Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

N° : 2006-ISAL-0031 ANNEE 2006 

THESE EN COTUTELLE 

Présentée devant 

L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON 

Et 

LA FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE MOHAMMEDIA 

Pour obtenir 

LE GRADE DE DOCTEUR 

Formation doctorale: Biochimie 

Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences Santé 

Et 

UFR Biotechnologies et Génie de Dépollution 

Par 

AMAL BENZARIA 

ETUDE BIOCHIMIQUE ET NUTRITIONNELLE DE L’EFFET 

IMMUNOMODULATEUR DES HUILES D’ARGAN, DE POISSON ET D’OLIVE. 

EFFETS COMPARES DE LEURS ACIDES GRAS 

Soutenue le 24 juin 2006 

Jury de thèse : 

M. le Pr. A. ADLOUNI. (Rapporteur) 

Mme. le Pr. Z. CHARROUF (Rapporteur) 

M. le Pr. S. EL ANTRI (Examinateur) 

Mme.le Pr. F. ERGAN (Rapporteur) 

M. le Pr. M. LAGARDE (Président) 

M. le Pr. F. MELLOUKI (Examinateur) 

Mme. le Pr. N. MESKINI (Directeur de thèse) 

Mme. le Dr. A.F. PRIGENT (Directeur de thèse)Cette thèse a été préparée au 

laboratoire de physiopathologie des lipides et des membranes de l’INSA (INSERM UMR585) 

Thèse soutenue par le comité mixte interuniversitaire franco-marocain dans le cadre de l’action intégrée MA/01/25.

FOLIOS ADMINISTRATIFS 

Novembre 2003 

INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON 

Directeur : STORCK A. 

Professeurs : 

AMGHAR Y. 

LIRIS 

AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE 

BABOT D. 

CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS 

BABOUX J.C. GEMPPM*** 

BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE 

BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS 

BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE 

BASKURT A. LIRIS 

BASTIDE J.P. LAEPSI**** 

BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS 

BENADDA B. LAEPSI**** 

BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE 

BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS 

BLANCHARD J.M. LAEPSI**** 

BOISSE P. LAMCOS 

BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE 

BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES 

BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain 

BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain 

BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE 

BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES 

BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment 

BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE 

BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE 

BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES 

BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION 

BUFFIERE J-Y. GEMPPM*** 

BUREAU J.C. CEGELY* 

CAMPAGNE J-P. PRISMA 

CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** 

CHAMPAGNE J-Y. LMFA 

CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications 

CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine 

COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS 

COURBON GEMPPM 

COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures 

DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique 

DJERAN-MAIGRE I. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL 

DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE 

DUBUY-MASSARD N. ESCHIL 

DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES 

DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE 

EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION 

ESNOUF C. GEMPPM*** 

EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE 

FANTOZZI G. GEMPPM*** 

FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS 

FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS 

FAYET M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES 

FAZEKAS A. GEMPPM 

FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES 

FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS 

FLEURY E. CITI 

FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS 

FOUGERES R. GEMPPM*** 

FOUQUET F. GEMPPM*** 

FRECON L. (Prof. émérite) REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES 

GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES 

GERMAIN P. LAEPSI**** 

GIMENEZ G. CREATIS** 

GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** 

GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE 

GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE 

2

GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** 

GOUJON L. GEMPPM*** 

GOURDON R. LAEPSI****. 

GRANGE G. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE 

GUENIN G. GEMPPM*** 

GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE 

GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE 

GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS 

GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE 

GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE 

HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON 

JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES 

JAYET Y. GEMPPM*** 

JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION 

Novembre 2003 

JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures 

JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE 

KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique 

KOULOUMDJIAN J. (Prof. émérite) INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION 

LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE 

LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES 

LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique 

LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique 

LAREAL P (Prof. émérite) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique 

LAUGIER A. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE 

LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE 

LAURINI R. INFORMATIQUE EN IMAGE ET SYSTEMES D’INFORMATION 

LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE 

LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS 

MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE 

MAZILLE H. (Prof. émérite) PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE 

MERLE P. GEMPPM*** 

MERLIN J. GEMPPM*** 

MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE 

MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE 

MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine 

MOREL R. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES 

MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** 

NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS 

NAVARRO Alain (Prof. émérite) LAEPSI**** 

NELIAS D. LAMCOS 

NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE 

NORMAND B. GEMPPM 

NORTIER P. DREP 

ODET C. CREATIS** 

OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** 

PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE 

PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES 

PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE 

PECORARO S. GEMPPM 

PELLETIER J.M. GEMPPM*** 

PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux 

PERRIAT P. GEMPPM*** 

PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE 

PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE 

PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION 

PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE 

POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE 

PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE 

PROST R. CREATIS** 

RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux 

REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE 

RETIF J-M. CEGELY* 

REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures 

RICHARD C. LGEF 

RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES 

RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES 

ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES 

ROUBY D. GEMPPM*** 

ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat 

RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION 

SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux 

SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES 

SCAVARDA S. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE 

3

SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE 

SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE 

THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE 

THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon 

UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES 

VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS 

VERMANDE P. (Prof émérite) LAEPSI 

VIGIER G. GEMPPM*** 

VINCENT A. GEMPPM*** 

VRAY D. CREATIS** 

VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE 

Directeurs de recherche C.N.R.S. : 

BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS 

CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE 

COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE 

ESCUDIE D. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON 

FRANCIOSI P. GEMPPM*** 

MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE 

POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE 

ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES 

SEGUELA A. GEMPPM*** 

VERGNE P. LaMcos 

Directeurs de recherche I.N.R.A. : 

FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS 

GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS 

RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS 

Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : 

KOBAYASHI T. PLM 

PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE 

MAGNIN I. (Mme) CREATIS** 

* CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON 

** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAI 

TEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL 

***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX 

****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS 

4

SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE 

E2MC 

E.E.A. 

E2M2 

EDIIS 

EDISS 

CHIMIE DE LYON 

ECONOMIE, ESPACE ET 

MODELISATION 

DES 

COMPORTEMENTS 

ELECTRONIQUE, 

ELECTROTECHNIQUE, 

AUTOMATIQUE 

EVOLUTION, ECOSYSTEME, 

MICROBIOLOGIE, MODELISATION 

http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2 

INFORMATIQUE ET INFORMATION 

POUR LA SOCIETE 

http://www.insa-lyon.fr/ediis 

INTERDISCIPLINAIRE 

SANTE 

http://www.ibcp.fr/ediss 

MATERIAUX DE LYON 

http://www.ec-lyon.fr/sites/edml 

SCIENCES- 

M. Denis SINOU 

Université Claude Bernard Lyon 1 

Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS 

5622 

Bât 308 

2 ème étage 

43 bd du 11 novembre 1918 

69622 VILLEURBANNE Cedex 

Tél : 04.72.44.81.83 

sinou@univ-lyon1.fr 

M. Alain BONNAFOUS 

Université Lyon 2 

14 avenue Berthelot 

MRASH 

Laboratoire d’Economie des Transports 

69363 LYON Cedex 07 

Tél : 04.78.69.72.76 

Alain.Bonnafous@mrash.fr 

M. Daniel BARBIER 

INSA DE LYON 

Laboratoire Physique de la Matière 

Bâtiment Blaise Pascal 


Tél : 04.72.43.64.43 

Daniel.Barbier@insa-lyon.fr 

M. Jean-Pierre FLANDROIS 

UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive 

Equipe Dynamique des Populations 

Bactériennes 

Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de 

Bactériologie BP 1269600 OULLINS 

Tél : 04.78.86.31.50 

Jean-Pierre.Flandrois@biomserv.univ-lyon1.fr 

M. Lionel BRUNIE 

INSA DE LYON 

EDIIS 

Bâtiment Blaise Pascal 


Tél : 04.72.43.60.55 

lbrunie@if.insa-lyon.fr 

M. Alain Jean COZZONE 

IBCP (UCBL1) 

7 passage du Vercors 

69367 LYON Cedex 07 

Tél : 04.72.72.26.75 

cozzone@ibcp.fr 

M. Jacques JOSEPH 

Ecole Centrale de Lyon 

Bât F7 Lab. Sciences et Techniques des 

Matériaux et des Surfaces 

36 Avenue Guy de Collongue BP 163 

69131 ECULLY Cedex 

Tél : 04.72.18.62.51 

Jacques.Joseph@ec-lyon.fr 

5

Math IF 

MEGA 

MATHEMATIQUES 

ET 

INFORMATIQUE FONDAMENTALE 

http://www.ens-lyon.fr/MathIS 

MECANIQUE, ENERGETIQUE, 

GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE 

http://www.lmfa.eclyon.fr/autres/MEGA/index.html 

M. Franck WAGNER 

Université Claude Bernard Lyon1 

Institut Girard Desargues 

UMR 5028 MATHEMATIQUES 

Bâtiment Doyen Jean Braconnier 

Bureau 101 Bis, 1 er étage 


Tél : 04.72.43.27.86 

wagner@desargues.univ-lyon1.fr 

M. François SIDOROFF 

Ecole Centrale de Lyon 

Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes 

Bât G8 

36 avenue Guy de Collongue 

BP 163 

69131 ECULLY Cedex 

Tél :04.72.18.62.14 

Francois.Sidoroff@ec-lyon.fr 

6

Dédicace 

Je dédie ce travail 

A mes parents 

Toutes les lettres ne sauraient trouver les mots qu’il 

faut… 

Tous les mots ne sauraient exprimer la gratitude, l’amour 

Le respect, la reconnaissance… 

Aussi, c’est tout simplement que 

Je souhaite que Dieu vous préserve une longue vie. 

A mes sœurs : Nadia, Hanane, Hasna, à mon frère Kamel 

et à mon beau frère Simo 

Pour leur soutien moral 

Pour leurs encouragements et leur affection 

A eux tous, je souhaite un avenir plein de joie, de 

bonheur et de succès. 

Aux petits anges de la famille : Saida ma fée magique, 

Aymen, Malak et Nizzar. 

7

REMERCIEMENTS 

Les recherches qui font l’objet de ce mémoire ont été réalisées dans le laboratoire de 

Physiopathologie des Lipides et Membranes INSERM/INSA - Lyon UMR 585 

Le lecteur se demandera sans doute pourquoi la section des remerciements est si longue. La 

réponse est simple : bien qu'étant un effort personnel, un travail de thèse ne peut aboutir sans 

l'aide d'un certain nombre de personnes. Je remercierai toutes celles sans qui cette thèse ne 

serait pas ce qu'elle est (aussi bien par les discussions que j'ai eu la chance d'avoir avec eux, 

leurs suggestions ou contributions). Et je remercierai aussi toutes les personnes que j’ai pu 

rencontrer. Le nombre de personnes qui ont rendu ces années de thèse agréables n’a fait que 

croître au fil des années. Si j’oublie une personne dans cet exercice, et je le ferai sans doute, 

je m’en excuse d’avance. 

Je tiens à remercier en tout premier lieu M. le professeur Michel LAGARDE, je tiens à vous 

exprimer toute ma reconnaissance pour m’avoir accueillie dans votre laboratoire. Je vous 

suis très reconnaissante aussi d’avoir accepté la présidence du jury de cette thèse. Trouvez ici 

l’expression de mes sincères remerciements. 

Je tiens à exprimer mes remerciements : 

A Mme Annie France PRIGENT, merci de m’avoir accueillie au sein de votre équipe et 

d’avoir assuré la direction et l’encadrement de ces travaux de thèse. Merci pour votre 

disponibilité, votre gentillesse, votre patience, et vos précieux conseils. J’ai vraiment 

apprécié de travailler à vos côtés tant sur le plan scientifique que sur le plan humain. Je 

garde toujours beaucoup de plaisir à discuter avec vous et à profiter de vos conseils. 

A Mme Nadia MESKINI, merci de m’avoir encadrée dans ce travail de thèse. Merci pour 

votre aide technique et pour vos longues discussions scientifiques. 

Je tiens à remercier Mme le Professeur Françoise ERGAN, Mme le professeur Zoubida 

CHARROUF et M. le professeur Ahmed ADLOUNI de m’avoir fait l’honneur d’accepter 

d’être rapporteurs de cette thèse, me permettant ainsi de bénéficier de leur expertise. Je les 

remercie pour le temps qu’ils ont consacré à juger ce travail et je tiens à leur exprimer ma 

respectueuse considération. Merci également aux autres membres du jury qui ont accepté de 

juger ce travail : M. le professeur Said El ANTRI et M. le professeur Fouad MELLOUKI. 

. 

8

Je remercie également Mme Madeleine DUBOIS qui m’a initiée à la manipulation correcte 

de la CPV. Merci pour ton précieux soutien, tes encouragements dans les moments difficiles. 

C’est l’occasion pour moi de te témoigner mon amitié. 

A Mme Olga MACOVSCHI, Mme Evelyne VERICEL et M. George NEMOZ, merci pour 

les encouragements, les conseils et l’attention que vous avez portée à mon égard. 

Je remercie l'ensemble des membres du laboratoire "Physiopathologie des Lipides et 

Membranes" INSA/INSERM pour la sympathie ou l'aide qu'ils m'ont témoignées durant ces 

années de thèse, notamment Patrick, Madeleine, Salam, Nicolas, Catherine, Véronique, 

Laurence, Fabien et Christophe. Qu’il est bon d’apprendre au contact de gens chaleureux 

comme vous. 

A M Fabio NARO, merci pour ta gentillesse. Merci de m’avoir donné l’occasion de 

découvrir l’une des plus belles villes du monde, Rome et de m’avoir permis de connaître la 

générosité d’une mama italienne. 

Il y a certaines personnes qui méritent un remerciement spécial: celles qui ont été à mes côtés 

dans les moments les plus durs et celles qui ont créé et partagé tant de si bons souvenirs avec 

moi. Ce sont souvent les mêmes. Je les remercie de croire en moi lorsque j'ai de la difficulté à 

croire en moi-même. A tout ce beau monde je dis un GROS MERCI : mon entourage 

familial. Mes amis thézards : Bader, Hiba, Saida, Anisio, Caroline et Salim. Mes amies de 

toujours : Samira, Hakima, Nadia Nassim, Farida et Rachida. 

Je n’oublierai pas de remercier la famille Mebarrek Azzam pour leur accueil, je tiens à 

remercier la maman avec laquelle j’ai passé des moments inoubliables devant la télé 

algérienne. Elle m’a fait découvrir son merveilleux pays, l’Algérie. Je lui dis qu’elle sera 

toujours la bienvenue chez moi pour lui faire découvrir mon pays le Maroc. 

9

RESUME 

L’huile d’argan est extraite de l’arganier « Argania spinosa L.» (Skeels). Cette huile est 

caractérisée par sa composition lipidique unique et sa richesse en acides oléique et linoléique. 

Alors qu’elle suscite un intérêt croissant pour ses effets bénéfiques dans la prévention des 

maladies cardiovasculaires, son rôle potentiel sur les fonctions immunitaires n’est pas connu. 

C’est pourquoi, nous avons réalisé une étude nutritionnelle visant à comparer l’effet 

immunomodulateur d’un régime enrichi en huile d’argan (HA) à ceux de régimes riches en 

huiles de poisson (HP), d’olive (HO), de noix de coco (HC) et de tournesol (HT), administrés 

pendant quatre semaines chez le rat. 

Nos résultats ont montré que les différents régimes induisent des changements dans la 

composition en acides gras des triglycérides et des phospholipides plasmatiques, et à un degré 

moindre dans les phospholipides des thymocytes. Les thymocytes des rats nourris avec un 

régime enrichi en huile de coco ont une réponse proliférative significativement diminuée par 

rapport aux autres groupes, alors que les réponses les plus fortes sont observées chez les 

animaux des groupes poisson et tournesol. De plus, une corrélation positive a été établie entre 

la réponse proliférative aux mitogènes et la proportion de 18 :2n-6 dans les phospholipides 

cellulaires, quel que soit le régime. Cette réponse proliférative est aussi corrélée négativement 

avec l’activité phospholipase D (PLD) thymocytaire. Les résultats de Western blotting 

indiquent que les variations d’activité PLD induites par les différents régimes reflètent 

essentiellement les variations d’expression de la protéine PLD2. Parallèlement, des travaux 

ont été réalisés in vitro afin de vérifier les effets des acides gras majeurs des différentes huiles 

sur la prolifération et l’activité PLD. Nous avons mis en évidence une corrélation négative 

entre la réponse proliférative aux mitogènes et l’activité PLD. 

L’ensemble de nos résultats indique que l’huile d’argan est dépourvue d’effets majeurs sur la 

prolifération lymphocytaire et que son profil immunomodulateur est proche de celui de l’huile 

d’olive. L’huile d’argan s’étant montrée par ailleurs plus efficace dans la prévention des 

maladies cardiovasculaires, sa consommation peut être recommandée sans restriction 

puisqu’elle est dépourvue d’effets secondaires au niveau du système immunitaire. 

MOTS-CLES : Huile d’argan, thymocytes de rat, immunomodulation, prolifération, 

phospholipase D, acide linoléique, acide oléique. 

10

AVANT-PROPOS 

Le travail présenté dans ce mémoire a fait l’objet de publications parues et sous presse. Ces 

résultats ont également été présentés par communications affichées ou orales lors de congrès 

scientifiques. En voici les références : 

Publications scientifiques : 

Benzaria A, Meskini N, Dubois M, Croset M, Némoz G, Lagarde M and Prigent A.F (2006). 

The effet of dietary argan oil on fatty acid composition, proliferation and phospholipase D 

activity of rat thymocytes; Nutrition: Publication sous presse. 

Benzaria A, Meskini N, Dubois M, Némoz G, Lagarde M and Prigent A.F (2006). 

Phospholipase D as apotential target for the antiproliferative effects of polyunsatured fatty 

acids in rat thymocytes, Journal of Nutritional Biochemistry: publication acceptée. 

Diaz O, Mebarek S, Benzaria A, Dubois M, Lagarde M, Némoz G and Prigent AF (2005). 

Disruption of lipid rafts stimulates phospholipase D activity in humain lymphocytes: 

implication in the regulation of immune function, Journal of Immunology, 175(12):8077-86. 

Communications affichées: 

Diaz O, Mebarek S, Benzaria A, Dubois M, Lagarde M, Némoz G and Prigent AF (2005). 

Disruption of lipid rafts stimulates phospholipase D activity in human lymphocytes: 

implication in the regulation of immune function, 46 th International Conference on the 

Bioscience of Lipids (ICBL), Ajaccio, Corse, septembre 2005 

Benzaria A, Meskini N, Dubois M, Lagarde M, Némoz G et Prigent AF. Étude nutritionnelle 

comparative des effets immunomodulateurs des huiles de poisson, d’argan, d’olive, de noix 

de coco et de tournesol. 2 ème congrès de la Nouvelle Société Française d’Athérosclérose, 

(NSFA) Biarritz, France, juin2005. 

Benzaria A, Meskini N, Dubois M, Lagarde M, Némoz G et Prigent AF. Étude nutritionnelle 

comparative des effets immunomodulateurs des huiles de poisson, d’argan, d’olive et de noix 

11

de coco. 8 ème journée scientifique de l’Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences et Santé 

(EDISS) Lyon, France, Avril 2004. 

Benzaria A, Meskini N, Dubois M, Lagarde M, Némoz G et Prigent AF. Étude biochimique 

de l’effet immunomodulateur des acides gras insaturés extraits des huiles de poisson, 

d’argan et d’olive. Congrès lipidomique, Gerli, Paris, France, Septembre 2003. 

Benzaria A, Meskini N, Lagarde M et Prigent AF. Eude biochimique et nutritionnelle de 

l’effet immunomodulateur des acides gras insaturés extraits des huiles de poisson, d’argan et 

d’olive. 1 er Congrès National de Biochimie, Casablanca, Maroc, Mai 2002. 

Communications orales : 

Benzaria A, Meskini N, Dubois M, Lagarde M et Prigent AF. Etude biochimique et 

nutritionnelle de l’effet immunomodulateur des acides gras insaturés extraits des huiles de 

poisson, d’argan et d’olive. Congrès International de Biochimie, Marrakech, Maroc, Mai 

2004. 

Benzaria A, Meskini N, Dubois M, Lagarde M et Prigent AF. Huiles de poisson, d’argan et 

d’olive: étude comparative des effets immunomodulateurs. Journée d’Études des Lipides 

(JEL) Mohammedia, Maroc, Décembre 2003. 

