peste porcina clasica: diagnostico y caracterizacion ... - Inicio - CENSA

congelación de tejido o las células de cultivo preparadas como antígenos laminares -
según se describe en el acápite 3.1.5. -, se depositaron 30 µL del conjugado fluorescente
diluido en PBS con 25 % del volumen final de dilución de azul de Evans al 0,01 %.
La incubación se realizó en cámara húmeda protegida de la luz y se evaluaron la
temperatura - temperatura ambiente y 37ºC - y el tiempo - 30 min y 1 hora - de
incubación. Posteriormente, se realizaron tres lavados por inmersión, de 10 minutos cada
uno, del corte de tejido o las células de cultivo en PBS, se añadió una gota de solución
montante - glicerina tamponada con fosfato pH 9,6 -, se colocó un cubreobjeto y finalmente,
se examinaron las células bajo microscopio de fluorescencia con aumento de 400x, para
detectar focos fluorescentes.
Las condiciones del ensayo de IPD se establecieron según se describe a continuación: se
evaluó el tratamiento previo de los cortes de tejidos con una solución de peróxido de
hidrógeno al 3 % en PBS, para consumir la actividad de peroxidasa endógena que puede
estar presente en los tejidos animales. Se dispensaron 30 µL del conjugado enzimático
sobre el corte por congelación o células de cultivo, previamente diluido en diferentes
diluentes, sometidos a evaluación con relación a la intensidad y nitidez de la tinción, que
fueron solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 (PBS); tampón TBS (Tris 10 mM;
NaCl 250 mM, pH 8,0) y PBS con albúmina de huevo (OVA) al 1 %.
Se realizó la incubación en cámara húmeda cerrada y en condiciones de oscuridad, se
evaluaron las condiciones de temperatura - temperatura ambiente y 37ºC - y el tiempo - 30
min y 1 hora - de incubación del conjugado enzimático, con relación a la mayor intensidad
de la tinción y el fondo de reacción más bajo.
Se lavaron las células por inmersión del portaobjeto en PBS, tres veces 10 min cada vez,
se dejaron secar a temperatura ambiente y se recubrieron con 30 µL de la solución de
sustrato-cromógeno, para lo cual se evaluaron dos cromógenos, el tetra hidrocloruro de
diaminobencidina (DAB) (1 mg de DAB diluida en TBS) y el 3-amino-9 etil-carbazol (AEC)