林千佳

生化科技學系微生物學組專題討論
題目: Disease-causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second
Intracellular Loop for Class A G-protein-coupled Receptor Function
作者:Jennifer L. Wacker, David B. Feller, Xiao-Bo Tang, Mia C. DeFino, Yuree
Namkung, John S. Lyssand, Andrew J. Mhyre, Xu Tan, Jill B. Jensen, and Chris
Hague
文章來源:Journal of Biological Chemistry Papers in Press, published online ahead of
print September 4, 2008
演講人:Chang-Chia Lin 林千佳 B94B02031
指導老師:Chii-Shen Yang, Ph.D. 楊啟伸 博士
演講日期:December 23rd, 2008
演講地點:The 6th classroom
摘要
G 蛋白質偶合受器(G-protein-cuopled receptor, GPCR)中的 GPR54 在哺乳動
物生殖系統的運作中扮演關鍵的角色,若 GPR54 的基因發生突變,將會嚴重影
響性成熟及性荷爾蒙的分泌。在 GPR54 的第二胞內環狀區(the second intracellular
loop, IL2)上的一個點突變──L148S──可導致人類的原發性腦下垂體性腺激素功
能低下症(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism, IHH),造成青春期延緩甚至
是不孕。
本篇作者建構了一個 in vitro 的模型,確定 GPR54 L148S 突變株在表現
(expression)、位置(localization)、與配體(ligand)結合能力均與野生型(wild-type)
的 GPR54 相同後,藉由分析下游分子的活性,作者發現 L148S 突變株活化下游
Gα 的能力顯著降低;由序列以及結構資訊比對的結果,作者假設 IL2 對於 Class
A GPCRs 活性有十分重要的的貢獻,並以此為基礎提出 GPR54 可能的活化機制。
Keywords: gonadotropin-releasing-hormone, hypogonadotropic hypogonadism,
heterotrimeric G-proteins, G-protein-coupled receptor
Abbreviations: GPR54, G-protein-coupled receptor 54; IL2, the second intracellular
loop; IHH: idiopathic hypogonadotropic hypogonadism; GnRH:
gonadotropin-releasing hormone; FRET: fluorescence resonance energy transfer
analysis; HA: hemagglutinin; GFP, CFP, YFP: green, cyan and yellow fluorescence
protein, respectively; HEK293: human embryonic kidney 293 cell; KP: kisspeptin;
IP3: inositol triphosphate; α1A-AR: human adrenergic receptor α1A; GST: glutathione
S-transferase;

本研究之重要性
前言
目前的 IHH 的療法是以小泵浦將促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing
hormone, GnRH)一陣陣地注射到皮下,以模擬 GnRH 在下視丘間歇性的分泌。
2003 至 2005 年間,科學家發現 IHH 與 GPR54 分子發生突變有很大的關係 [1-3] ,
此後刺激 GPR54 活性的藥物成為研究的新方向,因此深入了解 GPR54 的分子
作用機制十分必要。
前人作過的研究
下視丘腦下垂體性腺中樞(hypothalamic-pituitary-gonadal axis)之間神經傳導物
質的分泌與訊息傳遞掌管著哺乳動物的生殖系統 [4] ,包括性荷爾蒙的分泌、青
春期的展開與動情週期等,此過程中的參與分子若發生變異,將會導致生殖系
統的失調,如IHH。
在 2003 年,由 Seminara et al.的團隊所發表的一篇論文中指出,在 GPR54 的
IL2 上第 148 號的胺基酸 leucine 若被突變為親水性的 serine,將會造成人類的
IHH [5] 。GPR54 是調控青春期展開的關鍵分子,研究顯示當 GPR54 被激活後,
可刺激下視丘分泌 GnRH,並活化下視丘腦下垂體性腺中樞 [6] ;此外,剔除
Gpr54 基因的小鼠,其表現性狀就有如患 IHH 的人類 [7] ,在在顯示了 GPR54
與生殖系統的關聯性。
作者為何要作本研究
GPCR 與下游 G-protein 共結晶結構的資訊不足,限制了對 GPR54 催化機制的
了解,雖然 GPR54 在生殖週期的調控角色已被確定,且由突變株 L148S 的分
析也能窺得疏水性的 IL2 似乎對 GPR54 的活性有絕對的影響,然而此突變究
竟是經由何種機制影響 GPR54 的活性,卻是個尚待回答的問題。
本研究欲完成之項目
藉由研究 L148S 突變株的分子機制,作者發現此突變並不會影響 GPR54 的表
現、與配體的結合力等性質,免疫共沉澱(co-immunoprecipitation)的結果也指出
L148S 不會影響與下游 Gα 分子的結合力;然而螢光共振能量轉移分析
(fluorescence resonance energy transfer analysis, FRET)顯示,L148S 大大削弱了
GPR54 對 Gα 的活化能力;此外,由 Class A GPCR-Gα 結構的模擬比對結果,
作者提出 IL2 以及其上的疏水性胺基酸可穩定 Gα 的結構、促進其活化的假設,
顯示 IL2 及其保留性的(conserved)的疏水性胺基酸對於 Class A GPCRs 活性的
重要性。
重組質體及突變株建構
材料與方法
人類 GPR54 (hGPR54)基因利用 5’限制酶 EcoRI 與 3’ HamHI 切位接入帶有 N
端 FLAG tag 或是 hemagglutinin (HA) epitope tag 的 pcDNA3.1 質體中;利用 5’