12

TABLE DES MATIERES 

REMERCIEMENTS................................................................................................................ 8 

RESUME................................................................................................................................. 10 

AVANT-PROPOS .................................................................................................................. 11 

TABLE DES MATIERES ..................................................................................................... 13 

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX............................................................................. 18 

LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................. 22 

I- INTRODUCTION GENERALE....................................................................................... 24 

II- RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................ 27 

II-1- LE SYSTEME IMMUNITAIRE............................................................................................ 27 

II-1-1 Généralités............................................................................................................. 27 

II-1-2 Immunité adaptative et immunité innée ................................................................. 27 

II-1-3 Les cellules du système immunitaire...................................................................... 28 

II-1-3-1 Les phagocytes ............................................................................................... 30 

II-1-3-1-1 Les polynucléaires................................................................................... 30 

II-1-3-1-2 Les phagocytes mononucléés.................................................................. 30 

II-1-3-2 Les lymphocytes............................................................................................. 30 

II-1-3-2-1 Les lymphocytes B.................................................................................. 30 

II-1-3-2-2 Les lymphocytes T .................................................................................. 33 

II-1-3-2-3 Les lymphocytes non T non B ou nuls.................................................... 35 

II-1-4 Activation lymphocytaire ....................................................................................... 35 

II-1-4-1 Microdomaines membranaires ....................................................................... 35 

II-1-4-2 La composition des radeaux lipidiques .......................................................... 39 

II-1-4-2-1 Composition lipidique............................................................................. 39 

II-1-4-2-2 Composition protéique ............................................................................ 40 

II-1-4-3 Radeaux lipidiques : réalité ou artéfact ?........................................................ 41 

II-1-4-4 Radeaux lipidiques, cavéoles, DRMs : mêmes structures ? ........................... 44 

II-1-4-5 Les fonctions cellulaires des radeaux lipidiques ............................................ 45 

II-1-4-6 DRMs, lieu de signalisation............................................................................ 45 

II-2 LA PHOSPHOLIPASE D..................................................................................................... 48 

II- 2-1 Introduction........................................................................................................... 48 

13

II-2-2 La réaction d’hydrolyse catalysée par la PLD...................................................... 48 

II-2-3 Mesure de l’activité PLD....................................................................................... 50 

II-2-4 Clonage et caractérisation de la PLD ................................................................... 51 

II-2-5 Structure de la PLD ............................................................................................... 52 

II-2-5-1 Motifs HKD et mécanisme catalytique .......................................................... 52 

II-2-5-2 Les régions conservées I et III (CRI et CRIII) ............................................... 53 

II-2-5-3 Les domaines PH et PX.................................................................................. 55 

II-2-5-4 Les régions amino et carboxy-terminales....................................................... 55 

II-2-5-5 La boucle centrale de PLD1 ........................................................................... 56 

II-2-6 Régulation de la PLD............................................................................................. 56 

II-2-6-1 Régulation par le phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PIP2).................... 58 

II-2-6-2 Les protéines G monomériques ..................................................................... 58 

II-2-6-2-1 Régulation par les protéines ARF « ADP-Ribosylation Factor » ........... 59 

II-2-6-2-2 Régulation par les protéines Rho ............................................................ 60 

II-2-6-3 Régulation par les protéines kinases C (PKC)................................................ 60 

II-2-6-4 Régulation par les tyrosines kinases............................................................... 62 

II-2-6-5 Régulation par le calcium (Ca 2+ ) .................................................................... 62 

II-2-6-6 Régulation par des facteurs inhibiteurs .......................................................... 62 

II-2-7 Localisation des PLD............................................................................................. 63 

II-2-7-1 Localisation tissulaire..................................................................................... 63 

II-2-7-2 Localisation subcellulaire............................................................................... 64 

II-2-8 Rôles physiologiques de la PLD ............................................................................ 66 

II-2-8-1 PLD et prolifération cellulaire........................................................................ 67 

II-3 ACIDES GRAS ET IMMUNITE............................................................................................ 68 

II-3-1 Généralités............................................................................................................. 68 

II-3-2 Nomenclature des AG ........................................................................................... 69 

II-3-3 Les acides gras essentiels (AGE)........................................................................... 71 

II-3-4 Rôle biologique des AG: ........................................................................................ 71 

II-3-4-1 Rôle énergétique:............................................................................................ 71 

II-3-4-2 Rôle structural: ............................................................................................... 71 

II-3-4-3 Rôle fonctionnel ............................................................................................. 73 

II-3-4-3-1 Synthèse des eicosanoïdes....................................................................... 73 

II-3-4-3-2 Régulation de la transmission membranaire du signal :.......................... 74 

II-3-5 Sources habituelles des AGE et de l’acide oléique............................................... 74 

14

II-3-5-1 Huile d’olive................................................................................................... 77 

II-3-5-2 Huile de sardine.............................................................................................. 77 

II-3-5-3 Huile d’argan .................................................................................................. 78 

II-3-5-3-1 Utilisation de l’huile d’argan................................................................... 79 

II-3-6 Effet des AG sur les fonctions immunitaires.......................................................... 80 

II-3-6-1 Données épidémiologiques............................................................................. 81 

II-3-6-2 Effets des AG sur les fonctions immunitaires ................................................ 82 

II-3-6-2-1 Effets antiprolifératifs «in vitro»............................................................. 82 

II-3-6-2-2 Effets antiprolifératifs dans les études nutritionnelles ............................ 83 

II-3-7 Mécanismes d’action des AG................................................................................ 86 

II-3-7-1 Effets des AG sur la synthèse d’eicosanoïdes ................................................ 87 

II-3-7-2 Effets des AG sur les radeaux lipidiques........................................................ 89 

II-3-7-3 Effets des AG sur la structure et les fonctions membranaires........................ 91 

II-3-7-4 Effets des AG sur l’expression des gènes....................................................... 91 

III- MATERIELS ET METHODES .................................................................................... 95 

III-1 MATERIELS................................................................................................................... 95 

III-1-1 Appareils...............................................................................................................95 

III-1-2 Réactifs ................................................................................................................. 96 

III-2 METHODES.................................................................................................................... 97 

III-2-1 Préparation des régimes et administration aux animaux..................................... 97 

III-2-2 Préparation des échantillons biologiques ............................................................ 99 

III-2-2-1 Le plasma ...................................................................................................... 99 

III-2-2-2 Préparation des thymocytes........................................................................... 99 

III-2-3 Préparation des complexes acide gras albumine................................................. 99 

III-2-4 Test de prolifération ........................................................................................... 100 

III-2-5 Dosage de l’activité PLD des cellules intactes .................................................. 102 

III-2-5-1 Marquage des cellules avec de l’acide arachidonique tritié........................ 102 

III-2-5-2 Activation mitogénique des thymocytes ..................................................... 102 

III-2-5-3 Extraction lipidique..................................................................................... 102 

III-2-5-4 Séparation du Pbut et du PA par CCM ....................................................... 103 

III-2-5-5 Quantification de la radioactivité du [ 3 H]-Pbut et du [ 3 H]-PA ................... 103 

III-2-6 Dosage de l’activité PLD en système acellulaire............................................... 104 

III-2-6-1 Activité PLD oléate sensible....................................................................... 104 

15

III-2-6-2 Activité PLD PIP2 sensible......................................................................... 104 

III-2-7 Analyse de la composition en acides gras des phospholipides totaux de 

thymocytes et des triglycérides et phospholipides plasmatiques par chromatographie en 

phase gazeuse (CPG) ..................................................................................................... 105 

III-2-8 Etude des microdomaines................................................................................... 106 

III-2-8-1 Isolement des microdomaines à partir des thymocytes de rat..................... 106 

III-2-8-2 Dosage du ganglioside GM1 et du PIP2 dans les fractions des gradients... 107 

III-2-8-3 Dosage du cholestérol ................................................................................. 108 

III-2-8-4 Dosage des phospholipides ......................................................................... 109 

III-2-8-5 Dosage des protéines................................................................................... 109 

III-2-8-5-1 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976)................... 109 

III-2-8-5-2 Dosage des protéines par la méthode Schaffner–Weissmann (1973).. 109 

III-2-9 Electrophorèse en SDS-PAGE et "Western-blotting" : ...................................... 110 

III-2-9-1 Préparation des échantillon : ....................................................................... 110 

III-2-9-2 Précipitation des protéines par l’acétone à froid : ....................................... 110 

II-2-9-3 Electrophorèse en SDS-PAGE : ................................................................... 110 

III-2-10 Transcription inverse et Réaction en chaîne de la polymérase........................ 111 

III-2-10-1 Préparation des ARN................................................................................. 111 

III-2-10-2 Transcription inverse (RT)........................................................................ 112 

III-2-10-3 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) ............................................. 112 

III-2-10-4 Electrophorèse sur gel d'agarose des ADN ............................................... 114 

III-2-11 Analyses statistiques des résultats.................................................................... 114 

IV- RESULTATS ................................................................................................................. 115 

IV-1 EFFET DES ACIDES GRAS «IN VITRO» SUR LES FONCTIONS IMMUNES........................... 115 

IV-1-1 Effet des acides gras « in vitro » sur la réponse proliférative des thymocytes de 

rat. .................................................................................................................................. 115 

IV-1-2 Effet des AGI « in vitro » sur l’activité PLD des thymocytes de rat................... 118 

IV-1-2-1 Caractérisation de la PLD des thymocytes de rat ....................................... 119 

IV-1-2-2 Effet des acides gras «in vitro» sur l’activité PLD ..................................... 123 

IV-1-3 Caractérisation des DRMs dans les thymocytes de rat ...................................... 129 

IV-1-3-1 Détection du ganglioside GM1 ................................................................... 130 

IV-1-3-2 Détection du PIP2 ....................................................................................... 131 

IV-1-3-3 Dosage du cholestérol et des phospholipides.............................................. 132 

16

IV-1-3-4 Distribution de la protéine PLD1 dans les radeaux lipidiques.................... 133 

IV-1-4 Effets de l’enrichissement des cellules en acides gras sur les radeaux lipidiques 

........................................................................................................................................ 134 

IV-1-4-1 Effet des AG sur la distribution du GM1, du cholestérol et des 

phospholipides............................................................................................................ 134 

IV-1-4-2 Effet des AG sur la localisation de la protéine PLD1................................. 135 

IV-2 ETUDE NUTRITIONNELLE COMPARATIVE DE L’EFFET IMMUNOMODULATEUR DES HUILES 

DE POISSON, D’ARGAN ET D’OLIVE CHEZ LE RAT ................................................................. 136 

IV-2-1 Composition en acides gras des régimes............................................................ 137 

IV-2-2 Effets des régimes sur la croissance des rats ..................................................... 139 

IV-2-3 Modifications lipidiques induites par les régimes .............................................. 139 

IV-2-3-1 Modifications lipidiques plasmatiques induites par les régimes................. 140 

IV-2-3-2 Modifications lipidiques des thymocytes de rat induites par les régimes... 140 

IV-2-4 Effets des régimes sur la réponse proliférative des thymocytes ......................... 145 

IV-2-5 Effets des régimes sur l’activité de la phospholipase D ..................................... 147 

IV-2-6 Effets des régimes sur l’expression de la PLD des thymocytes de rat................ 149 

V- DISCUSSION .................................................................................................................. 153 

VI- CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES............................................. 160 

VII- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES................................................................... 163 

RESUME............................................................................................................................... 205 

17

Liste des figures et tableaux 

Les Figures 

Figure 1 : Hématopoïèse du système immunitaire................................................................... 29 

Figure 2 : Structure du récepteur des cellules B (BCR)........................................................... 32 

Figure 3 : Structure du récepteur des cellules T (TCR). .......................................................... 34 

Figure 4 : Organisation des microdomaines membranaires..................................................... 36 

Figure 5 : Asymétrie de la composition au niveau des deux feuillets de la bicouche lipidique 

.......................................................................................................................................... 40 

Figure 6 : Résumé schématique des signaux d’activation intracellulaire des lymphocytes T 

CD4+ ................................................................................................................................ 47 

Figure 7: Réaction de catalyse de la PLD. ............................................................................... 49 

Figure 8: Représentation schématique des différentes régions conservées de PLD1 et PLD2.53 

Figure 9: Modèle théorique de catalyse par les PLD ............................................................... 54 

Figure 10: La superfamille des protéines G. ............................................................................ 59 

Figure 11: la famille des PKC.................................................................................................. 61 

Figure 12: Règle de nomenclature des acides gras. ................................................................. 69 

Figure 13: Métabolisme des acides gras .................................................................................. 72 

Figure 14: Synthèse des eicosanoïdes. ..................................................................................... 73 

Figure 15 : La répartition de l’arganier, l’olivier et la sardine au Maroc................................. 76 

Figure 16 : L’arganier .............................................................................................................. 78 

Figure 17 : Fruit de l’arganier .................................................................................................. 78 

Figure 18: Effet de l’âge sur la réponse proliférative des lymphocytes................................... 85 

Figure 19: Mécanismes d’action des AG ................................................................................. 86 

Figure 20: Les différentes séries d’eicosanoïdes...................................................................... 87 

Figure 21 : Synthèse des eicosanoïdes à partir des précurseurs oméga 6 et oméga 3.............. 88 

Figure 22: Effet des AGPI n-3 sur les radeaux lipidiques........................................................ 90 

Figure 23: Métabolisme du MTT en sel de formazan par les cellules viables. B: Comparaison 

du spectre UV du MTT (ligne pointillée) et du sel de formazan après solubilisation (ligne 

continue)......................................................................................................................... 101 

Figure 24: Séparation du PBut et du PA par chromatographie sur couche mince 

bidimensionnelle après révélation au bleu de Coomassie.............................................. 103 

Figure 25 : Schéma récapitulatif d’un chromatographe en phase gazeuse. ........................... 106 

18

Figure 26 : Gradient de saccharose ........................................................................................ 107 

Figure 27 : Détermination de la concentration optimale de ConA induisant une réponse 

proliférative maximale ................................................................................................... 116 

Figure 28 : Effets des acides gras in vitro sur la viabilité cellulaire des thymocytes de rat... 117 

Figure 29 : Effets des acides gras in vitro sur la prolifération mitogénique des thymocytes. 118 

Figure 30 : Synthèse de phosphatidylbutanol dans les thymocytes de rat. ............................ 119 

Figure 31 : Absence d’activité PLD oléate sensible dans les thymocytes de rat ................... 120 

Figure 32 : Activité PLD PIP2-sensible dans les thymocytes de rat...................................... 121 

Figure 33 : Caractérisation de l’expression des ARNm de PLD dans les thymocytes de rat 122 

Figure 34 : Expression des protéines PLD1 et PLD2 dans les thymocytes de rat. ................ 122 

Figure 35 : Effets des acides gras in vitro sur l’activité phospholipase D des thymocytes. .. 127 

Figure 36 : Corrélation négative entre la réponse proliférative et l’activité PLD stimulée par la 

ConA dans les thymocytes de rat. .................................................................................. 128 

Figure 37 : Effet du TPA sur la réponse proliférative des thymocytes de rat........................ 129 

Figure 38 : Distribution du ganglioside GM1 dans les différentes fractions du gradient de 

saccharose....................................................................................................................... 130 

Figure 39 : Distribution du PIP2 dans les différentes fractions du gradient de saccharose. .. 131 

Figure 40 : Distribution du cholestérol dans les différentes fractions du gradient de 

saccharose....................................................................................................................... 132 

Figure 41 : Distribution des phospholipides dans les différentes fractions du gradient de 

saccharose....................................................................................................................... 133 

Figure 42: Détection de PLD1 dans les différentes fractions du gradient de saccharose. ..... 134 

Figure 43 : Effet d’un enrichissement en DHA (a) et en acide linoléique (b) sur la distribution 

de la protéine PLD1 dans les fractions des gradients..................................................... 135 

Figure 44 : Effet des régimes sur la réponse proliférative des thymocytes à la ConA. ......... 146 

Figure 45 : Corrélation positive entre la réponse proliférative et la proportion de 18:2n-6 

présent dans les phospholipides des thymocytes de rat.................................................. 147 

Figure 46 : Effets des régimes sur l’activité PLD stimulée par la ConA des thymocytes de rat. 

........................................................................................................................................ 148 

Figure 47 : Corrélation inverse entre l’activité PLD et la réponse proliférative des thymocytes 

à la ConA........................................................................................................................ 149 

Figure 48 : Effets des différents régimes sur l’expression des protéines PLD1 (A) et PLD2 (B) 

dans les thymocytes de rats. ........................................................................................... 151 

19

Figure 49 : Effets des différents régimes sur l’expression des ARNm de PLD1 (A) et PLD2 

(B) dans les thymocytes de rats...................................................................................... 152 

Les tableaux 

Tableau I : Antigènes couramment utilisés pour distinguer les sous-populations de 

lymphocytes ..................................................................................................................... 31 

Tableau II : Proposition de nomenclature des radeaux lipidiques ........................................... 38 

Tableau III : Modifications lipidiques des protéines................................................................ 40 

Tableau IV : Techniques d’analyse des radeaux lipidiques ..................................................... 43 

Tableau V : Propriétés des radeaux lipidiques et cavéoles ...................................................... 44 

Tableau VI: Caractéristiques des PLD..................................................................................... 57 

Tableau VII: Localisation subcellulaire de l’activité PLD....................................................... 65 

Tableau VIII: Nomenclature des acides gras. .......................................................................... 70 

Tableau IX: Distribution (mole %) des acides gras présents dans les triglycérides des 

différentes huiles. ............................................................................................................. 75 

Tableau X: Production des cytokines par les splénocytes de deux souches de souris ............. 84 

Tableau XI : Influence des régimes lipidiques sur les fonctions du système immunitaire chez 

des animaux infectés avec différents pathogènes............................................................. 93 

Tableau XII : Composition des régimes expérimentaux.......................................................... 98 

Tableau XIII: Séquence des amorces utilisées pour la PCR. ................................................. 113 

Tableau XIV: Programme de la réaction PCR....................................................................... 113 

Tableau XV a : Composition en acides gras des phospholipides des thymocytes après 

enrichissement par les acides gras de la famille n-3. ..................................................... 124 

Tableau XV b: Composition en acides gras des phospholipides des thymocytes après 

enrichissement par les acides linoléique et oléique....................................................... 125 

Tableau XV c : Composition en acides gras des phospholipides des thymocytes après 

enrichissement par les acides gras saturés...................................................................... 126 

Tableau XVII: Influence des différents régimes sur le gain de poids corporel, le poids du 

thymus et le nombre de thymocytes par thymus,........................................................... 139 

Tableau XVIII: Effet des régimes sur la composition en acides gras des triglycérides du 

plasma............................................................................................................................. 142 

Tableau XIX : Effet des régimes sur la composition en acides gras des phospholipides du 

plasma............................................................................................................................. 143 

20

Tableau XX : Effet des régimes sur la composition en acides gras des phospholipides des 

thymocytes. .................................................................................................................... 144 

Tableau XXI: Effets de la nature du sérum sur la réponse proliférative des thymocytes à la 

ConA. ............................................................................................................................. 145 

21

LISTE DES ABREVIATIONS 

Aa : acides aminés 

ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire 

AGI : acide gras insaturé 

AGPI : acide gras polyinsaturé 

AGS : acide gras saturé 

ARF : facteur d'ADP-ribosylation 

ARN : acide ribonucléique 

BCR : B cell receptor 

BET : bromure d’éthidium 

BHT : butyl-hydroxy-toluène 

BSA : albumine sérique bovine 

CCM : chromatographie sur couche mince 

CD : cluster de différentiation 

CMH : complexe majeur d’histocompatibilité 

ConA : concanavaline A 

CPG : chromatographie en phase gazeuse 

CST : cholestérol 

DAG : diacylglycérol 

DHA : acide docosahexaénoïque 

DMSO : dimethylsulfoxide 

DRM : detergent resistant membranes 

ECL : enhanced chemiluminescence 

EDTA : acide éthylènediamine tétraacétique 

EGF : facteur de croissance de l’endothélium 

EGTA : acide éthylèneglycol tétraacétique 

Gab : Grb2 associated binder 

Gads : Grb2-related protein adaptor downstream of Shc 

GFP : protéine de fluorescence verte 

GPI : glycosylphosphatidylinositol 

Grb2 : growth factor receptor binding protein 2 

GTP : guanosine triphosphate 

GTP-γ-S : guanosine 5'-O-3-thiotriphosphate 

HEPES : acide N-(2-hydroxyéthylpipérazine)N’-(2-éthanesulfonique) 

HETE: acide hydroxyeicosatétraénoïque 

HPETE: acide hydroxyperoxyeicosatétraénoïque 

HLA: human leucocyte antigen 

HPLC : chromatographie liquide haute performance 

HRP: peroxydase du raifort 

HSA : albumine sérique humaine 

Ig: immunoglobuline 

IGF : insulin-like growth factor 

IL: Interleukine 

INFγ: interferon γ 

ITAM: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif 

ItK: Interleukin-2 tyrosine kinase 

LAT: linker for activation of T cells 

LPA : acide lysophosphatidique 

22

MAP Kinase: Mitogen Activated Protein Kinase 

NF-AT : nuclear factor of activated T cells 

PA : acide phosphatidique 

PAGE : électrophorèse en gel de polyacrylamide 

PAP : phosphatidate phosphohydrolase 

PBut : phosphatidylbutanol 

PC : phosphatidylcholine 

PCR : polymerase chain reaction 

PDGF : platelet derived growth factor 

PE : posphatidyléthanolamine 

PH : pleckstrin homology 

PIP2 : phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 

PIP3 : phosphatidylinositol 1,4,5-trisphosphate 

PKC : protéine kinase C 

PL : phospholipide 

PLA 2 : phospholipase A 2 

PLC: phospholipase C 

PLD : phospholipase D 

PTK : protéine tyrosine kinase. 

