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INSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS AGROPECUARIAS DE LA HABANA
FRUCTUOSO RODRIGUEZ PEREZ
CENTRO NACIONAL DE SANIDAD AGROPECUARIA
PESTE PORCINA CLASICA: DIAGNOSTICO Y
CARACTERIZACION MOLECULAR DE AISLADOS
VIRALES CUBANOS
TESIS EN OPCION AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS VETERINARIAS
Autor: Heidy Díaz de Arce Landa
Tutor: María Teresa Frías Lepoureaux
Cotutor: Francisco Sobrino
La Habana, 1998

TABLA DE CONTENIDO
11. . INTTRODUCCI
I
ION
22. . REVI ISI ION BI IBLLI IOGRAFFI ICA
3. .
2.1. Características Generales del virus 7
2.2. Relaciones entre Pestivirus 12
2.2.1. Relaciones genómicas y antigénicas 12
2.2.2. Especificidad de hospederos 14
2.3. Diagnóstico 16
2.3.1. Detección del virus 17
2.3.2. Detección de anticuerpos 20
2.4. Características clínicas y anatomopatológicas 21
2.4.1. Infecciones post-natales 22
2.4.2. Infecciones trasplacentarias 24
2.5. Patogenia 25
2.6. Epidemiología 26
2.7. Control 30
MATERI IALES Y METODOS
3.1. Generales 34
3.1.1. Cultivos celulares 34
3.1.2. Virus 34
3.1.3. Suspensiones virales 34
3.1.4. Preparación de la muestra 35
3.1.5. Preparación de antígenos laminares 35
3.1.6. Experimento de infección 36
3.1.7. Desarrollo y Validación de los ensayos 36
33
11
66
Pág.

4. .
3.1.8. Secuenciación 36
3.2. Inmunofluorescencia e Inmunoperoxidasa directas 37
3.2.1. Obtención de conjugados 37
3.2.2. Desarrollo y Estandarización 38
3.2.3. Evaluación de criterios sobre el desempeño de los ensayos 40
3.3. Aislamiento viral 41
3.3.1. Preparación de los cultivos celulares 41
3.3.2. Inoculación de los cultivos celulares 41
3.3.3. Evaluación de la multiplicación viral 42
3.4. Transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la
polimerasa
3.4.1. Obtención de ARN 42
3.4.2. Cebadores 43
3.4.3. Desarrollo y Estandarización 44
3.4.4. Evaluación de criterios sobre el desempeño de los ensayos 45
3.5. Neutralización de la peroxidasa 46
3.5.1. Desarrollo y Estandarización 46
3.5.2. Evaluación de criterios sobre el desempeño del ensayo 48
3.5.3. Análisis de correlación 48
3.6. Caracterización genómica de aislados y análisis filogenético 48
3.6.1. Virus 49
3.6.2. RT-PCR 49
3.6.3. Secuenciación 49
3.6.4. Análisis de computación 49
RESULTADOS Y
DI ISCUSI ION
5511
42

4.1. Inmunofluorescencia e Inmunoperoxidasa directas 52
ensayos
5. .
6. .
7. .
8. .
4.1.1. Obtención de conjugados 52
4.1.2. Desarrollo y Estandarización 52
4.1.3. Evaluación de criterios sobre el desempeño de los
4.2. Aislamiento viral 59
4.3. Transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la 61
polimerasa
4.3.1. Obtención de ARN 61
4.3.2. Cebadores 63
4.3.3. Desarrollo y Estandarización 64
4.3.4. Evaluación de criterios sobre el desempeño del ensayo 68
4.4. Ensayo de neutralización de la peroxidasa 72
4.4.1. Desarrollo y Estandarización 72
4.4.2.Evaluación de criterios sobre el desempeño del ensayo 75
4.5. Diagnóstico 77
4.6. Caracterización genómica de aislados y análisis filogenético 78
DI ISCUSI ION GENERALL
CONCLLUSI IONES
RECOMENDACI IONES
REFFERENCI IAS BI IBLLI IOGRAFFI ICAS
57
8866
9999
110022
110044

1. INTRODUCCION
Entre los principales objetivos del desarrollo del país, se destaca el control de las
enfermedades infecciosas que causan enormes pérdidas al afectar especies animales -
fuente natural de proteínas para el hombre - de interés económico.
El control efectivo de estas enfermedades depende, en gran medida de la disponibilidad
de medios y métodos para la detección, identificación y clasificación de sus agentes
causales.
El género Pestivirus de la familia Flaviviridae está conformado por los virus de la peste
porcina clásica, de la diarrea viral bovina (BVDV) y de la enfermedad de la frontera (BDV)
(Francki y col., 1991), pequeños virus de simple cadena de ARN que constituyen
importantes patógenos en medicina veterinaria. Los hospederos primarios de estos tres
virus son los cerdos, bovinos y ovinos, respectivamente, aunque los primeros pueden ser
infectados de forma natural por las tres especies virales (Paton, 1995).
Entre los pestivirus, se destaca el agente causal de la peste porcina clásica (PPC),
enfermedad de notificación obligatoria de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), por
el impacto económico devastador que causa en la industria del cerdo.
Los pestivirus están biológica, antigénica y estructuralmente relacionados (Francki y col.,
1991; Terpstra, 1996) y comparten el mismo rango de hospederos (Paton, 1995). Esto
explica que no puedan ser diferenciados por los métodos de diagnóstico tradicionales
(Terpstra, 1996).
El diagnóstico de laboratorio tradicional de infecciones causadas por pestivirus se basa en
ensayos inmunohistoquímicos (Terpstra, 1996), que emplean conjugados elaborados a partir

de anticuerpos específicos policlonales, que no son capaces de diferenciar la especie pero
son útiles en la detección del género viral.
Entre las enfermedades rojas del cerdo se encuentran, además de las causadas por el virus
de la PPC y por pestivirus de rumiantes, la peste porcina africana (PPA), la salmonelosis, la
erisipela y la streptococcosis que pueden ser confundidas entre sí (Terpstra, 1996). Por lo
tanto, un diagnóstico tentativo, basado en signos clínicos y lesiones post-mortem, debe ser
confirmado por investigaciones de laboratorio.
De las infecciones por pestivirus en cerdos la más importante es la causada por el virus de la
PPC, que transcurre con un curso clínico agudo, con mortalidad cercana al 100%, en la
forma clínica aguda. No obstante, el cuadro clínico y las lesiones post-mortem en cerdos son
variables, debido a diversos factores como la virulencia de la cepa, dosis y período de
infección y otros relacionados con el hospedero -fondo genético, condiciones nutricionales y
estado inmunitario- que dan lugar a la forma clínica crónica o atípica y en ocasiones
subclínica, que en cerdas preñadas provocan infecciones prenatales (síndrome de la cerda
portadora), de las que se derivan crías inmunotolerantes (Liess, 1987). Estos animales con
infecciones atípicas e inmunotolerantes se convierten en reservorios y fuentes de
diseminación del virus (Westergaard, 1996 y Depner, 1996).
Por otra parte, las infecciones de cerdos por pestivirus de rumiantes tienen una amplia
distribución mundial y generalmente transcurren sin signos clínicos de enfermedad. No
obstante, se han reportado infecciones naturales en cerdos con virus de la diarrea viral
bovina, asociadas con signos clínicos y lesiones post-mortem indistinguibles de peste porcina
clásica crónica.
La PPC es una enfermedad de importancia global, que es enzoótica en Centro y Sudamérica
y en gran parte de Asia, mientras que en los países de la Unión Europea -grandes
productores de cerdos-, a pesar de los programas de erradicación que emprendieron hace
algunos años, continúan presentándose importantes epizootias con enormes pérdidas
económicas (Westergaard, 1996),

Existen varias razones para que la enfermedad prevalezca, a pesar de las medidas de
control tomadas. Entre ellas están el movimiento no controlado de cerdos, el síndrome de la
cerda portadora, la circulación de cepas de baja virulencia y de pestivirus de rumiantes que
pueden enmascarar el cuadro clínico y retardar el diagnóstico, fallos vacunales, el
incremento de cerdos susceptibles y sobre todo, la no disponibilidad de herramientas diagnósticas
adecuadas para cada caso, lo que puede impedir seriamente el progreso hacia la
erradicación final.
En Cuba, el programa nacional de control, que incluyó la vacunación con la cepa china o "C"
lapinizada desde 1965, contribuyó a una disminución progresiva de la aparición de casos,
hasta que desde 1974 no hubo más reportes. Sin embargo, a partir de 1993 se comenzaron a
presentar brotes de enfermedad roja del cerdo, causada por pestivirus, según se diagnosticó
por inmunofluorescencia directa, con diferentes cuadros clínico-epizootiológicos y la focalidad
fue aumentando hasta adquirir características de epizootia, con lo que se llegó a 451 focos
de la enfermedad hasta diciembre de 1997, distribuidos en la casi totalidad de las provincias
del país, a pesar de haberse cumplido el programa de vacunación contra PPC establecido.
La afectación económica que esta epizootia ha ocasionado, aunque aún no se ha
cuantificado, ha sido elevada y está dada, en primer lugar, por las pérdidas directas por
muertes debidas a la enfermedad (4 926), sacrificios sanitarios (58 755) y, sobretodo, por las
más de 1 600 toneladas de carne desaprovechadas.
Con la epizootia de enfermedad roja del cerdo causada por pestivirus, se puso en
evidencia el poco desarrollo de nuestros medios de diagnóstico y la imposibilidad de
identificar la especie de virus causal, así como de establecer las relaciones fiologenéticas
entre los aislados virales, necesarias para detectar las posibles fuentes de infección y
diseminación del virus.
Los datos clínico-epizootiológicos apuntaban hacia el virus de la peste porcina clásica
como agente etiológico de la epizootia, no obstante el hecho de que la enfermedad se

presentara después de un silencio epizootico de casi veinte años, con un cuadro clínico y
lesional variable y en una masa sometida a vacunación durante muchos años, dio lugar a
numerosas interrogantes acerca de la posibilidad de una reintroducción externa, de que
las infecciones se debieran a pestivirus de rumiantes y de que la cepa vacunal estuviera
distante genéticamente de las variantes virales circulantes y por tanto no fuera capaz de
inducir una protección efectiva contra estas.
Considerando los elementos expuestos, esta investigación se desarrolló bajo la hipótesis
de que la epizootia de enfermedad roja del cerdo que afectó nuestro país recientemente,
se debió al virus de la peste porcina clásica, no se originó por una reintoducción viral
externa, ni por lejanía genética entre la cepa vacunal en uso y las variantes virales
circulantes.
Para desarrollar esta hipótesis se establecieron los siguientes objetivos:
• Elaborar y evaluar medios y metodologías para la detección, identificación y
caracterización molecular del virus, así como para la detección de anticuerpos
específicos contra el mismo y su posterior aplicación en el Programa Nacional de
Lucha.
• Establecer la relación filogenética entre aislados virales sobre la base de su
caracterización genómica.
2. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1. Características generales del virus.

La Peste porcina clásica (PPC) es la más importante de las enfermedades que afectan al
ganado porcino, tanto desde el punto de vista económico como sanitario. Está
ampliamente distribuida geográficamente, es altamente contagiosa y se caracteriza por
causar morbilidad y mortalidad elevadas en los rebaños (Moennig, 1992).
La enfermedad fue reconocida en Estados Unidos a mediados del siglo XIX, donde recibió
el nombre de hog cholera. En los países europeos fue descrita usando nombres
diferentes como classical swine fever (CSF) en Inglaterra, swinepest en Suecia, pneumoentérite
infectieuse en Francia, schweineseuche en Alemania y peste porcina clásica en
España (Moennig y Plagemann, 1992).
El agente causal de esta enfermedad es un virus ARN, pequeño y envuelto (Moennig,
1988), que pertenece al género Pestivirus dentro del cual se incluyen además, el virus de
la diarrea viral bovina (BVDV) y el virus de la enfermedad de la frontera (BDV) (Horzinek,
1973; Mattthews, 1982), con los cuales está muy relacionado desde los puntos de vista de
rango de hospederos, estructural y antigénico (Darbyshire, 1960, Dinter, 1963, Donis y
Dubovi, 1987). Este género, anteriormente clasificado dentro de la familia Togaviridae
(Westaway y col., 1985 ) por sus características morfológicas y la polaridad de su genoma,
ha sido reclasificado taxonómicamente en la familia Flaviviridae sobre la base de la
organización del genoma y la estrategia de replicación viral (Collet y col., 1988a ; Francki
y col., 1991; Wengler, 1991; Collet, 1992). Esta familia comprende tres géneros, los
llamados Flavivirus, el grupo de virus de la hepatitis C y los Pestivirus (Horzinek, 1991).
En suspensiones purificadas del virus se han observado consistentemente al microscopio
electrónico partículas esféricas, envueltas y con diámetros entre 40 y 60 nm (Horzinek,
1981). Ocasionalmente, se encuentran proyecciones de forma irregular en estas
preparaciones que son muy lábiles y consecuentemente se pierden en los procesos de
purificación (Ritchie y Fernelius, 1968). Una envoltura lipídica, de aproximadamente 8 nm
de ancho, rodea la cápsida de simetría icosaédrica, que posee un diámetro aproximado de
30 nm (Horzinek y col., 1967; Francki y col., 1991).

Debido a la presencia de lipoproteínas en su envoltura, el virus se inactiva rápidamente
con solventes orgánicos como cloroformo y éter, así como con detergentes, como Nonidet
P-40, desoxicolato y saponina. También, es sensible a la acción de radiaciones
ultravioletas y a pH entre 3-4 y entre 11-12 (Terpstra, 1991). La infectividad se pierde
fácilmente sometiendo al virus a la temperatura de 60°C durante un mínimo de 10 min o a
una temperatura menor si se aumenta el tiempo de exposición, por ejemplo 56°C por 60
min, 50°C por 3 días o 35°C durante 15 días (Terpstra, 1991). Las enzimas proteolíticas
como la tripsina ejercen una inactivación moderada de la infectividad (Liess, 1981).
El virus es muy estable en un amplio rango de pH que va desde 5 hasta 10 (Terpstra,
1991), a temperaturas de -20°C y -70°C y liofilizado. La inactivación del virus se alcanza
con hipoclorito al 2%, cresol al 6%, fenol al 5% e hidróxido de sodio al 2% (Moennig y
Plagemann, 1992).
La supervivencia del virus en la naturaleza depende tanto del medio ambiente como del
sustrato en que se encuentre (sangre, saliva, heces). Es relativamente resistente a la
desecación, sobre todo, cuando se encuentra protegido en exudados, sangre, saliva o
heces. Debido a la supervivencia del virus en un amplio rango de pH , la acidez cadavérica
no lo destruye, por lo que se conserva durante un tiempo variable en carnes frescas,
ahumadas y congeladas (Helwig y Keast, 1966; Stewart y col., 1979). La estabilidad del
virus es de particular importancia práctica, porque el tiempo relativamente largo de
sobrevivencia en productos cárnicos contribuye a la diseminación del mismo y a la
aparición de brotes de la enfermedad en áreas libres de PPC (Terpstra, 1991).
Las primeras investigaciones sobre el virus de la PPC estuvieron dirigidas hacia la
identificación y caracterización del ácido núcleico viral y describieron que el genoma viral
es una molécula de ARN de banda simple, con polaridad positiva y coeficiente de
sedimentación de 40-45s (Enzmann, 1988). Estudios previos, que emplearon
electroforesis en geles de agarosa después de marcajes metabólicos, representaron una

molécula de aproximadamente 12,5 kb de longitud (Moormann y Hulst, 1988; Rümenapf
y col., 1989). Esto fue posteriormente confirmado al clonar y secuenciar los genomas de
cinco cepas de pestivirus: tres cepas de BVDV, Osloss (Renard, y col., 1987), NADL
(Collett y col., 1988b) y SD-1 (Deng y Brock, 1992) y dos cepas de PPC, Alfort (Meyers y
col., 1989) y Brescia (Moorman, y col., 1990a).
El genoma viral consta de un marco de lectura abierto, flanqueado por dos pequeñas
regiones no codificantes conservadas (Moennig y Plagemann, 1992). El ácido núcleico del
virus actúa como ARN mensajero (Purchio y col., 1984) y es traducido en una poliproteína
de aproximadamente 4 000 aminoácidos que es procesada co- y post- traduccionalmente
por proteasas, probablemente codificadas por la célula y por el virus (Stark y col., 1990;
Wiskerchen y col., 1990; Wiskerchen y Collett, 1991).
Se ha determinado la organización genómica completa del virus de la diarrea viral bovina
(Wiskerchen y col., 1990; Wiskerchen y Collett, 1991), sin embargo, del virus de la peste
porcina clásica sólo se han mapeado los genes que codifican la proteína de la cápsida y
las glicoproteínas de la envoltura (Moormann y col., 1990b; Stark y col., 1990; Thiel y
col., 1991; Rümenapf y col., 1993).
Las proteínas estructurales están localizadas dentro del tercio N-terminal de la poliproteína
(Stark y col. 1990) e incluyen tres glicoproteínas llamadas E0, E1 y E2, según el orden en
que aparecen en la poliproteína. Usando experimentos de marcaje radioactivo, se ha
demostrado que se forma E012 para luego ser procesada en E0, E1 y E2 de manera
ordenada (Rümenapf y col., 1993). El procesamiento es iniciado por una ruptura entre la
proteína de la cápsida y E012, seguido por la proteolisis en el carboxilo terminal de E2
(Van Zijl y col., 1991), E012 es entonces rápidamente escindido para formar E01 y E2.
Después que E2 es liberado del precursor se procesa E01 en E0 y E1. Las secuencias
alrededor de los sitios de proteolisis: cápsida/E0 y E1/E2, así como, la secuencia en el
carboxilo terminal de E2 son los péptidos hidrófobos señales para las proteasas celulares
(Rümenapf y col., 1993). La comparación de las secuencias alrededor de los sitios de

proteolisis de los pestivirus sugiere un esquema de procesamiento general para las
glicoproteínas estructurales (Stark y col., 1993).
En la secuencia del genoma la primera proteína codificada es una autoproteasa, no
estructural (p 23), con pesos moleculares de 19-23 kD, según el sistema de electroforesis
usado (Stark y col., 1993) , la cual es seguida por la proteína de la cápsida viral p14, con
un peso molecular de 14 kD (Moormann y col., 1990b), que es liberada de la p23 en una
fase temprana por una actividad autoproteolítica, que parece residir en la p23 (Thiel y col.,
1991). La secuencia aminoacídica en la que ocurre esta proteolisis se determinó por la
secuenciación de la p14, producida en diferentes sistemas de expresión. La comparación
de las secuencias de aminoácidos deducida sugiere un sitio de procesamiento común
entre la autoproteasa amino terminal y la proteína de la nucleocápsida de todos los
pestivirus (Stark y col., 1993)
A continuación, se encuentran las tres glicoproteínas del virión asociadas a la membrana,
E0 (gp 44/48), E1 (gp33) y E2 (gp55) (Stark y col., 1990), las tres existen en forma de
dímeros enlazados por puentes disulfuro que aparecen en las células infectadas y en los
viriones; gp44 y gp55 cada una forma homodímeros, mientras gp55 se encuentra además
dimerizada con gp 33. Tales interacciones de complejos covalentes entre proteínas
estructurales no han sido descritos para ningún otro virus ARN, y su significado biológico
real no se conoce en la actualidad (Thiel y col., 1991). La gp55 es la más antigénica de
todas e induce anticuerpos monoclonales neutralizantes (Wensvoort y col., 1986;
Wensvoort, 1989; Weiland y col., 1990a) y aunque, ciertos anticuerpos monoclonales
contra la gp 44 también pueden contribuir a la neutralización del virus (Weiland y col.,
1990b) la respuesta a la gp 55 sola confiere inmunidad protectora (Van Zijl y col.,1991;
Hulst y col., 1993). La gp 33 es hidrofóbica y puede funcionar como una proteína
transmembrana, sirviendo como ancla para la gp55 (Weiland y col., 1990a) y es la menos
inmunogénica de todas. La función de la gp44 en el complejo de glicoproteínas virales no
está clara. El resto del marco de lectura abierto codifica proteínas no estructurales, que
incluyen una polimerasa putativa ARN polimerasa.

