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QUANTA Lite TM Histone ELISA 708520Para Diagnóstico In VitroComplejidad de CLIA: AltoAplicaciónQUANTA Lite TM Histone es un ensayo basado en la técnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)para la detección semi cuantitativa de anticuerpos antihistona en suero humano. La presencia deanticuerpos antihistona puede ser utilizada en conjunción con hallazgos clínicos y otras pruebas delaboratorio como ayuda en el diagnóstico de Lupus Eritematoso Sistémico (LES), LES inducido por fármacosy enfermedades relacionadas con el tejido conectivo, como la artritis reumatoide, dermatomiositis o elsíndrome de Sjögren’s. Determinar el estado de los anticuerpos antihistona del paciente puede ser útil a lahora de diferenciar entre un diagnóstico de LES y LES inducido por fármacos.Sumario y Explicación de la pruebaLos anticuerpos antihistona han sido detectados entre el 18-53% de los pacientes con LES. 1,2 El 95% de lospacientes con lupus inducido por fármacos tiene autoanticuerpos contra la histona. Estos anticuerpos, dehecho, son el autoanticuerpo predominante en estos pacientes 1-5 , mientras que los pacientes con LESidiopático tienen más variedad de autoanticuerpos además de los antihistona. Los anticuerpos antihistonade la clase IgG han demostrado ser específicos del LES, mientras que los anticuerpos IgM los podemosencontrar tanto en gente sana como en personas con otras afecciones diferentes al LES 1,6,7Los anticuerpos antihistona pueden detectarse con diferentes métodos; el más utilizado es lainmunofluorescencia indirecta. 5 Este método es engorroso, subjetivo y no detecta los anticuerpos con lamisma fiabilidad para todas las subclases de histonas. 8 Los métodos ELISA más nuevos utilizan subclasesde histonas altamente purificadas y definidas, y así sortean muchas de las desventajas del procedimientoinmunofluorescente. El procedimiento ELISA permite testar convenientemente tanto muchas como pocasmuestras de pacientes y permite la detección de anticuerpos antihistona y permite la detección de perfilesde anticuerpos antihistona junto con los tests ELISA para los otros anticuerpos antinucleares específicos.Procedimiento de trabajoLos antígenos purificados de histonas se han unido a los pocillos de la microplaca en unas condiciones quemantienen su estado nativo. Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillosseparados, uniéndose durante la incubación los anticuerpos anti Histona al antígeno que los recubre. Elresto de componentes no unidos se elimina mediante lavado y se añade conjugado anti IgG humana a cadapocillo. Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los anticuerpos presentes. Trasun lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación se evalúala actividad enzimática presente en el pocillo, que es proporcional a la intensidad de color desarrollado. Elensayo puede ser evaluado fotométricamente comparando la intensidad de color en las muestras con la delos controles.Reactivos1. Microplaca ELISA de poliestireno con pocillos recubiertos con antígeno Histona purificado (12-1 x 8pocillos), envasada en su soporte en una bolsa de aluminio con desecante2. Control negativo ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano ausente deanticuerpos humanos anti Histona, prediluido, 1.2 ml3. Control ELISA Histona Positivo Débil, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humanocon anticuerpos anti Histona, prediluido, 1.2 ml4. Control ELISA Histona Positivo Fuerte, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suerohumano con anticuerpos anti Histona, prediluido, 1.2 ml5. Diluyente de Muestra HRP, 1 frasco color rosado conteniendo tampón con Tris, Tween 20 yconservante, 50 ml6. Solución de Lavado Concentrada HRP, 1 frasco de concentrado 40x color rojo conteniendo tampóncon Tris y Tween 20, 25ml. Referirse a la Sección “Metodología” para instrucciones de dilución.7. Conjugado HRP IgG, con anti-IgG humana de cabra, 1 frasco - color azul conteniendo tampón,estabilizante de proteína y conservante, 10ml8. Cromógeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml9. Solución de Parada HRP, Acido Sulfúrico 0.344 M, 1 frasco, incolora, 10 mlAdvertencias1. Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el Diluyente de muestras, controles yconjugado considerado en el estado de California como causante de cáncer.2. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se haexaminado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobadospor la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV ootros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles Histona ELISA positivo fuerte,Histona ELISA positivo débil y ELISA negativo deben manejarse como si fueran materialpotencialmente contagioso. 93. Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión oabsorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de lastuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para laeliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación dedichas azidas metálicas.1

