Principios de Bioquimica Clinica y Biologia Molecular - González

38 Parte I— Introducción a la bioquímica clínica y patología molecular
Fragmento que va
y a amplificarse r,
. . g
i
Cebadores
i
^
Desnaturalización •
Hibridación
i ADN-polimerasa
25-40 ciclos
Elongación
ADN amplificado
Min
Figura 3-6A. Reacción de la cadena de la polimerasa en que el ADN se somete a ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación con la enzima
ADN-polimerasa. Se indican los cambios de temperatura durante el proceso de los ciclos.
de la muestra y para desnaturalizar completamente el ADN
que se va a amplificar.
2. Después, 2 5 -4 0 ciclos, cada uno de los cuales consta de los
siguientes pasos:
a) Fase de hibridación (annealing), para lo cual se dism i­
nuye la tem peratura a 5 0 -6 5 ®C durante 1-2 m in para
perm itir que los cebadores se hibriden con sus respectivas
secuencias com plem entarias en el ADN que se
desea am plificar.
b) Fase de elongación, en la cual se eleva la tem peratura a
unos 72 ®C, dependiendo de la polimerasa. Esta tem ­
peratura es adecuada para que esta enzima sintetice una
secuencia complementaria usando el ADN como molde
a partir del cebador y de los desoxinucleótidos trifosfato
en dirección 3’. Esta fase se mantiene durante un
tiempo suficiente para que se realice la copia completa
(1-3 min).
c) Fase de desnaturalización m ediante calentam iento a
unos 94 ■’C durante 1 min, en la cual se separan las dos
hebras del A D N para producir hebras sencillas.
3. Al term in ar los ciclos, hay una etapa final, en la cual se
prolonga la últim a elongación unos 10 m in para asegurar
que todos los fragmentos se han amplificado.
El núm ero de amplificaciones del ADN de partida será de
2 n.“decidos eficacia óptim a; por ejemplo, tras 20 ciclos
se form an 2“ copias, esto es, el ADN se amplifica m ás de un
millón de veces. El producto de las amplificaciones (P) que se
obtiene también depende de la cantidad de copias de ADN inicial
(C):
P _ ^ y 2^'“ ciclos
La detección de los productos de PC R se puede realizar
mediante técnicas com o la electroforesis en gel de agarosa, ya
que la cantidad que se produce suele ser suficiente para visualizarse
con tinción con brom uro de etidio o SYBR Green.
Esta técnica de biología molecular es la más utilizada en los
laboratorios clínicos ya que permite detectar de forma rápida
pequeñas cantidades de ADN y es muy específica de la secuencia.
Además, es sencilla y automatizable y existen tanto equipos
como sistemas comerciales para realizarla. Se utiliza en la detección
de diversos agentes infecciosos que son difícilmente cultivables
(VIH , etc.). También tiene aplicaciones en la detección
de mutaciones puntuales, deleciones o inserciones (analizando
la longitud del producto de la PCR), o incluso translocaciones.
Debido a su elevada sensibilidad, es necesaria una gran m eticulosidad
en el procedimiento y en la limpieza para evitar contaminaciones
que alteren el resultado.
Un ejemplo de la aplicación de la PCR en la farm acogenóm
ica se puede observar en la figura 3-6B . El m edicam ento
antineoplásico 5-fluorouracilo actúa inhibiendo la enzim a
timidilato-sintasa e impide el crecim iento tum oral. La presencia
de tres repeticiones en tándem de 28 pares de bases en la
región prom otora del gen de esta enzim a causa un aumento
de su expresión. Así pues, los individuos homocigóticos para
el polim orfism o de tres repeticiones tienen una respuesta
m enor al fárm aco ya que presentan m ayor expresión de esta
enzim a que los que tienen dos repeticiones. La detección de
las repeticiones en tándem se realiza mediante el siguiente procedimiento:
Se extrae sangre con ED TA y se separan las células
mononucleares con un gradiente de Ficoll. Posteriormente
se extrae del ADN, que se amplifica mediante PCR y los productos
amplificados se separan en un gel de agarosa. Se identifica
a los individuos quimiorresistentes por la m igración más
lenta del fragm ento amplificado de 3 repeticiones respecto al
fragm ento de 2 repeticiones.