La replicación de los pestivirus se inicia a partir de la penetración de la célula por
endocitosis mediada por receptor, seguida por la liberación del genoma viral en el citosol
(Boulanger y col., 1992). Se sugiere, que para la interacción inicial y la subsecuente
endocitosis debe ocurrir una interacción entre la gp55 y un receptor celular de 50 kD (Xue
y Minocha, 1993). La segunda fase del ciclo de replicación se inicia con la liberación del
ARN viral, en forma de un complejo de ribonucleoproteína, en el citosol de la célula. El
complejo se pone en contacto con los ribosomas y subsecuentemente los factores de
iniciación de la traducción son reclutados por el dominio no codificante de la región 5'
(Poole y col. 1995). En tanto, la traducción del marco de lectura abierto progresa,
proteasas virales y celulares escinden los polipéptidos nacientes en sitios específicos,
para generar proteínas virales maduras o intermedias (Purchio y col. 1984).
Una vez, que se producen las enzimas virales necesarias para la replicación del ARN por
la traducción del genoma, el ciclo de vida viral entra en la fase de replicación de su
genoma. Primero, se forma una cadena negativa del ARN genómico (ARNc) para servir
de molde y segundo, se sintetiza la progenie del ARN genómico (ARNv), a partir del ARNc
del paso previo. La replicasa viral aún no ha sido estudiada en detalle (Donis, 1995).
Con el empaquetamiento del ARN progenie y el ensamblaje de los viriones, que ocurre en
el retículo endoplásmico o en el Golgi, donde los viriones adquieren una envoltura lipídica,
el ciclo entra en su etapa final. Los virus alcanzan el compartimiento extracelular por
transporte vesicular (exocitosis) a las 10 horas post-infección (Donis, 1995).
2.2. Relaciones entre Pestivirus.
Los miembros del género Pestivirus están muy relacionados entre sí. Los viriones son
morfológica y estructuralmente similares (Laude, 1979), el ARN genómico es virtualmente
del mismo tamaño y los polipéptidos estructurales y no estructurales son muy similares
(Coria y col. 1983), por otra parte, el género comparte un rango específico de hospederos
(Bolin y col., 1994). Estos aspectos son de considerable importancia práctica para el
diagnóstico y la epidemiología de estos virus.

2.2.1. Relaciones genómicas y antigénicas.
El genoma de los pestivirus consiste de una molécula simple de una sola cadena de ARN,
de polaridad positiva y de aproximadamente 12-13 kb (Collet y col., 1989). Se han clonado
y secuenciado los genomas de tres aislados de BVDV - NADL, Osloss y SD1 - y dos del
virus de la PPC - Alfort y Brescia -(Renard y col., 1987; Collett y col., 1988b; Meyers y
col., 1989; Moorman y col., 1990a ; Deng y Brock, 1992). Las comparaciones de
secuencias, asistidas por computadoras, entre estos genomas, han revelado un 66% de
homología (Meyers y col. 1989), lo que resulta sorprendentemente alto, así como cierto
número de regiones de divergencia interesantes (Collet y col. 1991), de las cuales la más
importante es una inserción de 270 núcleotidos localizada en la secuencia del BVDV
dentro de la región codificante para una proteína de 115-125 kD altamente conservada.
Los 90 aminoácidos, derivados de esta secuencia adicional, reflejan exactamente la
diferencia en capacidad codificante del largo marco de lectura abierto entre los genomas
de BVDV y del virus de la PPC (Meyers y col., 1989).
La apreciación de que los pestivirus formaban un grupo antigénicamente relacionado
provino, de la observación histórica de Darbyshire, en 1960, de que el virus de la PPC
formaba una línea de identidad con el BVDV en ensayos de agar gel difusión.
Posteriormente, se comprendió que el BDV de los ovinos se encontraba también muy
relacionado (Acland y col., 1972).
Existe consenso acerca de que hay un espectro relativamente amplio de variaciones
antigénicas solapadas entre las tres especies de pestivirus, más que la existencia de un
punto de corte claro (Moennig, 1988). Los antisueros policlonales contra los pestivirus
generalmente son incapaces de distinguir especies, cepas o aislados cuando se emplean
en técnicas de inmunodifusión o inmunofluorescencia.
Fue a través de ensayos de neutralización cruzada que se establecieron evidencias de la
diversidad antigénica entre los pestivirus, y fueron los únicos capaces de diferenciarlos
(Hafez y Liess, 1972; Wensvoort y col., 1989b). Pero, sólo con el desarrollo de anticuerpos

monoclonales contra el virus, en los últimos años de la década de los 80, fue posible
definir la variabilidad con mayor precisión (Bolin y col., 1988; Edwards y col., 1988; Corapi
y col., 1990).
Muchos grupos han reportado anticuerpos monoclonales con especificidad pan-pestivirus,
ellos detectan epitopes altamente conservados, que han sido encontrados en células
infectadas con todos los pestivirus ensayados. La mayoría de ellos están dirigidos contra
la proteína no estructural designada p125/80 (Cay y col., 1989).
Los aislados de PPC poseen un dominio antigénico conservado importante en la
glicoproteína 55 o E2, pues se preparan fácilmente anticuerpos monoclonales contra este
dominio y tienen un poderoso poder diagnóstico al detectar todas las cepas del virus de la
PPC y ninguno de los pestivirus de rumiantes (Wensvoort y col., 1989a ; Edwards y
Sands, 1990).
El alto grado de homología (85%) en cuanto a aminoácidos, entre las cepas de pestivirus
indica un alto grado de conservación y por tanto, una similitud funcional de las respectivas
proteínas (Rümenapf y col., 1991).
Estos datos de alta homología a nivel genómico y aminoácidico indican una similitud
elevada, en cuanto a la organización del genoma y al procesamiento de la poliproteína
dentro del género Pestivirus (Meyers y col., 1989).
2.2.2. Especificidad de hospederos.
La especificidad de hospederos fue la base inicial para la subdivisión de los pestivirus, en
los grupos porcino, bovino y ovino.
Los hospederos naturales del virus de la PPC son el cerdo y el jabalí, aunque el virus es
capaz de replicarse en otras especies animales, como rumiantes domésticos, venados y

animales de experimentación (Paton, 1995). Entre ellos el conejo, que se ha utilizado para
la obtención de cepas vacunales (Bognar y Meszaros, 1963), y en los que provoca una
reacción febril, prácticamente asintomática. Sin embargo, la enfermedad aparece sólo en
cerdos domésticos y salvajes y nunca se han reportado casos naturales en rumiantes. No
obstante, el virus de la PPC puede replicarse en bovinos inoculados experimentalmente
(Loan y Storm, 1968; Dahle y col. 1987) y causa enfermedades reproductivas en ovinos
experimentalmente infectados (Shimizu y Kumagai, 1989).
Las primeras enfermedades causadas por pestivirus en rumiantes reconocidas fueron la
enfermedad de las mucosas del bovino y la diarrea viral bovina, las cuales son ambas
causadas por el BVDV. Algunas cepas del BVDV pueden además, causar enfermedad en
otros rumiantes y en cerdos (Snowdon y French, 1968; Acland y col., 1972; Snowdon y
col., 1975; Terpstra y Wensvoort, 1988; Carlsson, 1991; Loken y Bjerkas, 1991).
La última de las enfermedades causada por pestivirus fue descrita en ovinos como
enfermedad de la frontera (BD). Algunos pestivirus de ovinos tienen además, un amplio
rango de hospederos y pueden infectar bovinos, chivos y cerdos, con consecuencias
similares a las de la infección por el BVDV (Huck, 1973; Gibbons y col., 1974; Loken, y
Bjerkas, 1991; Paton y Done, 1994). La similitud entre BVD y BD y el hecho de que los
virus responsables de estas enfermedades no tengan hospederos específicos, ha llevado
a especular que las mismas tienen un origen común (Terpstra y col., 1984).
In vitro, algunos pestivirus pueden ser estricta o relativamente específicos para las células
de sus hospederos naturales, mientras que otros se replican bien en cultivos de células de
origen porcino, bovino y ovino (Wensvoort y col., 1989b; Liess y Moennig, 1990; Roehe y
Edwards, 1994). De ahí que, la especificidad in vitro es un criterio para la clasificación de
pestivirus, aunque la susceptibilidad in vitro de células de diferentes especies animales no
refleja necesariamente la susceptibilidad de la especie a la infección (Roehe y Edwards,
1994), ya que se conoce que puede ocurrir un proceso de adaptación. Este fenómeno
parece estar relacionado con la capacidad del virus de enlazarse a receptores celulares
específicos (Moennig, 1990; Paton y col., 1991). Tanto el BVDV como el virus de la PPC

pueden ser adaptados a crecer en conejos (Baker, 1946; Fernelius y col., 1969) y en
cultivos celulares de gran variedad de especies animales (Horzinek, 1981).
Los pestivirus pueden ser citopatogénicos o no citopatogénicos, en monocapas de cultivos
de células. Las formas citopatogénicas son más comunes en aislados bovinos, mientras
que, los aislados del virus de la PPC son casi invariablemente no citopatogénicos, aunque
se han descrito cepas citopatogénicas (Gillespie y col., 1960). Los virus ovinos sólo
exhiben citopatogenicidad ocasionalmente (Laude y Gelfi, 1979).
2.3. Diagnóstico.
Históricamente, la PPC se diagnosticó sobre la base de los signos clínicos y las lesiones
que presentaban los animales. Sin embargo, estos datos aunque en ocasiones
suministran la base para un diagnóstico presuntivo no son los recomendados.
El cuadro clínico y de lesiones en esta enfermedad es altamente variable y por otra parte,
las infecciones congénitas con BVDV en cerdos dan lugar a una enfermedad clínica
indistinguible de la PPC (Vannier y Carnero, 1985; Wensvoort y Terpstra, 1988; Terpstra
y Wensvoort, 1988), esto también ocurre con enfermedades como la peste porcina
africana, la salmonelosis y la erisipela, que pueden ser confundidas con PPC aguda
(Terpstra, 1996), por lo que para un diagnóstico inequívoco son imprescindibles los
métodos de laboratorio.
Los métodos de diagnóstico se basan en la demostración de la presencia del virus por
métodos biológicos como son el aislamiento en cultivos celulares o por inoculación en
cerdos y en métodos de detección de antígeno o ácido nucleico virales, a través de los
ensayos inmunohistoquímicos, del ensayo ELISA para detección de antígeno y de la
transcripción reversa con reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), así como, a

través de ensayos serológicos, los cuales incluyen la neutralización de la
inmunofluorescencia (NIF), de la inmunoperoxidasa (NPLA) y el ELISA. Estos
procedimientos aparecen en las revisiones de Carbrey, 1988; Terpstra, 1996 y
Vanderhallen y Koenen, 1996.
2.3.1. Detección del virus.
El método clásico para la detección de antígenos virales es la inmunofluorescencia directa
en cortes criostáticos de órganos, que resulta rápida y sencilla. La amígdala es el órgano
más adecuado, ya que es el primero en afectarse independientemente de la vía de
infección (Ressang, 1973). Además se emplean, bazo, riñón, ganglios linfáticos y porción
distal del ileum. Este último debe ser examinado porque frecuentemente contiene
antígenos virales, en las formas subaguda y crónica de la enfermedad, y puede ser en
algunos casos el único tejido que muestre reacción positiva (Terpstra, 1996).
Los tejidos pueden ser colectados de varios animales y transportados sin preservantes en
frío, pero no congelados. Las amígdalas pueden ser colectadas de animales vivos con el
empleo de forceps de biopsia rectal humana.
El ensayo de inmunofluorescencia utiliza un conjugado de fluoresceína, preparado a partir
de anticuerpos policlonales, que no distingue entre los antígenos de diferentes pestivirus
(Terpstra, 1996). Los cerdos infectados con BVDV pueden dar resultados falsos positivos,
ya que las infecciones congénitas con este virus pueden causar signos clínicos y lesiones
patológicas indistinguibles de las causadas por PPC crónica (Vannier y Carnero, 1985;
Terpstra y Wensvoort, 1988; Wensvoort y Terpstra, 1988).
Actualmente, se emplea un panel de anticuerpos monoclonales que permite la
diferenciación de pestivirus, una vez realizado el aislamiento viral (Wensvoort, y col.,
1989a; Edwards, 1991).

El aislamiento en cultivos celulares es aceptado como gold standard, es usado
rutinariamente para permitir la posterior caracterización del aislado con anticuerpos
monoclonales, es un método más sensible, pero más lento, que el diagnóstico por
inmunofluorescencia en cortes de órganos y requiere facilidades de cultivo de tejidos y de
contención para el trabajo con cepas virulentas. Debe realizarse en células en rápida
división. Las células PK-15 recién sembradas son inoculadas con 2% de suspensión de
órgano, posteriormente son examinadas por inmunofluorescencia directa a las 72 horas.
En caso negativo, se deben dar hasta tres pases en células para confirmar el resultado
(Terpstra, 1996).
El aislamiento por inoculación en animales es muy sensible, (Carbrey, 1988) pero es
costoso y consume mucho tiempo. La infección es confirmada por reaislamiento del
virus en cultivos celulares. En los cerdos que sobreviven, la infección puede ser
confirmada por la respuesta inmunológica de los cerdos inoculados.
El ELISA para la detección de antígeno, ha sido descrito recientemente (Shannon y col.,
1993), resulta adecuado para ensayos en mayor escala, no consume mucho tiempo y es
de fácil manipulación.
La reacción en cadena de la polimerasa, que involucra ciclos repetidos de amplificación de
un fragmento del genoma, ha demostrado ser un método rápido y muy sensible para la
detección de diversos patógenos en muestras clínicas (Liu y col.,1991; Wirz y col., 1993).
El método de RT-PCR ha sido descrito para la detección del virus de la PPC (Liu y col.,
1991; Katz y col., 1993; Wirz y col., 1993; Sullivan y Akkina, 1995) y se debe señalar que
además de ser rápido, es simple y muestra elevadas especificidad y sensibilidad. Es muy
útil, ya que es capaz de diferenciar las infecciones por el virus de la PPC y el BVDV en
cerdos.

El ensayo de RT-PCR ha demostrado ser más sensible que el ELISA y las técnicas
inmunohistoquímicas y por tanto permite detectar pequeñas concentraciones del virus
como las que pueden estar presentes en sueros sanguíneos (Vanderhallen y Koenen,
1996)
Son los procedimientos para la identificación del virus en muestras clínicas los que
permiten una detección temprana de la enfermedad, lo que es vital para su control
(Vanderhallen y Koenen, 1996).
2.3.2. Detección de anticuerpos.
La serología es el método de selección para la vigilancia en un área aparentemente libre
de la enfermedad y para asegurar que no haya focos residuales de infección durante un
programa de erradicación, sobre todo, cuando circulan cepas de baja virulencia. Además,
constituye una herramienta necesaria en la producción y evaluación de vacunas y en la
determinación de los niveles de inmunidad de la masa sometida a vacunación. Sin
embargo, el diagnóstico no puede basarse en la serología, porque, debido al efecto
inmunosupresor del virus, los anticuerpos no pueden ser detectados hasta cuatro
semanas después de la infección (Pearson, 1992).
Una evaluación de los ensayos serológicos durante el brote de PPC ocurrido en Bélgica
durante 1990, demostró que los mismos son de poco valor para detectar PPC en
estadíos tempranos de la enfermedad (Vanderhallen y Koenen, 1996).
Como la incidencia de infecciones por BVDV puede ser alta en los cerdos, los ensayos
que discriminen pestivirus son los más útiles. La virus-neutralización y el ELISA con

anticuerpos monoclonales, satisfacen los requerimientos de especificidad y sensibilidad
(Wensvoort y col., 1988; Pearson, 1992; Terpstra, 1996) del diagnóstico.
Como las cepas del virus no son citopatogénicas es necesario detectar los virus no
neutralizados después de su multiplicación en las células. Para este fin, un sistema
indicador como la neutralización de la inmunofluorescencia (NIF) (Liess y Prager, 1976) o
de la inmunoperoxidasa (NPLA) (Terpstra y col., 1984; Terpstra, 1996), son las técnicas
empleadas y se realizan en placas de microtítulo. Por otra parte, el sistema peroxidasa
tiene la ventaja de que los resultados se conservan de forma permanente y pueden ser
leídos sin instrumental.
Ocasionalmente, sueros de cerdo con anticuerpos frente al BVDV pueden reaccionar, en
el ensayo de NPLA a bajas diluciones, como si los animales estuvieran infectados por
PPC. Sin embargo, los niveles de anticuerpos que se alcanzan después de la infección por
PPC incluyendo las producidas por cepas de baja virulencia, permiten el empleo de
diluciones de suero relativamente altas, y de este modo se evitan las reacciones cruzadas
(Terpstra y col. 1984; Terpstra y Wensvoort, 1988).
Los ensayos ELISA que se emplean incluyen procedimientos competitivos, de bloqueo e
indirectos (Have, 1984; Hulst y col., 1993; Mose y col., 1996). La sensibilidad de estos
ensayos debe ser suficiente para detectar cualquier suero positivo por ensayos de
neutralización. Si el ELISA no es PPC específico, entonces las muestras positivas deben
ser examinadas posteriormente por un ensayo que discrimine entre PPC y otros pestivirus.
2.4. Características clínicas y anatomopatológicas.
El cuadro clínico y las lesiones post-mortem, en cerdos afectados por PPC, son muy
variables debido a diversos factores como son, la existencia de cepas de baja
virulencia, la dosis y vía de infección y factores del hospedero (edad, fondo genético,