SDS : dodécylsulfate de sodium 

SH 2: src homology 

SLP 76 : SH2 containing tyrosine phosphatase-1 

TBS-T: tampon tris salin + tween 

TCR : récepteur des lymphocytes T 

TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine 1,2-bis(diméthylamino)éthane 

TPA : 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate 

Tween : monolaurate de polyéthylène-sorbitane 

23

I- Introduction générale 

L’huile d’argan est extraite à partir de l’amandon oléagineux de l’arganier « Argania spinosa 

L. » (Skeels), un arbre endémique du sud-ouest marocain. Cette huile est composée de deux 

fractions, l’une glycérique et l’autre insaponifiable. La fraction glycérique représente 99% de 

l’huile d’argan. Elle est riche en acides gras insaturés, essentiellement l’acide oléique (45- 

48%) et l’acide linoléique (35-38%) et dépourvue d’acides gras polyinsaturés de la famille n- 

3. La fraction insaponifiable est composée de tocophérols, stérols, polyphénols, carotènes et 

autres composés connus pour leurs propriétés antioxydantes. Cette composition particulière 

confère à l’huile d’argan des propriétés thérapeutiques en matière de prévention et de 

traitement des maladies cardiovasculaires et de l’athérosclérose. En effet, plusieurs études ont 

mis en évidence ses effets hypolipidémiant, hypocholestérolémiant et antioxydant (Berrougui 

et al., 2003 et 2004 ; Drissi et al., 2004 ; Berrougui et al., 2005 ; Derouiche et al., 2005). Une 

étude clinique récente réalisée par Drissi et al. (2004) a montré que la consommation 

journalière d’huile d’argan, à raison de 15 g/jour, diminue le cholestérol-LDL plasmatique 

ainsi que la susceptibilité des LDL à la peroxydation, par rapport à des sujets témoins nonconsommateurs. 

Cependant, il est bien connu maintenant que les lipides alimentaires peuvent 

influer sur certains paramètres de la fonction immune, notamment la prolifération, la 

production de cytokines, la synthèse d’eicosanoïdes… (Perez et Alexander, 1988 ; Calder et 

al., 2002 ; Yaqoob, 2004). Or, aucune étude à ce jour ne s’est intéressée aux effets potentiels 

d’une consommation journalière d’huile d’argan sur les fonctions immunitaires. C’est 

pourquoi nous avons entrepris une étude nutritionnelle chez le rat visant à déterminer l’effet 

d’un régime enrichi en huile d’argan sur la réponse proliférative des thymocytes aux 

mitogènes. 

Au laboratoire, notre équipe avait montré qu’après enrichissement des lymphocytes en acide 

docosahexaénoïque, une nouvelle voie de signalisation, différente de celle impliquée dans les 

conditions normales (cellules non enrichies) se déclenche. Cette nouvelle voie sollicite une 

phospholipase D (PLD) silencieuse dans les conditions normales (Bechoua et al., 1998 ; Diaz 

et al., 2002). La PLD est une phosphodiestérase qui hydrolyse la liaison phosphodiester 

distale de la phosphatidylcholine des membranes cellulaires, libérant la choline et l’acide 

phosphatidique (PA). Chez les mammifères deux gènes distincts, PLD1 et PLD2, ne 

présentant que 50% d’homologie de séquence ont été décrits (Frohman et al., 1999), chaque 

gène donnant naissance à plusieurs variants d’épissage (Hammond et al., 1997 ; Katayama et 

24

al., 1998 ; Steed et al., 1998). Les deux isoformes de PLD nécessitent du phosphatidylinositol 

biphosphate (PIP2) comme cofacteur pour leur activité mais diffèrent par leur mode de 

régulation. La PLD1 a une activité basale faible et est activée par les petites protéines G des 

familles Rho et ARF, et par les protéines kinases C (PKC). La PLD2 au contraire à une 

activité basale élevée, et sa sensibilité aux protéines activatrices est moins bien documentée 

(Exton, 2002). Une autre PLD, activée spécifiquement par les acides gras insaturés, nommée 

PLD oléate-sensible, a été décrite dans plusieurs tissus tels que le poumon (Okamura et 

Yamashita, 1994), le cœur (Dai et al., 1995) et dans les cellules T Jurkat (Kasai et al., 1998). 

Les fonctions cellulaires où une implication de la PLD a été démontrée sont multiples. On 

peut citer le trafic vésiculaire, la réorganisation du cytosquelette, l’explosion respiratoire, la 

prolifération cellulaire… (Mc Dermott et al., 2004). L’activation de la PLD dans divers types 

cellulaires a un effet pro-prolifératif, alors que ce n’est pas le cas dans les cellules 

lymphoïdes où son activation induit des signaux antiprolifératifs. En effet, l’activation de la 

PLD par l’acide docosahexaénoïque ou le dérivé monohydroxyde de l’acide arachidonique, 

12-HETE, dans les lymphocytes humains est accompagnée par une inhibition de la réponse 

proliférative aux mitogènes (Joulain et al., 1995 ; Bechoua et al., 1998 ; Diaz et al., 2002). 

D’autres équipes ont également observé que l’activation de la PLD de lymphocytes B inhibe 

leur réponse proliférative (Gilbert et al., 1998). 

Certaines données de la littérature indiquent que la PLD serait préférentiellement associée à 

des structures particulières de la membrane plasmique, les microdomaines (Czarny et al., 

2000; Liscovitch et al., 2000). Dans le lymphocyte ces structures ont un rôle clef dans la 

transduction du signal mitogénique et permettent notamment le recrutement de protéines 

tyrosines kinases au voisinage du complexe protéique qui constitue le récepteur à l'antigène 

(TCR/CD3), (Ilangumaran et al., 2000). En outre, il a été montré que l’incorporation des 

acides gras dans les phospholipides membranaires altère les propriétés de la membrane et 

perturbe le fonctionnement des microdomaines. Ces données nous ont conduits à étudier la 

localisation sub-membranaire de la PLD1 et à rechercher l’effet d’un enrichissement en acides 

gras sur cette localisation. 

L’objectif principal de notre travail a été de déterminer, chez le rat, l’effet d’une 

consommation d’huile d’argan, riche en acides oléique et linoléique, sur certains paramètres 

de la réponse thymocytaire. A titre de comparaison, nous avons également étudié les effets de 

plusieurs autres huiles : l’huile de poisson riche en acides gras polyinsaturés de la famille n-3, 

25

l’huile d’olive constituée majoritairement d’acide oléique de la famille n-9, l’huile de noix de 

coco riche en acides gras saturés et l’huile de tournesol constituée majoritairement d’acide 

linoléique de la famille n-6. Nous nous sommes intéressés en particulier aux liens qui 

pourraient exister entre l’enrichissement des membranes lymphocytaires en différents acides 

gras, l’activité et la localisation de la PLD, et la réponse lymphoproliférative. Dans une 

approche in vitro, nous avons aussi étudié l’effet sur ces mêmes paramètres des acides gras 

majeurs des différentes huiles, apportés directement au milieu de culture des thymocytes sous 

forme de complexe avec l’albumine. 

Le manuscrit s'articule comme suit 

• La première partie de ce mémoire est consacrée aux rappels bibliographiques présentant 

les données nécessaires à la compréhension du travail. Elle comporte trois chapitres. Le 

premier est consacré aux données concernant le système immunitaire et les radeaux 

lipidiques. Le deuxième chapitre fait l’état des connaissances actuelles sur la PLD des 

mammifères, sa régulation et ses fonctions physiologiques. Le troisième chapitre est consacré 

aux acides gras et à leurs effets sur le système immunitaire. 

• Le reste du mémoire concerne notre travail personnel. Il décrit tout d’abord les matériels 

et méthodes utilisés au cours du travail expérimental. Les résultats expérimentaux sont ensuite 

présentés et discutés. Ce mémoire se termine par une conclusion générale et par l’exposé des 

perspectives qui découlent de notre travail. 

26

II- Rappels bibliographiques 

II-1- Le système immunitaire 

II-1-1 Généralités 

Les microorganismes (virus, bactéries, levures, protozoaires et parasites multicellulaires) 

rencontrés par un individu en bonne santé peuvent causer des maladies graves qui 

conduiraient à la mort si ces microorganismes se multipliaient de façon incontrôlée. 

Cependant la plupart des infections guérissent rapidement et laissent peu de séquelles, ceci 

grâce au système immunitaire. 

Le système immunitaire est constitué d’un réseau complexe de cellules et organes chargés de 

défendre l’organisme contre les agents pathogènes. Ceci implique, au niveau moléculaire, une 

capacité de distinction entre les antigènes du « soi » et du « non soi ». Cette capacité de 

distinction se fait grâce à certaines protéines membranaires qui servent de marqueurs dans les 

réactions immunitaires, les plus importantes étant les molécules du complexe majeur 

d’histocompatibilité (CMH) (HLA chez l’humain « Humain Leucocytes Antigen »). Les 

molécules du CMH diffèrent d’un individu à un autre et constituent une « carte d’identité » 

immunitaire. On distingue trois classes de CMH : 

Les molécules du CMH de classe I, extrêmement polymorphes, ont un rôle 

important dans le rejet des greffes. Les glycoprotéines de classe I sont exprimées à la surface 

de toutes les cellules nucléées et servent de marqueurs spécifiques pour les lymphocytes T 

cytotoxiques. 

Les molécules du CMH de classe II jouent un rôle important dans le contrôle des 

réponses des cellules T et B et dans les interactions macrophages / cellules T auxiliaires 

(présentation de l’antigène). 

Les molécules du CMH de classe III déterminent la structure et le niveau des 

composants du complément (Goldsby et al., 2000). 

II-1-2 Immunité adaptative et immunité innée 

On distingue deux catégories d’immunité : l’immunité innée et l’immunité adaptative 

Immunité innée ou non spécifique : C’est la première ligne de défense. Elle repose sur 

des fonctions générales du corps humain (sécrétions des muqueuses, de la peau et de la flore 

commensale) et les cellules phagocytaires (monocytes, macrophages et polynucléaires 

27

neutrophiles). Ces dernières utilisent un système de reconnaissance primitif, non spécifique. 

Elles captent les microorganismes, les internalisent puis les détruisent. 

Immunité adaptative ou immunité spécifique : Elle permet une réponse hautement 

spécifique mettant en jeu plusieurs types de cellules (lymphocytes et macrophages) et des 

substances humorales sous forme de protéines plasmatiques spécifiques. Il existe deux 

grandes classes de réponse immunitaire : 

1) les réponses de type humoral mettant en jeu les lymphocytes B et des anticorps. Les 

anticorps sont des molécules qui reconnaissent et se lient spécifiquement avec l’antigène. 

L’antigène peut être une molécule présente à la surface d’un microorganisme ou bien une 

toxine produite par un agent infectieux. 

2) les réponses immunitaires à médiation cellulaire mettant en jeu les lymphocytes T 

qui ont une gamme d’activité plus large. Certains lymphocytes T sont impliqués dans le 

contrôle du développement des lymphocytes B et de la production d’anticorps. Un autre 

groupe de cellules T interagit avec les cellules phagocytaires pour les aider à détruire les 

microorganismes intracellulaires. Un troisième groupe de lymphocytes T reconnaît les 

cellules infectées par un virus et les détruit. En pratique, il y a beaucoup d’interactions entre 

les lymphocytes et les cellules phagocytaires. Par exemple, certains phagocytes peuvent 

absorber des antigènes et les présenter aux cellules T. Ce processus est appelé présentation de 

l’antigène. De leur coté, les lymphocytes T secrètent des facteurs solubles, les cytokines, qui 

stimulent les phagocytes et leur permettent de détruire les microorganismes qu’ils ont 

phagocytés. Dans un autre type d’interactions, les phagocytes utilisent les anticorps produits 

par les cellules B pour reconnaître les microorganismes. 

L’immunité innée et l’immunité adaptative n’opèrent pas en totale indépendance l’une de 

l’autre, elles coopèrent dans de nombreux cas pour produire une immunité efficace. Grâce à la 

mémoire immunologique, tout nouveau contact avec le même microorganisme entraînera une 

réponse plus rapide et plus efficace. 

II-1-3 Les cellules du système immunitaire 

Les cellules immunitaires sont caractérisées par leur hétérogénéité tant au niveau 

morphologique que moléculaire ou fonctionnel. Toutes les cellules du système immunitaire 

proviennent des cellules souches pluripotentes, localisées au niveau de la moelle osseuse, qui 

s’organisent en deux voies de différenciation principales. Celles-ci donnent naissance à deux 

lignées distinctes : l’une lymphoïde donnant naissance aux lymphocytes, l’autre myéloïde 

donnant naissance aux érythrocytes et leucocytes (Figure 1). 

28

Figure 1 : Hématopoïèse du système immunitaire. 

Chez l’adulte, les cellules souches sont principalement concentrées au niveau de la moelle osseuse. 

Après différenciation, elles génèrent l’ensemble des cellules sanguines, à savoir les érythrocytes 

(globules rouges), les mégacaryocytes (précurseurs de plaquettes), les lymphocytes et les cellules 

myéloïdes. Le progéniteur lymphoïde commun est également capable de générer des cellules 

dendritiques et des cellules tueuses naturelles (cellules natural killer, NK). Il : interleukine, CSF : 

facteur de stimulation des colonies, EPO : erythropoïetine (Goldsby et al., 2000). 

29

II-1-3-1 Les phagocytes 

II-1-3-1-1 Les polynucléaires 

Les polynucléaires sont issus de la lignée granulocytaire. Ils sont caractérisés par un noyau 

polylobé. On distingue trois types de polynucléaires: les neutrophiles, les basophiles et les 

éosinophiles. Ils phagocytent les corps étrangers et les dégradent avec des enzymes 

puissantes, éliminant ainsi bactéries et parasites 

II-1-3-1-2 Les phagocytes mononucléés 

Ces cellules proviennent de cellules souches pluripotentes. Les monocytes ne demeurent que 

2 à 3 jours dans la circulation et se transforment en macrophages tissulaires, grandes cellules 

au polymorphisme considérable et qui présentent un grand nombre de récepteurs 

membranaires. Les macrophages ont des fonctions essentiellement pro-inflammatoires, 

bactéricides et tumoricides. Ils interviennent également dans la présentation de l’antigène. 

II-1-3-2 Les lymphocytes 

Ils constituent le support de l’immunité spécifique. Les lymphocytes sont des cellules 

arrondies de petite taille : 7 à 9 µm de diamètre. Au microscope optique, il n’est pas possible 

de distinguer les différentes populations lymphocytaires. Elles se caractérisent par leurs 

protéines membranaires de surface appelées « clusters de différenciation » ou CD suivis d’un 

numéro d’identification. Le tableau I présente les CD les plus couramment utilisés pour 

distinguer les populations lymphocytaires humaines. 

II-1-3-2-1 Les lymphocytes B 

Ils constituent le support de l’immunité humorale. Les lymphocytes B sont issus de la moelle 

osseuse (Bone marrow) où ils acquièrent leur immunocompétence, puis ils iront rejoindre les 

organes lymphoïdes (rate, ganglions lymphatiques, amygdales). Ils sont capables de 

synthétiser des immunoglobulines (Igs), qu’ils expriment à leur surface sous forme d’un 

complexe appelé le récepteur des cellules B (BCR, « B Cell Receptor »). Sa structure de base 

comporte une Ig composée de quatre chaînes peptidiques : deux chaînes lourdes identiques 

d’isotype : µ, δ, γ, ε ou α, et deux chaînes légères identiques d’isotype : κ ou λ. 

30

Tableau I : Antigènes couramment utilisés pour distinguer les sous-populations de lymphocytes (Goldsby et al., 2000). 

Cellule T 

CD Fonction Cellule B TH TC Cellule NK 

CD2 Molécule d’adhésion ; transduction du signal - + + + 

CD3 

CD4 

Élément de transduction du signal du 

récepteur des cellules T 

Molécule d’adhésion qui se lie aux molécules 

CMH de classe II ; transduction du signal 

- + + - 

- + - - 

CD5 Inconnue + + + - 

CD8 

Molécule d’adhésion qui se lie aux molécules 

CMH I ; transduction du signal 

- - + + 

CD16 

(FcγRIII) 

CD21 

(CR2) 

CD28 

CD32 

(FcγRIII) 

Récepteur de faible affinité pour la région Fc 

des Immunoglobulines G 

Récepteur du complément (C3d) et du virus 

d’Epstein-Barr 

Récepteur de la molécule B7 de costimulation 

sur les CPA 

- - - + 

+ - - - 

- + + - 

Récepteur de la région Fc des Ig G + - - - 

CD35 Récepteur du complément (C3b) + - - - 

CD40 Transduction du signal + - - - 

CD45 Transduction du signal + + + + 

CD56 Molécule d’adhésion - - - + 

31

Chaque chaîne légère est liée à une chaîne lourde par des ponts disulfure et les deux chaînes 

lourdes sont reliées entre elles de la même façon. Dans le complexe de base nommé BCR, 

cette Ig est associée de manière non covalente à un hétérodimère Ig-α/Ig-β dont les 

monomères sont liés entre eux par un pont disulfure. Cet hétérodimère est indispensable à la 

transduction du signal car il présente au niveau de sa partie cytoplasmique des sites 

spécifiques de phosphorylation sur tyrosine, appelés ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based 

Activation Motif). Ces ITAMs sont substrats des kinases de la famille Src (Lck et Fyn) 

(Figure 2). 

Figure 2 : Structure du récepteur des cellules B (BCR). 

Le BCR comporte une Ig, le plus souvent IgM, composée de deux chaînes lourdes et de deux chaînes 

légères. Chaque chaîne légère est liée à une chaîne lourde par des ponts disulfure. Cette Ig est 

associée à un hétérodimère Ig-α/Ig-β. 

32

Il existe cinq classes d’immunoglobulines : M, G, E, D et A. Chaque classe se distingue par 

des séquences d’aminoacides spécifiques dans la région constante et au niveau des chaînes 

lourdes, ce qui confère à chaque classe des propriétés structurales et fonctionnelles 

spécifiques. 

Les lymphocytes B expriment une seule immunoglobuline à leur surface, le plus souvent IgM, 

parfois IgG ou IgA associée aux molécules du CMH de classe II et à d’autres molécules de 

surface (CD19, CD21, CD22, CD24). Les lymphocytes B activés se différencient soit en 

lymphocytes mémoires, soit en plasmocytes. 

II-1-3-2-2 Les lymphocytes T 

Ils dérivent des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse. Les lymphocytes T 

immatures migrent ensuite vers le thymus pour subir un processus de maturation où ils vont 

acquérir certaines molécules de surface spécifiques. Ils migreront par la suite dans les organes 

lymphatiques et ils circuleront sans cesse dans le sang et dans tout l’organisme. On distingue 

deux populations majeures de cellules T fonctionnellement différentes : 

Les lymphocytes T auxiliaires (ou helper, Th), ils expriment à leur surface le marqueur 

CD4 et reconnaissent les antigènes liés aux molécules du CMH de classe II. Lorsqu’elles sont 

activées, ces cellules secrètent différentes cytokines qui agissent sur d’autres cellules du 

système immunitaire. Les lymphocytes T auxiliaires sont classés en fonction des cytokines 

qu’ils sécrètent : les Th1 sécrètent des cytokines pro-inflammatoirs et activent principalement 

certaines cellules T et les macrophages, les Th2 activent essentiellement les cellules B et les 

réponses immunitaires qui dépendent des anticorps. 

Les lymphocytes T cytotoxiques (Tc), Ils expriment à leur surface le marqueur CD8. Ils 

reconnaissent les antigènes liés aux molécules du CMH de classe I. Lorsqu’elles sont 

activées, ces cellules se différencient en cellules effectrices qui peuvent détruire des cellules 

du soi altérées. Contrairement aux cellules Th, la plupart des Tc secrètent peu de cytokines. 

