notice technique - Biocentric

Amplificación
Deben realizarse dos reacciones PCR por separado con cada muestra: una con PNM
EHEC 1 y otra con PNM EHEC 2. Prepare la mezcla de amplificación (45 µl) en una
habitación libre de DNA. La muestra debe añadirse en un área separada.
Mezcle por tubo :
– 35 µl de PNM EHEC 1 o PNM EHEC 2
– 5 µl 10x de buffer para incubación de polimerasa – no suministrado.
– x µl de solución MgCl 2
1)
- no suministrado
– 1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable (consulte el manual) – no suministrado
– y µl de agua para obtener un volumen de 45 µl (sin considerar el volumen de
enzima) – no suministrado.
– Añada 5 µl de solución de DNA recién aisladado (20–100 ng DNA) para obtener
un volumen final de 50 µl (sin considerar el volumen de enzima).
1)
Dependiendo del sistema enzima/buffer usado, la concentración óptima de MgCl 2
puede variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que algunos buffers para incubación
ya contienen MgCl 2
.
Determine el número de muestras a amplificar (número de muestras a analizar más
las muestras de control). Por ejemplo, un control negativo contiene 5 µl de agua en
lugar de solución de DNA. Para las dos PNMs (PNM EHEC 1 y PNM EHEC 2), prepare
una mezcla maestra que contenga todos los reactivos, excepto la solución de ADN,
y mezcle bién. No utilice vortex.
Si utiliza un termociclador sin tapa térmica, cubra las muestras con aceite mineral.
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