condiciones nutricionales y estado inmunitario) (Liess, 1987; Van Oirschot, 1988;
Moennig y Plagemann, 1992).
Por otra parte, infecciones congénitas con BVDV pueden dar lugar a una enfermedad
clínica indistinguible de la PPC (Vannier y Carnero, 1985; Terpstra y Wensvoort, 1988;
Liess y Moennig, 1990; Paton y col., 1992), las infecciones bacterianas sobreañadidas
pueden enmascarar el cuadro lesional, y la infección de cerdas gestantes por cepas poco
virulentas dan lugar a infecciones intrauterinas, que provocan abortos, malformaciones
fetales, nacidos muertos e infecciones persistentes e inaparentes. Debido a esto, no es
posible con frecuencia establecer un diagnóstico solo sobre bases clínicas y patológicas
(Terpstra, 1996).
La PPC puede presentar diferentes formas clínicas en infecciones post-natales:
hiperaguda, aguda y crónica. Además, la infección transplacentaria puede dar lugar a
diversas afecciones fetales y neonatales, así como a infecciones persistentes, en
dependencia del momento de la gestación en que se produjo la infección (Van Oirschot y
Terpstra, 1989).
La aparición de numerosas cepas y aislados de baja virulencia, que producen un cuadro
clínico-lesional variable, (Dahle y Liess, 1995; Gruber y col., 1995; Depner y col., 1996 )
dificulta seriamente el reconocimiento de la enfermedad y contribuye a la diseminación del
virus (Van Oirschot, 1988).
2.4.1. Infecciones post-natales.
Los primeros reportes de la enfermedad describían un curso hiperagudo a agudo con un
período de incubación de 2-3 días (Dahle y Liess, 1992). En la enfermedad hiperaguda los
animales infectados no muestran más que un aumento de temperatura corporal de
aproximadamente 41ºC antes de morir, 2-5 días después de la exposición al virus. En la
necropsia, los cambios que se observan corresponden a los de shock, con congestión y

edema pulmonar, congestión del hígado y del tracto gastrointestinal y poca evidencia de
hemorragias.
Hoy, la forma hiperaguda de la enfermedad parece ser la excepción y predominan las
formas aguda, crónica y subclínica. Esto puede estar relacionado con la aparición de
cepas de moderada a baja virulencia, que emergieron en el curso de la historia de esta
enfermedad, y sobre lo cual se especula que tiene que ver con la utilización de la
serovacunación, introducida en 1908 en los EUA, lo que favoreció las condiciones para el
desarrollo de mutantes virales. Por otra parte, los virus ARN de simple cadena son
altamente variables y una selección natural de virus de baja virulencia parece ser una
proposición plausible.
La forma clínica aguda se caracteriza por morbilidad alta y muerte de los animales entre
los 10 y 20 días después de la infección (Dahle y Liess, 1992). La tasa de mortalidad varía
con el estado inmunológico de la población afectada y con la virulencia de la cepa, con
cifras variables desde el 30-40% al 90-100%. El período de incubación es de dos a seis
días. La fase clínica se caracteriza por fiebre, apatía o baja actividad, disminución del
apetito y embotamiento. La temperatura puede llegar a 42ºC o más y la fiebre persiste. Se
observan leucopenia y trombocitopenia. Posteriormente los animales se hacinan y
manifiestan temblores, conjuntivitis con marcada descarga ocular y en algunos casos
descarga nasal. Al comienzo de la enfermedad, puede existir estreñimiento, que acaba en
diarreas. En la fase terminal, tienen una marcha ondulante por debilidad en el tercio
posterior y afectaciones del sistema nervioso central con parálisis del tercio posterior y
pedaleo. Un signo clínico característico que aparece en las primeras fases de la
enfermedad es la hiperemia cutánea, en orejas, hocico, abdomen y extremidades, que
puede progresar hacia la cianosis.
En la necropsia, las lesiones corresponden a la de una diátesis hemorrágica, con
hemorragias petequiales en la mayoría de los sistemas orgánicos, sobre todo, en riñones,
vejiga urinaria, ganglios linfáticos, bazo, laringe, piel, mucosas y serosas. Las infecciones

acterianas secundarias pueden modificar o intensificar algunos hallazgos macroscópicos
(Trautwein, 1988).
La forma clínica crónica se define como una enfermedad letal, en la que los cerdos
sobreviven más allá de los 30 días después de la infección (Mengeling y Packer, 1969;
Liess, 1987). Como el cuadro clínico en estas infecciones puede ser no característico,
también se denominan atípicas. Los factores que condicionan esta supervivencia
prolongada, no se conocen con precisión y puede tener un curso de 2-4 semanas o aun
meses. El curso es muy lento y suele haber afectación predominante de algún sistema u
órgano. Las afecciones bacterianas secundarias son muy comunes. Se caracteriza por
períodos prolongados e intermitentes de fiebre y viremia. Esta infección puede estar
confinada a solo unos pocos animales de una piara, que muestran signos típicos tales
como debilidad, retardo en el crecimiento, diarreas intermitentes y anorexia. Los índices de
mortalidad del rebaño pueden elevarse ligeramente por encima del nivel esperado.
Morfológicamente, hay poca evidencia de hemorragias generalizadas, pero pueden estar
afectados algunos órganos, en el intestino pueden verse ocasionalmente úlceras
botonosas, los ganglios pueden mostrar hiperplasia y aparece una atrofia generalizada del
tejido linfoide.
2.4.2. Infecciones trasplacentarias.
Al igual que el resto de los pestivirus el virus de la PPC se transmite congénitamente in
utero (Van Oirschot y Terpstra, 1989). La afectación que sufre el feto depende, sobre todo,
del tiempo de gestación y de la virulencia de la cepa. Después de una infección
experimental de cerdas con un virus de baja virulencia, a diferentes momentos de
gestación, se reconocieron tres grupos diferentes de cerditos: abortos o nacidos muertos,
cerditos con viremia congénita desde el nacimiento hasta la muerte y cerdos normales no
infectados con PPC (Liess, 1987).

A pesar de las variaciones se llegó a las siguientes conclusiones generales: infecciones
tempranas (antes de los 41 días de gestación) usualmente resultan en abortos y crías
muertas, mientras que inoculaciones posteriores (85 días de gestación) producen
animales virémicos. El desarrollo del sistema inmune posibilita al feto combatir las
infecciones después de aproximadamente 85 días de gestación (Van Oirschot, 1988).
2.5. Patogenia.
El virus penetra en el organismo normalmente por ingestión, inhalación o a través de la
piel erosionada. El contacto genital con cerdos infectados puede además mediar la
infección en las cerdas (Liess, 1987). Una vez en el organismo, el virus infecta las
células epiteliales de las criptas de las amígdalas que son consideradas el órgano diana
para la multiplicación primaria del virus independientemente de la vía de infección
(Ressang, 1973).
A partir de las amígdalas y utilizando los vasos linfáticos el virus llega a los ganglios
linfáticos regionales. De ahí el virus pasa a sangre periférica, dando lugar a una viremia
que facilita la diseminación de las partículas víricas, con lo que se produce una nueva
multiplicación del virus en bazo, médula ósea y otros ganglios linfáticos.
La fase virémica comienza a las 14-24 horas post-infección y puede durar hasta poco
antes de la resolución de la enfermedad. Las hemorragias múltiples que caracterizan
las infecciones por el virus de la PPC se deben, a la degeneración de las células
epiteliales junto con una fuerte trompocitopenia y a la alteración de los mecanismos de
coagulación de la sangre. Este virus afecta fundamentalmente a los tejidos epiteliales y
al sistema reticulo-endotelial. La infección del endotelio vascular causa edema e
inflamación, lo que resulta en la interrupción del flujo de los vasos sanguíneos e
infartos.

Nuevos conocimientos acerca de la organización especial del sistema inmune del cerdo
(Binns y Pabst, 1988) y el clonaje del genoma viral (Meyer y col., 1989) posibilitaron
identificar los tejidos de replicación viral, por sondas moleculares, que han permitido
profundizar sobre el efecto del virus de la PPC sobre el sistema inmune. Se demostró que,
la dramática depleción de linfocitos B causada por la destrucción de los centros
germinales en los tejidos linfoides, es la consecuencia patoinmunológica de la infección
aguda por PPC (Milorad y col., 1992). La replicación del virus de la PPC, en los folículos
B, es un evento temprano y específico y precede a la infección generalizada. Claramente,
la depleción de linfocitos B no puede responder por todos los síntomas pleiotrópicos de la
enfermedad, pero el tropismo del folículo B es un determinante importante en el curso de la
infección.
2.6. Epidemiología.
El contacto directo entre animales infectados y susceptibles es la forma más común de
transmisión del virus de la PPC. En condiciones naturales las vías oral e intranasal son
las más importantes, también pueden ocurrir infecciones a través de la piel erosionada y
por agujas (Terpstra, 1991).
El virus puede excretarse incluso durante el período de incubación (Liess, 1987). En las
infecciones agudas aparecen altos niveles de virus en sangre y otros tejidos. Se
excretan grandes cantidades de virus en saliva y cantidades menores en orina y
secreciones nasales y oculares (Ressang, 1973). La excreción viral continúa hasta la
muerte o en los animales que se recuperan hasta que los anticuerpos se establecen
(Terpstra, 1991).

En las infecciones crónicas, el virus es excretado continuamente o de forma intermitente
hasta la muerte del animal (Mengeling y Packer, 1969). Las infecciones
trasplacentarias pueden dar lugar a animales persistentemente infectados (Liess,
1987), que excretan virus en grandes cantidades, durante meses, sin signos clínicos de
enfermedad ni desarrollo de respuesta de anticuerpos (Van Oirschot y Terpstra, 1989).
En la transmisión de la enfermedad desempeñan un papel muy importante las infecciones
inaparentes, como son las crónicas, persistentes y de sintomatología atípica. Estos
animales pueden actuar como fuente de virus no reconocida y durante meses mantenerse
eliminando virus, por lo que suponen un reservorio de virus muy peligroso, que causa en
muchas ocasiones nuevos brotes sin explicación aparente (Van Oirschot, 1988). El
movimiento de cerdos no controlado constituye la manera de diseminación más común del
virus (Terpstra, 1991).
Otra fuente de infección muy importante son los productos cárnicos de origen porcino
infectados con virus de la PPC. En la carne y productos cárnicos, el virus se mantiene
infeccioso durante largos períodos que van desde los 27 días en el tocino hasta los 1
500 días en la carne congelada. Sin embargo, en jamones y lomos elaborados, el virus
desaparece antes de finalizar el proceso de curación comercial (Tapiador y col., 1993).
No se han encontrado vectores biológicos de importancia epidemiológica, lo que sí se
ha demostrado es que en ocasiones, los dípteros pueden servir de vectores mecánicos
transportando el virus entre animales infectados y susceptibles (Bram, 1976).
Experimentalmente, se ha visto que los tábanos transmiten la enfermedad en las dos
horas que siguen a la picadura el animal infectado (Tidwell y col., 1972), así mismo las
moscas pueden llevar al virus al menos durante 72 horas (Morgan y Miller, 1972). La
transmisión mecánica por el hombre es de mayor significación en áreas con una
elevada densidad de cerdos (Terpstra, 1991), él puede transmitir el virus a través de
instrumentos contaminados y drogas de uso parenteral al no descartar jeringuillas y

agujas. La transmisión por ropas, calzado y roedores es rara, ya que la dosis de virus
que puede ser transferida está usualmente por debajo de la dosis infectiva mínima para
los cerdos (Terpstra, 1991).
Los nuevos enfoques moleculares posibilitan que los análisis epidemiológicos se sustenten
en un mayor conocimiento del genoma de los patógenos. Estos nuevos conceptos basados
en la posibilidad de secuenciar los ácidos nucleicos, así como en el estudio de regiones
polimórficas de los diferentes aislamientos permiten establecer cadenas filogenéticas entre
éstos, para conocer la procedencia y las vías de diseminación (Lowings y col., 1994, 1996).
Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de secuenciación de ácidos
nucleicos, en conjunto con el análisis filogenético han generado información epidemiológica a
escala molecular sobre diversos virus como el de la Inmunodeficiencia humana (Salminen y
col., 1993), Dengue (Rico-Hesse, 1990), Influenza B (Rota y col., 1992) y fiebre Aftosa (Beck
y Strohmaier, 1987), entre otros.
Existen varios reportes de la utilización de métodos moleculares aplicados a estudios
epidemiológicos de PPC (Edwards y Sands, 1990; Harding y col., 1994; Lowings y col.,
1996), donde se demuestra la utilidad de estos estudios para la identificación individual y el
análisis filogenético de las cepas involucradas en diferentes brotes, así como para
comprender la patogénesis, evolución y diseminación de la enfermedad.
Para el estudio molecular de cepas y aislados del virus de la PPC se han empleado
diversos procedimientos, como análisis de patrones de enlazamiento de anticuerpos
monoclonales (Edwards y Sands, 1990), de datos de restricción (Harding y col., 1994;
Viçek y col., 1996) y de secuencias nucleotídicas (Hofmann y col., 1994; Lowings y col.,
1994, 1996; Stadejek y col., 1996; Vilçek y col., 1996). Entre estos procedimientos la mayor
discriminación se reporta con los datos obtenidos del análisis de secuencias (Lowings y
col, 1996).

En la literatura se encuentran análisis de comparación de secuencias, realizados en
diferentes regiones del genoma viral, como el gen putativo de la polimerasa (NS5B) en
el extremo 3´ (Lowings y col., 1994), la región no codificante (NCR) del extremo 5´
(Hofmann y col., 1994; Stadejek y col., 1996) y el de la glicoproteína más importante E2
(gp55) (Lowings y col., 1996; Viçek y col., 1996). Un estudio de comparación de estas
regiones reveló que de estas tres, la E2 produjo la mejor discriminación y fue capaz de
distinguir entre muchos de los virus que resultaron idénticos por análisis de las otras
dos regiones (Lowings y col., 1996).
Los análisis filogenéticos realizados en esta región y en otras regiones genómicas,
(Lowings y col.,1996; Viçek y col. 1996) muestran que las cepas y aislados de PPC se
dividen en dos grandes grupos. El grupo l está representado por la cepa Brescia e incluye
todos los virus anteriores a 1964, aislados más recientes de cepas no europeas (América
y Asia) y todas las cepas vacunales analizadas y el grupo II está representado por la cepa
Alfort e incluye los virus aislados después de 1970, la mayoría europeos y posteriores a
1985.
2.7. Control.
Después de su primera descripción en 1830 en Ohio, EUA, el virus de la PPC ha sido
reportado en la mayor parte del mundo, hoy, es enzoótico al menos en áreas de
Sudamérica y Asia del Este (Liess, 1981; Terpstra, 1991; Dahle y Liess, 1992). Los
programas de erradicación de las últimas décadas han resultado exitosos en
Norteamérica, Australia y en países europeos. Sin embargo, a pesar de los grandes
esfuerzos que se han realizado para su erradicación, continúan ocurriendo repetidos
brotes epidémicos dentro de Europa central (Westergaard, 1996).

En muchos países la enfermedad prevalece con riesgos de reemergencia ante fallos en el
control, a pesar de las medidas tomadas, por lo que la aparición de brotes agudos tiene
que ser tomada como indicador de infecciones clínicas no advertidas, con significación
epidemiológica (Moennig, 1990), sobre todo, en países como el nuestro con programas de
vacunación establecidos. Las razones para esto son diversas y varían de un país a otro.
Entre ellas está el movimiento no controlado de cerdos, el síndrome de la cerda portadora
(Van Oirschot y Terpstra, 1989), la circulación de cepas de baja virulencia (Dahle y Liess,
1995) y de pestivirus de rumiantes que pueden enmascarar el cuadro clínico y retardar el
diagnóstico, fallos vacunales, el incremento de cerdos susceptibles y sobre todo, la falta
de disponibilidad de herramientas diagnósticas adecuadas para cada caso, que pueden
impedir seriamente el progreso hacia la erradicación final.
El control de la enfermedad es intentado bien por vacunación o por erradicación. Para la
vacunación se han desarrollado cepas “C” lapinizadas de PPC y mutantes sensibles a la
temperatura, los cuales han sido usados exitosamente en numerosos países (Aynaud y
Jones, 1988). Sin embargo, la Unión europea prohibió la vacunación en 1990, sobre todo,
porque la respuesta de anticuerpos a la vacunación o a infecciones de campo no pueden
ser discriminadas. Este último aspecto se está tratando de solucionar con el desarrollo de
vacunas por subunidades o por vectores recombinantes (Rümenapf y col., 1991; Van Zijl y
col. 1991; Hulst y col., 1993).
En los países en que la PPC está presente de forma enzootica se debe proceder a la
vacunación sistemática, con el fin de controlar la enfermedad y reducir la pérdidas. Las
vacunas que se vienen utilizando en las dos últimas décadas sin problemas son cuatro
vacunas vivas modificadas: la cepa “C” lapinizada, la japonesa adaptada a cultivo celular
de cobayo, la cepa francesa Thiverval adaptada a la linea celular PK-15 y la PAV-250 en
PK-15. Estas cuatro vacunas no presentan virulencia residual y están consideradas como
inocuas, tanto para las cerdas preñadas como para los lechones de más de dos semanas.