Les lymphocytes T expriment à leur surface le TCR (T Cell Receptor) composé de deux 

chaînes polypeptidiques hétérodimériques α et β (90-95% des lymphocytes T), plus rarement 

γ et δ (5-10% des lymphocytes T), liées de manière covalente par des ponts disulfure. Ces 

chaînes sont composées de régions variables et de régions constantes. Les parties variables se 

33

situent vers l’extrémité N-terminale et sont responsables de la reconnaissance de l’antigène 

par le CMH. Le TCR est associé à un complexe multi-protéique appelé CD3 composé des 

chaînes polypeptidiques δ, γ, ε, ζ, et η qui s’associent pour former trois dimères : un 

hétérodimère γε, un hétérodimère δε et un homodimère ζζ. L’hétérodimère ζη ne se trouve 

que dans 10% des CD3. Ces protéines possèdent une partie intracellulaire comportant un ou 

plusieurs ITAMs (Figure 3). 

Site de liaison 

peptide / CMH 

Cellule T 

Complexe CD3 

Figure 3 : Structure du récepteur des cellules T (TCR). 

Le TCR est composé de deux chaînes peptidiques α et β liées de manière covalente. Le TCR est 

associé à un complexe multiprotéique appelé CD3. 

34

II-1-3-2-3 Les lymphocytes non T non B ou nuls 

Ce sont de grands lymphocytes représentant environ 15 % des lymphocytes circulants. Ils 

n’expriment ni BCR ni TCR à leur surface membranaire : ils possèdent cependant des 

récepteurs reconnaissant des antigènes fixés sur la cellule cible, permettant la fixation de la 

cellule. On les appelle cellules tueuses naturelles ou « naturel killer » parce qu’elles exercent 

un effet cytotoxique direct vis à vis des cellules anormales, infectées par des virus ou 

cancéreuses. 

II-1-4 Activation lymphocytaire 

L’activation des lymphocytes est initiée par l’association d’un antigène ou d’un mitogène 

avec son récepteur spécifique. Une série complexe de signaux biochimiques est alors 

transmise de la membrane vers le cytoplasme et le noyau déclenchant ainsi une réponse 

cellulaire appropriée. 

Il a été montré récemment que ces processus de signalisation mettent en jeu des 

microdomaines de la membrane plasmique appelés radeaux lipidiques. Ces microdomaines 

constituent en effet des plates-formes concentrant à des endroits particuliers de la membrane 

plasmique les composants nécessaires à la transduction des signaux. 

II-1-4-1 Microdomaines membranaires 

La membrane plasmique a longtemps été représentée comme une matrice bidimensionnelle 

principalement constituée de phospholipides dans laquelle s’insèrent partiellement ou 

totalement des protéines. Dans ce modèle de "mosaïque fluide" décrit par Singer et Nicholson 

en 1972, lipides et protéines peuvent diffuser librement dans le plan de la bicouche lipidique, 

ce qui devrait conduire à une répartition aléatoire de ces molécules au sein de la bicouche. En 

1992, les travaux de Brown et Rose ont révélé l’existence de domaines enrichis en 

sphingomyélines, glycosphingolipides, cholestérol et en protéines ancrées par un groupement 

GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inisitol) dans la membrane apicale des cellules épithéliales 

polarisées (Figure 4). Ces structures s’organisent en une phase liquide ordonnée « Lo » ayant 

des caractéristiques intermédiaires entre celles d’une phase fluide « Lβ » et celles d’une phase 

gel « Lα », contrairement au reste de la membrane qui adopte une phase Lα moins organisée. 

35

Cholestérol 

Figure 4 : Organisation des microdomaines membranaires. 

Le regroupement des molécules de sphingolipides et de cholestérol dans le feuillet externe de la 

membrane plasmique constitue les "microdomaines", qui sont dispersés au sein de la mosaïque fluide 

de glycérophospholipides. Les protéines-GPI ont tendance également à se regrouper au sein des 

microdomaines, alors que les protéines transmembranaires ont tendance à être exclues. Au niveau du 

feuillet cytoplasmique, on retrouve les protéines tyrosines kinases de la famille Src (Fyn et Lck) 

(Ilangumaran et al., 2000). 

36

Par la suite, de telles structures ont été décrites chez les mammifères dans une grande variété 

de types cellulaires y compris dans les cellules non polarisées comme les lymphocytes T 

(Simons et Ikonen, 1997) et dans d’autres organismes tels que les levures, parasites ou 

insectes (Kubler et al., 1996 ; Raccosin et al., 1999 ; Rietveld et al., 1999). 

D’un point de vue pratique, les microdomaines sont isolés de la membrane plasmique par 

ultracentrifugation sur gradient de densité après extraction des membranes totales par un 

détergent non ionique à froid. Cette insolubilité des microdomaines dans les détergents non 

ioniques à froid est due à leur composition lipidique unique et à leur propriétés 

physicochimiques particulières (état de phase Lo) (Brown et Rose, 1992). 

Dans la littérature, il existe différentes dénominations pour ces structures insolubles dans les 

détergents non ioniques : DRMs « Detergent-Résistant Membranes » DIGs « Detergent- 

Insoluble-Glycosphingolipids », GEMs « Glycolipid-Enriched Membranes », Microdomains, 

caveolae like domains, LDTI « Low Density Triton Insoluble fraction », LDMs « Low 

Density Membrans », TIFF « Triton-Insoluble Floating Fraction ». Une nomenclature 

simplifiée a été suggérée par Simons et Toomre en 2000 (Tableau II). 

Au cours de cette étude et par souci de clarté ces microstructures membranaires insolubles 

seront regroupées sous l’abréviation de « DRMs ». 

37

Tableau II : Proposition de nomenclature des radeaux lipidiques (Simons et Toomre , 2000). 

I- Rafts II- Rafts agrégés III- DRMs IV-Caveole 

Composition 

• Glycosphingolipides 

• Cholestérol 

• Protéines modifiées 

♦ Protéines à ancre GPI 

♦ Doublement acylées 

tyrosine kinase Src 

• Protéines 

transmembranaires 

• Rafts agrégés par 

♦ Anticorps 

♦ Lectines 

♦ Protéines des cellules 

adjacentes 

♦ Protéines à pouvoir 

réticulant physiologique 

• Rafts insolubles après 

traitement à froid avec des 

détergents Triton X-100, 

Brij-58, CHAPS, NP 40 

• Protéines et 

lipides du raft 

• Cavéolines 

Propriétés 

• 50 nm de diamètre 

• Mobile (10 -8 cm -2 sec -1 ) 

• Phase liquide ordonnée (lo) 

• 100 nm à quelques µm de 

diamètre 

• Souvent liés au 

cytosquelette 

• flottent à faible densité 

sur gradient de saccharose 

ou optiprep TM 

• Invaginations à la 

surface de la 

cellule 

Commentaires 

• Les rafts natifs sont détectés 

seulement dans les cellules 

vivantes 

• L’agrégation est utilisée 

aussi bien artificiellement 

que physiologiquement pour 

déclencher les cascades 

d’activation 

• Rafts non natifs 

(agrégés) 

• Effets variables selon 

♦ type de détergent 

♦ ratio lipide détergent 

♦ types cellulaires 

• Sous catégories 

du raft 

• Très spécialisés 

38

II-1-4-2 La composition des radeaux lipidiques 

La principale différence entre radeaux lipidiques et DRMs réside dans le fait que les premiers 

ont été décrits in vivo tandis que les seconds correspondent à des structures membranaires 

extraites par un détergent non ionique, à froid. Ainsi, les études de caractérisation de leur 

composition n’ont pu être réalisées que sur ce second type de microdomaines. 

II-1-4-2-1 Composition lipidique 

La plupart des études montrent que les DRMs sont enrichis en trois classes de lipides : 

cholestérol, sphingolipides et glycosphingolipides. Brown et Rose (1992) ont montré que les 

DRMs contiennent 32 mol% de cholestérol et 14 mol % de sphingomyélines alors que le reste 

des membranes, ne contient que 12 mol % de cholestérol et 1 mol% de sphingomyélines. En 

outre, ils sont 5 fois plus riches en glycosphingolipides que le reste de la membrane. Des 

résultats similaires ont été obtenus par Prinetti et al (2000) en utilisant des méthodes de 

marquages appropriés. 

Une autre particularité des radeaux lipidiques est l’asymétrie de composition des feuillets 

externe et interne de la bicouche lipidique (Bretscher, 1973 ; Devaux, 1991). Ainsi, La 

plupart, si ce n’est la totalité des sphingolipides sont présents dans le feuillet externe, par 

opposition aux glycérophospholipides (phosphatidylsérine, phosphatidylinositol, phosphatidyl 

éthalonamine) qui sont présents dans le feuillet interne. Par contre la phosphatidylcholine est 

présente en plus forte proportion dans le feuillet externe que dans le feuillet interne (Devaux, 

1991 ; Balasubramanian et Schroit, 2003 ; Devaux et Morris, 2004) (Figure 5). La principale 

caractéristique des lipides constitutifs de ces microdomaines est leur haut degré de saturation, 

ce qui leur confère une structure organisée en phase Lo (Brown et London, 1998 ; Fridriksson 

et al., 1999). 

Les molécules de cholestérol présentes en fortes quantités dans les "DRMs" semblent être le 

" ciment" essentiel qui rend ces structures résistantes aux traitements par les détergents non 

ioniques à froid (Silvius, 2003). La distribution du cholestérol entre les deux feuillets n’est 

pas parfaitement connue. Certaines études ont montré que le cholestérol interagit 

préférentiellement avec les sphingolipides par rapport aux phospholipides (Van Dijck et al, 

1976 ; Leventis et Silvius, 2001 ; Yeagle et Young, 1986). De ce fait, il serait plus abondant 

dans le feuillet externe de la bicouche que dans le feuillet interne. 

39

Extérieur de la cellule 

Sphingomyéline Glycolipide Phosphatidylcholine Cholestérol 

Phosphatidylsérine Phosphatidylinositol 

Cytoplasme 

Phosphatidyléthanolamine 

Figure 5 : Asymétrie de la composition au niveau des deux feuillets de la bicouche lipidique 

II-1-4-2-2 Composition protéique 

De nombreuses protéines ont été identifiées à ce jour dans les fractions membranaires 

insolubles dans le Triton X-100. Les protéines décrites dans les DRMs sont essentiellement 

des protéines possédant des modifications lipidiques (Tableau III). 

Tableau III : Modifications lipidiques des protéines. 

Type de modification Groupement lipidique transféré Acide aminé cible 

Acylation Palmitate Cystéine 

Myristate 

Glycine N-terminale 

Prénylation Farnésyle, géranyl-géranyle Cystéine 

Glypiation Glycosylphosphatidylinositol Extrémité N-terminale 

Certaines de ces protéines sont liées à la membrane par des chaînes acyles saturées (Brown et 

London, 1997). Les protéines les plus souvent détectées sont des kinases de la famille Src : 

p Lck et p fyn , les sous-unités α des protéines G hétérotrimériques, les récepteurs de l’ EGF 

(Epithelial Growth Factor) et du PDGF (Platelet Derived Growth Factor), les MAP kinases 

(MAPK), les protéines kinases C …. Pour les kinases Src et les protéines G une double 

40

acylation (N-palmitoylation et S-myristoylation) est nécessaire pour permettre leur ancrage 

aux DRMs (Shenoy-Scaria et al., 1994). 

D’autres protéines sont liées au feuillet externe des microdomaines par une ancre GPI (Brown 

et Rose, 1992, Sargiacomo et al., 1993). L’enrichissement particulier de ces protéines à pied 

d’ancrage GPI dans les DRMs a conduit à considérer leur présence comme un indicateur du 

degré de purification des microdomaines. Les protéines à ancre GPI les plus souvent décrites 

comme marqueurs des microdomaines sont : la phosphatase alcaline (Brown et Rose, 1992), 

la 5’-nucléotidase (Diaz et al., 2002), les protéines Thy1 et Thy 2 et le prion (Madore et al., 

1999). 

II-1-4-3 Radeaux lipidiques : réalité ou artéfact ? 

La première préparation de radeaux lipidiques a été décrite par Brown et Rose en 1992. Après 

traitement des lysats de cellules épithéliales par le triton X-100 à froid, ces auteurs ont isolé 

une fraction résistant à la solubilisation par centrifugation sur gradient de saccharose. Le 

traitement des membranes à 37°C par le Triton X-100 ne permet d’obtenir qu’une faible 

quantité de matériel membranaire. Ceci aurait pu signifier que les radeaux n’existent qu’à 

4°C. En outre, leur petite taille les rend invisibles en microscopie classique. A cause de ces 

contraintes, l’existence de DRMs in vivo a été mise en doute. Cependant, plusieurs approches 

expérimentales récentes sont en faveur de leur existence dans les membranes des cellules 

vivantes (pour revue voir Horejsi, 2003). 

Parmi les alternatives aux méthodes biochimiques de fractionnement cellulaire, les approches 

chimiques (pontage chimique des molécules de surface) et biophysiques (FRET, Single 

particle tracking, laser trap ou single dye tracking) ont permis de déterminer la composition 

lipidique et protéique des microdomaines ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques et 

leur taille. 

D’autre part, les expériences réalisées sur des membranes modèles (Ahmed et al., 1997 ; 

Schroeder et al., 1998) ont permis de montrer que la membrane préexiste dans une phase Lo 

avant l’utilisation de détergent, et que c’est bien l’existence de cette phase Lo qui conditionne 

la résistance au Triton X-100. Dans ces travaux, l’état de phase Lo est provoqué par l’ajout de 

cholestérol à un mélange de PC et SM dans des rapports molaires physiologiques. 

41

Une troisième approche consiste à manipuler un composant lipidique crucial des radeaux 

lipidiques : le cholestérol. On peut limiter la formation de rafts à la surface cellulaire soit par 

séquestration du cholestérol par des antibiotiques tels que la filipine et la nystatine, soit par 

déplétion des membranes cellulaires en cholestérol par la méthyl-β-cyclodextrine, ou encore 

en inhibant sa biosynthèse par des statines. Le Tableau IV présente les méthodes les plus 

couramment utilisées pour l’étude des radeaux lipidiques. 

42

Tableau IV : Techniques d’analyse des radeaux lipidiques (Pizzo et Viola, 2004). 

Méthodes Informations obtenues cellules 

vivantes ? 

Avantages et limites 

Extraction biochimique 

(utilisation de détergents non ioniques) 

• Présence / absence de molécules 

spécifiques dans les DRMs 

Non 

• Facile, protocole non standardisé. 

• Artéfacts possibles. 

• Ne permet pas de détecter les faibles 

associations. 

Déplétion du cholestérol 

• Les fonctions cellulaires associées au 

cholestérol des membranes (intégrité des 

rafts) 

Oui 

• Possibilité d’effets secondaires des 

drogues utilisées pour séquestrer le 

cholestérol. 

Marquage avec des anticorps et 

microscopie à fluorescence 

• Co-localisation de certaines molécules 

avec les marqueurs des rafts. 

• dynamique des rafts dans les processus 

cellulaires 

Oui / Non 

• facile ; problème de quantification 

des données. 

• analyse des rafts dans des 

conditions d’activation cellulaire 

Fluorescence par énergie de transfert 

de résonance (FRET) 1 

• Assemblage des molécules dans les 

microdomaines. 

• la dimension des rafts. 

Oui 

• technique informative 

• artéfact possibles 

Suivi de particule individuelle (SPT) 2 

• dynamique d’une molécule associée 

aux rafts 

• durée de vie et dimensions des rafts 

Oui 

• technique très informative 

• nécessite des équipements très 

spécifiques et une grande expérience. 

1 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert ; 2 SPT : Single particle Tracking microscopy 

43

II-1-4-4 Radeaux lipidiques, cavéoles, DRMs : mêmes structures ? 

Les cavéoles sont des invaginations particulières de la membrane enrichies en cholestérol et 

sphingolipides. Elles se distinguent des radeaux lipidiques par leur principale protéine 

structurale, la cavéoline (protéine intégrale en forme d’"épingle à cheveux" qui se lie 

fortement au cholestérol) (Parton, 1996 ; Smart, 1999). La famille des cavéolines regroupe 

des protéines transmembranaires de 21-25 KDa impliquées dans plusieurs fonctions 

cellulaires. Trois gènes de cavéoline sont connus. Les cavéolines 1 et 2 sont exprimées 

ubiquitairement tandis que la cavéoline 3 est spécifique du muscle (Way et Parton, 1995 ; 

Scherer et al., 1996). 

La présence de cette protéine a été mise en évidence dans la plupart des cellules mais pas dans 

les cellules hématopoiétiques (globules rouges, plaquettes, lymphocytes (Fra et al, 1994)), et 

les cellules de neuroblastome (Gorodinsky et Harris, 1995). Dans les cellules où la cavéoline 

n’est pas exprimée, les microdomaines résistant aux détergents non ioniques à froid ont une 

composition similaire à celle des cavéoles. Cependant, des résultats obtenus par d’autres 

équipes ont permis de mettre en évidence une possible distinction entre ces deux structures 

(Tableau V). 

Tableau V : Propriétés des radeaux lipidiques et cavéoles. (Fielding et Fielding, 2003) 

Radeaux lipidiques 

Cavéoles 

Lipides majeurs Cholestérol, sphingolipides Cholestérol, sphingolipides 

Structure plane Invaginé 

Protéines majeures Protéines à ancre GPI Cavéolines 

Modifications lipidiques 

acylation 

Demi vie Petite (min) Longue (heure) 

Dépendent du cholestérol 

libre 

oui 

Oui 

Ces deux types de structure existent au sein des cellules vivantes mais il n’a pas été 

clairement déterminé si ces deux structures coexistent au sein d’une même cellule, bien que 

cela soit probable. Des études biochimiques combinées à des observations microscopiques ont 

démontré la cœxistence de deux domaines distincts à la surface de cellules MDCK et de 

fibroblastes en culture (Chigorno et al., 2000). Un premier domaine enrichi en cavéoline-1 se 

44

distingue d’une seconde zone de la membrane où le ganglioside GM3 est présent en forte 

proportion. Il serait en fait trop simple de décrire la membrane uniquement par deux types de 

structures lipidiques (rafts ou non rafts). Il existe sans doute différentes catégories de 

microdomaines (de taille et composition spécifiques…) mais les outils d’analyse des 

membranes biologiques vivantes ne sont pas aujourd’hui suffisamment performants. 

II-1-4-5 Les fonctions cellulaires des radeaux lipidiques 

Les radeaux lipidiques sont impliqués dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire 

incluant l’apoptose, l’adhérence et la migration cellulaire, la transmission synaptique, 

l’organisation du cytosquelette, la sortie des enzymes digestives (Brown et London, 1998 ; 

Simons et Toomre, 2000 ; Harris et Siu, 2002 ; Tsui Pierchala et al, 2002). 

En plus de leur rôle dans les fonctions biologiques normales, les radeaux lipidiques pourraient 

également représenter des « portes d’entrée » pour certains virus, parasites ou bactéries 

(Suomalainen, 2002 ; Kovbasnjuk et al., 2001 ; Simons et Ehehalt, 2002 ; Shin et Abraham, 

2000 ; Shin et al., 2000). 

II-1-4-6 DRMs, lieu de signalisation 

L’intérêt croissant des immunologistes pour les radeaux lipidiques vient du fait que ces 

structures peuvent être essentielles à la signalisation du TCR (Montixi et al., 1998), du BCR 

(Pierce, 2002) et des récepteurs Fc. Le système le plus décrit est sans doute celui du récepteur 

des lymphocytes T. La déplétion des membranes en cholestérol par des méthyl-βcyclodextrines 

dissocie ces structures et inhibe la cascade de signalisation (Stefanova et 

Horejsi, 1991 ; Montixi et al., 1998 ; Xavier et al., 1998). Les signaux intracellulaires émis à 

travers ces structures peuvent conduire à la prolifération, la différenciation, l’apoptose ou 

l’anergie. La signalisation par le TCR ou le BCR est similaire et les détails décrits ci-dessous 

s’appliquent généralement aux deux types lymphocytaires (Figure 6). 

La première étape de l’activation des lymphocytes T est le contact avec la cellule 

présentatrice de l’antigène pour lequel il est spécifique. Ceci implique une interaction forte 

entre les deux types cellulaires. Cette contrainte physique ne peut être assurée par le seul TCR 

dont l’affinité pour les complexes CMH / peptides spécifiques est connue pour être 

relativement faible. De nombreuses études ont rapporté la formation très organisée de 

45

« synapses immunes » entre le TCR et les cellules présentatrices de l’antigène in vitro (Lee et 

al, 2002). 