BamHI 與 3’ XhoI 切位將 hGPR54 基因放入帶有 C 端綠色螢光蛋白(green
fluorescence protein, GFP)的質體 pEGFP-N3 中。
以 QuikChange site-directed mutagenesis 操作 GPR54 的 L148S 點突變株建構,
以及同為 Class A GPCR 的人類腎上腺素受體 α1A(human adrenergic receptor α1A,
α1A-AR)及其對應突變株 L132S 的建構。
表現細胞株──HEK293 細胞 (Human embryonic kidney 293 cell culture)
HEK 細胞以 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(10%牛胎血清(fetal bovine
serum),100μg/ ml 鏈黴素(streptomycin)與青黴素(penicillin))在 37℃、5% CO2
的環境下培養,在細胞覆蓋率 70%時轉染(transfection)入所建構之重組 DNA,
以表現目標蛋白質。
綠色螢光蛋白免疫沉澱與染色(GFP immunoprecipitation / immunoblotting)
以抗 GFP 抗體與蛋白質混合,在 4℃下放置隔夜,隔天加入 protein G-Sepharose
beads,以 500 倍重力離心後收集上清液,之後操作 10% BisTris gel 電泳分析
後轉移至硝酸纖維膜(nitrocellulose membrane),利用 Rabbit anti-GFP 抗體操作
西方點墨法(Western blot),最後分析 680 及 800 奈米光波長螢光,偵測帶有
GFP 的蛋白質。
同位素標定配體結合試驗(Radioligand Binding assay)
使用以 125 I 或是 3 H 標定的配體與 GPR54 結合後,分析 GPR54 與配體結合能
力的試驗。
磷酸肌醇水解效率分析([ 3 H] Phosphoinositol hydrolysis assay)
GPR54 與配體 kisspeptin 結合後會活化下游的 Gαq,被激活的 Gαq 會進一步活
化磷脂酶 C (phospholipase C);磷脂酶 C 能將磷酸肌醇(phosphoinositol)水解為
二醯甘油(diacyl glycerol)與三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3),經 3 H 標定的
IP3 會被釋放出來、進一步被偵測到。由 IP3 的數量可以間接推得 GPR54 活化
下游分子的能力。
結構定矛分析(Structural modeling)
作者利用軟體,將一個高解析度的 GPCR 結構(β2-adrenergic GPCR, PDB ID:
2RH1 [8] )與一個活化狀態的 Gαq 分子(PDB ID: 2BCJ)定矛結合(docking),試圖由
結果分析 Class A GPCR 與 Gα 間的結合區位與作用方式。
免疫共沉澱(Co-immunoprecipitation)
將同時表現 Gα (Gαq 或 Gα15/16)及 GPR54 (WT 或 L148S)的 HEK 細胞打破,純
化蛋白質後操作電泳並轉移至膜上,隨後以抗 Gαq 的抗體以及偵測 GPR54 的
抗 HA 抗體偵測目標蛋白質,可確認 Gα 與 GPR54 間是否有作用力。
GPR54 IL2 與 Gαq 的共純化(Co-purification)
將帶有 N 端 GST tag 的 GPR54 IL2 序列與帶有 N 端 His tag 的 Gαq 序列共同轉
染入 HEK 細胞,經由打破細胞並純化蛋白後,將萃取液通入可與 His tag 結合
的鎳離子管柱,再以 200 mM 的咪唑(imidazole)溶液競爭、將蛋白質流洗下來,
最後操作 12%的 SDS-PAGE 並觀察結果,若兩蛋白質最後均出現於膠片上,