Estas vacunas confieren una inmunidad rápida y duradera (Correa y col., 1992; Gómez-
Tejedor y Martínez-Orozco, 1994).
Para un control efectivo de la PPC deben aplicarse una serie de medidas de orden
sanitario, como son la eliminación de todos los cerdos en las granjas afectadas, la
desinfección de las mismas, la prohibición del movimiento de animales, la vigilancia
epizootiológica y las normas de repoblación.
La experiencia de muchos países, es que un programa de vacunación estricto y
sistemático llevado a cabo durante un tiempo prolongado y acompañado de las medidas
zoosanitarias oportunas, hace desaparecer los brotes de PPC. Una vez que el país esté
libre de la enfermedad, se debe tender a la erradicación prohibiendo las vacunaciones y
efectuando un seguimiento serológico a los dos años de la prohibición (Gómez-Tejedor y
Martínez-Orozco, 1994).
La mejor medida para que un país libre de PPC siga siéndolo es la prevención, atendiendo
a los mecanismos de transmisión expuestos anteriormente, y aplicar un buen sistema de
vigilancia, basado en el diagnóstico efectivo de la enfermedad.
3. MATERIALES Y METODOS
3.1. Generales.
3.1.1. Cultivos celulares: Se emplearon líneas celulares de riñón de cerdo PK-15 (ATCC
CCL 33) y de riñón de ternero MDBK (ATCC CCL 22), certificadas libres de BVDV, en medio
esencial mínimo de Eagle (MEM), suplementado con penicilina-estreptomicina 100 UI-µg/mL
en el caso del medio de mantenimiento y con el mismo medio pero suplementado además,

con 5 % de suero fetal bovino (Gibco, certificado libre de virus y micoplasmas), en el caso del
medio de crecimiento. Las células se utilizaron tanto en suspensión celular como en
monocapa establecida.
3.1.2. Virus: Se utilizaron las cepas del virus de la PPC, de referencia: Alfort y Ames y
vacunales: PAV-250 y “C” (Labiofam, S.A.), así como de BVDV, de referencia: NADL,
Oregon y Singer y vacunal: Mucossifa (Rhône-Mérieux, Francia). Además, fueron
incluidas dos colecciones de 16 y 7 aislados virales de PPC y BVD respectivamente, de
diferentes regiones de Cuba, identificados por anticuerpos monoclonales (CVL-Weybridge,
UK).
3.1.3. Suspensiones virales: Se utilizaron suspensiones virales para la elaboración de
antígenos laminares e inmunógenos, así como, para la extracción de ARN empleados en
los diferentes experimentos. Para su obtención, se propagaron las cepas/aislados de PPC,
a una multiplicidad de infección de 0,001 DICT50/célula, en células PK15 durante 48-72 h y
las cepas/aislados de BVD, a la misma multiplicidad de infección, en células MDBK hasta
que el efecto citopático afectó el 70-80 % de la monocapa celular. Los virus fueron
extraídos por congelaciones y descongelaciones repetidas de las células y se separaron
los restos celulares del sobrenadante de las células infectadas por centrifugación.
3.1.4. Preparación de la muestra: Se emplearon muestras de órganos, procedentes
de animales sacrificados en brotes de PPC en Cuba, que se prepararon, tanto para
intentar el aislamiento viral como para la obtención directa del ARN, como se describe a
continuación.
Luego de cortar 1-2 g de una muestra de tejido - amígdala, ganglio linfático o bazo -
en pequeñas porciones, se evaluaron diferentes métodos de homogenización que
fueron, la maceración del tejido con arena lavada estéril en mortero, el empleo del
homogenizador eléctrico (Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik) por 1 min a alta velocidad
y del homogenizador manual de vidrio.

Se preparó una suspensión del tejido homogenizado al 10 % en medio MEM y se
evaluaron dos métodos para evitar la contaminación de los cultivos celulares con la
muestra, la filtración del extracto de órgano por filtros de 0,22 µ previa centrifugación a
1 000 g por 15 min y, el tratamiento de la muestra con antibióticos - penicilina G
potásica 1 000 UI/mL, estreptomicina 500 µg/mL y gentamicina 500 µg/mL -, a
temperatura ambiente por 1 hora o a 4ºC toda la noche, con posterior centrifugación en
las condiciones descritas.
3.1.5. Preparación de antígenos laminares: Las monocapas de células de cultivo
infectadas y no infectadas, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato
pH 7,2 (PBS), posteriormente se tripsinizaron, se lavaron de nuevo las células con PBS, se
dispensaron 30 µL de una suspensión ajustada a 5 x 10 5 células/mL en PBS sobre láminas
portaobjetos, se secaron las células a temperatura ambiente, se fijaron posteriormente en
acetona fría (calidad reactivo) por 10 min y finalmente se conservaron a - 20ºC hasta su
evaluación.
3.1.6. Experimento de infección: Se seleccionaron 20 cerdos comerciales entre 12 y 15 kg
de masa corporal, negativos serológicamente a pestivirus, y se les administró una dosis de la
vacuna contra la PPC (Labiofam, S.A.). Los animales fueron sangrados antes de ser
vacunados, y desde los 30 días de vacunados y cada 10 días hasta los 90 días para la
detección de anticuerpos en suero por las técnicas de NPLA y ELISA (Rhône-Mérieux,
Francia).
Para la detección de virus en fluidos biológicos por ELISA (Rhône-Mérieux, Francia) y RT-
PCR los animales se sangraron a los 4, 7, 10, 15, 21 y 30 días post-vacunación. Para la
detección de antígenos virales en amígdalas por inmunofluorescencia directa y ELISA

(Rhône-Mérieux, Francia), se sacrificaron dos animales cada día, a los 4, 8, 10, 15 y 24 días
post-vacunación.
3.1.7. Desarrollo y Validación de los ensayos: Se realizaron de acuerdo a las normas para
la validación de ensayos serológicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas de la
OIE (Jacobson, 1996). En estas, se establece lo referido a la selección de muestras, reactivos
y protocolos, la estabilidad de los medios diagnósticos, la evaluación de las concentraciones
óptimas de los reactivos y de los parámetros de las reacciones, la determinación de la
sensibilidad y especificidad analíticas, la sensibilidad y especificidad diagnósticas, la
sensibilidad y especificidad diagnósticas relativas y la evaluación de la repetibilidad como
estimado de la precisión de los ensayos.
3.1.8. Secuenciación: Para la secuenciación directa de los productos de la RT-PCR, estos
fueron analizados por electroforesis en 2 % de agarosa, conteniendo 0.5 µg/ml de bromuro de
etidio y los ADNc fueron purificados directamente de la mezcla de reacción utilizando el kit
Wizard PCR Preps (Promega). Para las reacciones de secuenciación fueron usados 50 ng
del ADN recobrado, 10 µCi de 35 S-dATP y 20 ng de bien, el cebador sentido o el antisentido,
estas reacciones fueron realizadas usando el ƒmol DNA cycle Sequencing System
(Promega).
Las muestras se analizaron en un gel de acrilamida al 8 % en tampón TBE (Tris-borato 45
mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y urea al 42 %. Los geles son secados y expuestos a una película
para autoradiografía, luego de revelado se procede a su lectura.
3.2. Inmunofluorescencia e Inmunoperoxidasa directas (IFD e IPD).
3.2.1. Obtención de conjugados: Se obtuvo un suero policlonal específico, mediante la
inmunización de cinco cerdos comerciales de aproximadamente 90 kg de masa corporal,
negativos serológicamente a los virus de la enfermedad de Aujeszky, y encefalomiocarditis, así

como a pestivirus, con cepas vacunales y virulentas de peste porcina clásica a través del
siguiente esquema de inmunización.
Los cerdos se vacunaron con una dosis (2 mL) de la cepa vacunal “C” (Labiofam, S.A.) por vía
intramuscular. Tres meses después se inocularon con 2 mL de la cepa vacunal PAV-250 por vía
intramuscular y 25 días más tarde se aplicó una segunda dosis de esta vacuna. Luego, durante
tres semanas (una vez por semana) se desafiaron con 1 ml de la cepa virulenta Ames por vía
intramuscular y a continuación con 1 mL de la cepa virulenta Alfort por vía intramuscular
semanalmente por dos ocasiones, siete días después de la última inoculación se procedió al
sangrado total de los cerdos.
El suero obtenido se empleó para la obtención de inmunoglobulinas G específicas, por
cromatografía de afinidad en Proteína G - Sepharosa (Guss y col., 1986). Las fracciones que
mostraron mayor concentración de proteínas (31 mg/mL) y mayor reactividad específica por
inmunofluorescencia indirecta (IFI) (>1:200) se marcaron con isotiocianato de fluoresceína
(Hurrel, 1982) y peroxidasa de rábano picante (Wilson y Nakane, 1978).
La IFI se realizó según lo descrito por Coba y Correa (1993) sobre antígenos laminares
(ver acápite 3.1.5), preparados sobre células PK-15 no infectadas e infectadas con la
cepa Alfort.
3.2.2. Desarrollo y Estandarización: Para la estandarización de las condiciones de los
ensayos se emplearon antígenos laminares (ver acápite 3.1.5), preparados a partir de células
PK-15 infectadas con la cepa Alfort y no infectadas, así como cortes por congelación -
obtenidos según está normado por la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) (Terpstra,
1996) - de órganos procedentes de animales infectados con PPC y sanos. Estos ensayos se
emplearon tanto para la detección directa de antígenos virales en cortes por congelación de
órganos de animales infectados, como para revelar la multiplicación de cepas/aislados de
PPC en cultivos celulares.
El ensayo de IFD se realizó según establece la OIE (Terpstra, 1996), con modificaciones
orientadas a optimizar el ensayo, según se describe a continuación: sobre el corte por

congelación de tejido o las células de cultivo preparadas como antígenos laminares -
según se describe en el acápite 3.1.5. -, se depositaron 30 µL del conjugado fluorescente
diluido en PBS con 25 % del volumen final de dilución de azul de Evans al 0,01 %.
La incubación se realizó en cámara húmeda protegida de la luz y se evaluaron la
temperatura - temperatura ambiente y 37ºC - y el tiempo - 30 min y 1 hora - de
incubación. Posteriormente, se realizaron tres lavados por inmersión, de 10 minutos cada
uno, del corte de tejido o las células de cultivo en PBS, se añadió una gota de solución
montante - glicerina tamponada con fosfato pH 9,6 -, se colocó un cubreobjeto y finalmente,
se examinaron las células bajo microscopio de fluorescencia con aumento de 400x, para
detectar focos fluorescentes.
Las condiciones del ensayo de IPD se establecieron según se describe a continuación: se
evaluó el tratamiento previo de los cortes de tejidos con una solución de peróxido de
hidrógeno al 3 % en PBS, para consumir la actividad de peroxidasa endógena que puede
estar presente en los tejidos animales. Se dispensaron 30 µL del conjugado enzimático
sobre el corte por congelación o células de cultivo, previamente diluido en diferentes
diluentes, sometidos a evaluación con relación a la intensidad y nitidez de la tinción, que
fueron solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 (PBS); tampón TBS (Tris 10 mM;
NaCl 250 mM, pH 8,0) y PBS con albúmina de huevo (OVA) al 1 %.
Se realizó la incubación en cámara húmeda cerrada y en condiciones de oscuridad, se
evaluaron las condiciones de temperatura - temperatura ambiente y 37ºC - y el tiempo - 30
min y 1 hora - de incubación del conjugado enzimático, con relación a la mayor intensidad
de la tinción y el fondo de reacción más bajo.
Se lavaron las células por inmersión del portaobjeto en PBS, tres veces 10 min cada vez,
se dejaron secar a temperatura ambiente y se recubrieron con 30 µL de la solución de
sustrato-cromógeno, para lo cual se evaluaron dos cromógenos, el tetra hidrocloruro de
diaminobencidina (DAB) (1 mg de DAB diluida en TBS) y el 3-amino-9 etil-carbazol (AEC)

(1 mL de 0,4 % de AEC en N,N-dimetil-formamida, 19 mL de acetato de sodio 0,05 M pH
5,0), en ambos casos se empleó peróxido de hidrógeno al 0,01 % como sustrato de la
enzima. Se incubaron las células en cámara húmeda y oscuridad a temperatura ambiente
por 15 min, se lavaron con agua corriente y se cubrieron con una gota de solución -
montante (glicerina tamponada con fosfato pH 9,6) y con un cubreobjeto. Finalmente, se
observaron las células al microscopio óptico con un aumento de 400x y un filtro azul.
Una vez estandarizadas las condiciones de los protocolos y determinado el título de los
conjugados obtenidos (CENSA/C-Kure), por diluciones frente a células PK-15, inoculadas
con una multiplicidad de infección de 0,001 DICT50/célula, y no infectadas, se evaluaron la
especificidad y sensibilidad analíticas y la estabilidad de los conjugados (ver acápite
3.1.7).
Para evaluar la especifidad analítica de los conjugados, se enfrentaron a antígenos
laminares de los virus de la encefalomiocarditis, de la enfermedad de Aujeszky, de la
diarrea viral bovina y de la peste porcina africana. Para determinar la sensibilidad analítica,
se utilizaron los conjugados frente a antígenos laminares de células PK-15 infectadas con
multiplicidad de infección decreciente de la cepa Alfort.
Para evaluar la estabilidad de los conjugados (ver acápite 3.1.7) se ensayaron mensualmente
tres muestras de conjugado por lote, almacenados entre 4 o C-8 o C y a -20ºC en el caso de
los fluorescentes, y a -20 o C en el caso de los enzimáticos.
3.2.3. Evaluación de criterios sobre el desempeño de los ensayos: Se evaluó la
capacidad del ensayo de IFD para detectar antígenos virales en 10 muestras de
amígdalas de cerdos experimentalmente infectados (ver acápite 3.1.6). Estas muestras
fueron evaluadas paralelamente por un ensayo de ELISA (Rhône-Mérieux, Francia) para
la detección de antígenos.

La sensibilidad y especificidad diagnósticas relativas de ambos ensayos se evaluaron frente a
un conjugado fluorescente policlonal específico de referencia (CISA-INIA/Valdeolmos, Madrid,
España) en células infectadas por diferentes cepas/aislados y en cortes por congelación de
órganos de animales que presentaron signos clínicos y lesiones compatibles con PPC y de
animales procedentes de una piara no vacunada y sin historia de la enfermedad.
La repetibilidad del ensayo (ver acápite 3.1.7) se evaluó con 10 muestras de cortes de
órganos positivas y 10 negativas por triplicado, durante tres días.
3.3. Aislamiento viral.
El procedimiento de aislamiento viral se estableció básicamente de acuerdo a Terpstra,
1996, con modificaciones orientadas a optimizar las condiciones del ensayo.
3.3.1. Preparación de los cultivos celulares: Se preparó una suspensión de
células PK-15 a una concentración de 2 x 10 6 células/mL en medio MEM de
crecimiento y se dispensó 1 mL de la misma por tubo de cultivo celular con y sin
cubreobjetos.
3.3.2. Inoculación de los cultivos celulares: Se evaluaron dos procedimientos de
inoculación de la muestra - preparada según se describe en el acápite 3.1.4. - en los
cultivos celulares, con vistas a facilitar el revelado posterior de la multiplicación viral. Por
una parte, se inocularon directamente 0,2 mL de muestra/tubo de cultivo, sobre células

ecién sembradas en tubos sin cubreobjetos y por otra, se inoculó de igual forma y en
las mismas condiciones, pero en tubos con cubreobjetos. Cinco tubos no se inocularon
para emplearlos como controles.
La incubación de los cultivos celulares se realizó a 37ºC y se evaluó la multiplicación
viral a diferentes tiempos, entre 24 y 96 horas post-inoculación.
3.3.3. Evaluación de la multiplicación viral: Transcurrido el tiempo de incubación los
cubreobjetos son lavados dos veces con PBS y fijados con acetona fría (calidad
reactivo) por 10 min, mientras que las células procedentes de los tubos sin
cubreobjetos, son preparadas como antígenos laminares según se describe en el
acápite 3.1.5.
Los antígenos virales son detectados por IFD según se describe en el acápite 3.2.2.
3.4. Transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-
PCR).
3.4.1. Obtención de ARN: Con el propósito de optimizar la extracción de ARN se
evaluaron dos métodos de extracción. Para esto, se partió de la cepa Alfort (título 10 5
DICT50/mL), de la que se realizaron diluciones seriadas base 10 en medio MEM de
mantenimiento o en extractos de bazo de cerdos sanos, preparados según se describe en
el acápite 3.1.4. Para ambos métodos se tomaron 500 µL de cada dilución, que se
incubaron, en el caso de los extractos de órganos, con SDS 0.2 % y proteinasa K 0.1
mg/mL (concentraciones finales) a 56ºC por 25 min.
En el primer método, se extrajo el ARN con igual volumen de fenol saturado con buffer
citrato 100 mM pH 4,0 : cloroformo (vol/vol), luego de mezclar en vortex por 1 min y
centrifugar a 13 000 g por 5 min a 4ºC, se tomó la fase acuosa, a la que se le agregó 1/10

del volumen final de TNE (Tris 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5mM, pH 8,0) y se
precipitó con dos volúmenes de etanol absoluto a -20ºC toda la noche, se centrifugó y el
precipitado se resuspendió en 10 µL de agua desionizada libre de ARNasa. El ARN se
utilizó directamente o se conservó a -80°C.
En el segundo método, se extrajo el ARN con igual volumen de fenol saturado con tampón
TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) y dos fenolizaciones más, con una solución de fenol
saturado con tampón TE : cloroformo (vol:vol), alcohol isoamílico (1 %) y hidroxiquinoleína
(1 mg/mL), se mezcló en vortex por 1 min y se centrifugó a 13 000 g por 5 min a 4ºC. La
fase acuosa se trató con igual volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (49:1), se
precipitó, se resuspendió y se conservó de igual forma que en el método anterior
(Rodríguez y col., 1992).
El ensayo de comparar ambos procedimientos, se realizó a partir de diluciones de la cepa
Alfort titulada, en un extracto de bazo sano por triplicado.
3.4.2. Cebadores: La pareja de cebadores para la detección de todas las especies virales
dentro del género Pestivirus (Pest1-Pest2) se tomó de la literatura (Wirz, B. y col., 1993) y
corresponde a la región 5' no codificante del genoma viral. La pareja de cebadores capaz
de detectar específicamente el virus de PPC fue diseñada a partir del alineamiento de dos
cepas de PPC: Alfort (Meyers y col., 1989) y Brescia (Moorman y col., 1990) y tres de
BVD: Osloss (Renard y col., 1987), NADL (Collett y col., 1988b) y SD1 (Deng y Brock,
1992) con el paquete de programas GCG (Devereux y col., 1984) y el programa Hint PCR
(Dopazo y Sobrino, 1993), a partir de establecer la búsqueda en las regiones que fueran
altamente conservadas entre las cepas de PPC y altamente divergentes entre las cepas
de PPC y BVD. Entre los pares de cebadores suministrados por el programa se
seleccionó una pareja (PPC1-PPC2) correspondiente al gen putativo de la polimerasa
(NS5B).

3.4.3. Desarrollo y Estandarización: Una vez estandarizados las concentraciones de los
reactivos y los parámetros de la reacción, se estableció el ensayo como se describe a
continuación.
Se emplearon 2,5 µL de ARN como material de partida para la reacción de amplificación,
que combinó la transcripción reversa del ARN seguida de la amplificación con Taqpolimerasa,
en un solo tubo de reacción. Se realizó un paso previo de calentamiento a
90°C durante 5 min con enfriamiento rápido en hielo por 5 min que contribuyó a exponer
el genoma viral, luego se incubó en 94 µL de una mezcla de Tris 10 mM pH 8,3, KCl 50
mM, MgCl 1,5 mM, gelatina 0,01 %, dithiotreitol 10 mM y deoxinucleósido trifosfato 5 mM
de cada uno. Se le agregó 1 µL (40 U) de inhibidor de ribonucleasa de placenta humana
(HPRI), 1 µL (200 ng) del cebador antisentido y 0,5 µL (10 U) de transcriptasa reversa del
virus de la mieloblastosis aviar (Seikagaku America, Inc.). Después de 40 min a 42ºC, se
añadieron a la reacción 1 µL (200 ng) del cebador sentido, 0,5 µL (2,5 U) de Taq-
Polimerasa (Perkin-Elmer) y dos gotas de aceite mineral (Sigma).
Las muestras fueron amplificadas por un programa que incluyó primero, una incubación a
94°C por 2,5 min seguida por, 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 15 seg,
alineamiento a 58°C por 30 seg, extensión a 72°C por 30 seg y, una extensión final a
72°C por 10 min en un termociclador (MJ research, Inc.).
Los productos de la RT-PCR fueron analizados por electroforesis en agarosa al
2 % en TBE (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) con 0,5 µg/mL de bromuro de
etidio, se utilizó el marcador de peso molecular V pBR322 DNA HaeIII (Bœrinhger-
Mannheim, GmbH-Germany) como patrón.
Para confirmar la especificidad del fragmento de amplificación obtenido, se determinó la
secuencia de nucleotidos del producto obtenido de la amplificación de los ARN de las
cepas Alfort y Ames (ver acápite 3.1.8).

