Principios de Bioquimica Clinica y Biologia Molecular - González

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16 Parte I— Introducción a la bioquímica clínica y patología molecular Por su parte, la absorbancia (A) es el logaritm o del inverso de la transm itancia: T % = 100 X - A = -logio (T ) = 2 - logio {T%)
Capítu lo 2— Metodología analítica I. Técnicas generales 17 Cp = Ce X Ap /Ac = Ap X K, siendo K = Q /A c Cuanto m ayor sea e, m ayor será la absorción del compuesto (crom ógeno) y m ás sensible será la determ inación. Por ello, interesa emplear cromógenos con un elevado valor de e. Siempre que sea posible, se ha de m edir la absorbancia a la longitud de onda de m áxim a absorción del compuesto o en su cercanía ya que se consigue la m áxim a sensibilidad y menores errores. Existen una serie de factores que afectan a la relación entre la absorbancia y la concentración, com o son: NAD-"+H-"+2e' NADH 1. Parte de la energía también será absorbida por el solvente y la pared de la celda que contiene la solución. 2. La luz incidente quizá no sea totalm ente m onocrom ática. 3. La energía puede ser también dispersada. Para tener en cuenta la interferencia de estos factores, se utilizan blancos que contienen todos los elementos de la solución, excepto el compuesto de interés. La absorbancia debida al com puesto será la diferencia entre la absorbancia de la m uestra y la absorbancia del blanco. Adem ás, hay que tener en cuenta que pueden estar presentes otros com puestos que interfieren, que absorben a la m ism a longitud de onda que el com puesto de interés (fig. 2-2) y que, por tanto, pueden producir cálculos erróneos de la concentración. Reacciones acopladas Se emplean en muchas de las reacciones enzim átícas que generan productos difíciles de determ inar directamente. Estas reacciones se acoplan a otras reacciones indicadoras que form an com puestos que pueden ser fácilm ente cuantificados mediante técnicas espectrales. Los productos de la reacción inicial se utilizan com o sustratos en las segundas reacciones indicadoras. Los productos de la reacción indicadora que se pueden detectar por un sistem a de m edida adecuado (p. ej., espectrofotom étricam ente) son proporcionales a la cantidad de sustrato inicial en la prim era reacción. Entre la reacción principal y la reacción indicadora es posible acoplar una o m ás reacciones interm edias. Las reacciones indicadoras más empleadas son las reacciones en que el H^Oj oxida un com puesto indicador, com o la reacción de Trinder, y la del seguim iento de la producción o el consum o del nicotinam ida adenina dinucleótido reducido (N A D H ). La reacción de Trinder se acopla a reacciones que provocan la form ación de H 2O 2 com o producto. El H 2O 2 producido es empleado entonces por una enzima peroxidasa ante un fenol y 4-am inofenazona (4A F) para generar una quinona coloreada que se detecta espectrofotom étricam ente: Peroxidasa 2H~0~ + fenol -1- 4A F • quinona + 4HjO La reacción de Trinder se acopla a métodos para cuantiñcar numerosas magnitudes bioquímicas, com o glucosa, colesterol, ácido úrico y triglicéridos, entre otros, que emplean sus respectivas oxidasas. En los métodos que emplean la reacción de Trinder puede haber interferencias por la existencia de com puestos antioxidantes, com o la bilirrubina, la hemoglobina o el ácido ascórbico, que pueden interferir en la reacción de oxidación. Debido a ello se ha de evitar la utilización de muestras muy ictéricas o hemolizadas. Longitud de onda (nm) Figura 2-3. Espectro de absorbancia del NAD*y del NADH. La conversión de uno en otro se puede seguir fácilmente por el cambio de absorbancia a 340 nm. NADH: nicotinamida adenina dinucleótido reducido. O tra form a de acoplar las reacciones es mediante el empleo de NADH o de N ADPH, que absorben a longitudes de onda de 340 nm , por lo que su producción o consum o pueden ser m onitorizados p o r espectrofotom etría. Por tanto, son muy empleados com o sustrato o producto en reacciones indicadoras de tipo redox (oxidación-reducción). Un ejemplo sería la determ inación de una enzim a-transam inasa que forme piruvato de m odo que la form ación de este compuesto se acople a una oxidación de NADH (o NADPH ) a NAD"" (o NADP""). En este caso, el descenso progresivo de la absorbancia a 340 nm será proporcional a la concentración de la enzim a-transam i- nasa (fig. 2-3): Transaminasa Cetoácido -1- alanina- LDH NADH -I- H* + piruvatoam inoácido -1- piruvato NAD"" -I- lactato En otros casos, en lugar de ser consum ido, el N A D H (o NADPH) es un producto de la reacción indicadora y, por consiguiente, se observará un aumento progresivo de la absorbancia a 3 40 nm: G lucosa-6-P-deshidrogenasa G lucosa-6-P -HNADP^----------------------- »■6-fosfogluconato -1- NADPH -I- H" Instrumentación Los espectrofotóm etros con stan de las siguientes partes (fig. 2-4): 1. U na lám para com o fuente estable de energía radiante, que suele ser una lám para de filamento (halógena o de tungsteno) para em itir longitudes de onda a partir de 350 nm y de hidrógeno o de deuterio para em itir en luz ultravioleta, entre 160 y 3 80 nm.
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