即顯示兩者間存在作用力。
螢光共振能量轉移分析(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)
FRET為觀察蛋白質間作用力的分析法,將藍螢光蛋白(cyan fluorescent protein,
CFP)與Gαq分子融合;黃螢光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)與Gβγ分子融
合。當Gαq被活化時會與Gβγ分開,CFP與YFP間距變大,導致螢光訊號的下降,
藉此法可觀察GPR54對Gαq的活化能力。
結果與討論
L148S hGPR54 在表現、位置,以及與配體結合性質均與野生型的 hGPR54
相同
免疫沉澱的結果顯示,WT 與 L148S 突變株的分子大小相同,顯示 L148S 在蛋
白質的表現上並無異常(圖表一 A);由共焦顯微鏡(confocal microscopy)觀察,
作者發現 L148S 在細胞中的分布與 WT 無顯著差異(圖表一 B);利用螢光定量
WT 與 L148S 在細胞膜的表現量也能看出,L148S 並不會影響 GPR54 的表現
程度(圖表一 C);且實驗證實 L148S 並不會影響 GPR54 與配體的結合性(圖表
一 D)。
綜合以上各點,顯示 L148S 必定是經由其他機制影響 GPR54 的活性。
GPR54 第 148 號 leucine 對 GPR54 活化下游 Gα 分子有決定性的影響
GPR54 經配體活化後能激活下游路徑的磷脂酶 C,造成磷酸肌醇被水解,透過
偵測過程中所釋放的三磷酸肌醇(IP3),可以定量 GPR54 的活性。由一系列
WT 與 L148S 的活性測定(圖表二),作者發現 L148S 活化下游分子的能力顯著
變差(下降 90%以上),因此作者得到初步的結論──L148S 乃是藉由削弱 GPR54
與下游分子的活化關係來影響 GPR54 的活性。
Class A GPCR 保留性的疏水性胞內第二環狀區(IL2)是活性的關鍵
透過比較 Class A GPCR 的序列可發現,IL2 上第九(IL2-9)與第十個(IL2-10)胺
基酸有高度的保守性,顯示其在功能上可能有重要的地位(圖表三 A)。IL2-9
通常為 proline,而 IL2-10 通常為疏水性的胺基酸,位於 IL2 的中央。
作者接下來利用同為Class A GPCR的腎上腺素受體α1A-AR,以及其對應的突變
株L132S來作配體結合以及活性測定,發現與GPR54 L148S的分析結果一致(圖
表三B, C)。
GPCR-Gα分子的預測結合模型也顯示,IL2很靠近Gα分子的活性區,且IL2-10
由模型中看來能幫助穩定Gα活化時的結構(圖表四A, B);若將IL2-10突變為親
水性分子,將會大大影響GPR54的活性(圖表四C),作者推測,IL2以及其上的
疏水性胺基酸對Class A GPCR分子活化Gα十分重要。
過量表現下游的 Gα 分子可以部分緩解 IL2 上第十個胺基酸突變所產生的影響
免疫共沉澱的結果證實了 IL2 與 Gα 分子間的作用力,且此作用力並不會受到
L148S 突變的影響(圖表五 A, B);且作者發現了一個有趣的現象,過度表現 Gα
分子能稍微緩解 IL2-10 突變所帶來的影響,提高 Class A GPCR 活化下游分子