L’engagement du TCR avec son ligand induit l’activation des tyrosines kinases (PTK) 

cytoplasmiques de la famille Src : Lck ou Fyn (Kane et al., 2000). Ces protéines présentent 

toutes un domaine catalytique homologue appelé SH1 (Src Homology domain 1) contenant un 

site d’autophosphorylation sur un résidu tyrosine. Les portions intracellulaires des molécules 

CD3, les ITAMs servent de substrat aux PTK. La phosphorylation des domaines ITAMs de 

CD3 va permettre le recrutement des kinases ZAP-70 qui font partie de la famille Syk. Cellesci 

peuvent en effet s’ancrer via leurs domaines SH2 (pour Src Homology domain 2) aux 

tyrosines phosphorylées des domaines ITAMs de CD3, ce qui les rendrait accessibles aux 

kinases Src qui les activeraient par phosphorylation. Les kinases vont ensuite phosphoryler un 

groupe de protéines adaptatrices membranaires dont LAT, SPL-76, SIT ou PAG. Ces 

molécules qui ne possèdent pas d’activité enzymatique ont par contre la particularité de 

posséder des domaines modulaires d’interaction avec de nombreuses protéines comme les 

domaines SH2, SH3 ou PH (Pleckstrin Homology domain). Elles permettent ainsi le 

recrutement d’autres protéines à la membrane et favorisent leurs interactions. Ces adaptateurs 

membranaires sont donc à l’origine de la formation de complexes permettant la transduction 

du signal. Parmi ces adaptateurs, la protéine LAT « Linker Activation of T cells » est 

particulièrement bien étudiée et ses mécanismes d’action peuvent être considérés comme un 

modèle de la transduction du signal (Leo et al., 2002). Il a été montré que LAT pouvait 

recruter des protéines cytosoliques comme la PLCγ, les kinases Itk, PI3K et des adaptateurs 

cytosoliques comme Grb2, Gads, ou SLP76. Ces différentes protéines vont agir en synergie 

pour activer les voies de transduction en aval comme la voie du Ca 2+ et la voie Ras / MAPK 

kinase. 

La PLCγ a un rôle crucial dans l’amplification du signal. Sa phosphorylation sur des résidus 

tyrosine est indispensable à son activation. Sous forme active, la PLCγ scinde le PIP2 

(phosphatidylinositol biphosphate membranaire) en deux parties : l’IP3 (inositol triphosphate) 

et le DAG (diacylglycérol). L’IP3 en interagissant avec son récepteur sur le réticulum 

endoplasmique induit la libération massive d’ions calciques (Ca 2+ ). L’augmentation du 

calcium intracellulaire active la calmoduline qui, à son tour, active d’autres protéines et 

enzymes, jusqu'à l’activation du facteur de transcription NFAT (Janeway et al., 2001). Le rôle 

46

essentiel du DAG est d’activer les protéines kinases C (PKC). Ces sérine-thréonine kinases 

sont impliquées dans l’activation de NFAT et NFκB (Janeway et al., 2001). 

Figure 6 : Résumé schématique des signaux d’activation intracellulaire des lymphocytes T 

CD4+ (Goldsby et al., 2000) 

47

II-2 La phospholipase D 

II- 2-1 Introduction 

La phospholipase D (PLD) est une phosphodiestérase qui catalyse l’hydrolyse de la liaison 

phosphodiester distale d’un phospholipide pour libérer d’une part sa tête polaire, et d’autre 

part l’acide phosphatidique (PA). Le substrat majeur de la PLD des mammifères est la 

phosphatidylcholine (PC), un des principaux phospholipides des membranes plasmiques. 

L’activité PLD a été découverte par Hanahan et Chaikoff dans les feuilles de chou en 1947. 

Elle a longtemps été considérée comme une enzyme typique du règne végétal. Aujourd’hui, 

cette enzyme apparaît ubiquitaire. Elle a été retrouvée chez l’ensemble des êtres vivants : 

plantes, organismes procaryotes, levures et mammifères. 

La première description d’une activité PLD chez les mammifères a été réalisée par Saito et 

Kanfer en 1973 dans des extraits membranaires de cerveau de rat (Saito et Kanfer, 1973 ; 

1975). Ce n’est que dans les années 1980 que cette activité a été impliquée dans la 

transduction du signal via des récepteurs membranaires (Billah et al., 1989). Plusieurs 

tentatives de purification à homogénéité de la PLD ont échoué, principalement à cause d’une 

perte de l’activité enzymatique au cours des différentes étapes de purification. Cette activité a 

pu être conservée et caractérisée, après purification partielle, six ans plus tard (Taki et Kanfer, 

1979). La première purification à homogénéité a été réalisée en 1994 par Okamura et 

Yamashita. Depuis lors, les travaux portant sur l’identification, la purification, l’isolement de 

la PLD et la détermination de son mécanisme d’action se sont succédés. 

II-2-2 La réaction d’hydrolyse catalysée par la PLD 

Dans les conditions physiologiques, la PLD des mammifères hydrolyse la PC pour générer le 

PA et la choline. En présence d’un alcool primaire, la PLD catalyse une réaction de 

transphosphatidylation qui est spécifique de cette famille d’enzyme. Le transfert du 

groupement phospatidyl se fait alors sur l’alcool qui est un meilleur accepteur nucléophile 

(1000 fois plus d’affinité) que l’eau (Yang et al., 1967 ; Frohman et al., 1999). On observe 

ainsi la formation de phosphatidylalcool aux dépens du PA. Ce phospholipide non 

physiologique est un métabolite stable. Il permet donc un dosage fiable et spécifique de 

l’activité PLD dans les cellules intactes (Morris et al., 1997a) (Figure 7). 

48

R1 –O– 

R2 –O– 

Transphosphatidylation 

Ethanol 

Hydrolyse 

H 2 O 

Protéines cibles 

Effets physiologiques 

Figure 7: Réaction de catalyse de la PLD. 

La phospholipase D (PLD) hydrolyse la phosphatidylcholine (PC) en acide phosphatique (PA) et 

choline. Le PA peut être métabolisé en diacylglycérol (DAG), lui-même source d’acide arachidonique 

(AA), ou en acide lysophosphatidique (Lyso PA). Ces seconds messagers et le PA lui-même induisent 

des réponses physiologiques variées. En présence d’un alcool primaire (éthanol), la PLD catalyse une 

réaction de transphosphatidylation pour produire du phosphatidylalcool (phosphatidylethanol, PEth) 

aux dépens du PA. 

49

II-2-3 Mesure de l’activité PLD 

Les méthodes de dosage de l’activité PLD peuvent être distinguées en fonction de la 

méthodologie utilisée pour isoler et quantifier le produit de catalyse. L’activité PLD peut être 

déterminée par la mesure du produit lipidique (PA ou phosphatidylalcool) ou du produit 

soluble (choline) formé. 

L’activité PLD peut être mesurée par dosage de la choline libérée lors de l’activation de 

l’enzyme. Cette méthode consiste à marquer la tête polaire de la PC avec de la choline tritiée. 

La PLD libère alors la choline tritiée qui peut être dosée dans le milieu réactionnel. 

Cependant, dans les cellules intactes, la choline formée est très rapidement phosphorylée en 

phosphocholine qui peut provenir aussi d’une activité PLC (Besterman et al., 1986 ; Purkiss et 

al., 1991). Inversement, la phosphocholine générée par la PLC peut aussi être métabolisée en 

choline sous l’action d’une phosphatase. Cette méthode de dosage n’est donc utilisable 

qu’avec des cellules perméabilisées ou des membranes isolées dans lesquelles la choline 

libérée dans le milieu réactionnel n’est pas accessible aux kinases intracellulaires. La phase 

aqueuse contenant la choline marquée peut être séparée de la phase lipidique selon la méthode 

de Bligh et Dyer (1959). La choline radioactive est alors quantifiée 

L’activité PLD peut être déterminée aussi par la mesure du produit lipidique. Pour cela, un 

acide gras marqué peut être incorporé dans les phospholipides. Différents acides gras sont 

couramment utilisés pour marquer les phospholipides : acides oléique, myristique, 

arachidonique ou palmitique (Morris et al., 1997a). L’activité PLD est alors déterminée par la 

mesure du PA radioactif formé. Cependant, ce type de mesure ne reflète pas toujours de façon 

certaine une activité PLD. Le PA peut aussi être produit par phosphorylation du DAG par une 

DAG kinase ou résulter de la voie de la biosynthèse des phospholipides. D’autre part, il est 

très rapidement métabolisé dans les cellules (Figure 7). La méthode la plus fiable et la plus 

utilisée est celle qui consiste à mesurer le phosphatidylalcool marqué produit lors de la 

réaction de transphosphatidylation caractéristique de la PLD, comme décrit dans le 

paragraphe II-2-2 (Randall et al., 1990 ; Cook et Wakelam, 1992). Il est extrait dans la phase 

organique et séparé des autres phospholipides par chromatographie sur couche mince ou par 

HPLC. 

50

II-2-4 Clonage et caractérisation de la PLD 

Les PLD ont d’abord été clonées chez les procaryotes. La première PLD de mammifères à 

avoir été clonée est une PLD humaine. Le gène a été isolé à partir d’une banque d’ADN 

complémentaire de cellules HeLa, par homologie de séquence avec celui de la levure 

(Hammond et al., 1995), et la protéine correspondante a été dénommée PLD1. L’alignement 

des séquences de cinq PLD représentatives de chaque règne (vertébrés, invertébrés, 

champignons, végétaux et bactéries) révèle la présence de caractéristiques communes 

(Liscovitch et al., 2000). 

Le gène de la PLD1 humaine (hPLD1) code une protéine de 1072 acides aminés de masse 

moléculaire 120 KDa. La PLD1 est caractérisée par une activité basale faible. Elle est activée 

par trois classes d’effecteurs : les protéines kinases C, les petites protéines G monomériques 

de la famille ARF (ADP-ribosylation factor) et celles de la famille Rho (Ras-homology family 

protein). Elle nécessite du PIP2 pour son activité et elle est inhibée par l’oléate (Hammond et 

al., 1995). La PLD1 présente deux variants, PLD1a et PLD1b, produits par un épissage 

alternatif. PLD1b comporte une délétion de 38 acides aminés (aa 585 à 624) par rapport à 

PLD1a (Hammond et al., 1997 ; Katayama et al., 1998). Ces deux variants d’épissage 

présentent la même structure et montrent des sensiblilités aux différents effecteurs identiques. 

Après le clonage de la PLD1, la séquence complète d’une nouvelle PLD appelée PLD2 a été 

décrite (Colley et al., 1997b ; Kodaki et Yamashita., 1997). La PLD2 ne présente que 50% 

d’homologie de séquence avec PLD1. Elle est délétée d’une boucle centrale de 106 acides 

aminés par rapport à PLD1 (PLD1a, aa 505-620). De plus, elle diffère de PLD1 dans ses 

parties N-terminale et C-terminale. La PLD2 est une protéine de 932 acides aminés, de masse 

moléculaire 100 KDa environ. Trois variants d’épissage de la PLD2 humaine ont été décrits à 

ce jour (Steed et al., 1998). La PLD2 a une activité basale élevée, PIP2 dépendante, qui peut 

être activée par l’ajout de quelques micromolaires d’AGI (Kim et al., 1999b), mais elle est 

peu ou pas stimulable par les protéines activatrices de PLD1 (Colley et al., 1997a ; Lopez et 

al., 1998). Certains travaux ont décrit une activation de PLD2 par les PKC mais d’une 

amplitude plus faible que celle de PLD1 (Han et al., 2002 ; Chen et Exton, 2004). La 

sensibilité de la PLD2 à la protéine ARF est variable selon les différentes espèces. Ainsi, les 

travaux de Jenco et al. (1998) ont montré que les protéines G de la famille ARF n’ont aucun 

effet sur la PLD2 murine in vitro. Par contre, la PLD2 humaine a été décrite comme activable 

51

par les ARF, mais à un degré moindre que PLD1 (Lopez et al., 1998). La PLD2 n’est pas 

activable par les protéines G de la famille Rho. 

II-2-5 Structure de la PLD 

La séquence peptidique de la PLD montre la présence de quatre domaines fortement 

conservés entre les différentes isoformes et entre espèces, nommés CRI à CRIV pouvant être 

soit des sites catalytiques, soit des motifs de liaison à des cofacteurs ou des activateurs de la 

PLD (Morris et al., 1996) (Figure 8). 

II-2-5-1 Motifs HKD et mécanisme catalytique 

Les régions CRII (aa 463 à 487 de hPLD1a) et CRIV (aa 894 à 919) sont des régions 

hautement conservées, nommées « HKD » parce qu’elles contiennent chacune un motif 

invariable HxK(x) 4 D, appelé aussi triade catalytique (Hammond et al., 1995). Ces domaines 

sont caractérisés par la présence de résidus conservés (histidine, lysine et acide aspartique) qui 

sont indispensables à la catalyse in vitro et pour le fonctionnement de l’enzyme in vivo (Sung 

et al., 1997). En effet, il a été montré que la délétion de l’un de ces motifs provoque la perte 

de l’activité catalytique de l’enzyme. Cette activité peut être restaurée par cotransfection du 

mutant délété avec le domaine manquant dans des cellules Cos. Ceci s’explique par le fait que 

les deux parties N- et C-terminales peuvent s’associer physiquement lorsqu’elles sont 

exprimées dans les cellules Cos 7 (Xie et al., 2000). 

Le mécanisme catalytique implique la formation d’un intermédiare phosphatidyl-enzyme 

selon un mécanisme ping-pong (Sung et al., 1997). La structure cristalline de la PLD de 

Streptomyces species a pu être déterminée par Leiros et ses collaborateurs (2000). Chez 

Streptomyces species, la PLD est constituée d’une seule chaîne polypeptidique comportant 

deux domaines caractéristiques. Le repliement de la chaîne mettant en contact ces deux 

domaines forme un site actif à l’interface. Ce modèle structural a confirmé la nécessité d’une 

dimérisation de deux monomères comportant chacun une triade catalytique HKD pour obtenir 

un site actif. En ce qui concerne le mécanisme catalytique, des résultats récents ont permis 

d’imaginer un modèle faisant intervenir les résidus histidyl- des deux triades catalytiques. Une 

histidine servirait de nucléophile et l’autre servirait à protoner l’oxygène du groupement 

partant (Iwasaki et al., 1999) (Figure 9). 

52

Figure 8: Représentation schématique des différentes régions conservées de PLD1 et 

PLD2. 

Les rectangles représentent les séquences très conservées dans les PLD de mammifères et entre les 

deux isoformes (CRI à CRIV), les domaines PH et PX ou la région unique de la PLD « boucle ». 

II-2-5-2 Les régions conservées I et III (CRI et CRIII) 

Le domaine CRI (aa 362 à 421 de hPLD1a) est retrouvé dans toutes les PLD. Des mutations 

effectuées dans ce domaine ont montré que certains des acides aminés sont indispensables au 

fonctionnement de l’enzyme (Sung et al., 1999b). Cependant la délétion de cette région 

n’affecte ni l’activité enzymatique ni la dépendance de cette enzyme envers le PIP2. La 

troisième région conservée, CRIII (aa 463 à 487), contient le motif « IYIENQFF », qui est 

essentiel pour l’activité catalytique puisque les mutations de la tyrosine en sérine, cystéine ou 

isoleucine, diminuent l’activation de l’enzyme. De plus, le domaine CRIII est enrichi en 

résidus aromatiques, comme le domaine de liaison à la choline présent dans le récepteur à 

l’acétylcholine (Harel et al., 1993 ; Gilson et al., 1994). Ainsi, le domaine CRIII pourrait 

faciliter la catalyse ou plus vraisemblablement limiter la spécifité de la PLD aux 

phospholipides qui portent un groupement polaire de type choline (Frohman et al., 1999). 

Cette région code pour une séquence consensus de liaison à la cavéoline, ØxØxxxxØ ; où Ø 

est un acide aminé aromatique (Okamoto et al., 1998). 

53

Intermédiaire PLD-PA 

Hydrolyse ou 

transphosphatidylation 

Libération 

du produit 

Histidines 

catalytiques 

Liaison au substrat 

Domaine 

HKD 

Figure 9: Modèle théorique de catalyse par les PLD 

Le mécanisme est divisé en quatre étapes successives. Ce modèle a pu être élaboré grâce aux 

observations de Sung et al. (1997) et Stuckey et Dixon (1999). Au début de la réaction, seul un des 

deux résidus histidyl- du site catalytique est protoné. La première demi-réaction (étapes 1 et 2) 

conduit à la formation d’un intermédiaire phosphatidyl-PLD covalent « PLD-PA intermediaire ». La 

formation de cet intermédiaire se traduit par la libération de la choline grâce à l’intervention de 

l’histidine protonée, l’autre histidine du site catalytique étant liée de manière covalente au 

groupement phosphatidyl-. Dans la deuxième demi-réaction (étapes 3 et 4), il se produit une 

substitution nucléophile grâce à une molécule d’eau ou d’alcool qui va ainsi libérer l’histidine de la 

liaison covalente. Cette substitution nucléophile est réalisée grâce à l’histidine libre qui affaiblit une 

liaison H - O de l’eau et se retrouve ainsi à nouveau protonée. Entre les étapes 3 et 4, l’acide 

phosphatique ou le phosphatidylalcool selon la nature de l’accepteur nucléophile (H2O ou alcool 

primaire) est libéré du site actif. La PLD est alors de nouveau capable de réaliser le même cycle 

d’hydrolyse de la PC (étape 1) (MC Dermott et al., 2004). 

54

II-2-5-3 Les domaines PH et PX 

Il existe dans la région N-termiale des PLD, adjacente au CRI, un domaine PH ou domaine 

d’homologie à la pleckstrine (Steed et al., 1998). Ce domaine PH permet généralement une 

interaction spécifique des protéines avec les inositides biphosphorylés possédant leurs 

phosphates en position vivinale, comme le PIP2 (Hodgkin et al., 2000). Cependant, la délétion 

de cette région N-terminale contenant le domaine PH, ne modifie pas la dépendance de la 

PLD envers le PIP2, ni son activité in vitro mesurée sur des vésicules artificielles contenant 

du PIP2 (Sung et al., 1999a et 1999b ; Hoer et al., 2000). Ceci implique la présence d’un autre 

domaine de liaison au PIP2 responsable de l’activation de l’enzyme par ce phosphoinositide 

(Sciorra et al., 1999). Ce domaine se situe entre les deux domaines HKD. Il contient un motif 

riche en acides aminés aromatiques et basiques. L’association de ce domaine avec le PIP2 est 

nécessaire à l’activité enzymatique des PLDs de levure et de mammifères, ce qui suggère que 

ce domaine est responsable de la dépendance des PLD envers le PIP2 (Sciorra et al., 1999). 

Le domaine PH semble jouer un rôle dans la localisation subcellulaire de la protéine. En effet, 

Brown et ses collaborateurs ont montré que la PLD1b sauvage, exprimée dans les cellules Cos 

1 et RBL-2H3, est localisée au niveau des endosomes et des lysosomes. La PLD1b délétée de 

son domaine PH est exprimée de manière diffuse dans la cellule (Hodgkin et al., 2000). 

Un autre domaine a été identifié dans la partie N-terminale des PLD, le domaine PX, ou 

domaine d’homologie à PHOX (Ponting et Kerr., 1996 ; Liscovitch et al., 2000). Ce domaine 

est impliqué dans diverses interactions protéine-protéine incluant la liaison à des kinases ou 

des domaines SH3. Il a été montré récemment que ces domaines peuvent fixer PI3P, 

PI(3,4)P2, PI(4,5)P2, PI(3,5)P2 et PI(3,4,5)P3 (Xu et al., 2001). Des mutations ponctuelles à 

ce niveau n’altère que faiblement l’activité de l’enzyme, suggérant que le domaine PX n’est 

pas essentiel pour la catalyse in vitro. 

II-2-5-4 Les régions amino et carboxy-terminales 

Les régions N-terminales des PLD de nombreuses espèces, de la levure à l’homme, sont 

relativement peu conservées et semblent tolérer des modifications comme la fusion à d’autres 

protéines telles que la protéine fluorescente verte (GFP). Ces modifications n’influent pas sur 

l’activité PLD (Hammond et al., 1995 ; Sung et al., 1997). Dans cette partie N-terminale de 

PLD1 se trouve une zone qui serait impliquée dans la régulation par la PKC (Xie et al., 1998 ; 

Sung et al., 1999b). Ainsi des mutants de PLD1 délétés de leur partie N-terminale perdent leur 

55

sensibilité aux esters de phorbol, puissants activateurs des PKCs. Par contre, la partie N- 

terminale de PLD2 semble nécessaire à son activité basale. Une délétion dans cette région 

conduit à une enzyme de faible activité basale qui devient sensible à l’activation par ARF. 

La région C-terminale est relativement bien conservée entre les PLD (Xie et al., 2000). 