4. El Conjugado HRP contiene diluido un producto químico venenoso y corrosivo que puede ser tóxicosi se ingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos.5. El Cromógeno TMB contiene un irritante. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido porla piel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos.6. La Solución de parada HRP consiste de una solución diluida de ácido sulfúrico. Evitar exposición abases, metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con ácidos. El ácido Sulfúrico esvenenoso y corrosivo, puede ser tóxico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto conpiel y ojos.7. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit.8. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en sulaboratorio acerca de la eliminación de residuos.Precauciones1. Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro.2. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultadosinconsistentes.3. Un lavado incompleto o ineficiente y una eliminación insuficiente de líquido de los pocillos puede darlugar a una pérdida de precisión y/o un fondo elevado.4. La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros dispositivos,totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados en comparación con elprocedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio de validar sus procedimientoautomatizado y comprobar que produce resultados dentro de los límites aceptables.5. Existe una variedad de factores que influyen en la realización del ensayo. Esto incluye latemperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la exactitud y reproducibilidad detécnica de pipeteo, la calidad de la técnica de lavando, el fotómetro que se utiliza para medir losresultados, y los tiempos de incubación durante el ensayo. Es necesario un exquisito cuidado y untrabajo consistente para obtener resultados exactos y reproducibles.6. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo.7. El sellado incompleto de la bolsa “zip-lock” que contenga tiras sin usar y desecante provocará ladegradación del antígeno que se apreciará en un empeoramiento de la precisión de resultados.8. Pueden observarse absorbancias inaceptablemente bajas tras dos o más usos separados de unconjugado HRP. Es importante seguir todas las recomendaciones de manipulación específicas paraeste producto para evitar que esto ocurra.9. La contaminación química del conjugado HRP puede ocurrir como resultado de una limpieza osecado inadecuados del equipo o instrumentos. Residuos de productos químicos comunes en ellaboratorio como formalina, lejía, etanol, o detergente causan la degradación del conjugado HRP conel tiempo. Enjuague bien todo equipo o instrumentos después de usar dichos productos.Condiciones de Almacenaje1. Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8°C. No congelar. Los reactivos son estables hastala fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente.2. Las tiras sin utilizar deben volverse a guardar en la bolsa de aluminio que contiene desecantescerrándola herméticamente y almacenándola a 2-8ºC.3. La solución de lavado diluida es estable 1 semana a 2-8°C.Recolección de MuestrasEste kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puedeafectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o quecontengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas.Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documentoNCCLS H18-A3 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar lasmuestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas,refrigerar la muestra a 2-8°C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras,congelar a -20°C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antesde utilizarse.ProcedimientoMateriales Suministrados1 Microplaca Histona ELISA (12-1 x 8 pocillos), con soporte1 1.2 ml control prediluido ELISA negativo1 1.2ml control prediluido Histona ELISA Positivo Débil1 1.2ml control prediluido Histona ELISA Positivo Fuerte1 50ml Diluyente de muestra HRP1 25ml Solución de lavado concentrada 40X1 10ml Conjugado HRP IgG (cabra) anti IgG humana1 10ml Cromógeno TMB1 10ml Solución parada HRP (Ácido Sulfúrico 0.344M)Material necesario no incluidoMicropipetas para 5, 100, 200-300 y 500µlPuntas desechables para micropipetaTubos para dilución de muestras, 4ml2

Cálculo de ResultadosDebe determinarse en primer lugar el promedio de densidades ópticas de cada juego de duplicados. Lareactividad para cada muestra se calcula dividiendo la densidad óptica promedio de la muestra por ladensidad óptica promedio del control Histona positivo débil.DO MuestraValor de la Muestra = —————————————————— x Valor ELISA Positivo Débil(unidades) DO ELISA Positivo Débil (unidades)La reactividad de la muestra está relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo presente.Mientras que los aumentos y disminuciones en la concentración de anticuerpos del paciente se reflejarán enel aumento o disminución correspondiente de la reactividad, los cambios no son proporcionales (porejemplo, al doblarse la concentración de anticuerpo no se dobla la reactividad). Si se deseara unacuantificación más precisa de la cantidad de anticuerpo, puede informarse como el título de anticuerpo de lamuestra la última dilución positiva de una serie de diluciones seriadas de la muestra.Interpretación de los ResultadosLa técnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeñas diferencias entre poblaciones depacientes. Los valores presentados a continuación son sólo valores sugeridos. Cada laboratorio debeestablecer su propio rango normal basado en su propia metodología, controles, equipo y población depacientes.La muestra puede clasificarse con un valor negativo, positivo débil, positivo moderado o positivo fuertesegún la tabla siguiente.UnidadesNegativo 2.51. Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anti Histona y sugiere la posibilidad deLupus Eritematoso Sistémico, LES inducido por fármacos y enfermedades relacionadas con el tejidoconectivo, como la artritis reumatoide, dermatomiositis o el síndrome de Sjögren’s y enfermedadesrelacionadas del tejido conectivo.2. Un resultado negativo indica la ausencia de anticuerpos antihistona o niveles inferiores al punto decorte del ensayo.3. Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmación “Los siguientesresultados se obtuvieron con el kit INOVA QUANTA Lite TM Histone ELISA. Los valores obtenidoscon kits de diferentes fabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. La magnitudde los niveles informados de IgG no puede correlacionarse con un punto final”.Limitaciones del Procedimiento1. La presencia de inmunocomplejos u otros agregados de inmunoglobulinas en la muestra delpaciente puede producir un aumento de uniones inespecíficas y causar falsos positivos en esteensayo.2. No todos los pacientes con LES o lupus inducido por fármacos dan positivo por histona.3. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otraspruebas serológicas.4. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.Valores EsperadosLa capacidad del procedimiento QUANTA Lite TM Histone ELISA para detectar anticuerpos antihistona seevaluó comparándola con los tests ELISA disponibles en el mercado. Los resultados del test ELISA sedeterminaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Rango NormalSe seleccionaron aleatoriamente ciento seis muestras de suero y fueron sometidas al test QUANTA Lite TMHistone ELISA. De estas muestras sólo dos presentaban un cociente de 1.0 o mayor (un positivo con estesistema ELISA). Una de estas muestras también dio un resultado positivo en el test del método dereferencia para anticuerpos antihistona, así como en los dos tests separados de inmunofluorescencia y fueseparada, en consecuencia, de la población normal. La otra muestra dio negativo con el test del método dereferencia de anticuerpos antihistona así como en los dos tests de inmunofluorescencia indirecta diferentesy en consecuencia fue considerado como perteneciente a la población normal. Esta muestra, aparentementeun falso positivo, produjo un cociente de 1.11, que está justo por encima del punto de corte positivo. Elcociente medio de la población fue 0.16, con una desviación estándar de 0.13. El rango de la población fuede 0.04 a 1.11. Esta prueba indica que la media de la población normal tiene una desviación estándar 6.5puntos por debajo de punto de corte.4

Sensibilidad y Especificidad RelativasPara determinar la sensibilidad y especificidad del ensayo, se testaron 42 muestras que habían sidopreviamente sometidas a la prueba de anticuerpos antihistona tanto con INOVA como con otro métodoELISA. De estas 42 muestras, 14 salieron positivas y 28 negativas en ambos métodos. Aparentemente nohubo falsos positivos ni negativos al compararlos con el método de referencia.INOVA+ -+ 14 0 Sensibilidad relativa 100%Método de referencia Especificidad relativa 100%- 0 28 Eficiencia relativa 100%Precisión y ReproducibilidadLa precisión y reproducibilidad del ensayo se midieron mediante seis replicados de muestras positivasfuerte, débil y negativas en cuatro ensayos separados. La reactividad media de los positivos fuerte fue de3.42 unidades, positivos débil fue de 1.34 unidades y la de los negativos fue de 0.28. La desviación estándary el coeficiente de variación para cada muestra se resume a continuación.Negativo Positivo Fuerte Positivo DébilGlobal Conjunto 0.014 4.8% 0.270 8.0% 0.040 3.8%Intra ensayo 0.010 3.4% 0.158 4.6% 0.051 3.8%Inter ensayo 0.014 4.8% 0.260 7.8% 0.037 2.8%Referencias1. Rubin RL, et. al.: Specificity of antihistone antibodies in systemic lupus erythematosus. ArthritisRheum 25: 779, 1982.2. Klajman A, et. al.: The prevalence of antibodies to histone induced by procainamide in old people, incancer patients and in rheumatoid like disease. Clin Immunol Immunopathol 27: 1, 1983.3. Biundo JJ and Cummings NA: Biochemical, hematologic and immunologic tests, Rheumatic Disease,Diagnosis and Management. Edited by AW Katz, Philadelphia, JB Lippincott, p.265, 1977.4. Epstein A and Barland P: The diagnostic value of antihistone antibodies in drug-induced lupuserythematosus. Arthritis Rheum 28: 158, 1985.5. Fritzler MJ and Tan EM: Antibodies to histones in drug-induced and idiopathic lupus erythematosus.J Clin Invest 62: 560, 1978.6. Krippner H, et. al.: Antibodies to histones of the IgG and IgM class in systemic lupus erythematosus.Clin Exp Immunol 58: 49, 1984.7. Gockel S and Binder WL: Immunoglobulin class specificity of antihistone. Arthritis Rheum (suppl) 28:558, 1985.8. Portanova JP, et. al.: Reactivity of anti-histone antibodies induced by procainamide and hydralazine.Clin Immunol Immunopathol 25: 67, 1982.9. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/NationalInstitutes of Health, 2007, Fifth Edition.Fabricante:INOVA Diagnostics, Inc.9900 Old Grove RoadSan Diego, CA 92131United States of AmericaRepresentante Autorizado:Medical Technology Promedt Consulting GmbHAltenhofstrasse 80D-66386 St. Ingbert, GermanyTel.: +49-6894-581020Fax.: +49-6894-581021www.mt-procons.comTechnical Service 888-545-9495628520ESP June 2009Revision 185