Para definir la sensibilidad analítica del ensayo de RT-PCR en sobrenadantes de cultivos
celulares infectados, se realizaron diluciones seriadas base 10 de la cepa Alfort con título
conocido, en medio de cultivo. Para ello se partió de ARN extraído de cada dilución de la
suspensión viral.
Por otra parte, para determinar la sensibilidad analítica del ensayo realizado a partir de
extractos de órganos, se infectó experimentalmente un extracto de órgano negativo a PPC
con una suspensión de la cepa Alfort de título conocido y se realizaron diluciones base 10
en este extracto, de cada una de las cuales se realizó la extracción del ARN.
Para evaluar la especificidad analítica se empleó como molde de la reacción de RT-PCR,
ARN extraído de cepas/aislados de PPC y BVD.
3.4.4. Evaluación de criterios sobre el desempeño del ensayo: Para evaluar la
sensibilidad y especificidad diagnósticas relativas se empleó el ensayo de RT-PCR frente
a la IFD, en un total de 25 extractos de órganos, procedentes de animales sacrificados por
presentar signos clínicos y lesiones compatibles con PPC, y 7 de animales procedentes de
una piara no vacunada y sin historia de la enfermedad. Para ello se emplearon tres tipos
de órganos diferentes, amígdala, bazo y ganglio linfático.
Además, para evaluar el potencial del procedimiento como instrumento para el diagnóstico
en animales vivos, se analizaron muestras de suero y buffy coat provenientes del
experimento descrito en el epígrafe 3.1.5. Estos resultados fueron comparados con los
obtenidos a través de un ensayo de ELISA (Rhône-Mérieux, Francia), para la detección
de antígenos del virus de la PPC, en estas muestras.
La repetibilidad del ensayo (ver acápite 3.1.5) se evaluó con 10 muestras de ARN,
extraído a partir de sobrenadantes de cultivo de células infectadas con el virus de la PPC y

no infectadas, y 10 extractos de órganos de cerdos con resultados positivos y negativos
previos, por triplicado cada día durante tres días.
3.5. Neutralización de la peroxidasa (NPLA).
3.5.1. Desarrollo y Estandarización: El ensayo se estandarizó según describe Terpstra,
1996, para esto se emplearon como muestras tres sueros hiperinmunes
(ver acápite 3.2.1), y tres sueros negativos procedentes de una unidad donde no se
vacuna ni se ha presentado la enfermedad. Brevemente, se diluyeron los sueros 1:25 en
medio de crecimiento, en placas de poliestireno estériles de fondo plano para un volumen
final de 50 µL, se añadieron 50 µL de suspensión viral de la cepa Alfort ajustada a 100
DICT50 /50 µL en medio de crecimiento, se incubó a 37ºC por 1 hora en atmósfera húmeda
con 5 % de CO2.
Transcurrido este tiempo, se añadieron a todos los pozos 50 µL de células PK-15
ajustadas a 5 x 10 5 células/mL en medio de crecimiento y se incubó en las condiciones
anteriormente descritas por 48 horas. Se retiró el medio de las placas, se lavaron las
células con PBS y finalmente se secaron a 80ºC, por una hora y media.
Una vez secas las placas para el revelado de la reacción se usó, durante la fase de
estandarización, un suero de cerdo hiperinmune contra PPC de referencia (INIA, España),
diluido 1/100 en PBS-Tween 20 al 0,05 % (PBS-T), se incubó por 1 hora a 37ºC en
cámara húmeda, luego se retiró, se lavaron las células tres veces con PBS-T y se
añadieron 50 µL/pocillo del conjugado Proteína A - Peroxidasa (Sigma), diluido 1/1 000 en
PBS-T y se incubó una hora en las mismas condiciones. Al concluir la incubación se lavó
dos veces con PBS-T y una vez con PBS. Se adicionó la solución de sustrato-cromógeno
(peróxido de hidrógeno y AEC) que se incubó a temperatura ambiente por 15 min.
Finalmente, se frenó la reacción retirando el sustrato y añadiendo 50 µL/pocillo de PBS, y
se observó al microscopio o visualmente la tinción de la monocapa celular.

Una vez estandarizadas las condiciones del ensayo se evaluaron los sueros hiperinmunes
obtenidos, se titularon para usarlos como suero detector, se escogió el de mayor título y se
evaluaron las siguientes modificaciones: sustitución del sistema de revelado indirecto -
suero detector / Proteína A – Peroxidasa (Sigma) - por el conjugado específico de la
inmunoperoxidasa directa (CENSA/C-kure) para acortar el ensayo una hora; conjugado
anti-IgG de cerdo (CENSA/ C-kure) / Peroxidasa en lugar de Proteína A - Peroxidasa;
dilución más adecuada de las muestras para lograr la detección de los sueros débiles
positivos; empleo de las células PK-15, en monocapa o recién sembradas, para tratar de
acortar el ensayo 24-48 horas. Todas estas modificaciones se evaluaron utilizando 10
sueros positivos y 10 negativos.
Se evaluó la especificidad analítica del ensayo con 60 sueros de bovino reactores por
seroneutralización a dos cepas de BVDV (NADL y Oregon).
3.5.2. Evaluación de criterios sobre el desempeño del ensayo: Se evaluaron la
sensibilidad y especificidad diagnósticas (ver acápite 3.1.7) con 70 sueros de cerdo
experimentalmente infectados (ver acápite 3.1.6) y 20 sueros negativos de estos animales
antes de ser infectados, los cuales provenían de madres no vacunadas de piaras sin
historia de la enfermedad. Estos sueros fueron además evaluados por un ELISA para la
detección de anticuerpos a pestivirus (Rhône- Mérieux, Francia).
Se evaluaron la sensibilidad y especificidad diagnósticas relativas (ver acápite 3.1.7) frente
a dos juegos de ELISA comerciales, uno para la detección de anticuerpos específicos al
virus de la PPC, CEDITEST-CTB/ELISA, ID-DLO, Holanda, con 30 sueros de cerdo y
otro para la detección de anticuerpos a pestivirus, CIVTEST HC/PPC, HIPRA, S.A.,
España, frente a 225 sueros de cerdo. Los sueros de cerdo empleados correspondían a
animales de diferentes edades y provenían de una piara vacunada y otra no vacunada.
Para evaluar la repetibilidad (ver acápite 3.1.7), se utilizó la forma indirecta de revelado
que incluye suero detector /Proteína A (Sigma), con 40 sueros de cerdos positivos (hijos

de madres vacunadas) y 40 sueros de cerdos negativos provenientes de una piara no
vacunada y sin historia de la enfermedad, por triplicado repetidos durante tres días.
3.5.3. Análisis de correlación: Para medir la posible relación entre los resultados del
ELISA (Rhône-Mérieux, Francia) para determinación de anticuerpos y del NPLA, se
calculó el coeficiente de correlación lineal entre los valores brindados por ambos ensayos,
a través del programa de computación Microsoft ® Excel 97.
3.6. Caracterización genómica de aislados y análisis filogenético.
3.6.1. Virus: Datos acerca de las cepas y aislados que se emplearon en este estudio se
presentan en la Tabla 1.
3.6.2. RT-PCR: Para la obtención de la banda a secuenciar se empleó la pareja de
cebadores descrita por Lowings y col., 1996, para amplificar una región de 230 pb del
producto E2 correspondientes a los nucleotidos 2467-2486 y 2716-2738 de la cepa Alfort.
Se emplearon 2 µL de ARN como material de partida para las amplificaciones de RT-
PCR. Brevemente, el ARN se incubó en 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl,
0.01 % gelatina, 10 mM dithiotreitol, 100 M de cada deoxinucleósido trifosfato, 40 U de
inhibidor de ribonucleasa de placenta humana, 200 ng del cebador antisentido y 10 U de
transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar (Seikagaku America, Inc.), en un
volumen final de 100 µL. Después de 40 min a 42ºC, se añadieron a la reacción 200 ng del
cebador sentido, 2,5 U de Taq-Polimerasa (Perkin-Elmer) y dos gotas de aceite mineral
(Sigma). Las muestras fueron amplificadas según el programa indicado por Lowings y col.,
1996.
3.6.3. Secuenciación: La secuenciación de ácidos núcleicos se realizó según se describe
en el acápite 3.1.8.

3.6.4. Análisis de computación: Se realizó el alineamiento de secuencias usando el
programa de alineamiento múltiple de secuencias CLUSTAL V (Higgings y col., 1992). El
árbol filogenético fue construido con el programa de computación Windows Easy Tree
(Dopazo y Sobrino, 1993). El método empleado fue NEIGHBOR-JOINING (Saitou y Nei,
1987).
4. RESULTADOS Y DISCUSION
4.1. Inmunofluorescencia e Inmunoperoxidasa directas.
4.1.1. Obtención de conjugados: El título medio de los sueros hiperinmunes obtenidos
fue de 1: 800 por NPLA, lo que coincide con los resultados de Correa, (1991), quien
empleó un esquema de inmunización similar con resultados satisfactorios. El título de los 5
lotes de conjugado fluorescente y 3 lotes de conjugado enzimático producidos fue de 1:16
y 1:50 respectivamente.
4.1.2. Desarrollo y Estandarización: En la optimización de las condiciones del ensayo de
IFD, los parámetros más importantes de la reacción resultaron ser la temperatura y el tiempo
de incubación del conjugado fluorescente que se establecieron finalmente a 37ºC durante 1
hora, ya que a pesar de que en 30 min se obtenía una fluorescencia específica e intensa en
las células infectadas y no se observaba tinción de fondo en las células no infectadas, tal y
como reportan otros autores (Dinter, 1989; Coba y Correa, 1993), las muestras con menor
número de células infectadas requerían un tiempo de incubación mayor que se estableció en

1 hora, con lo que aumentó la sensibilidad de la técnica. El procedimiento de IFD quedó
establecido finalmente como se muestra en la figura 1.
Luego de estandarizado el procedimiento se observó una fluorescencia verde brillante en
el citoplasma de las células infectadas, mientras que los núcleos no fluorescían (figura 2).
En la figura 3 se observan células fluorescentes en una sección positiva de un corte por
congelación de bazo de cerdo infectado por el virus de la PPC.
Figura 1. Esquema del procedimiento de IFD.
Figura 2. Células PK-15 fluorescentes infectadas por la cepa Alfort.
Figura 3. Células fluorescentes en corte por congelación de bazo de cerdo infectado por
el virus de la PPC.
En la estandarización de las condiciones del ensayo de IPD, se determinó que en cuanto
a:
♦ El tratamiento previo de los cortes de tejidos con una solución de peróxido de
hidrógeno, para consumir la actividad de peroxidasa endógena que puede estar
presente en los tejidos animales, no mostró diferencias entre las muestras tratadas y
no tratadas, por lo que no se incluyó en el procedimiento. La actividad de peroxidasa
endógena aparece con preferencia en la secresión de las mucosas y en las células
inflamatorias (Dinter, 1989) y provoca tinción no específica en ensayos de
inmunoperoxidasa. En la detección de este virus a partir de cortes de muestras de
órganos no se reportan inconvenientes por actividad de peroxidasa endógena
(Terpstra, 1996) lo que coincide con estos resultados.
♦ Los diferentes diluentes del conjugado. Al emplear OVA al 1 % en PBS se reducía
considerablemente la tinción de las células con relación al empleo del PBS y el TBS.

Se determinó el uso del PBS como diluente del conjugado porque con el mismo se
obtenía la coloración más fuerte en las células infectadas.
♦ Las condiciones de temperatura y el tiempo de incubación del conjugado enzimático.
La mejor tinción de las células infectadas con el fondo más bajo para las células no
infectadas empleadas como control negativo se obtuvo al incubar las muestras con el
conjugado durante 1 hora a 37ºC. Como ha sido reportado (Terpstra, 1996) para este
virus.
♦ Los cromógenos evaluados. El cromógeno AEC produjo la tinción más intensa en las
células infectadas.
El procedimiento de IPD quedó establecido finalmente como se resume en la figura 4.
Los conjugados enzimáticos mostraron una tinción de color rojo en el citoplasma de las
células de cultivo infectadas (figura 5).
Los conjugados fluorescentes y enzimáticos no demostraron reactividad frente a las cepas
virales heterólogas: encefalomiocarditis, enfermedad de Aujezky y peste porcina africana y
sí una débil reacción frente al virus de la diarrea viral bovina. El resultado, obtenido en el
caso de este último virus, corresponde a lo reportado en la literatura con relación a la
reacción cruzada que presentan los virus de la PPC y la BVD en este tipo de ensayos
(Moennig y Plagemann, 1992).
Figura 4. Ensayo de IPD sobre células PK-15 infectadas con la cepa Alfort del virus de la
PPC.
La especificidad analítica demostrada por estos conjugados los hace confiables en la
detección de pestivirus, ya que no hay interferencias con los virus de cerdos más

frecuentes en nuestro medio, ni con el virus de la peste porcina africana agente causal de
esta grave enfermedad exótica, sobre la que se mantiene una constante vigilancia
epizootiológica.
Figura 5. Esquema del procedimiento de IPD.
Los conjugados fluorescentes y enzimáticos mostraron una elevada sensibilidad analítica
al ser capaces de detectar hasta 5,6 DICT50 del virus de la PPC, lo cual resulta más que
satisfactorio para la identificación de las infecciones agudas en las que aparecen elevados
niveles de virus en sangre y por tanto en otros tejidos (Liess, 1987).
Los conjugados policlonales fluorescentes y enzimáticos para la detección de antígenos
del virus de la PPC resultaron estables hasta los 12 meses de fabricados a –20ºC y hasta
los 6 meses entre 4 y 8ºC.
4.1.3. Evaluación de criterios sobre el desempeño de los ensayos: Las 10 muestras
de amígdalas del experimento de infección (ver acápite 3.1.6.), consideradas como
verdadero positivas, evaluadas por IFD y por un ensayo de ELISA comercial (Rhône-
Mérieux, Francia) para la detección de virus resultaron positivas. Los resultados
concordaron por ambos ensayos que además, demostraron ser capaces de detectar el
virus vacunal y mostraron su presencia en el animal al menos hasta 24 días después de la
vacunación. Por lo tanto, se propone que para el diagnóstico deben tomarse muestras de
animales con más de 30 días de vacunados.
La sensibilidad y especificidad diagnósticas relativas de los conjugados fluorescentes
obtenidos frente al conjugado fluorescente de referencia (CISA-INIA/Valdeolmos, Madrid,
España) fue de 100% en 10 muestras de cultivos de células PK15 infectadas con cepas y
aislados del virus de la PPC y 5 de células de cultivo no infectadas, además de en 160
cortes por congelación de órganos procedentes de 90 casos clínicos de PPC y en 60 de
cerdos aparentemente sanos.

Los conjugados enzimáticos mostraron un 100% de sensibilidad y especificidad
diagnósticas relativas frente al conjugado fluorescente de referencia en 7 muestras de
cultivos de células PK15 infectadas con cepas y aislados del virus de la PPC y en 5 de
células de cultivo no infectadas, además de 75 cortes por congelación de órganos
procedentes de 25 casos clínicos de PPC y 24 cortes por congelación de órganos de
cerdos aparentemente sanos.
La IFD y la IPD comparten el mismo principio: la detección de antígenos en células
infectadas por técnicas de inmunotinción. De ahí la concordancia en los resultados de
sensibilidad y especificidad obtenidos.
Los ensayos inmunohistoquímicos son ampliamente empleados en el diagnóstico (Dinter,
1989) ya que combinan la sensibilidad de las técnicas histológicas con la especificidad de
las técnicas inmunológicas.
Los conjugados fluorescentes han permitido establecer el diagnóstico primario en 4 032
muestras de cortes por congelación de órganos de cerdos y en más de 80 aislados virales
en células en cultivo, al emplear la IFD para el diagnóstico primario de PPC durante la
epizootia de esta enfermedad que nos afecta desde el año 1993. Estos conjugados han
sido empleados además para titular cepas y aislados del virus de la PPC.
La repetibilidad de ambos ensayos fue de 100% para todas las muestras evaluadas.
Ambos ensayos demostraron ser rápidos, sencillos y fáciles de realizar tanto para la
detección del virus de la PPC en muestras de órganos de animales afectados como para
revelar la presencia de antígenos virales en células de cultivo infectadas.
Estos procedimientos inmunohistoquímicos, brindan la posibilidad de realizar un
diagnóstico primario, económico, sencillo, rápido, sensible y específico a partir de
muestras de órganos in situ y permiten identificar con rapidez los virus crecidos en
cultivos celulares, lo que es imprescindible por tratarse de virus no citopatogénicos. Sin

embargo, no son útiles para el diagnóstico en animales vivos, requisito indispensable para
la detección de cerdos persistentemente infectados, que constituyen el principal reservorio
del virus (Van Oirschot, 1988), ni para la detección de infecciones de PPC crónicas ya que
son interferidos por los anticuerpos específicos contra el virus presentes en estos casos
(Liu y col., 1991).
4.2. Aislamiento viral.
En la estandarización de las condiciones del ensayo de aislamiento viral, se determinó que
en cuanto a:
♦ Los métodos para la homogenización de las muestras de órganos. El homogenizador
eléctrico producía la mejor disgregación de las células del tejido, sin embargo,
presentaba el inconveniente práctico de que a pesar de la desinfección de la barra
realizada entre muestra y muestra, las mismas podían ser contaminadas unas con
otras, por lo que se decidió emplear el homogenizador de vidrio, con el cual se obtenía
una buena homogenización del tejido y era posible disponer de un homogenizador
estéril para cada muestra.
♦ Los métodos para evitar la contaminación de los cultivos celulares. La filtración mostró
ser el único procedimiento capaz de asegurar la esterilidad en todas las muestras
evaluadas. El tratamiento con antibióticos se reporta como suficiente para asegurar la
esterilidad de los cultivos (Terpstra, 1996), sin embargo, se demostró que en nuestro
medio con elevadas condiciones de temperatura y humedad, es indispensable filtrar las
muestras.
♦ Los procedimientos para facilitar el revelado de la multiplicación viral. La preparación y
el empleo de los antígenos laminares, para la identificación del virus por métodos
inmunohistoquímicos, resultó ser menos laboriosa y de más fácil ejecución que la
manipulación de los cubreobjetos, que fue engorrosa y consumió mucho tiempo.

