notice technique - Biocentric

2. Lavare le colonie da una piastra in cui sono cresciute adeguatamente (tappeto di
crescita) con 1,5 ml di soluzione sterile allo 0,9% di NaCl, dispensare la sospensione
in una nuova provetta e miscelare bene.
3. Incubare la sospensione per 10 minuti a 95°C in un termoblocco.
4. Centrifugare per 5 minuti alla massima velocità in una centrifuga da banco e
trasferire il surnatante in un una nuova provetta. Usare 5 µl del lisato per l’amplificazione
(diluire se necessario).
Le valutazioni del kit GenoType ® EHEC sono state eseguite utilizzando il metodo
descritto sopra. Di seguito è descritto un protocollo alternativo per la coltura e
isolamento di DNA:
1. Inoculare il bouillon di MacConkey con un quantitativo di feci grande quanto una
lenticchia o, nel caso le feci fossero liquide, usando un’ansa da inoculo da 10 µl
e incubare una notte a 35 +/- 2°C.
2. Piastrare il bouillon con un’ansa da inoculo da 10 µl in una piastra di agar Mac-
Conkey e incubare una notte a 35 +/- 2°C.
3a. Rimuovere le colonie dalla piastra utilizzando un tampone di cotone sterile precedentemente
impregnato di acqua sterile per biologia molecolare. Stemperare
il tampone in una provetta contenente 500 µl di acqua sterile (vedi sopra).
3b.Lavare le colonie dalla piastra usando 1,5 ml di una soluzione salina allo 0,9%
sterile, trasferire in una provetta e miscelare bene. Centrifugare in una centrifuga
da banco per 5 minuti a 8000xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il
pellet in 300-500 μl di acqua sterile per biologia molecolare e vortexare.
4. Incubare la sospensione ottenuta dalla procedura 3a o 3b per 15 minuti a 95°C
in un termoblocco.
5. Centrifugare con una centrifuga da banco per 5 minuti alla massima velocità e
trasferire poi il surnatante in una nuova provetta. Usare 5 µl del lisato per l’amplificazione
(diluire se necessario).
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