peste porcina clasica: diagnostico y caracterizacion ... - Inicio - CENSA

con 5 % de suero fetal bovino (Gibco, certificado libre de virus y micoplasmas), en el caso del
medio de crecimiento. Las células se utilizaron tanto en suspensión celular como en
monocapa establecida.
3.1.2. Virus: Se utilizaron las cepas del virus de la PPC, de referencia: Alfort y Ames y
vacunales: PAV-250 y “C” (Labiofam, S.A.), así como de BVDV, de referencia: NADL,
Oregon y Singer y vacunal: Mucossifa (Rhône-Mérieux, Francia). Además, fueron
incluidas dos colecciones de 16 y 7 aislados virales de PPC y BVD respectivamente, de
diferentes regiones de Cuba, identificados por anticuerpos monoclonales (CVL-Weybridge,
UK).
3.1.3. Suspensiones virales: Se utilizaron suspensiones virales para la elaboración de
antígenos laminares e inmunógenos, así como, para la extracción de ARN empleados en
los diferentes experimentos. Para su obtención, se propagaron las cepas/aislados de PPC,
a una multiplicidad de infección de 0,001 DICT50/célula, en células PK15 durante 48-72 h y
las cepas/aislados de BVD, a la misma multiplicidad de infección, en células MDBK hasta
que el efecto citopático afectó el 70-80 % de la monocapa celular. Los virus fueron
extraídos por congelaciones y descongelaciones repetidas de las células y se separaron
los restos celulares del sobrenadante de las células infectadas por centrifugación.
3.1.4. Preparación de la muestra: Se emplearon muestras de órganos, procedentes
de animales sacrificados en brotes de PPC en Cuba, que se prepararon, tanto para
intentar el aislamiento viral como para la obtención directa del ARN, como se describe a
continuación.
Luego de cortar 1-2 g de una muestra de tejido - amígdala, ganglio linfático o bazo -
en pequeñas porciones, se evaluaron diferentes métodos de homogenización que
fueron, la maceración del tejido con arena lavada estéril en mortero, el empleo del
homogenizador eléctrico (Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik) por 1 min a alta velocidad
y del homogenizador manual de vidrio.