♦ El tiempo de incubación de las células de cultivo una vez inoculadas, en que se obtenía
con mayor consistencia una fluorescencia específica e intensa de las células
infectadas era de 48 horas. Esto coincide con lo reportado por Terpstra, 1996 que
indica que, las muestras deben ser procesadas entre 24 y 72 horas después de haber
sido inoculadas.
El virus aislado se detectó a través de ensayos inmunohistoquímicos de
inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa directas y de transcripción reversa acoplada a la
reacción en cadena de la polimerasa.
Las condiciones finales establecidas para el aislamiento viral se muestran en la figura 6.
De las 100 muestras procesadas para aislamiento viral se obtuvieron 39 aislados,
identificados como pestivirus por IFD e IPD; 35 fueron evaluados, para el diagnóstico
diferencial con pestivirus, con un panel de anticuerpos monoclonales (CVL- Weybridge,
UK) y fueron identificados como virus de la PPC. La RT- PCR fue útil para identificar los
aislamientos a partir de sobrenadantes de cultivo y esto se confirmó en los 13 aislados
evaluados, previamente identificados por anticuerpos monoclonales.
Figura 6. Esquema del aislamiento viral en cultivos celulares.
4.3. Transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa.
4.3.1. Obtención de ARN: Dentro de la estandarización de las condiciones del ensayo
de RT-PCR, el procedimiento de extracción del ARN constituye un paso muy
importante (Vilçek y col., 1994), sobre todo, cuando se parte de muestras clínicas, por
la elevada actividad de ribonucleasas endógenas y la concentración variable del virus.

La relativa pureza e integridad del ARN aislado son críticas para su uso efectivo como
molde en este tipo de ensayo.
El tratamiento con proteinasa K en presencia de detergente previo al aislamiento del ARN
demostró ser crítico, sobre todo, cuando se trabaja con muestras clínicas, en las cuales
se requiere una efectiva desnaturalización de los complejos de nucleoproteínas unido a la
inactivación de la actividad de ribonucleasas endógenas que se liberan con la disrupción
de los tejidos y las células.
La figura 6 muestra el fragmento de 174 pb obtenido por amplificación en RT-PCR a partir
del ARN aislado de las diferentes diluciones del virus de título conocido, por ambos
métodos de extracción de ARN evaluados. Al emplear como molde de la reacción el ARN
extraído a partir de una suspensión de la cepa Alfort, diluida en extracto de bazo no
infectado, la dilución mayor que resultó en una amplificación positiva correspondió a 2
DICT50 por el primer método descrito, mientras que, por el segundo método fue de 20
DICT50.
En un intento por mejorar la sensibilidad del ensayo a partir de muestras clínicas, mientras
se asegura un protocolo rápido y fácil, se empleó un juego comercial para el aislamiento
de ARN (TriPureIsolation Reagent, Boehringer Mannheim). Sin embargo, la sensibilidad
del ensayo no aumentó al emplear este procedimiento basado en el método desarrollado
por Chomczynski y Sacchi, (1987).
A partir de estos resultados, se adoptó como método de extracción de ARN el primer
método descrito, que consta de un solo paso de extracción con fenol-cloroformo y
posterior precipitación en etanol. La mayor sensibilidad analítica obtenida por este
procedimiento puede estar relacionada con el hecho de que en el mismo se emplea un
tampón de pH ácido para saturar el fenol, lo que permite que a partir de muestras con
pequeñas cantidades de ARN y altos niveles de ARNsas endógenas haya pérdidas
mínimas de ARN (Sambrook y col., 1989), por otra parte, la sencillez del procedimiento

con un solo paso de extracción reduce la pérdida de ARN que se incrementa con el
número de pasos involucrados en el protocolo de purificación.
El procedimiento, que tiene la ventaja de que se realiza en un solo tubo de reacción, es
fácil de realizar con pequeñas cantidades de muestras clínicas o cultivos celulares y
permite procesar múltiples muestras. El empleo de un simple paso de extracción
fenol/cloroformo, resulta más económico, simplifica el procedimiento, posibilita brindar un
diagnóstico más rápido y expone menos al personal del laboratorio a estas sustancias
tóxicas, al eliminar la necesidad de realizar pasos de extracción selectiva en solventes
orgánicos (Chomczynski y Sacchi, 1987) que alargan el proceso.
4.3.2. Cebadores: La aplicación del programa Hint PCR en la búsqueda de las regiones
conservadas del genoma del virus de la PPC, que además, divergieran del genoma del
BVDV, permitió identificar varios pares de cebadores, de ellos, sobre la base de la
eficiencia de amplificación empleando un programa de amplificación general, se
seleccionaron dos oligonucleotidos: PPC1/PPC2, de los que se predijo que amplificaban
un fragmento de ADN de 174 pb dentro del gen correspondiente a la proteína noestructural
NS5B. Los datos acerca de la pareja de cebadores diseñada se muestran en
la Tabla 2.
Tabla 2. Cebadores genotipo-específico usados para la amplificación por
RT-PCR del ARN del virus de la PPC.
Cebador Secuencia
PPC1
Sentido
(5'-3')
CCTGAGGACCAAACACATGTTG
Posición
Genoma a
10.230-10.251
Talla
producto
(pb)
174

PPC2
Antisentido
TGGTGGAAGTTGGTTGTGTCTG 10.403-10.382
a La numeración de los nucleotidos corresponde a la secuencia de la cepa Alfort del virus
de la PPC (Meyers y col., 1989).
Estos cebadores fueron seleccionados solo sobre la base de la homología de secuencia
de ácidos nucleicos a lo largo de todo el genoma viral sin tomar en cuenta las regiones
codificantes de proteínas, a diferencia de otros autores que han centrado la búsqueda
de cebadores capaces de establecer una detección diferencial de pestivirus en regiones
codificantes de proteínas descritas como de baja homología entre las cepas del virus de
la PPC y el BVDV (Katz y col., 1993), con lo cual se reducen las posibilidades de
encontrar parejas de cebadores eficientes solo a estas regiones. La pareja de
cebadores para la detección general de pestivirus está reportada y extensivamente
evaluada por Wirz, B. y col. (1993) y corresponde a la región 5' no codificante del
genoma viral, la cual es altamente conservada entre las cepas virales.
4.3.3. Desarrollo y Estandarización: Como parte de la estandarización del ensayo de
RT-PCR, se establecieron las condiciones del programa de amplificación general,
previamente empleado, que requirió ser optimizado para que los fragmentos de
amplificación pudieran ser consistentemente visualizados con ambas parejas de
cebadores. El parámetro más importante de la reacción demostró ser la temperatura de
alineamiento, que se seleccionó finalmente a 58°C, la cual está 8ºC y entre 6 y 4ºC por
debajo de las temperaturas de fusión de las parejas de cebadores PPC1/PPC2 y
PEST1/PEST2, respectivamente. Las condiciones del ensayo fueron optimizadas,
resultando en un programa con 35 ciclos de amplificación, idéntico para ambas parejas de
cebadores, lo que está relacionado con la similitud en las temperaturas de fusión, 66ºC
para PPC 1-2, 64ºC para PEST1 y 62ºC para PEST2, y con el hecho de que las
longitudes de los productos amplificados en ambos casos no difieren demasiado, 174 pb y
74 pb para PPC1/PPC2 y PEST1/PEST2 respectivamente. El ensayo se realiza en

presencia de inhibidores de ARNsas (HPRI) y todos los procedimientos son realizados en
hielo, lo que disminuye significativamente la velocidad de degradación del ARN.
Una vez optimizados los parámetros de amplificación se obtuvieron resultados
consistentes, con claras bandas visualizadas en geles de agarosa teñidos con bromuro de
etidio. Se confirmó la especificidad del fragmento de amplificación obtenido a partir de
ARN de las cepas Alfort y Ames por secuenciación de nucleotidos. En ambos casos, las
secuencias obtenidas correspondieron a aquellas del fragmento amplificado.
El ensayo consta de dos pasos, la generación de un ADNc a partir del ARN viral y la
posterior amplificación de este ADNc con Taq-polimerasa. Las dos reacciones son
combinadas en el mismo tubo de reacción, lo cual reduce significativamente el tiempo del
ensayo, disminuye los riesgos de contaminación y facilita el manejo de un mayor número
de muestras.
Al evaluar la sensibilidad analítica (ver acápite 3.1.7) se alcanzaron amplificaciones
positivas, cuando se utilizaron como material de partida diluciones de sobrenadantes de
células infectadas, correspondientes a 0,4 DICT50 o menores. Para estimar la sensibilidad
analítica del ensayo a partir de extractos de órganos, se exploró la capacidad del
procedimiento para amplificar ARN extraído de diluciones seriadas de la cepa Alfort en
extracto de bazo negativo. La mayor dilución que resultó en una amplificación positiva del
ARN viral correspondió a 2 DICT50. Estos resultados fueron idénticos para ambas parejas
de cebadores.
La sensibilidad en la detección del virus resultó elevada y adecuada para el diagnóstico ya
que detectó la presencia del virus en muestras de órganos. Por otra parte el nivel de
detección resultó el mismo para ambas parejas de cebadores, lo que puede estar
relacionado con el hecho de que la longitud del producto de amplificación es pequeña en
ambos casos, lo cual está a favor de una mayor sensibilidad en la detección (Innis y
Gelfand, 1990)

La sensibilidad analítica obtenida al emplear el protocolo de RT-PCR descrito parece ser
mayor que la reportada previamente (Wirz y col., 1993). Es de esperar que, el
procedimiento de extracción con fenol resultara en una exposición de las moléculas molde
más efectiva que la obtenida con el tratamiento por calor usado por Wirz y col., (1993). La
sensibilidad analítica del ensayo resultó mayor con el virus propagado in vitro que con el
ARN molde obtenido a partir de muestras de tejidos porcinos, la cual es una muestra más
contaminada y con mayor actividad de ribonucleasas endógenas.
La especificidad analítica (ver acápite 3.1.7) se estableció en sobrenadantes de cultivos
celulares infectados. La figura 7 muestra el fragmento de 74 pb obtenido con la pareja de
cebadores generales PEST1/PEST2, a partir de sobrenadantes de cultivos celulares
infectados con 7 cepas de referencia de pestivirus y utilizando como control negativo
sobrenadantes de células no infectadas. En la figura 8 se muestra el fragmento de 174
pb obtenido de la amplificación de tres cepas de referencia de PPC, con la pareja de
cebadores específica PPC1/PPC2, mientras que no se observaron productos de ADN en
los carriles correspondientes a tres cepas de referencia de BVDV y a sobrenadante de
células no-infectadas.
La especificidad analítica (ver acápite 3.1.7) de la amplificación fue, posteriormente,
analizada utilizando ARN extraído de 19 aislados de PPC (16 aislados de Cuba y 3 de
España). Se observó amplificación positiva de una banda de ADN de la talla esperada,
con todas las cepas/aislados de PPC evaluados (tabla 3). Además, no se observó
amplificación con el ARN de 4 cepas de referencia y vacunales de BVDV y 7 aislados de
campo de este virus (tabla 3). En todos los casos, la presencia de ARN en las muestras de
BVDV fue confirmada, ya que fueron eficientemente amplificados con los cebadores
PEST1 y PEST2 (Wirz y col., 1993). Estos resultados confirmaron la especificidad analítica
de la amplificación por RT-PCR, basada en el uso de los cebadores PPC1/PPC2.

Tabla 3. Amplificación por RT-PCR de ARN del virus de la PPC, usando los cebadores
PPC1 y PPC2, en sobrenadantes de células de cultivo infectadas.
Virus Cepa o Aislado a Amplificación b
PPC ALFORT +
PAV-250 +
AMES +
MARGARITA +
“C” +
157/93 +
198/93 +
34/96 +
38/96 +
41/96 +
95/96 +
146/96 +
167/96 +
253/96 +
14/97 +
15/97 +
Es1/97 c +
Es2/97 c +
Es3/97 c +
BVDV NADL -
OREGON -
SINGER -
MUCOSIFFA -
VC/96 -

Virus Cepa o Aislado a Amplificación b
GR1/96 -
GR2/96 -
GR3/96 -
GR4/98 -
GR5/97 -
GR6/97 -
a
Los diferentes virus analizados son indicados como sigue: Cepas de referencia y
vacunales, en negritas.
b
La detección de un fragmento de ADN de la talla esperada, 174 pb, por análisis de los
productos de reacción del RT-PCR en geles de agarosa, fue considerada como
amplificación positiva.
c
Virus aislados en España en 1997.
4.3.4. Evaluación de criterios sobre el desempeño del ensayo: En la tabla 4 son
comparadas las amplificaciones obtenidas por RT-PCR y los resultados de IFD
correspondientes, en muestras de órganos. Se alcanzaron amplificaciones positivas de
RT-PCR en todas excepto una de las 25 muestras de campo analizadas, mientras que,
la detección directa del virus de la PPC en órganos por IFD fue positiva solo en 22 de
las muestras evaluadas. La presencia del virus en las 2 muestras que fueron positivas
por RT-PCR (32/97 y 33/97) fue confirmada como positiva por aislamiento en células
PK-15, mientras que la muestra negativa por RT-PCR se mantuvo negativa por
aislamiento en cultivos celulares. Además, para confirmar la especificidad de este
ensayo, no se observó amplificación en muestras de animales no-infectados. Del
análisis de estos resultados el ensayo de RT-PCR muestra una especificidad
diagnóstica relativa del 100 %, mientras que demostró mayor sensibilidad diagnóstica
relativa que la IFD en cortes por congelación de órganos.
Se compararon los resultados obtenidos por el ensayo de RT-PCR y por un ensayo de
ELISA (Rhône-Mérieux, Francia) para la detección de antígeno del virus de la PPC en
muestras de suero y buffy coat de cerdos vacunados (tabla 5) (ver acápite 3.1.6). Del

total de muestras dos resultaron positivas y dos negativas por ambos ensayos. Otras
dos muestras fueron detectadas como dudosas (buffy coat 65 y 69) por el ELISA debido
a que, probablemente, luego de transcurridos 21 días de la vacunación la concentración
del antígeno viral detectado comienza a disminuir y cae en la zona gris del ensayo. Sin
embargo, el RT-PCR fue capaz de determinar que una de estas muestras (65) era
positiva y la otra (69) negativa.

Tabla 4. Amplificación por RT-PCR de ARN del virus de la PPC en muestras de
órganos de cerdos infectados naturalmente.
Código Organo RT-PCR amplificación IFD
INFECTADOS
253/96 Bazo + +
169/96 Ganglio + +
121/95 Bazo + +
168/96 Ganglio + +
164/96 Amígdala + +
165/96 Bazo + +
192/96 Bazo + +
163/96 Bazo + +
110/96 Bazo + +
141/96 Bazo + +
185/96 Bazo + +
199/96 Amígdala + +
125/95 Amígdala + +
275/96 Bazo + +
281/96 Bazo + +
14/97 Bazo + +
85 Bazo + +
88 Bazo + +
1-67 Bazo + +
2-62 Bazo + +
25-2/97 Bazo + +
25-M/97 Bazo + +

32/97 Bazo + + a
33/97 Bazo + + a
34/97 Bazo - -
NO-INFECTADOS
68/96 Bazo - -
77/96 Bazo - -
78/96 Amígdala - -
26/96 Amígdala - -
106/96 Bazo - -
35/96 Bazo - -
34/97 Bazo - -
a Estas muestras fueron negativas por IFD, cuando se evaluaron directamente en
cortes de órganos, sin embargo resultaron positivas por IFD después de un pase en
células PK-15.
Tabla 5. Amplificación por RT-PCR de ARN del virus de la PPC en muestras de suero y
buffy coat de cerdos de un experimento de infección
Muestra RT-PCR
ELISA
(Rhône-
Mérieux)
Suero 11 (0 DPV*) - ND**
Suero 39 (0 DPV) - ND
Suero 92 (0 DPV) - ND
Suero 97 (0 DPV) - ND

* Días post-vacunación
** No determinado
Suero 58 (4 DPV) + +
Suero 69 (4 DPV) + +
Suero 11 (7 DPV) + ND
Suero 39 (7 DPV) + ND
Suero 92 (7 DPV) + ND
Suero 97 (7 DPV) + ND
Buffy
DPV)
coat 65 (21
Buffy
DPV)
coat 69 (21
Buffy
DPV)
coat 93 (30
Buffy
DPV)
coat 94 (30
+ Dudoso
- Dudoso
- -
- -
Aunque el número de muestras evaluadas es pequeño la concordancia de los
resultados preliminares obtenidos por ambos ensayos nos habla a favor de la
sensibilidad y especificidad del RT-PCR al emplear muestras obtenidas de animales
vivos e incluso el RT-PCR se mostró capaz de discernir entre muestras que resultan
dudosas por ELISA. Ambos ensayos demostraron ser capaces de detectar el virus
vacunal. Estos resultados coinciden con los de Vanderhallen y Koenen, (1987), que al
comparar varios métodos para la detección del virus de la PPC encontraron más

sensible y específico el ensayo de RT-PCR con relación al ELISA para la detección de
antígeno.
Los ensayos de RT-PCR para el diagnóstico de pestivirus en cerdos han estado
orientados a la detección de estos virus en sobrenadantes de cultivos celulares y
muestras de órganos fundamentalmente (Liu y col., 1991; Katz y col., 1993; Wirz y col.,
1993; Sullivan y Akkina, 1995). Otros autores como, Vilçek y col., (1994), exponen la
necesidad de desarrollar en el futuro métodos para la detección de pestivirus en fluidos
biológicos. Dentro de estos se debe destacar la utilidad del suero como muestra clínica
por su facilidad de obtención, transporte y conservación, lo que permite muestreos
eficientes a mayor escala.
Los reportes de este tipo de ensayos realizados a partir de muestras clínicas tales como
suero, buffy coat o semen son escasos (Harding y col., 1994; Horner y col., 1995) y han
sido evaluados con un número limitado de muestras.
El protocolo de RT-PCR descrito mostró resultados satisfactorios en la detección de virus
en muestras de sueros y buffy coats y debe ser validada su aplicación en el diagnóstico de
la enfermedad en animales vivos, lo que constituye un problema no resuelto en las
investigaciones que se realizan en el ámbito internacional en este campo.
La repetibilidad del ensayo resultó del 100% para las muestras evaluadas.
Este ensayo de RT-PCR puede ser un valioso instrumento para el diagnóstico de
pestivirus en animales con infecciones crónicas, en los cuales los anticuerpos específicos
al virus, pueden interferir en la detección viral al emplear los ensayos inmunohistoquímicos
convencionales (Liu y col., 1991).
4.4. Ensayo de neutralización de la peroxidasa.