Contrairement à la région amino-terminale, toutes modifications de cette région, notamment 

l’introduction d’étiquettes, altèrent l’activité enzymatique. Cette région est impliquée dans 

l’interaction de la PLD1 avec ARF et Rho (Sung et al., 1999a et 1999b ; Yamazaki et al., 

1999). 

II-2-5-5 La boucle centrale de PLD1 

La PLD1 possède une région de 100 à 150 acides aminés au centre de la protéine (aa 505- 

620), absente de la PLD2 ou des PLD des organismes inférieurs (Hammond et al., 1995 ; 

Colley et al., 1997a). Cette région appelée « boucle » aurait une activité régulatrice négative. 

La délétion de la région boucle ou de la partie N-terminale de PLD1 augmente l’activité 

basale de l’enzyme. Ceci suggère que ces deux régions sont des domaines de régulation 

négative qui permettent de maintenir l’activité basale de PLD1 à un niveau faible. L’activité 

basale de PLD2, qui ne possède pas de séquence boucle, est très élevée. Cette boucle au 

centre de la PLD1 serait donc impliquée dans un mécanisme d’autoinhibition, levé par des 

activateurs de l’enzyme (Sung et al, 1999 a et b). 

II-2-6 Régulation de la PLD 

L’activité PLD des cellules de mammifères est régulée par des signaux extracellulaires 

d’origine variée : hormones, neurotransmetteurs, facteurs de croissance, cytokines, antigènes 

et molécules d’adhésion cellulaire. Trois classes de protéines activatrices sont impliquées 

dans la régulation de l’activité PLD: les PKC et les petites protéines G monomériques des 

familles Rho et ARF. 

De nombreux travaux réalisés sur des cellules perméabilisées ou des membranes isolées 

montrent que les protéines ARF, Rho et PKC activent la PLD de façon synergique (Geny et 

Cockcroft, 1992 ; Coorson et Halsam, 1993 ; Whatmore et al., 1994). Ces observations ont été 

confirmées par des expériences réalisées in vitro avec des protéines recombinantes purifiées 

(Ohguchi et al., 1995 ; Singer et al., 1996). Les principales caractéristiques et mécanismes de 

régulation de la PLD sont résumés dans le Tableau VI. 

56

Tableau VI: Caractéristiques des PLD. (Okamura et Yamashita, 1994; Colley et al., 1997; Hammond et al., 1997; Kodaki et Yamashita, 1997; Morris et 

al., 1997b; Brown et al., 1998; Katayama et al., 1998; Lopez et al., 1998; Frohmen et al., 1999). 

PLD1a, PLD1b PLD2 PLD oléate dépendante 

Taille 

124 Kda (a) a , 

119 Kda (b) a 106 Kda a 190 Kda a 

Localisation membranaire 

Membranes du Golgi 

Microsomes, endosmoses 

Membrane plasmique 

Membrane plasmique, nucléaire, 

microsomes 

Localisation cytosolique probable possible non 

Activité basale faible forte faible 

Activation par: 

* Lipides PIP2 b , PIP3 b PIP2, PIP3 Oléate et arachidonate 

* Petites Protéines G ARF, Rho A, Rac, Cdc42 mineur non 

* Protéines Kinases cPKCα, β; nPKCε mineur non 

Protéines inhibitrices Synaptojanine, fodrine, AP3 Synaptojanine, Synucléïnes inconnu 

Autre inhibiteurs 

Oléate, alcools primaires, 

céramides 

Oléate, alcools primaires 

Alcools primaires 

a taille approximative estimée par électrophorèse. b PIP2: phosphatidylinositol 4, 5-biphosphate, PIP3: phosphatidylinositol 3, 4, 5-triphosphate. 

57

II-2-6-1 Régulation par le phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PIP2) 

Le phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) est connu comme précurseur de seconds 

messagers dans plusieurs voies de signalisation (Hinchliffe et al., 1998). Les premières 

constatations de l’importance du PIP2 comme cofacteur dans l’activation de la PLD ont été 

réalisées sur des vésicules artificielles de PE/PC, contenant ou pas ce phosphoinositide. La 

présence de PIP2 qui n’est pas hydrolysé par la PLD, est nécessaire à l’activation de cette 

enzyme (Brown et al., 1995). Dans les cellules U937, l’utilisation d’anticorps qui bloquent la 

PI(4)P5-kinase, et par conséquent la synthèse de PIP2, inhibe complètement l’activité PLD 

stimulable par GTPγS (Pertile et al., 1995). La néomycine, un antibiotique capable de fixer le 

PIP2 avec une grande affinité, inhibe l’activité PLD des cellules neuronales, des cellules 

HL60 et des neutrophiles (Liscovitch et al., 1991 ; Geny et Cockcroft, 1992 ; Ohguchi et al., 

1996b). 

Dans les systèmes reconstitués, les activités PLD1 et PLD2 restent marginales en absence de 

PIP2 (Colley et al., 1997a ; Hammond et al., 1997 ; Exton, 1997a et b). Le PIP2 est nécessaire 

à l’effet stimulant de la PKC et des petites protéines G ARF et Rho A sur la PLD 

recombinante, la PLD des membranes de cerveau de rat ou de porc et de cellules HL-60 

(Brown et al., 1995 ; Kuribara et al., 1995 ; Ohguchi et al., 1996b ; Hammond et al., 1997). 

Un autre phosphoinositide, le phosphatidylinositol-3,4,5 triphosphate, PIP3, semble posséder 

les mêmes propriétés d’activation de PLD que le PIP2 mais avec une efficacité moindre 

(Liscovitch et al., 1994). 

II-2-6-2 Les protéines G monomériques 

Les protéines G sont des protéines intermédiaires dans la transduction des signaux 

intracellulaires présentes dans l’ensemble des organismes vivants. Il existe deux classes de 

protéines G. La première correspond aux protéines G hétérotrimériques ou grandes protéines 

G localisées à la surface interne de la membrane plasmique et couplées à des récepteurs à sept 

domaines membranaires. La seconde classe comprend les protéines G monomériques ou 

petites protéines G. Elles sont classées en fonction de leurs homologies de séquence en 5 

familles Ras, Rho, Rab, ARF et Ran (Figure 10). Les petites protéines G ARF et Rho sont 

impliquées dans l’activation de la PLD. 

58

Figure 10: La superfamille des protéines G. 

II-2-6-2-1 Régulation par les protéines ARF « ADP-Ribosylation Factor » 

L’addition de GTPγS, un analogue non hydrolysable de GTP qui maintient les protéines G 

sous forme active, à des cellules perméabilisées n’induit aucune activation de PLD. Ceci 

indique que l’activation de la PLD par le GTPγS requiert des facteurs cytosoliques. En effet, 

l’addition du cytosol permet de restaurer l’activité PLD stimulable par le GTPγS (Anthes et 

al., 1991; Geny et al., 1993). La purification de ces facteurs a permis d’identifier les protéines 

ARF comme facteurs activateurs de la PLD (Brown et al., 1993 ; Cockcroft et al., 1994). 

L’implication des ARF dans la régulation de la PLD a également été montrée par l’utilisation 

d’inhibiteurs. Ainsi, la Brefeldine A, une toxine fongique qui inhibe l’échange GDP / GTP au 

niveau des protéines ARF, et par conséquent son activation, diminue l’activité PLD 

(Rumenap et al., 1995; Mitchell et al., 1998). L’activité de la PLD est stimulée par ARF 1, 

ARF 3, ARF 5 et ARF 6 (Brown et al., 1995; Caumont et al., 1998). Il a été montré que ARF 

est plus efficace sous sa forme myristoylée (Massenburg et al., 1994; Brown et al., 1995). En 

fait, la myristoylation permet l’ancrage de la protéine à la membrane et son interaction avec la 

PLD. Les deux variants d’épissage de la PLD1, PLD1a et PLD1b, sont activables par ARF 

(Hammond et al., 1995; Hammond et al., 1997). La PLD2 semble être activable par ARF mais 

59

à un moindre degré (Lopez et al., 1998) tandis que la PLD oléate-sensible, semble être 

insensible à ARF (Massenburg et al., 1994). 

II-2-6-2-2 Régulation par les protéines Rho 

La famille de Rho est divisée en trois groupes principaux: Rho, Rac et Cd-42-like (Bishop et 

Hall, 2000) (Figure 10). Ces protéines constituent un autre facteur d’activation de la PLD par 

un mécanisme GTPγS-dépendant (Bowman et al., 1993). La première démonstration d’une 

activation de la PLD par les protéines Rho a été réalisée par Olsen et al (1991). Ces auteurs 

ont montré que l’effet activateur du GTPγS sur la PLD dans des membranes de neutrophiles 

est supprimé par Rho-GDI,un inhibiteur spécifique de la dissociation du GDP des protéines 

Rho. Le rôle régulateur des protéines Rho vis-à-vis de la PLD a été confirmé par l’utilisation 

de toxines comme l’exoenzyme C3 de Clostridium botulinum, ou l’exoenzyme C2 de 

Clostridium difficile qui inactivent spécifiquement Rho. En effet, ces toxines atténuent ou 

diminuent l’activité PLD dans divers types cellulaires (Balboa et al., 1995, Ohguchi et al., 

1996 a et b; Schmidt et al., 1998). Des expériences en systèmes reconstitués avec des PLD et 

des protéines Rho recombinantes ont permis de montrer que la PLD1 est fortement activée par 

les protéines Rho A et Rho B (Hammond et al., 1997; Bae et al., 1998) tandis que la PLD2 

reste insensible à ces stimulations (Colley et al., 1997). 

II-2-6-3 Régulation par les protéines kinases C (PKC) 

La famille des PKC est une famille de sérine-thréonine kinases. Elle comprend douze 

isoformes et peut être divisée en trois sous-familles (Jaken, 1996): les PKC classiques (cPKC, 

α, βI, βII et γ), activables par le calcium (Ca 2+ ), le DAG et la phosphatidylsérine (PS), les 

PKC nouvelles (nPKC, δ, ε, η et θ), activables par le DAG et la PS mais indépendantes du 

Ca 2+ , et les PKC atypiques (aPKC, ζ, λ et ι) activables seulement par la PS. Les différentes 

isoformes sont distribuées de façon différente dans les tissus et sont impliquées dans diverses 

fonctions physiologiques (Hug et Sarre ; 1993) (Figure 11). 

60

Figure 11: la famille des PKC. 

En utilisant l’ester de phorbol PMA pour activer artificiellement la PKC de cellules HeLa, 

Mufson et ses collaborateurs (1981) ont observé une libération de choline. Cabot et al (1988) 

ont montré que cette libération de choline correspondait bien à une activation de la PLD. 

Depuis ces premiers travaux, l’activation de la PLD par l’intermédiaire de la PKC a été 

largement décrite dans de nombreux types cellulaires chez les mammifères. Un traitement 

prolongé par le PMA provoque une élimination complète de l’activité enzymatique, appelée 

rétrocontrôle négatif. Ce traitement prolongé abolit la capacité de différents agonistes à 

stimuler la PLD. Cependant, dans certains cas, le rétrocontrôle négatif des PKC ne provoque 

qu’une inhibition partielle, ou n’a pas d’effet sur la stimulation de la PLD, ce qui suggère une 

activité PLD indépendante des PKC. D’autres part, l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de la 

PKC comme la chélérythine et le RO-31-8220, ou d’inhibiteurs moins sélectifs comme la 

staurosporine et la sphingosine bloque partiellement ou totalement l’activation de la PLD par 

certains agonistes (Bosh et al., 1999 ; Khan et Hichami, 1999 ; Slaaby et al., 2000). 

L’activation de la PLD par le PMA indique que les deux isoformes de la PKC impliquées sont 

les PKC α et β (Concoride et al., 1994 ; Pai et al., 1991 ; Balboa et al., 1994 ; Ohguchi et al., 

1996b). La PLD1 est sensible à l’activation par les PKC (Hammond et al., 1995 et 1997 ; Park 

et al., 1997 ; Colley et al., 1997a) alors que PLD2 a été initialement décrite comme insensible 

aux PKC (Colley et al., 1997b). Cependant, des travaux récents ont montré une activation de 

la PLD2 par les PKC, quoique plus faible que celle observée pour la PLD1 (Lee et al., 2000 ; 

Han et al., 2002). 

61

II-2-6-4 Régulation par les tyrosines kinases 

De nombreux travaux basés sur l’utilisation d’inhibiteurs de protéines à activité tyrosine 

kinase mais aussi tyrosine phosphatase ont fourni des preuves d’une régulation de la PLD par 

un mécanisme de phosphorylation / déphosphorylation (Marcil et al., 1997 ; Min et al.,1998). 

Dans plusieurs types cellulaires, la PLD est activée après stimulation des cellules par 

différents facteurs de croissance comme le PDGF ou l’EGF qui possèdent des récepteurs à 

activité tyrosine kinase intrinsèque (Cockcroft, 1997). Par ailleurs, la PLD peut être également 

stimulée par des tyrosines kinases cytosoliques comme la tyrosine kinase v-src (Jiang et al., 

1994). 

II-2-6-5 Régulation par le calcium (Ca 2+ ) 

L’implication du Ca 2+ dans l’activation de la PLD a pu être montrée grâce à l’utilisation 

d’ionophores du Ca 2+ comme l’ionomycine et le composé A23187, ou à celle de chélateurs de 

Ca 2+ comme l’EGTA (chélateur du Ca 2+ extracellulaire) et le BAPTA (chélateur du Ca 2+ 

intracellulaire). L’ionomycine et l’A23187 tout en augmentant le taux intracellulaires du Ca 2+ , 

stimulent la PLD dans plusieurs types cellulaires (Billah et al., 1989 ; Reinhold et al., 1990 ; 

Liahi et al., 1992). Les chélateurs de calcium inhibent l’activation de la PLD par différents 

agonistes, dans plusieurs types cellulaires (Pai et al., 1988 ; Kessels et al., 1991). Ces études 

suggèrent que la PLD peut être activée soit par la libération du Ca 2+ intracellulaire, soit par 

apport de Ca 2+ extracellulaire, soit par les deux mécanismes, selon le type de cellulaire 

considéré. Cependant, dans certains systèmes cellulaires comme les fibroblastes stimulés par 

l’EGF, le Ca 2+ n’est pas nécessaire à l’activation de la PLD (Cook et Wakelam, 1992). Il 

existe donc des PLD Ca 2+ -dépendantes et des PLD Ca 2+ -indépendantes. Cette activation de la 

PLD par le Ca 2+ pourrait être directe, mais plus probablement indirecte par l’intermédiaire 

d’autres protéines calcium-sensibles (ARF, PKCs, tyrosines kinases) (Takahashi et al., 1996; 

Yu et al., 1996; Ito et al., 1997). 

II-2-6-6 Régulation par des facteurs inhibiteurs 

Plusieurs protéines peuvent inhiber l’activité PLD in vitro, mais le rôle physiologique de cette 

inhibition reste mal compris. Deux d’entre elles, la synaptojanine et la fodrine inhibent 

l’activité PLD en diminuant la quantité de PIP2 disponible au sein de la membrane. La 

synaptojanine a une activité PI-5-phosphatase qui catalyse l’hydrolyse du PIP2 en 

62

phosphatidylinositol-4-monophosphate inactif (Chung et al., 1997). La fodrine, une protéine 

de cytosquelette, agit indirectement sur l’activité PLD en inhibant la synthèse des 

phosphoinositides et en séquestrant le PIP2 déjà présent dans les membranes (Lukowski et al., 

1996 et 1998). Une protéine synapse-spécifique, impliquée dans l’assemblage des vésicules à 

clathrine appelée AP3, inhibe la PLD1 par une interaction directe protéine/protéine (Lee et al., 

1997a). La gelsoline, une protéine fixatrice de l’actine, inhibe l’activation de la PLD par la 

bradykinine dans les fibroblastes NIH3T3 (Banno et al., 1999). Les amphiphysines I et II ont 

aussi été décrites comme inhibitrices des PLD (Lee et al., 2000). La PLD2 peut aussi être 

inhibée sélectivement par certaines protéines. Jenco et ses collaborateurs (1998) ont montré 

que les synucléines α et β sont capables d’inhiber sélectivement l’activité PLD2. L’inhibition 

par les synucléines ne peut pas être levée par les phosphoinositides, ni par les protéines 

activatrices de la PLD et elle n’est pas compétitive par rapport au substrat. 

Des facteurs non protéiques pourraient réguler physiologiquement la PLD. Ainsi, de 

nombreuses études ont montré une inhibition de la PLD par les céramides, qui sont des lipides 

appartenant au groupe des sphingolipides (Gomez-Munoz et al., 1994 ; Venable et al., 1996). 

En effet, les céramides exogènes à courte chaîne (C2-céramide ; C6-ceramide) capables de 

traverser la membrane plasmique, inhibent la PLD de certains types cellulaires tels que les 

fibroblastes (Jones et Murray, 1995), les basophiles leucémiques RBL-2H3 (Nakamura et al., 

1996), les neutrophiles (Nakamura et al., 1994). Le C2-ceramide diminue également la 

translocation à la membrane des PKC, de ARF et de Rho. Dans des cellules HL60 stimulées 

par le FMLP, cette diminution s’accompagne d’une inhibition de l’activité PLD (Abousalham 

et al., 1997). 

II-2-7 Localisation des PLD 

II-2-7-1 Localisation tissulaire 

Une activité PLD a été trouvée dans pratiquement tous les tissus des mammifères étudiés 

(Meier et al., 1999). La PLD1 a une expression restreinte à certains tissus comme la moelle 

épinière, le cerveau, le cœur, le placenta, la rate et le pancréas. Son expression est faible dans 

les poumons, le thymus, la trachée, les ganglions lymphatiques et les leucocytes (Steed et al., 

1998). Des études menées chez le rat et l’Homme ont montré une différence de distribution 

des deux variants PLD1a et PLD1b selon les tissus (Katayama et al., 1998 ; Steed et al., 

1998). La PLD2 semble avoir une distribution plus large que la PLD1. La hPLD2 est 

63

fortement exprimée dans le placenta, le thymus, la prostate, les ovaires, la thyroïde, la trachée 

et la moelle épinière. Les mPLD2 et rPLD2 ont une répartition tissulaire similaire à celle de la 

hPLD2, à l’exception du thymus et de la rate où cette enzyme est beaucoup plus abondante 

chez l’homme que chez les rongeurs (Colley et al., 1997b ; Kodaki et Yamashita, 1997). Des 

trois isoformes de PLD2, PLD2a est la plus abondante dans les tissus étudiés par rapport aux 

PLD2b et PLD2c. 

II-2-7-2 Localisation subcellulaire 

Les expériences de fractionnement sub-cellulaire démontrent la présence d’une activité PLD 

dans pratiquement tous les compartiments cellulaires y compris la membrane plasmique, 

l’enveloppe nucléaire, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi et les vésicules de 

transport et de sécrétion. Le Tableau VII résume les différents compartiments où la PLD a été 

décrite (Pour revue voir Liscovitch et al., 1999). 

Après fractionnement subcellulaire de foie de rat, l’activité PLD1 la plus importante a été 

trouvée au niveau de la membrane plasmique, bien qu’une activité significative soit également 

présente au niveau du noyau et de l’appareil de Golgi. Une autre étude montre que l’activité 

PLD stimulée par ARF est plus forte dans les membranes du Golgi que dans les membranes 

du réticulum endoplasmique ou que dans la membrane plasmique (Ktistsakis et al., 1995). 

Freyberg et al. (2001) ont montré que la PLD1 endogène est localisée au niveau de l’appareil 

de Golgi et du noyau en utilisant des anticorps spécifiques. La PLD2 recombinante est 

localisée au niveau de la membrane plasmique dans les cellules au repos et elle est 

redistribuée vers les compartiments vésiculaires sub-membranaires lorsque les cellules sont 

stimulées (Colley et al., 1997b). 

Une localisation de la PLD (activité et/ou protéine) au niveau des structures résistant aux 

détergents non ioniques de différentes cellules a aussi été rapportée (Czarny et al., 1999 ; 

Czarny et al., 2000 ; Liscovitch et al., 2000; Diaz et al ; 2002). Les deux isoformes PLD1 

et/ou PLD2, suivant le type cellulaire considéré, ont été identifiées dans ces structures. Ainsi, 

PLD2 est présente dans les fractions membranaires enrichies en cavéoline des kératinocytes 

HaCaT (Czarny et al., 1999). Les deux isoformes PLD1 et PLD2 coexistent dans les cavéoles 

des fibrobastes NIH 3T3 transformés par v-Src, v-Raf et v-Ras (Xu et al., 2000), alors que 

seule PLD1 a été détectée dans les fibroblastes de rat 3Y1 (Kim et al., 1999c). Selon certains 

64

auteurs, PLD2 serait la forme prédominante dans les cavéoles (60% pour PLD2 contre 10% 

pour la PLD1) (Czarny et al., 2000). Les deux isoformes de PLD sont inhibées par la 

cavéoline (Czarny et al., 1999 ; Czarny et al., 2000 ; Kim et al., 1999a). 

