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GenoType ® EHEC Test de Genética Molecular para identificación de los genes de las Shigatoxinas stx1 y stx2, el Gen eae, y el Gen ipaH Metodología El kit GenoType ® EHEC está basado en la tecnología DNA•STRIP ® y permite la identificación combinada de los genes stx1 y stx2 de la Shigatoxina, del gen eae, y del gen ipaH. El procedimiento completo se divide en tres pasos : aislamiento de DNA procedente de cultivo (crecimiento reciente en placas de cultivo; los reactivos necesarios no se suministran), una amplificación múltiplex con primers marcados con biotina (la DNA polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridación reversa. La hibridación incluye los siguientes pasos : desnaturalización química del producto a amplificar, hibridación de amplicones en una sola cadena, marcados con biotina, a sondas unidas a membrana, lavado astringente, adición de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una reacción de tinción mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretación sencilla y rápida del esquema de bandas obtenido. Almacenamiento y Precauciones A la recepción, almacenar el Primer/Mezclas de Nucleótidos (PNM EHEC 1 y PNM EHEC 2) a una temperatura de 2–8°C y aislado de cualquier fuente potencial de contaminación de ADN. Si se requiere almacenamiento durante más de 4 semanas, almacene a –20ºC. A fin de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote el PNM. Almacene el resto de los componentes del kit en 2–8°C. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes números de lote. Las muestras de pacientes deben siempre considerarse como potencialmente infecciosas. Las muestras procedentes de pacientes de riesgo han de ser etiquetadas y manipuladas bajo condiciones de seguridad. Observe todas las normas medioambientales y de seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuados. El tratamiento y preparación de la muestra, incluyendo el paso de inactivación por calor, deben ser llevados acabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del 52
paso de inactivación por calor las muestras deben ser centrifugadas en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Después de la inactivación por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la cabina de seguridad. Observe las precauciones normales para preparar la amplificación. Es esencial que todos los materiales y reactivos usados para aislamiento de DNA y amplificación estén libres de DNasas. Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad : La Solución de Desnaturalización (DEN) contiene
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