IGF 活化 Akt1 的細胞,並且用 Transwell assay 觀察細
胞遷移能力,發現 Akt1 的存在使細胞移動能力下降;另外,轉染能抵抗 Palladin
shRNA 的 HA-palladin Ser507Ala mutant*到去除 Palladin 的 MDA-MB-231 中,無
法抑制細胞移動能力。
圖六、Palladin 的磷酸化對乳癌細胞隨機遷移的調控
利用顯微鏡觀察的結果與圖五利用 Transwell assay 觀察的結果相吻合,palladin
Ser507 的磷酸化確實影響 Palladin 的調控能力。