peste porcina clasica: diagnostico y caracterizacion ... - Inicio - CENSA

del volumen final de TNE (Tris 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5mM, pH 8,0) y se
precipitó con dos volúmenes de etanol absoluto a -20ºC toda la noche, se centrifugó y el
precipitado se resuspendió en 10 µL de agua desionizada libre de ARNasa. El ARN se
utilizó directamente o se conservó a -80°C.
En el segundo método, se extrajo el ARN con igual volumen de fenol saturado con tampón
TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) y dos fenolizaciones más, con una solución de fenol
saturado con tampón TE : cloroformo (vol:vol), alcohol isoamílico (1 %) y hidroxiquinoleína
(1 mg/mL), se mezcló en vortex por 1 min y se centrifugó a 13 000 g por 5 min a 4ºC. La
fase acuosa se trató con igual volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (49:1), se
precipitó, se resuspendió y se conservó de igual forma que en el método anterior
(Rodríguez y col., 1992).
El ensayo de comparar ambos procedimientos, se realizó a partir de diluciones de la cepa
Alfort titulada, en un extracto de bazo sano por triplicado.
3.4.2. Cebadores: La pareja de cebadores para la detección de todas las especies virales
dentro del género Pestivirus (Pest1-Pest2) se tomó de la literatura (Wirz, B. y col., 1993) y
corresponde a la región 5' no codificante del genoma viral. La pareja de cebadores capaz
de detectar específicamente el virus de PPC fue diseñada a partir del alineamiento de dos
cepas de PPC: Alfort (Meyers y col., 1989) y Brescia (Moorman y col., 1990) y tres de
BVD: Osloss (Renard y col., 1987), NADL (Collett y col., 1988b) y SD1 (Deng y Brock,
1992) con el paquete de programas GCG (Devereux y col., 1984) y el programa Hint PCR
(Dopazo y Sobrino, 1993), a partir de establecer la búsqueda en las regiones que fueran
altamente conservadas entre las cepas de PPC y altamente divergentes entre las cepas
de PPC y BVD. Entre los pares de cebadores suministrados por el programa se
seleccionó una pareja (PPC1-PPC2) correspondiente al gen putativo de la polimerasa
(NS5B).