4.4.1. Desarrollo y Estandarización: Como resultado de la estandarización del ensayo se
establecieron las siguientes modificaciones: sustitución del sistema de revelado indirecto -
suero detector / Proteína A - Peroxidasa (Sigma) - por el conjugado específico de la
inmunoperoxidasa directa (CENSA/C-kure) para acortar el ensayo una hora; conjugado
anti-IgG de cerdo / Peroxidasa (censa/ C-kure) en lugar de Proteína A – Peroxidasa
(Sigma); dilución de las muestras de suero 1:10, pues de lo contrario se escapan sueros
que son débiles positivos; las células PK- 15 pueden ser en monocapa o recién
sembradas en concentración de 5X 10 5 células / mL, de esta última forma se acorta el
ensayo 24-48 horas.
Las condiciones finales establecidas para la realización del ensayo se resumen en la
figura 11
Se observó una coloración rojiza en el citoplasma de las células infectadas, en las cuales
no fue neutralizada por el suero la multiplicación viral, mientras que el suero con
anticuerpos neutralizó la infección por el virus y en los pocillos correspondientes no se
observa esta coloración (figura 12).
En la evaluación de la especificidad analítica, se comprobó según lo descrito para este
ensayo (Terpstra, 1996) que el mismo es capaz de discriminar entre anticuerpos al virus
de la PPC y al BVDV, ya que 60 sueros de bovino reactores por seroneutralización a dos
cepas del BVDV (NADL y Oregon) resultaron negativos por NPLA al virus de la PPC.
4.4.2. Evaluación de criterios sobre el desempeño del ensayo: El ensayo de NPLA
detectó los 70 sueros correspondientes a cerdos experimentalmente infectados (ver
acápite 3.1.6) como positivos y los 20 sueros de estos cerdos antes de infectar como
negativos para un 100 % de especificidad y sensibillidad diagnóstica. El ensayo de ELISA
para determinación de anticuerpos (Rhône-Mérieux, Francia) concordó en un 100 % con

el NPLA, al evaluar estos sueros para un 100 % de sensibilidad y especificidad
diagnósticas relativas del NPLA frente a este ELISA.
Al emplear ambos ensayos en la evaluación de estos sueros, se observó una tendencia a
aumentar los títulos del NPLA y los índices de inhibición del ELISA en el tiempo (figura?).
Sin embargo, al tratar de correlacionar estos ensayos se obtuvo un gráfico de dispersión
(figura ¿) de los valores obtenidos por ambos procedimientos, a partir de los mismos
sueros (ver acápite 3.4.5), donde puede observarse que existe una gran dispersión de los
datos, ya que para un mismo título de NPLA se mueven en un amplio rango los índices de
inhibición del ELISA.
El coeficiente de correlación lineal calculado, fue de solo 0,51, lo que confirmó la baja
correlación que existe entre ambos ensayos.
Estos resultados confirman la utilidad del NPLA, que permite a diferencia del ELISA
conocer los títulos de anticuerpos y específicamente de los neutralizantes, que son los
relevantes cuando se evalúa la protección conferida por la vacunación frente al virus, esto
debe tenerse en cuenta en las evaluaciones que requieran conocer no solo la presencia
sino además estimar la cantidad y calidad de los anticuerpos.
Por otra parte los resultados obtenidos por el ensayo NPLA concordaron con los del juego
CEDITEST-CTB/ELISA en un 100 %, al obtener por ambos procedimientos 8 sueros
positivos y 23 negativos.
Sin embargo, con el juego CIVTEST HC/PPC se obtuvo una concordancia de 89 % ya
que resultaron 191 sueros positivos y 19 negativos por ambas pruebas, pero el NPLA
detectó anticuerpos en 15 sueros que resultaron negativos por el ELISA CIVTEST
HC/PPC, por lo que podemos decir que el ensayo de NPLA resultó más sensible que el
juego de HIPRA teniendo en consideración los resultados obtenidos frente a otros juegos
comerciales.

Se determinó que la repetibilidad del ensayo fue del 100%.
4.5. Diagnóstico.
Los resultados de esta tesis constituyen en sí una metodología valiosa que propone un
algoritmo para el diagnóstico de la peste porcina clásica (Figura 18) y establece que,
ante una sospecha de la enfermedad, debe procederse del modo que sigue:
1. La muestra que se ha de enviar al laboratorio debe provenir de animales sin vacunar o
de más de treinta días de vacunados.
2. Debe descartarse que se trate de peste porcina africana (PPA), cuyo cuadro clínico y
lesional resulta indistinguible de PPC (Terpstra, 1996).
3. En caso de que el resultado sea negativo a PPA, se debe realizar el ensayo de
inmunofluorescencia directa (IFD) en cortes por congelación de muestras de órganos
para la detección de antígenos de pestivirus in situ.
4. Si el resultado es positivo frente a pestivirus y se requiere un diagnóstico diferencial,
debe realizarse a través del ensayo de RT-PCR.
5. En caso de ser negativo, debe realizarse también el ensayo de RT-PCR.
6. Si se mantiene el resultado negativo, se debe intentar el aislamiento del virus en
cultivos celulares para su detección por IFD.
7. Si se obtiene el aislamiento del virus y es necesario el diagnóstico diferencial de
pestivirus, se debe realizar a través del RT-PCR.
8. Se requieren tres pases por cultivos celulares para informar un resultado negativo.
4.6. Caracterización genómica de aislados y análisis filogenético.

Los cebadores de la región E2 detectaron todas las cepas y aislados evaluados,
obteniéndose claras bandas de amplificación visualizadas en geles de agarosa con
bromuro de etidio.
El alineamiento de las secuencias nucleotídicas de los fragmentos de 230 pb se muestra
en figura 12. Como se observa, existen regiones del genoma altamente conservadas entre
las cepas evaluadas y otras muestran mayor variación. Los aislados 157/93, 198/93,
Soroa/93, AJT/93 y Camacho/93 por una parte; 34/96 y 38/96 por otra; así como 14/97 y
15/97 resultaron idénticos entre sí en la región evaluada. Se debe señalar que, la
secuencia de la cepa Margarita fue obtenida de sobrenadante de células PK15 infectadas
y directamente a partir de ARN extraído de la semilla del virus liofilizado y en ambos casos
se obtuvieron resultados idénticos.
El árbol filogenético construido con los datos de secuencias obtenidos en este trabajo y los
reportados en la literatura, correspondientes a cepas representativas de diferentes
subgrupos, se presentan en la figura 13
Los aislados cubanos secuenciados se localizaron en el grupo 1 subgrupo 1.2 y resultaron
estar muy próximos. Las mayores distancias se observan entre cuatro aislados de la zona
oriental del país y el resto correspondientes a la región occidental (figura 13).
Algunos aislados produjeron secuencias idénticas en la zona secuenciada y en todos los
casos se trata de virus cercanos, tanto en su fecha de aislamiento como geográficamente,
lo que sugiere que podría tratarse de las mismas variantes virales.
La cepa vacunal “C” empleada en nuestro país para la vacunación está dentro del mismo
subgrupo filogenético de estos aislados (figura 13), al igual que la cepa vacunal PAV-250.
Las variaciones en la secuencias entre aislados, en su mayoría, no afectaron los residuos
de aminoácidos codificados porque afectan la base que se encuentra en la tercera

posición del codón, excepto en el caso de la cepa vacunal ¨C¨ que presenta una
sustitución de aspártico por glutámico, de aspártico por asparagina y de treonina por
metionina con relación a los aislados y un cambio de serina en la cepa Margarita, y los
aislados 14/97 y 15/97 por leucina en el resto (figura 14).
Se ha estimado la razón de evolución de este virus a partir de la variabilidad de
secuencias nucleotídicas, comparando virus de una fuente común pero con diferentes
fechas de aislamiento. Para ello, se consideraron aislados de un área geográfica
específica (Italia central) en un período de 6 años y los valores estimados fueron desde
cero - en algunos casos se observa esta remarcada estabilidad como en virus polacos
(1991-1993), belgas (1990-1994) y austríacos (1990-1992) - hasta 2.7 x 10 -3 sustituciones
por base por año en la región E2. Un valor similar fue obtenido cuando se calculó el
promedio de la razón de evolución de todas las probables relaciones progenitor/progenie
(3.3 x 10 -3 ) del árbol E2 (Lowings, 1996).
En los aislados cubanos secuenciados, correspondientes a un periodo de 3-4 años, el
índice evolutivo, calculado de la variabilidad de la región E2, es de 1,4 x 10 -3 sustituciones
por base por año (figura 15), dentro de los aislados de la región occidental y de
4,3 x 10 -3 y 5,4 x 10 -3 sustituciones por base por año (figura 15) de los aislados de la
región oriental con relación a los virus aislados al inicio del brote, en el año 1993 y
provenientes del occidente del país. Los datos obtenidos a partir de los aislados de la
región occidental, muestran una elevada estabilidad del virus de la PPC en nuestras
condiciones. Entre los aislados del año 1993, correspondientes a occidente y los de la
zona oriental, de los años 1996 y 1997, el índice evolutivo está entre 4,3 x 10 -3 y 5 x 10 -3
(figura 15), que son valores superiores a los reportados internacionalmente y a los
obtenidos en la región occidental, lo que sugiere que se trata de clusters diferentes del
virus, tal y como se observa en el árbol filogenético (figura 13) establecido.
5. DISCUSION GENERAL

Las bases del programa de lucha llevado a cabo en numerosos países para el control y/o
erradicación de la peste porcina clásica, se han conformado con la vacunación usada
ampliamente durante muchos años, la estricta vigilancia epizootiológica, un adecuado
soporte diagnóstico y medidas de saneamiento rigurosas.
El diagnóstico de la PPC en nuestro país se limitaba a la detección de pestivirus por IFD
en cortes por congelación de muestras de órganos, para lo cual se contaba con
conjugados fluorescentes importados de la antigua URSS o de producción nacional, sin
los debidos controles de calidad. Por otra parte, no se disponía de una metodología
apropiada a nuestras condiciones para el aislamiento viral, no se contaba con un ensayo
para el diagnóstico diferencial de pestivirus, no era posible detectar el virus en animales
vivos, no existía ningún ensayo para detectar anticuerpos y no se poseían los medios y la
metodología para realizar estudios filogenéticos del virus que explicaran el
comportamiento epizootiológico del brote.
El aislamiento viral en cultivos celulares combinado con técnicas inmunohistoquímicas es
usado comúnmente, posee una elevada sensibilidad, provee un cultivo del agente causal y es
generalmente aceptado como ensayo de referencia para la detección del virus de la PPC. Sin
embargo, requiere la posterior identificación del aislado con anticuerpos monoclonales,
facilidades de laboratorio de cultivo de tejidos, así como de contención para el trabajo con
virus de la PPC virulentos, toma más tiempo de ejecución y es de mayor costo que los
ensayos para la detección directa del virus.
Los procedimientos inmunohistoquímicos desarrollados (IFD e IPD) están dirigidos a la
detección primaria del virus, y se debe señalar que, aunque ambos resultaron rápidos,
sencillos de realizar, sensibles y específicos, la IPD presenta ventajas sobre la IFD, como
son, que no requiere microscopio de fluorescencia, exige menor entrenamiento en la
lectura, los resultados se conservan de forma permanente y permite la detección directa
de aislados en cultivos celulares en placas de microtítulo. Aunque la IPD ha sido evaluada
con un número menor de muestras, constituye una alternativa valiosa frente a la IFD

tradicionalmente usada, sobre todo en laboratorios que no cuenten con microscopio de
fluorescencia.
Para el diagnóstico primario se ofertan comercialmente conjugados específicos,
enzimático y fluorescente, con precios que van desde $0.31 hasta $0.85
USD/determinación, mientras que el producido por nosotros es al menos dos veces más
barato.
La detección de antígenos virales mediante ensayos inmunohistoquímicos in situ puede
ser interferida por la presencia de anticuerpos en animales con infecciones crónicas (Liu y
col., 1991). Sin embargo, en infecciones agudas, debido al efecto inmunosupresor del
virus (Pearson, 1992), la detección de este no debe ser interferida por la presencia de
anticuerpos.
El ensayo de RT-PCR no solo permite identificar los aislados de pestivirus en cultivos
celulares en sustitución del empleo de anticuerpos monoclonales comercializados con este
fin, sino que su aplicación para la detección diferencial del virus de la PPC en órganos de
animales sacrificados, sin previo aislamiento viral y con elevadas sensibilidad y especificidad,
permite la identificación temprana de los animales infectados, lo cual constituye un elemento
clave en el control de un brote de peste porcina clásica (Vanderhallen y Koenen, 1996).
Por otra parte la detección de virus mediante RT-PCR, a diferencia de los ensayos
inmunohistoquímicos, no es interferida por la presencia de anticuerpos en el animal.
Debido a que en nuestro país la masa porcina está sometida a vacunación no es posible
utilizar la detección de anticuerpos tal y como se realiza en otros países (Koenen y col., 1996;
Saatkamp y col., 1996) para mantener una activa vigilancia epizootiológica dirigida a
identificar animales con formas clínicas crónicas o atípicas de la enfermedad, las cuales son
difíciles de detectar por el veterinario en el campo. Por otra parte, aun cuando se pudiera
utilizar la detección de anticuerpos, esta no permitiría la identificación de los animales

persistentemente infectados con viremia congénita y sin anticuerpos al virus. De ahí que el
ensayo de RT-PCR sea particularmente atractivo para detectar el virus en muestras clínicas
de animales vivos, lo que no es posible con los métodos virológicos convencionales, y
permitiría la identificación de estos animales que no son generalmente reconocidos y pueden
desempeñar un papel importante en la diseminación del virus en el campo (Van Oirschot,
1988).
Debe ser objeto de valoración la aplicación del RT-PCR, previa validación de este ensayo,
con un mayor número de muestras, en animales vivos en centros genéticos, pues esto
contribuiría a la eliminación progresiva de los animales infectados con clínica atípica o sin
clínica aparente que constituyen un importante reservorio del virus en el campo (Liess, 1987).
Para la detección de antígenos se comercializan juegos del tipo ELISA, con precios
variables, ya que están en dependencia del uso o no de anticuerpos monoclonales, y
aunque, la PCR cuesta más cara, permite el diagnóstico diferencial de PPC, tanto en
muestras de animales vivos como en órganos, no necesita del aislamiento viral y es una
opción disponible en ausencia de juegos de ELISA comerciales no siempre de probada
eficacia.
En nuestro país, los ensayos de determinación de anticuerpos no pueden emplearse en la
vigilancia epizootiológica al usarse la vacunación y ser los anticuerpos post-vacunales
indistinguibles de los inducidos por virus salvaje. No obstante, el ensayo de neutralización de
la peroxidasa constituye un valioso instrumento para evaluar el seroperfil de los cerditos hijos
de madres vacunadas y así determinar la edad óptima de la primo vacunación, conocer el
estado inmune de la masa a través de monitoreos de la respuesta humoral post-vacunal,
optimizar el esquema de vacunación y, finalmente, seleccionar los animales necesarios para
los controles de calidad de la vacuna.
Para la detección de anticuerpos, los precios de los juegos comerciales oscilan desde
$1.80 hasta $3.50 USD/determinación, mientras que nuestro procedimiento, el NPLA,
resulta 9 veces más barato, permite titular los anticuerpos y solo detecta los

neutralizantes, que son los relevantes en la protección frente al virus, por lo que resulta
muy útil en los estudios relacionados con la evaluación de vacunas.
La metodología desarrollada, que sirve de base al algoritmo propuesto para el diagnóstico
de PPC, permite en breve tiempo (48-72 horas) descartar peste porcina africana y diarrea
viral bovina, lo que reviste gran importancia en el control de la enfermedad y para evitar
que un posible brote de peste porcina africana no sea detectado rápidamente al
confundirse en el campo con PPC.
Actualmente, se conoce que para la prevención y control de las enfermedades infecciosas,
es necesario contar, unido al diagnóstico, con información molecular de las entidades
involucradas.
Los nuevos enfoques moleculares posibilitan que los análisis epidemiológicos se
sustenten en un mayor conocimiento del genoma de los patógenos. Estos nuevos
conceptos basados en la posibilidad de secuenciar los ácidos nucleicos, así como en el
estudio de regiones polimórficas de los diferentes aislados, permiten establecer cadenas
filogenéticas entre éstos, para conocer la procedencia, las vías de diseminación y la
evolución de los virus (Lowings y col, 1994, 1996).
Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de secuenciación de ácidos
núcleicos, en conjunto con análisis filogenéticos, han generado información
epidemiológica a escala molecular sobre diversos virus como el de la inmunodeficiencia
humana (Salminen y col, 1993), dengue (Rico-Hesse, 1990), influenza B (Rota y col.,
1992) y fiebre aftosa (Beck y Strohmaier, 1987), entre otros. En Cuba solamente se han
desarrollado estos estudios en VIH (Rolo y col., 1996) y en dengue (Guzmán y col., 1995)
que han dado importantes aportes sobre la evolución de estos virus en nuestro medio.
Para el estudio molecular de cepas y aislados del virus de la PPC se han empleado
diversos procedimientos como análisis de patrones de enlazamiento de anticuerpos
monoclonales (Edwards y Sands, 1990), de datos de restricción (Harding y col., 1994) y de

secuencias nucleotídicas (Lowings y col., 1994). Entre estos procedimientos, la mayor
discriminación se reporta con los datos obtenidos del análisis de secuencias (Lowings y
col., 1996).
La selección de las áreas genómicas para secuenciar debe tener en cuenta que estén
flanqueadas por zonas conservadas que permitan detectar todas las cepas estudiadas y
contener regiones variables para identificar variantes del virus. En el caso de PPC, esto
resulta difícil porque sólo se encuentran disponibles los datos de la secuencia genómica
completa de dos cepas: Alfort (Meyers y col., 1989) y Brescia (Moorman y col., 1990). Por
tanto, la selección de los cebadores es empírica y su calidad filogenética no puede ser
predicha por análisis de computación, por lo que para garantizar la calidad del área
seleccionada se debe estudiar un gran número de aislados.
En la literatura se encuentran análisis de comparación de secuencias realizados en
diferentes regiones del genoma viral como el gen putativo de la polimerasa (NS5B) en el
extremo 3´, la región no codificante (NCR) del extremo 5´ y el de la glicoproteína más
importante E2 (gp55). Un estudio de comparación de estas regiones reveló que de estas
tres, la E2 produjo la mejor discriminación y fue capaz de distinguir entre muchos de los
virus que resultaron idénticos por análisis de las otras dos regiones (Lowings y col., 1996).
Por esto, seleccionamos cebadores empleados para amplificar una zona de 230 pb en el
extremo 5´ de la glicoproteína E2, con los cuales se han estudiado 112 virus de todo el
mundo (Lowings y col., 1996).
Los análisis filogenéticos realizados en esta región y en otras regiones genómicas,
(Lowings y col.,1996; Vilçek y col. 1996) muestran que las cepas y aislados de PPC se
dividen en dos grandes grupos. El grupo l está representado por la cepa Brescia e incluye
todos los virus anteriores a 1964, aislados más recientes de cepas no europeas (América
y Asia), todas las cepas vacunales analizadas y en él se localizan los aislados de Cuba,
de acuerdo a nuestros resultados; el ll está representado por la cepa Alfort e incluye los
virus aislados después de 1970, la mayoría europeos y posteriores a 1985.

