notice technique - Biocentric

Amplifikation
Mit jeder Probe werden zwei getrennte PCR-Reaktionen durchgeführt: ein Amplifikationsansatz
mit dem PNM EHEC 1 und ein Amplifikationsansatz mit dem PNM
EHEC 2.
Den Amplifikations-Mix (45 µl) in einem Raum herstellen, der garantiert frei von DNA
ist. Aus Gründen des Kontaminationsschutzes sollte die zu amplifizierende DNA in
einem abgetrennten Bereich zugegeben werden.
Pro Ansatz werden benötigt:
– 35 µl PNM EHEC 1 bzw. PNM EHEC 2
– 5 µl 10-fach Polymerase-Puffer – nicht im Kit enthalten
– x µl MgCl 2
-Lösung 1) – nicht im Kit enthalten
– 1–2 Unit(s) thermostabile DNA-Polymerase (Angaben des Herstellers beachten)
– nicht im Kit enthalten
– y µl Wasser zum Auffüllen auf 45 µl (ohne Berücksichtigung des Enzymvolumens)
– nicht im Kit enthalten
– 5 µl frisch isolierte DNA-Lösung (20–100 ng DNA) zugeben. Dies ergibt ein Endvolumen
von 50 µl (ohne Berücksichtigung des Enzymvolumens).
1)
Je nach eingesetztem Enzym/Puffersystem liegt die optimale MgCl 2
-Endkonzentration
zwischen 1,5 und 2,5 mM. Beachten Sie, dass manche 10-fach Polymerase-
Puffer bereits MgCl 2
enthalten.
Berechnen Sie die Anzahl der zu amplifizierenden Proben. Diese ergibt sich aus der
Zahl der zu untersuchenden Proben zuzüglich der Zahl der gewünschten Kontrollproben.
Einer Kontaminationskontrolle z. B. wird statt DNA-Lösung Wasser zugesetzt.
Erstellen Sie für beide PNMs (PNM EHEC 1 und PNM EHEC 2) jeweils einen Master-
Mix, der bis auf die DNA-Lösungen sämtliche zur Amplifikation benötigten Reagenzien
enthält und mischen Sie gut (nicht vortexen).
Bei Verwendung eines Thermocyclers ohne heizbaren Deckel müssen die Proben
mit Paraffinöl überschichtet werden.
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