的訊號(圖表五 C, D)。
L148S 讓 GPR54 失去活化下游 Gαq 分子的能力
為證實 L148S 是否影響 GPR54 活化 Gαq 的能力,作者在 Gαq 與 Gβγ 分子上分
別接上藍螢光蛋白(CFP)與黃螢光蛋白(YFP),GPR54 活化 Gαq 後,將會使得 Gαq
與 Gβγ 分開,造成螢光訊號的下降(圖表六 C)。共焦顯微鏡顯示接上螢光蛋白
的 WT 與 L148S 分子在膜上的位置並無不同(圖表六 B),然而 L148S 經配體活
化後也無法造成螢光訊號的下降,顯示 L148S 的確會造成 GPR54 失去活化 Gαq
的能力。
參考文獻
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圖表
圖表一、L148S 突變並不影響 hGPR54 的表現、位置以及與配體結合的性質。
A.野生型(wild-type, WT)GPR54 與 L148S 突變株的免疫共沉澱分析顯示,兩者分
子量同為~70kDa。 B.表現 GFP 的 WT GPR54 與 L148 突變株於共焦顯微鏡下的
觀察,兩者在細胞中的分布無顯著差異。 C.利用螢光定量 WT 與 L148S GPR54
在細胞膜的表現量。 D. WT 及 L148S GPR54 與 125 I 標定的配體 kisspeptin-10
(KP-10)在不同濃度下的結合情形。
圖表二、Leucine 148 對 GPR54 的活性有絕對的影響。
A.及 B.以 FLAG 標定的 WT/L148S GPR54 分別與天然配體 KP-54(A.)、人工合成
配體 KP-10(B.)結合後,刺激磷酸肌醇(PI)被水解結果。C.及 D.以 GFP 標定的兩
種 GPR54 分別和 KP-54 與 KP-10 結合後的 IP 水解結果。

圖表三、於 Class A GPCR 高度保留性的 Leu148 是 GPR54 活性的關鍵分子。
A. 序列顯示 Class A GPCR IL2 上的第十個胺基酸為高度保守性的疏水性分子。
B.同位素標定配體結合試驗的結果,野生型及突變株的 α1A-AR 在與 3 H 標定的配
體 結 合 性 質 上 並 無 差 異 。 C. WT 與 突 變 株 的 α1A-AR 經 配 體 腎 上 腺 素
(phenylephrine)活化後的 PI 水解結果。
圖表四、IL2 可能是 GPCR 與 Gα 分子間疏水性作用力的關鍵。
A.腎上腺素受體 β2 (β2-AR)與 Gαq 分子經由軟體定矛分析結果顯示,IL2 與 Gα 的
結合位十分接近 Gα 的 GTPase domain。 B. β2-AR 的 Pro 138 分子讓 Phe 139 形成一
個疏水性的介面,與 Gαq 上高度保留性的胺基酸(Phe 220 、Val 223 、Trp 263 與 Phe 264 )
相接。 C.在 GPR54 第 148 號胺基酸進行突變的突變株,與 1 μm 的 KP-10 反應
後的 PI 水解結果(假設 WT GPR54 的 PI 水解效率為 100%)。
C

圖表五、L148S 突變株不影響與 G-protein 結合的性質,且過量表現 G-protein
可以緩解突變所造成的活性影響。
A. GST標定的IL2區域與Gαq的共純化結果,只有GST存在的情況做為負控制組。
B. WT與L148S與HA所標定的Gα15/16、His tag所標定的Gαq進行免疫共沉澱的結
果,顯示WT及L148S均能與Gα分子作用。 C.不同濃度Gα分子的影響下,L148S
接受1 μm KP-10活化後的PI水解情形(WT GPR54的結果設為100%)。 D. 過量表
現Gαq的影響下,α1A-AR L132S突變株經配體活化後的PI水解情形(WT α1A-AR的
結果設為100%)。
圖表六、L148S 突變株破壞 GPR54 經由配體誘導時,對於 Gαq 分子的活化能力。
A. 如圖所示,FRET 的現象發生在 Gαq 分子與 Gβγ 彼此靠近的情況下。 B. 表
現螢光蛋白的 WT 與 L148S GPR54 於共焦顯微鏡的觀察結果。 C. WT GPR54
在 100 nM KP-10 活化下的 FRET 訊號,活化後的 GPR54 會促使 Gαq 與 Gβγ 分子
分離,使整體螢光訊號下降。 D. WT 與 L148S GPR54 的 FRET 結果比較,L148S
並沒有出現典型的訊號下降現象。