En este estudio hemos realizado la secuenciación directa del producto de RT-PCR,
correspondiente a la región 5´ del gen E2 (gp55) de la cepa vacunal “C” lapinizada, la
cepa Margarita empleada en el ensayo de desafío de la vacuna, la cepa vacunal PAV-250
y trece aislados correspondientes a diferentes años y diferentes provincias del país, y
hemos analizado esta información aplicando técnicas filogenéticas.
El análisis comparativo de secuencias nucleotídicas de la región E2 del genoma viral ha revelado
dos principales grupos filogenéticos del virus de la PPC (Lowings y col., 1994, 1996; Vilçek y col.,
1996). Acerca de esto, se especula que los datos de secuencias están sesgados hacia Europa
continental (Vilçek y col., 1996), pues solo se dispone de información limitada acerca de aislados
de Suramérica y Asia, lo que no permite asegurar que en estas regiones no existan diferentes
subgrupos virales. Sin embargo, nuestros resultados no distorsionaron la morfología del árbol
filogenético y se agruparon dentro de uno de los subgrupos descritos.
Los aislados del virus de la PPC analizados se agrupan filogenéticamente junto con los
reportados en nuestra área geográfica, y los procedentes de los brotes actuales en la
región occidental son muy similares al aislamiento más antiguo Margarita, lo que sugiere
que el origen de la epizootia no está en una reintroducción de virus externa.
El agrupamiento filogenético de las cepas (figura 15) no guarda relación con la variación
de patogenicidad registrada para ellas (tabla 1), que van desde signos clínicos y lesiones
compatibles con infecciones crónicas o atípicas a formas agudas de la enfermedad. Estos
datos son consistentes con el hecho de que la región secuenciada no revela marcadores
de virulencia (Lowings y col., 1996). No obstante, es necesario subrayar el hecho de que
la virulencia no está solo basada en características intrínsecas de las cepas virales sino
que involucra a factores del hospedero que no se han tenido suficientemente en cuenta
hasta ahora (Depner y col., 1996).
La cepa “C” empleada en la vacunación se encuentra en el mismo subgrupo que los virus
aislados, lo que habla a favor de que confiera protección inmunológica frente a las cepas

circulantes, ya que, además, la región secuenciada se encuentra en el gen de la
glicoproteína principal inductora de anticuerpos neutralizantes y, por lo tanto, involucrada
en la protección.
Las variaciones detectadas entre los virus en cuanto a secuencia nucleotídica no se
traducen en diferencias importantes en la secuencia de aminoácidos deducida, lo que
muestra una elevada conservación de la glicoproteína E2 en los virus circulantes. En todos
los casos se conserva la cisteína del residuo 737 de la cepa Alfort, que está relacionada
con la estructura secundaria de esta proteína y cuya sustitución impide el enlazamiento de
anticuerpos monoclonales neutralizantes a los dominios antigénicos B y C de la
glicoproteína E2, cuya región secuenciada codifica epitopes cruciales para la
neutralización del virus mediada por anticuerpos (Van Rijn y col., 1994).
Nuestros resultados abundan en el conocimiento del estimado de la tasa de mutaciones del
virus de la PPC, de importancia para predecir cambios antigénicos. Este es difícil de
establecer si se tiene en cuenta que, al comparar virus con fechas de aislamiento diferentes,
hay que tener en cuenta que no existen sistemas completamente cerrados en el campo.
Hasta ahora el mejor modelo que se ha empleado para este fin es el que corresponde a
aislados de diferentes brotes de una región de Italia central en un período de seis años
(Lowings y col., 1996).
El modelo cubano es particularmente atractivo para estimar la tasa de mutaciones del virus,
ya que los aislados están muy relacionados, lo que permite distinguirlos de nuevas
reintroducciones, no está afectado por la presencia y el movimiento de jabalíes que
constituyen importantes reservorios del virus en otros países, al tratarse de una isla está
geográficamente aislada y no está sometida a un intercambio comercial importante de
cerdos y sus productos.
Los índices de evolución calculados para los aislados cubanos aportan nuevos datos al
conocimiento acerca de la evolución de este virus, permiten detectar una introducción nueva
y rastrear el origen, muestran que el virus es estable, brindan la información de que la cepa

vacunal en uso es capaz de inducir protección y permiten determinar si una cepa es
adecuada para elaborar una vacuna.
Es de resaltar que el conjunto de estos resultados aporta información de interés acerca del
agrupamiento filogenético y la evolución de estos virus que contribuyen a su conocimiento
internacional.
El resurgimiento de esta enfermedad en Cuba a partir de 1993, después de casi 20 años
de silencio epizoótico, generó múltiples interrogantes acerca del origen del brote, la
posible reintroducción externa del virus y la efectividad de la vacuna, entre otras.
En nuestro país, la enfermedad reapareció en el Occidente y se extendió paulatinamente a
casi todas las provincias coincidiendo con condiciones asociadas al período especial, al
producirse severas afectaciones en la alimentación de los animales, la protección
contraepizoótica, la disponibilidad de la vacuna y su conservación en el campo, entre otras.
Por otra parte, a pesar del programa de vacunación establecido para prevenir la enfermedad
durante estos años y, aun cuando el total de la masa se encuentre debidamente vacunada es
conocido que las vacunas virales impiden la aparición de signos clínicos, pero no
necesariamente la replicación de los virus en el animal (Fenner y col., 1993). Esto supone un
número de animales que podría estar infectado subclínicamente y diseminar el virus. La
aparición inesperada de brotes de la enfermedad se ha explicado en algunos casos por la
existencia de animales persistentemente infectados (Depner y col., 1996) y enfermos crónicos
con signos atípicos que no son detectados (Westergaard, 1996) y constituyen un reservorio
del virus.
En este estudio se observa que los virus de la región occidental son muy similares a la
cepa de desafío de la vacuna, por lo que no se puede descartar la posibilidad de que el
origen de la epizootia esté relacionado con una reintroducción de esta cepa.

Los aislados secuenciados de la región oriental, si bien están relacionados con los de la
zona occidental, se agrupan en un cluster diferente y muestran un índice de evolución, con
relación a los aislados del inicio del brote, superior al reportado internacionalmente para
este virus y al calculado en este trabajo para los aislados del Occidente del país. Esto
sugiere que estas variantes virales no parecen ser el resultado de la evolución en el
campo de los virus aislados al inicio de la epizootia.
Los aislados de la zona oriental podrían ser el resultado de la evolución en el campo de
variantes virales anteriores a la epizootia, representadas por la cepa Margarita, o podrían
corresponder a introducciones desde Haití, país que sufre una importante epizootia de
esta enfermedad (comunicación personal).
Para profundizar en este aspecto, se requiere aumentar el número de aislados
secuenciados del Oriente del país y compararlos con aislados provenientes de países del
área.
Debe destacarse que, por primera vez en Cuba, se realizó un estudio de variabilidad genética
por análisis comparativo de secuencias nucleotídicas de un virus que afecta una especie
animal de importancia económica; este permitió identificar y clasificar variantes del virus de la
PPC presentes en el país.
El análisis de las relaciones filogenéticas entre los diferentes aislados del brote concluyó
que el origen de la epizootia era común, que no estaba en una reintroducción externa y
que la cepa vacunal en uso era capaz de inducir protección. Por otra parte, brindó un
estimado de la tasa de mutaciones del virus con lo que se mostró que el mismo es
bastante estable, lo que permite inferirr que no es necesario sustituir la cepa vacunal con
frecuencia, como ocurre en otras enfermedades virales (Gibbs y col., 1995).
La aplicación de esta metodología permite reconocer cepas introducidas, predecir
cambios antigénicos y conocer la cadena de transmisión del virus en brotes de la
enfermedad.

El desarrollo de novedosas metodologías para la rápida detección, identificación y
clasificación viral es particularmente valioso en el caso de la PPC, considerando la
importancia epizootiológica y las dificultades para el diagnóstico de esta enfermedad.
Este trabajo permitió contar con medios y metodologías para la detección e identificación,
tanto de virus como de los anticuerpos específicos, y estableció por primera vez la
clasificación filogenética de los virus de la PPC que circulan en nuestro país, lo que resulta
imprescindible para el control y la futura erradicación de la enfermedad.
Con relación a esta enfermedad en nuestro país, se requiere continuar las investigaciones
para optimizar el esquema de vacunación vigente; desarrollar métodos tipo ELISA para la
detección de anticuerpos; aplicar medios diagnosticadores para la detección de animales
persistentemente infectados, al menos en los centros genéticos; extender los conocimientos
acerca de la patogénesis del virus, ampliar el número de aislados secuenciados de diferentes
regiones del país, establecer ensayos para la detección diferencial de virus vacunal y salvaje,
para lo cual será necesario profundizar en los marcadores moleculares de virulencia y
elaborar una vacuna con una metodología más avanzada.
Los medios y métodos de diagnóstico desarrollados permitieron realizar el diagnóstico
virológico en 1344 casos provenientes de casi todas las provincias del país, incluyendo los
centros genéticos, con lo cual se estableció el diagnóstico diferencial con peste porcina
africana, se determinó la focalidad y se dictaron las medidas contraepizooticas adecuadas a
cada caso.
El conjunto de estos resultados abunda en el conocimiento de las relaciones filogenéticas y la
evolución del virus, lo cual es importante pues se inserta en los estudios que se realizan en
este campo en el ámbito internacional, contribuyó de manera decisiva al control de la
epizootia, ya que en el transcurso del año 1997 y en lo que va de 1998 no se han declarado
nuevos focos, nos esclarece el comportamiento epizootiológico de la enfermedad en Cuba y

inda nuevas herramientas diagnósticas, por lo que contribuye al perfeccionamiento del
Programa Nacional de Lucha contra la PPC.
6. CONCLUSIONES
A partir del análisis de los resultados obtenidos podemos establecer las siguientes
conclusiones:
• Se elaboraron conjugados fluorescentes y enzimáticos y se establecieron los
procedimientos inmunohistoquímicos de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa
directas, que permiten realizar un diagnóstico primario, económico, sencillo, rápido,
sensible y específico a partir de muestras de órganos in situ y detectar con rapidez,
sensibilidad y especificidad, pestivirus multiplicados en cultivos celulares.
• Se estableció una metodología apropiada para el aislamiento viral en cultivos celulares
que, acoplado a los ensayos inmunohistoquímicos y al ensayo de RT-PCR, permiten
realizar un diagnóstico sensible y específico de la enfermedad y posibilitó contar con un
banco de aislados de PPC.
• Se desarrolló un ensayo de RT-PCR para la amplificación diferencial de ARN de
pestivirus. Este ensayo posibilita, en una reacción de un solo paso, identificar, con
rapidez, sensibilidad y especificidad, los virus tanto en sobrenadantes de cultivos celulares
como en especímenes clínicos.
• Se estableció un ensayo de neutralización de la peroxidasa que permite la determinación
económica, sensible y específica de anticuerpos dirigidos contra el virus de la PPC, lo que
brinda la posibilidad de realizar estudios serológicos de interés, con medios de producción
nacional.
• Se conformó un nuevo algoritmo diagnóstico, teniendo en cuenta los procedimientos
desarrollados.

• Los medios y métodos de diagnóstico desarrollados permitieron realizar el diagnóstico
virológico en 1344 casos provenientes de casi todas las provincias del país,
incluyendo los centros genéticos, con lo cual se estableció el diagnóstico diferencial
con peste porcina africana, se determinó la focalidad y se dictaron las medidas
contraepizooticas adecuadas a cada caso.
• Se estableció una metodología para la caracterización genómica del virus de la PPC,
que permitió el estudio de variabilidad genética por análisis comparativo de secuencias
nucleotídicas de cepas/aislados del virus de la PPC presentes en el país y su
clasificación filogenética.
• Los aislados cubanos secuenciados y la cepa “C”, empleada para la vacunación en
nuestro país, se localizaron en el grupo 1 subgrupo 1.2 del árbol filogenético E2, y
resultaron estar muy próximos. Dentro de los aislados las mayores distancias se
observan entre los de la región occidental y los de la zona oriental del país que se
agrupan en clusters diferentes.
• El análisis de las relaciones filogenéticas entre los diferentes aislados concluyó que el
origen de la epizootia era común, que no estaba en una reintroducción externa, que la
cepa vacunal en uso era capaz de inducir protección y brindó un estimado de la razón de
evolución del virus
7. RECOMENDACIONES
• Realizar la validación de los conjugados fluorescente y enzimático en el Centro Nacional
de Epizootiología y Diagnóstico (CENEDI) y presentar los registros a Control Estatal.

• Extender la aplicación del ensayo de NPLA para la determinación de anticuerpos a los
laboratorios de Control Estatal y CENEDI, para su utilización directa en las evaluaciones
relacionadas con el control de la vacuna, en la optimización del esquema de vacunación
vigente y en otras de interés.
• Validar el empleo del ensayo del RT-PCR para la detección del virus en especímenes
clínicos procedentes de animales vivos, para la identificación de portadores.
• Ampliar el estudio de los aislados de la zona oriental del país, a través de la comparación
de un mayor número de aislados de esta región con otros procedentes de la región.
• Continuar incrementando el banco de aislados para, a través de análisis filogenéticos,
seguir la evolución del virus en el campo, realizar estudios de epidemiología molecular y
detectar posibles nuevas variantes virales.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Tabla 1. Cepas y aislados evaluados en el presente estudio.
Código Material de Partida Año Categoría Origen Síntomas y Lesiones
Cepa “C” Preparado vacunal D* D* Hungría Cepa vacunal
Margarit
a
PK15, 5P y Virus
liofilizado
1958 ceba La Habana Cepa virulenta
PAV-250 PK15, 4P 1960 D* EUA Cepa vacunal
157/93 PK15, 4P 1993 Cría Pinar del Río Fiebre, anorexia
Ulceras botonosas
198/93 PK15, 4P 1993 preceba Ciudad Habana Fiebre, desmedro
Infartos marginales en bazo
196/93 PK15, 4P 1993 preceba Matanzas Fiebre, desmedro
Infartos marginales en bazo
CV/93 PK-15, 5P 1993 preceba La Habana Fiebre, anorexia
Panhemorragias
AJT/93 PK-15. 3P 1993 ceba La Habana Anorexia, diarreas
Infartos marginales en bazo
Soroa/93 PK-15, 4P 1993 ceba Pinar del Río Fiebre, diarreas
Panhemorragias
Camach
o/93
PK-15, 4P 1993 ceba La Habana Fiebre, conjuntivitis
Panhemorragias
34/96 PK15, 3P 1996 cría Ciudad Habana. Trastornos neurológicos, diarreas,
Panhemorragias
38/96 PK15, 6P 1996 ceba La Habana Fiebre, anorexia, conjuntivitis, eritema
Panhemorragias

95/96 PK15, 5P 1996 ceba La Habana. Anorexia, trastornos neurológicos
Panhemorragias, Neumonía
253/96 homogenado de bazo 1996 ceba Holguín Alta mortalidad
Panhemorragias
14/97 PK15, 1P 1997 cría Guantánamo Fiebre, diarreas, desmedro
N.A.P**
15/97 PK15, 1P 1997 cerda Guantánamo Cianosis distal
Panhemorragias
32/97 PK-15, 3P 1997 Preceba Stgo. de Cuba Fiebre, anorexia
Panhemorragias
33/97 PK-15, 3P 1997 ceba Stgo. de Cuba Fiebre, diarreas
Panhemorragias
*D=Desconocido, **NAP= No alteraciones anatomopatológicas.

Tabla 2. Cebadores genotipo-específico usados para la amplificación por
RT-PCR del ARN del virus de la PPC.
Cebador Secuencia
PPC1
Sentido
PPC2
Antisentido
(5'-3')
CCTGAGGACCAAACACATGTTG
TGGTGGAAGTTGGTTGTGTCTG
Posición
Genoma a
10.230-10.251
10.403-10.382
Talla
producto
a La numeración de los nucleotidos corresponde a la secuencia de la cepa Alfort del virus de la PPC
(Meyers y col., 1989).
(pb)
174

Tabla 3. Amplificación por RT-PCR de ARN del virus de la PPC, usando los cebadores
PPC1 y PPC2, en sobrenadantes de células de cultivo infectadas.
Virus Cepa o Aislado a Amplificación b
CSFV ALFORT +
PAV-250 +
AMES +
MARGARITA +
“C” +
157/93 +
198/93 +
34/96 +
38/96 +
41/96 +
95/96 +
146/96 +
167/96 +
253/96 +
14/97 +
15/97 +
Es1/97 c +
Es2/97 c +
Es3/97 c +
BVDV NADL -
OREGON -
SINGER -
MUCOSIFFA -
VC/96 -

Virus Cepa o Aislado a Amplificación b
GR1/96 -
GR2/96 -
GR3/96 -
GR4/98 -
GR5/97 -
GR6/97 -
a
Los diferentes virus analizados son indicados como sigue: Cepas de referencia y vacunales, letras
mayúsculas; aislados de campo, letras minúsculas.
b
La detección de un fragmento de ADN de la talla esperada, 174 pb, por análisis de los productos de
reacción del RT-PCR en geles de agarosa, fue considerada como amplificación positiva.
c
Virus aislados en España en 1997.

Tabla 4. Amplificación por RT-PCR de ARN del virus de la PPC en muestras de
órganos de cerdos infectados naturalmente.
Código Organo RT-PCR amplificación IFD
INFECTADOS
253/96 Bazo + +
169/96 Ganglio + +
121/95 Bazo + +
168/96 Ganglio + +
164/96 Amígdala + +
165/96 Bazo + +
192/96 Bazo + +
163/96 Bazo + +
110/96 Bazo + +
141/96 Bazo + +
185/96 Bazo + +
199/96 Amígdala + +
125/95 Amígdala + +
275/96 Bazo + +
281/96 Bazo + +
14/97 Bazo + +
85 Bazo + +
88 Bazo + +
1-67 Bazo + +
2-62 Bazo + +
25-2/97 Bazo + +
25-M/97 Bazo + +
32/97 Bazo + + a
33/97 Bazo + + a
34/97 Bazo - -

NO-INFECTADOS
68/96 Bazo - -
77/96 Bazo - -
78/96 Amígdala - -
26/96 Amígdala - -
106/96 Bazo - -
35/96 Bazo - -
34/97 Bazo - -
a Estas muestras fueron negativas por IFD, cuando se evaluaron directamente en cortes de
órganos, sin embargo resultaron positivas por IFD después de un pase en células PK-15.