Tableau VII: Localisation subcellulaire de l’activité PLD (Liscovitch et al., 1999). 

Compartiment cellulaire Type d’activité PLD Références 

Membrane plasmique 

Oléate indépendante 

GTPγS dépendante 

ARF et Rho dépendante 

PLD2 

Kobayachi et al., 1987 

Ribbers et al., 1996 

Whatmore et al., 1996 

Colley et al. 1997 

Granules sécrétoires 

ARF dépendante 

PLD1a et PLD1b 

Morgan et al., 1997 

Brown et al., 1998 

Appareil de Golgi ARF dépendante Ktistakis et al., 1995 

Réticulum endoplasmique PMA dépendante (in vivo) Decker et al., 1996 

Noyau 

ARF /Rho dépendante 

Oléate dépendante 

Clark et al., 1997 

Kanfer et al., 1996 

Mitochondries PE-PLD calcium dépendante Madesh et al., 1997 

Cavéoles PC-PLD-PIP2 dépendante Czarny et al., 1999 

Cytosquelette ARF et Rho dépendante Rudge et al., 1998 

Cytosol 

PI-PE/ PLD 

ARF dépendante 

Balsinde et al., 1989 

Siddiqui et al., 1995 

Cette inhibition de la PLD se produit aux fortes concentrations en cavéoline (de l’ordre de 

quelques dizaines de micromolaires). La présence de PLD dans les radeaux lipidiques des 

cellules dépourvues de cavéoline, essentiellement des cellules sanguines, a été décrite (Iyer et 

Kusner., 1999 ; Hodgkin et al., 1999 ; Diaz et al., 2002). Hodgkin et ses collaborateurs (1999) 

ont réussi à mettre en évidence une régulation de la PLD des radeaux par la PKC et par les 

petites protéines G. Les cellules mononucléées du sang périphérique expriment les deux 

isoformes de PLD (PLD1 et PLD2). PLD1 apparaît comme préférentiellement associée aux 

radeaux lipidiques alors que la PLD2 ne l’est pas (Diaz et al., 2002). Par ailleurs, certains 

65

travaux ont montré un enrichissement en PIP2, cofacteur de la PLD, au niveau des radeaux 

lipidiques qu’ils soient enrichis ou non en cavéoline (Hope et Pike., 1996 ; Liu et al., 1998 ; 

Pike et casey, 1996). 

II-2-8 Rôles physiologiques de la PLD 

Les fonctions cellulaires où une implication de la PLD a été démontrée sont multiples. On 

peut citer le trafic vésiculaire (Boman et al., 1995 ; Brown et al., 1993; Ktistakis et al., 1996; 

Singer et al., 1997), l’exocytose et la sécrétion (Caumont et al., 1998 ; Vitale et al., 2001 ; 

Gasmen et al., 2003), la réorganisation du cytosquelette (Ha et Exton, 1993 ; Ha et al.,1994 ; 

Kam et Exton, 2001; Komati et al., 2005), l’apoptose (Kasai et al., 1998; Chen et al., 2000) la 

différenciation et la prolifération cellulaire (Boarder, 1994 ; Yoshimura et al., 1996 et 1997 ; 

Naro et al., 1997 ; El Marjou et al., 2000 ; Foster et Xu, 2003 ; Mc Dermott et al., 2004; 

Komati et al., 2005). 

L’activation de la PLD via des récepteurs membranaires a été largement étudiée par 

différentes équipes. En hydrolysant les phospholipides membranaires (PC, PI, PE), la PLD 

modifie les propriétés physicochimiques des membranes en altérant leur composition. Son 

produit, le phospholipide anionique PA, provoque des changements de courbure de la 

membrane dus à sa forme en cône. Ces modifications pourraient expliquer l’implication de la 

PLD dans les processus faisant intervenir un remodelage des structures membranaires 

(sécrétion, phagocytose, trafic vésiculaire….) (Exton, 1997a et b). L’action de la PLD sur son 

substrat majeur la PC aboutit à la production de PA et de choline. La choline produite par la 

PLD est utilisée dans la synthèse de novo des phospholipides membranaires ainsi que dans 

celle de l’acétylcholine, un neuromédiateur des cellules neuronales (Klein et al., 1995). Le PA 

est un second messager de première importance impliqué dans divers processus biologiques 

tels que la mitogénèse, le trafic vésiculaire, le réarrangement du cytosquelette, les réactions 

inflammatoires, etc.… (English, 1996 ; Singer et al., 1997). Il peut être métabolisé en 

diacylglycérol (DAG) sous l’action d’une phosphatidate phosphohydrolase (Jamal et al., 

1991 ; Brindley et Waggoner., 1996). Le DAG est un second messager lipidique qui active les 

PKC impliquées dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires comme la croissance, 

la différenciation ou la mort cellulaire (Nishizuka, 1988 et 1992). Le PA peut aussi être 

métabolisé en acide lysophosphatidique (lyso-PA) sous l’action de phospholipases A2. Le 

lyso-PA est un second messager intracellulaire qui intervient dans l’agrégation plaquettaire, la 

66

prolifération, la croissance cellulaire et l’organisation du cytosquelette d’actine (Eichholtz et 

al., 1993 ; Moolenaar, 1995). 

II-2-8-1 PLD et prolifération cellulaire 

Les conséquences fonctionnelles de l’activation de la PLD sur la prolifération cellulaire 

dépendent du type cellulaire considéré. L’activité PLD est augmentée en réponse au PDGF 

(Plevin et al., 1991), l’EGF (Song et al., 1994), l’hormone de croissance (Zhu et al., 2002) et 

les facteurs de croissance des fibroblastes (Motoike et al., 1993; Sa et Das., 1999). Plusieurs 

observations ont confirmé le rôle clef de la PLD dans la prolifération. En effet, l’addition de 

PLD, PA ou LPA exogènes à des cellules en culture augmente l’incorporation de thymidine 

tritiée (Fukami et Takenawa, 1992; Kondo et al., 1992 ; Van corven et al., 1989). L’activité, 

et/ou l’expression de la PLD, sont élevées dans les cellules cancéreuses du sein (Noh et al., 

2000; Uchida et al., 1997), gastriques (Uchida et al., 1999) ou rénales (Zhao et al., 2000). 

Certains travaux ont montré que la stimulation de la PLD par les esters de phorbol, qui sont de 

puissants activateurs de PLD (Gustavsson et Hanson, 1999 ; Kötter et al., 2000 ; Komati et al., 

2004), induit une hyperprolifération (Kiss et Tomono, 1995 ; Kötter et al., 2000). De plus, 

l’utilisation d’alcools primaires comme inhibiteurs de PLD provoque l’arrêt de la prolifération 

(Kötter et Klein, 1999; Kötter et al., 2000). De l’ensemble de ces données, il ressort que la 

PLD a un rôle pro-prolifératif. 

Par contre, ce n’est pas le cas des cellules lymphoïdes où il a été montré que l’activation de la 

PLD est impliquée dans la transmission de signaux antiprolifératifs (Gilbert et al., 1998 ; Diaz 

et al., 2002 ; Diaz et al., 2005). L’activation de la PLD dans les lymphocytes humains, par 

l’acide docosahexaénoique (DHA) ou le monohydroxyde dérivé de l’acide arachidonique (12 

HETE), est accompagnée d’une inhibition de la réponse proliférative aux mitogènes (Joulain 

et al., 1995 ; Bechoua et al, 1998 ; Diaz et al, 2002). Une étude plus récente a montré que la 

surexpression de la PLD1 dans les cellules T Jurkat inhibe l’expression de l’ARNm de l’IL2 

en réponse au PMA et à l’ionomycine (Diaz et al., 2005). 

67

II-3 Acides gras et immunité 

II-3-1 Généralités 

De nombreuses études expérimentales et cliniques réalisées ces deux dernières décennies ont 

mis en évidence le rôle important que jouent les lipides alimentaires dans le contrôle de la 

réponse immunitaire. Les lipides sont présents dans les aliments sous deux formes 

principales : les triglycérides (TG) et les phospholipides (PL). Les acides gras (AG) sont 

majoritairement présents sous forme estérifiée dans ces structures et ne sont que peu 

abondants sous forme libre dans les matières grasses naturelles. Ce sont des molécules 

organiques comprenant une chaîne hydrocarbonée de longueur variable, avec une extrémité 

carboxyle et une extrémité méthyle terminales. La fonction carboxylique permet à l’AG de 

former une liaison ester avec les hydroxyles du squelette de base glycérol pour former des 

triglycérides ou des phospholipides. 

Les AG se caractérisent par: 

La longueur de leur chaîne carbonée: le nombre d’atomes de carbone, 

usuellement pair dans la nature, varie généralement entre 4 et 24. Les AG sont dits à chaîne 

courte lorsque le nombre d’atome de carbone est ≤ 6, à chaîne moyenne lorsque il est compris 

entre 6 et 14, et à chaîne longue lorsque il est ≥ 14. 

Leur degré d’insaturation: l’insaturation est définie par le nombre de doubles 

liaisons présentes sur la chaîne carbonée. L’absence de double liaison caractérise les AG 

saturés (AGS). Une seule double liaison définit les AG monoinsaturés (AGMI). Les AG ayant 

deux doubles liaisons ou plus sont appelés AG polyinsaturés (AGPI). La présence de doubles 

liaisons sur la chaîne carbonée rend l’AG sensible aux phénomènes de peroxydation 

particulièrement sous l’effet de l’oxygène de l’air. 

Leur isomérisation géométrique: l’isomérisation ne concerne que les AG 

comportant au moins une double liaison. Elle est définie par la position des chaînes carbonées 

par rapport aux doubles liaisons. L’isomère est cis lorsque les deux parties de la chaîne 

carbonée placées de part et d’autre de la double liaison sont, dans l’espace, situées du même 

côté d’un plan passant par la double liaison. Lorsque ces deux parties sont placées de part et 

d’autre de ce plan, l’isomère est trans. Les acides trans sont très peu abondants dans les 

matières grasses naturelles et leur rôle physiologique est encore mal connu. 

68

II-3-2 Nomenclature des AG 

La nomenclature des AG est basée sur le nombre d’atomes de carbone de leur chaîne 

aliphatique et leur degré d’insaturation. Il existe deux dénominations : un nom systématique et 

un nom commun (Tableau VIII). Le nom systématique s’efface souvent devant le nom 

d’usage. Deux numérotations coexistent, l’une systématique utilisée par les chimistes et 

l’autre utilisée par les nutritionnistes. Cette dernière permet de définir la famille de l’AG, 

identifiée par la lettre ω (Oméga) ou le sigle n-, suivi d’un chiffre qui indique la place de la 

première double liaison par rapport à l’extrémité méthyle de la chaîne carbonée. Il existe 

quatre familles principales d’AG: ω3, ω6, ω7 et ω9. A l’inverse, dans la numérotation 

systématique la position des doubles liaisons est déterminée à partir de l’extrémité 

carboxylique (Figure 12). 

Une notation symbolique qui mélange les deux numérotations, et qui va servir tout aussi bien 

aux chimistes qu’aux nutritionnistes a été définie. Sa notation est la suivante: 

Cx: yn-m où x est le nombre d’atomes de carbones, y, le nombre de doubles liaisons ; n 

définit la place de la double liaison la plus éloignée du carbonyle ; m définit la place de la 

double liaison décomptée à partir du groupement méthyle terminal qui donne l’appartenance à 

une famille. Les autres doubles liaisons se déduisent facilement, puisque dans les conditions 

physiologiques, il y a toujours trois carbones entre deux doubles liaisons. Ainsi, la 

dénomination de l’acide linoléique devient donc C18:2n-6 (18 : nombre d’atomes de carbone; 

2, nombre de doubles liaisons; n-6, première double liaison à 18-6= 12 atomes de carbone en 

partant du carboxyle et au sixième carbone à partir de l’extrémité méthyle. L’autre double 

liaison se déduit : 12-3= 9). 

18 10 

9 

6 5 4 3 2 

COOH 

Acide linoléïque 

1 2 3 4 5 

ω 

ω6 

Figure 12: Règle de nomenclature des acides gras. 

Deux numérotations existent, l’une systématique et l’autre utilisée par les nutritionnistes. La 

nomenclature systématique détermine la position de la première double liaison à partir de l’extrémité 

carboxylique. La nomenclature des nutritionnistes indique la première double liaison à partir de 

l’extrémité méthyle. 

69

Tableau VIII: Nomenclature des acides gras. 

Abréviation Nom commun Nomenclature Internationale 

C12:0 Acide laurique Acide dodécanoïque 

C14:0 Acide myristique Acide tétradécanoïque 

C16:0 

Acide palmitique 

Acide hexadécanoïque 

C16: 1n-7 Acide palmitoléique Acide ∆9-hexadécénoïque 

C18:0 Acide stéarique Acide octadécanoïque 

C18: 1n-9 Acide oléique Acide ∆9-octadécénoïque 

C18: 2n-6 Acide linoléique Acide ∆9, 12-octadécadiénoïque 

C18: 3n-6 Acide γ linolénique Acide ∆6, 9, 12-octadécatriénoïque 

C18: 3n-3 Acide α linolénique Acide ∆9, 12, 15-octadécatriénoïque 

C20: 0 Acide Arachidique Acide eicosanoïque 

C20: 3n-9 Acide eicosatriénoïque Acide ∆5, 8, 11-eicosatriénoïque 

C20: 3n-6 

Acide dihomo-γlinolénique 

Acide ∆8, 11, 14-eicosatriénoïque 

C20: 4n-6 Acide arachidonique Acide ∆5, 8,11, 14-eicosatétraénoïque 

C20: 5n-3 Acide eicosapentaénoïque Acide ∆5, 8, 11, 14, 17- éicosapentaénoïque 

C22:0 Acide béhénique Acide docosanoïque 

C22: 4n-6 Acide docosatétraénoïque Acide ∆7, 10, 13, 16-docosatétraénoïque 

C22: 5n-6 Acide docosapentaénoïque Acide ∆4, 7, 10, 13, 16-docosapentaénoïque 

C22: 5n-3 Acide docosapentaénoïque Acide ∆7, 10, 13, 16, 19- docosapentaénoïque 

C22: 6n-3 Acide docosahexaénoïque Acide ∆4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaénoïque 

C24:0 Acide lignocérique Acide tétracosanoïque 

70

II-3-3 Les acides gras essentiels (AGE) 

A partir des précurseurs, l’organisme est capable de synthétiser des AG à longue chaîne par 

une série de réactions d’élongation et de désaturation. L’élongation est obtenue grâce à des 

élongases, qui insèrent chaque fois deux atomes de carbone dans la chaîne carbonée de l’AG. 

L’AG résultant appartiendra à la même famille car l’allongement se fait toujours à partir de 

l’extrémité carboxyle. La désaturation résulte de l’action d’une désaturase. Les désaturases 

ont une grande spécificité de site. Par exemple, la ∆-9 désaturase ne peut introduire une 

double liaison qu’entre le carbone 9 et le carbone 10 d’un AG. Certaines désaturases sont 

communes aux animaux et végétaux (∆-9, ∆-6, ∆-5, ∆-4 désaturases), d’autres sont 

spécifiques du monde végétal (∆-12 et ∆-15 désaturases). Ces deux désaturases (∆-12 et ∆-15 

désaturases) sont à l’origine des deux familles d’AG dont les précurseurs (ou acides gras 

essentiels) ne peuvent être synthétisés par l’Homme. Il s’agit de l’acide linoléique (18:2n-6), 

précurseur de la famille n-6, et de l’acide α-linolénique (18:3n-3), précurseur de la famille n- 

3. Les voies de synthèse des AGPI sont schématisées dans la Figure 13. 

II-3-4 Rôle biologique des AG: 

Les AG sont impliqués dans la régulation de nombreuses fonctions essentielles dans 

l’organisme. On peut mentionner ainsi: 

II-3-4-1 Rôle énergétique: 

Les AG à longue chaîne sont activés sous forme d’acyl-CoA dans le cytoplasme et peuvent 

être estérifiés en triglycérides et stockés dans le tissu adipeux blanc, ou gagner les 

mitochondries pour suivre la voie de la β oxydation. Ce passage intra-mitochondrial est assuré 

après le couplage à la carnitine par l’acyl-carnitine-transférase. Leur valeur énergétique est de 

9 Kcal par gramme de lipide. 

II-3-4-2 Rôle structural: 

Les membranes biologiques sont essentiellement constituées de lipides complexes dont 70 à 

90% de phospholipides. Les AGS et AGI sont des constituants importants des phospholipides 

des membranes cellulaires dont ils assurent la structure et la perméabilité. Ils jouent par 

ailleurs un rôle important dans la disponibilité de protéines fonctionnelles dans la membrane 

cellulaire (acylation de certaines protéines de signalisation). 

71

Acide stéarique C18:0 

Série n-3 Série n-6 

végétaux 

végétaux 

∆15-désaturase 

Acide α-linolénique C18:3 n-3 Acide linoléique C18:2 n-6 


Acide oléique C18:1 n-9 

COOH 

COOH 

COOH 

COOH 


C18:4 n-3 Acide γ-linoléique C18:3 n-6 C18:2 n-9 

COOH 

COOH 

COOH 

élongase 

C20:4 n-3 Acide di-homo-γ-linoléique C20:3 n-6 C20:2 n-9 

COOH 

COOH 

COOH 


Acide éicosapentaénoïque C20:5 n-3 Acide arachidonique C20:4 n-6 

COOH 

COOH 

élongase 

C22:5 n-3 

COOH 

C22:4 n-6 

COOH 

élongase 

C24:5 n-3 

COOH 

C24:4 n-6 

COOH 


C24:6 n-3 C24:5 n-6 

COOH 

COOH 

β-oxydation 

C22:6 n-3 C22:5 n-6 

COOH 

COOH 

Figure 13: Filiation et métabolisme des acides gras (Calder, 1997). 

Le métabolisme des AG conduit à des dérivés supérieurs avec une chaîne métabolique faisant 

intervenir successivement plusieurs désaturases et élongases. L’acide linoléique conduit aux dérivés 

de la famille n-6, successivement les acides γ-linolénique et arachidonique. L’acide α-linolénique 

conduit aux acides eicosapentaénoïque (EPA) et docosahexaénoïque (DHA). L’acide oléique conduit 

aux dérivés de la famille n-9. 

72

II-3-4-3 Rôle fonctionnel 

II-3-4-3-1 Synthèse des eicosanoïdes 

Les eicosanoïdes sont des dérivés oxygénés des AGPI à 20 atomes de carbone. Ils regroupent 

les prostaglandines (PGs), les leucotriènes (LTs), les thromboxanes (TXs), les acides 

hydroxyperoxydés (HPETE) et hydroxylés (HETE). Leur synthèse s’effectue après libération 

de l’AG à partir des phospholipides membranaires par la phospholipase A2. L’AG ainsi libéré 

peut entrer dans deux voies métaboliques: celle des cyclooxygénases et celle des 

lipoxygénases (Figure 14). La voie des cyclooxygénases donne naissance aux PGs et Txs. 

Dans la seconde voie, les lipoxygénases produisent les HPETEs et HETEs. Le HPETE donne 

naissance aux leucotriènes. Ces molécules se comportent à la fois comme médiateurs 

intercellulaires et comme des hormones locales qui jouent de nombreux rôles physiologiques 

et physiopathologiques (notamment dans le processus inflammatoire). 

Acide gras 

(C20) 

Phospholipase A 2 

Cyclooxygénases 

20 2 

2 e- O2 

Lipoxygénases 

PGG 

Acide hydroperoxy-eicosatétraénoïque 

(HPETEs) 

2 e- 

PGH 

Prostanoïdes 

Prostaglandines, prostacyclines 

et thromboxanes 

Acide hydroxy-eicosatétraénoïque 

(HPETEs) 

Leucotriènes 

(LTs) 

Figure 14: Synthèse des eicosanoïdes. 

73

II-3-4-3-2 Régulation de la transmission membranaire du signal : 

Au delà de leurs effets structuraux, certains lipides membranaires sont également sources de 

seconds messagers assurant le couplage fonctionnel entre le récepteur membranaire activé par 

la fixation de son ligand spécifique et l’effecteur intracellulaire. Ces seconds messagers sont 

les diacylglycérols (DAG) libérés à partir des phospholipides sous l’action des PLC, l’acide 

phosphatidique (PA) libéré sous l’action de la PLD et les céramides libérés à partir des 

sphingomyélines sous l’action de la sphingomyélinase. 

II-3-5 Sources habituelles des AGE et de l’acide oléique 

Les acides gras alimentaires sont issus de tous les règnes du monde vivant. La nature et la 

répartition de ceux-ci au sein des aliments font l’objet d’une littérature abondante, parfois non 

convergente entre les auteurs. Cette situation est principalement liée d’une part à l’évolution 

des méthodes de dosage et d’autre part à la variabilité des teneurs dans les échantillons. Les 

principales sources d’AGI à longue chaîne sont les huiles végétales, les margarines élaborées 

à partir de ces dernières et les huiles de poisson. Dans le tableau IX, est reportée la 

composition en AG des principales huiles. 

Parmi les huiles riches en acide oléique on trouve les huiles d’olive, de palme et de colza 

tandis que les huiles riches en acide linoléique sont les huiles de tournesol, de mais, de soja et 

d’arachide. Les AG de la famille n-3 sont présents dans les huiles de poisson. L’huile de 

sardine est riche en AGPI dont les plus importants sont l’acide eicosapentaénoïque (EPA) et 

l’acide docosahexaénoïque (DHA) (Tableau IX). Dans notre étude nous nous sommes 

intéressés à trois huiles produites au Maroc: l’huile d’olive, l’huile de sardine et l’huile 

d’argan (Figure 15). 

74

Tableau IX: Distribution (mole %) des acides gras présents dans les triglycérides des différentes huiles. 

Huiles 

Colza Arachide Mais Tournesol Soja Olive Sardine Argan 

mole % 

C14:0 0,1 -- 0,3 0,1 0,1 0,1 9 0,1 

C16:0 6,8 10 12,8 7,1 10,8 10,1 18,7 13,3 

C16:1 0,3 0,1 0,6 0,1 0,2 0,4 9,3 0,1 

C18:0 1,3 4 3 3,9 3,6 2,4 3,5 5,7 

C18:1n-9 58,8 60,9 27,2 25,8 23,5 75,9 11 45,6 

C18:2n-6 23,3 19,1 52,9 63,1 54,3 10,4 1,5 34,4 

C18:3n-3 8,5 1,8 0,1 7,5 0,9 1 0,1 

C20:0 0,3 2 0,8 0,1 0,2 traces 0,5 0,3 

C20:5n-3 0,5 1 0,6 -- -- -- 18,5 0,2 

C22:5n-3 -- -- -- -- -- -- 1 -- 

C22:6n-3 -- -- -- -- -- -- 7,5 -- 

75

Figure 15 : La répartition de l’arganier, l’olivier et la sardine au Maroc. 

76

II-3-5-1 Huile d’olive 

Le Maroc est l’un des principaux pays producteurs d’huile d’olive. L’olivier est l’arbre le plus 

répandu au Maroc où il représente 50% de la superficie arboricole totale. C’est la « Picholine 

marocaine » qui est la variété la plus répandue puisque, à elle seule, elle couvre 98% des 

plantations. 

L’huile d’olive se compose généralement de 98% de triglycérides qui sont essentiellement 

monoinsaturés. Le principal AG de l’huile d’olive est l’acide oléique (18:1n-9). Il représente 

55 à 83% des AG totaux. Les principaux AGS sont l’acide stéarique (18:0) et l’acide 

palmitique (16:0). Parmi les AGPI, on note une majorité d’acide linoléique. L’huile d’olive en 

contient de 3,5 à 21% selon les conditions climatiques, les conditions de culture et bien 

entendu la variété de l’olivier. Les constituants mineurs de l’huile d’olive (0,5 à 2%) sont 

présents dans la fraction insaponifiable. Cette fraction est composée essentiellement de 

phénols qui sont des antioxydants et protègent l’huile contre le vieillissements, de vitamines 

dont les principales sont les vitamines E, K, D et A, d’alcools (stérols, methyl-stérols, alcools 

tri-terpéniques, alcools aliphatiques….) et de pigments qui donnent la couleur jaune ou verte à 

l’huile. Ce sont principalement la chlorophylle (verte) et le carotène (jaune). Leur proportion 

dépend beaucoup de la maturité des olives. 

II-3-5-2 Huile de sardine 

Le Maroc a une position géographique privilégiée qui lui confère une place remarquable en 

matière de pêche maritime, liée à sa double façade sur les deux mers poissonneuses: l’océan 

Atlantique et la mer Méditerranée. Il est le deuxième fournisseur de poisson en Afrique après 

le Nigeria. Il est aussi le premier producteur mondial de la sardine dite « Sardina 

pilchardus ». 

L’huile de sardine est très insaturée. Elle a tendance à s’oxyder et à se polymériser comme 

toutes les huiles de poisson. Elle est très complexe en raison de la grande variété des AG que 

l’on y trouve. L‘étude de la fraction triglycérique a mis en évidence la prépondérance des 

triglycérides insaturés comportant des AG avec trois insaturations ou plus. L’huile de sardine 

est riche en AG appartenant à la famille n-3. On note une majorité d’EPA (18,5%) et de DHA 

(7,5%). Dans la fraction monoénique, on note une prédominance des acides 16:1 et 18:1n-9. 

L’AGS majoritaire est l’acide palmitique. La composition en AG de cette huile dépend de 

77

l’espèce, de l’alimentation et de la période de la pêche. La fraction des insaponifiables 

constitue de 0,1 à 1,25%. Elle contient des vitamines liposolubles, des stérols, des phénols, 

des alcools tri-terpéniques et des pigments. 

II-3-5-3 Huile d’argan 

L’huile d’argan est extraite de l’amandon de l’arganier «Argania spinosa L. » (Skeels) qui est 

un arbre endémique du sud-ouest marocain. L’arganier est un arbuste épineux pouvant 

atteindre six à huit mètres de haut (Figure 16). Son aspect rappelle celui de l’olivier. Son 

tronc est noueux, souvent formé de plusieurs tiges entrelacées ; la ramification commence à 

environ un mètre du sol. La floraison a lieu au mois de mai. Les fleurs hermaphrodites ont 

une couleur jaune verdâtre. Les fruits sont des drupes ovoïdes vertes, striées de rouge, de la 

taille d’une grosse olive. Le noyau contient une seule amande oblongue (Figure 17). 

Figure 16 : L’arganier 

Figure 17 : Fruits de l’arganier 

78

L’analyse de la composition en AG de l’huile d’argan montre une prédominance des acides 

oléique et linoléique. L’acide palmitique est l’AGS majoritaire. L’acide linolénique est 

présent à moins de 0,25%. D’après sa composition, l’huile d’argan est une huile de type 

oléique/linoléique constituée de presque 80% d’AGI. Une telle composition la rapproche de 

l’huile d’arachide (par sa teneur en acides gras insaturés : 80%) et de l’huile d’olive (par sa 

teneur en acides oléique et palmitique). Cette composition intermédiaire entre l’huile d’olive 

et l’huile d’arachide confère à l’huile d’argan une bonne absorption. La fraction 

insaponifiable de l’huile d’argan possède des caractéristiques physico-chimiques et 

organoleptiques spécifiques, en particulier une odeur de noisette et une couleur brune. Elle 

représente approximativement 1% de la totalité de l’huile. L’analyse qualitative et 

quantitative de cette fraction a révélé la présence de tocophérols (α-tocophérol, β-tocophérol, 

γ-tocophérol et δ-tocophérol), de stérols (spinastérol, schotténol), de carotènes, d’alcools triterpéniques 

et de xanthophylles. La composition de l’huile d’argan peut présenter quelques 

variations en fonction des conditions de culture et des méthodes d’extraction. 

II-3-5-3-1 Utilisation de l’huile d’argan 

L’huile d’argan est une huile d’excellente valeur alimentaire. Elle est utilisée soit fraîche ou 

cuite mais jamais dans les fritures. Sa composition particulière (80% d’AGI) lui confère des 

valeurs nutritionnelles et diététiques intéressantes et ne pose aucun problème de digestibilité 

et d’absorption intestinale par l’organisme humain. Dans la pharmacopée traditionnelle, 

l’huile d’argan et divers produits dérivés de l’arbre ont été de tout temps utilisés pour leurs 

propriétés réelles ou supposées. Cette huile est utilisée pour les soins corporels, dans le 

traitement de l’acné juvénile, de la varicelle et des rhumatismes. Grâce à ces propriétés 

hypocholestérolémiantes, elle est également indiquée en prévention de l’athérosclérose. 

L’utilisation traditionnelle de l’huile d’argan contre le dessèchement cutané et le 

vieillissement physiologique de la peau a motivé certains laboratoires à l’incorporer aux 

produits cosmétiques et à la commercialiser. 

Bien que l’huile d’argan soit connue depuis longtemps pour ses vertus pharmaceutiques et 

nutritionnelles (Charrouf et Guillaume, 1999), la majorité des études réalisés sur cette huile 

s’est intéressée à ses propriétés physicochimiques (Charrouf et Guillaume, 1999 ; Khallouki 

et al., 2003 ; Hilali et al., 2005). L’étude nutritionnelle réalisée in vivo par Belcadi (1994), a 

79

montré que l'ingestion de l'huile d'argan conduit à une modification des AGPI membrannaires 

comparable à celle due à l'huile d'arachide. Récemment, des études pharmacologiques ont été 

entreprises afin de valoriser l’huile d’argan dans le domaine de la prévention et du traitement 

des maladies cardiovasculaires et de l’athérosclérose (Berrada et al., 2000 ; Berrougui et al., 

2003 ; Drissi et al., 2004 ; Berrougui et al., 2004 et 2005 ; Derouiche et al., 2005). Une étude 

nutritionnelle réalisée sur des modèles d’animaux hypertendus, a montré que le gavage 

quotidien des animaux avec de l’huile d’argan, à raison de 5ml /kg /j durant 8 semaines, 

diminue significativement les pressions artérielles systolique et diastolique (Berrada et al., 

2000). Cet effet hypotenseur est associé à une diminution du taux de cholestérol total et des 

LDL (lipoprotéines à faible densité) plasmatiques et à une augmentation des HDL 

(lipoprotéines à haute densité) plasmatiques. Une autre étude nutritionnelle conduite chez le 

rat a eu pour objectif de rechercher l’effet d’une consommation régulière d’huile d’argan sur 

le profil lipidique et lipoprotéique plasmatique. Les résultats obtenus ont montré que 

l’ingestion d’huile d’argan, à raison de 1ml/ 100g/ j pendant 7 semaines, diminue de 37% le 

cholestérol total, de 68% les LDL et de 31% les triglycérides plasmatiques, tandis que le taux 

des HDL reste inchangé par rapport au groupe témoin (Berrougui et al., 2003). Une étude 

clinique conduite par Drissi et al. (2004) chez des sujets sains a montré que l’ingestion d’huile 

d’argan (15g/j) réduit significativement la susceptibilité des LDL à l’oxydation et le taux de 

cholestérol total comparé au groupe non-consommateur. Ces auteurs ont suggéré que grâce à 

sa teneur en antioxydants, l’huile d’argan protège les LDL contre l’oxydation qui représente 

une étape clé dans l’athérosclérose. 

En conclusion, l’ensemble des études nutritionnelles réalisées sur l’huile d’argan, ont montré 

que cette huile possède des propriétés antioxydantes, hypolipémiantes, 

hypocholestérolémiantes et hypotensives. Ceci justifierait son utilisation dans la prévention et 

le traitement des maladies cardiovasculaires et de l’athérosclérose. 

II-3-6 Effet des AG sur les fonctions immunitaires 

Il est maintenant bien admis que les lipides alimentaires exercent une action 

immunomodulatrice et de nombreuses études ont mis en évidence leur rôle important dans le 

contrôle de la réponse immunitaire. En effet, la quantité et la nature des lipides dans 

l’alimentation modulent les fonctions immunitaires et leur régulation (Perez et Alexander, 

80

1998; Kelley, 2001; Calder et al., 2002; De Pablo et al., 2002). L’équilibre entre AGI n-6 et n- 

3 ainsi que le rapport AGS/AGI du régime alimentaire influencent et modulent les fonctions 

immunitaires. Ces données ouvrent des perspectives intéressantes en matière de prévention et 

de traitement des maladies autoimmunes, cardiovasculaires, inflammatoires et lors des 

transplantations d’organe (Van der Heide et al., 1993; Belluzzi et al., 1996; Grimminger et al., 

1996; Belluzzi, 2002; Gil, 2002; Yaqoob, 2003b ; Calder, 2004). 

II-3-6-1 Données épidémiologiques 

De nombreuses enquêtes épidémiologiques ont largement décrit la faible incidence des 

maladies auto-immunes et inflammatoires dans les populations consommant de l’huile d’olive 

(composant traditionnel et essentiel du régime méditerranéen) et de l’huile de poisson dans 

leur alimentation (Dyerberg et Bang, 1979; Keys et al., 1986; Linos et al., 1991; Shapiro et 

al., 1996; Stoneham et al., 2000). 

En 1970, Bang et Dyerberg (Bang et al., 1976; Bang et al., 1980; Dyerberg et Bang, 1979) ont 

publié les résultats des enquêtes épidémiologiques menées chez les esquimaux du Groenland, 

montrant que la très faible mortalité d’origine cardiovasculaire (accidents coronariens) dans 

cette population est due à la forte consommation de poisson dans leur alimentation apportant 

ainsi une forte dose d’AGPI n-3 (EPA et DHA). L’analyse des phospholipides tissulaires et 

plasmatiques confirme les taux élevés de ces AG. Inversement le taux d’acide arachidonique 

est très bas, ce qui se traduit par une inversion du rapport AGPI n-6/AGPI n-3. D’autres 

enquêtes épidémiologiques ont également montré une faible mortalité d’origine 

cardiovasculaire chez les populations suivant un régime méditerranéen (Keys et al., 1986; 

Linos et al., 1991) caractérisé par une faible consommation d’AGPI et une forte 

consommation d’AGMI provenant de l’huile d’olive. 

De nombreuses études ont montré qu’une forte consommation d’huile de poisson (AGPI n-3) 

ou d’huile d’olive (acide oléique) diminue la fréquence de différents types de cancer (sein, 

colon et prostate) (Blot et al., 1975; Martin-Moreno et al., 1994 ; Caygil et al., 1996; 

Stoneham et al., 2000; Trichopoulou et al., 2000). 

81

II-3-6-2 Effets des AG sur les fonctions immunitaires 

Basées sur ces études épidémiologiques, plusieurs études expérimentales visant à étudier les 

effets des AGI sur le système immunitaire ont été menées « in vitro », sur des lymphocytes 

d‘origine animale ou d‘origine humaine, et « in vivo »chez l’animal et l’Homme. L’addition 

d’AGI au milieu de culture des cellules immunitaires ou la supplémentation des régimes 

alimentaires par des AGI altèrent divers paramètres de la réponse immunitaire, notamment la 

réponse proliférative des lymphocytes aux mitogènes (Zurier et al., 1999; Verlengia et al., 

2003 et 2004; Liu et al., 2003), la production des cytokines (Endress et al., 1989; Endress et 

al., 1993 ; Yaqoob et Calder, 1995; Wallace et al., 2001; Verlengia et al., 2003 et 2004), 

l‘activité des cellules NK (Yaqoob et al., 1994; Thies et al., 2001a) et l‘expression des 

molécules de surface sur les lymphocytes T (Hughes et al., 1996 ; Hughes et Pinder, 1996; 

Sasaki et al., 1999). La supplémentation des régimes alimentaires en AGI modifie également 

la production des eicosanoïdes (Kinsella et al., 1990) et la composition en AG des 

phospholipides membranaires (Valette et al., 1991; Calder et al., 1994; Yaqoob et al., 1995a). 

La réponse proliférative des lymphocytes aux mitogènes, c’est-à-dire la capacité des 

lymphocytes à se diviser quand ils sont stimulés par un mitogène, est l’indicateur le plus 

souvent utilisé pour apprécier l’effet des AGI sur les fonctions des cellules immunitaires. Les 

mitogènes les plus utilisés sont la Concanavaline A (ConA) et la phytohémagglutinine (PHA) 

qui stimulent sélectivement les lymphocytes T, le lipopolysaccharide (LPS) qui stimule les 

lymphocytes B et le Pokeweed mitogen (PKW) qui stimule les deux types de lymphocytes. 

La prolifération des lymphocytes est mesurée par l’incorporation de la thymidine tritiée dans 

l’ADN de la cellule ou par des méthodes colorimétriques. 

II-3-6-2-1 Effets antiprolifératifs «in vitro» 

Plusieurs études ont mis en évidence un effet immunosuppresseur des AGI par des techniques 

«in vitro». Les lymphocytes sont mis en culture en présence de mitogène. Les AG sont 

ajoutés dans le milieu de culture des lymphocytes, soit sous forme libre dans l’éthanol, soit 

liés à de l’albumine dans un rapport donné. En général, les études sont réalisées en comparant 

les effets des différentes familles d’AG (saturés, n-6, n-9 et n-3). Les résultats de plusieurs 

groupes montrent que les AGI inhibent la prolifération des lymphocytes T stimulés par un 

mitogène de façon dose-dépendante (Calder et Newsholme, 1993; Joulain et al., 1995; Zurier 

et al., 1999; Verlengia et al., 2003 et 2004). Cependant, il est important de noter que tous les 

AG n’ont pas les mêmes propriétés immunomodulatrices. Ainsi, Calder et ses collaborateurs 

82

(1991) ont montré que les AGS ont peu ou pas d’effet sur la réponse lymphoproliférative, 

tandis que les AGI sont inhibiteurs. L’inhibition la plus forte a été observée quand les 

lymphocytes sont incubés en présence d’acide arachidonique ou d’EPA à des concentrations ≥ 

50µM (Calder et al., 1991). Les AG les plus inhibiteurs sont généralement de la série n-3. 

L’avantage d’une telle méthodologie est que contrairement à la nutrition, les expériences 

peuvent être réalisées dans des délais très brefs et donc renouvelées un grand nombre de fois. 

II-3-6-2-2 Effets antiprolifératifs dans les études nutritionnelles 

Les études nutritionnelles menées chez l’animal et l’Homme ont montré, de façon constante, 

que les régimes riches en huiles de poisson, essentiellement constituées d’AGPI n-3, ont un 

effet inhibiteur sur la réponse proliférative des lymphocytes (Kelley et Parker, 1997; Jolly et 

al., 1997; Thies et al., 2001b; Calder et al., 2002). Par contre, les travaux visant à étudier 

l’effet de régimes enrichis en AGPI n-6, notamment en acide linoléique (18:2n-6), sur la 

prolifération lymphocytaire ont donné des résultats contradictoires. En effet, certains auteurs 

ont rapporté une augmentation de la prolifération des lymphocytes (Erikson et al., 1980), 

d’autres au contraire ont montré un effet immunosuppresseur (Meydani et al., 1991; Calder et 

al., 1995; Moussa et al., 2000) ou une absence d’effet (Locniskar et al., 1983). Plusieurs 

études ont rapporté que des régimes contenant une quantité importante d’acide oléique (AG 

majeur de l’huile d’olive) diminuent significativement la prolifération des lymphocytes 

(Berger et al., 1993; Yaqoob et al., 1994; Sanderson et al., 1995; Jeffery et al., 1996b; 

Yaqoob, 1998 et 2002). 

La divergence des résultats obtenus lors des études nutritionnelles peut provenir de la nature 

du régime utilisé, sa durée, ainsi que des conditions expérimentales utilisées lors des tests de 

prolifération. En plus, ces différences peuvent être liées à l’espèce animale, à l’origine de la 

population lymphocytaire (splénique, thymique ou périphérique) ainsi qu’à l’âge et au sexe 

des animaux (Stulnig, 2003; Calder et al., 2002). L’administration à des rats d’un régime à 

fort apport en AG (high fat) a un effet immunosuppresseur plus important que celle du même 

type de régime mais à faible teneur en AG (low fat) (Calder et al., 1998; Moussa et al., 2000). 

Une étude nutritionnelle conduite chez des adultes sains montre que l’ingestion de 8g/j 

d’huile de poisson n’affecte pas la réponse lymphoproliférative à la PHA ou à la ConA bien 

qu’une tendance à la baisse de la réponse à l’anti-CD3 soit observée (Virella et al., 1991). La 

supplémentation du régime alimentaire de sujets sains avec 18 g/jour d’huile de poisson 

83

pendant 6 semaines conduit à une inhibition de la réponse lymphoproliférative à la PHA 

seulement 10 semaines après la fin du traitement (Endres et al., 1993) et non à la fin de la 

période de supplémentation. En ce qui concerne les différences liées à l’espèce animale. 

Alexander et Smythe (1988) ont montré que l’ingestion d’huile de poisson par des souris 

BALB/c conduit à une inhibition de la réponse proliférative des lymphocytes spléniques à la 

ConA. Dans le cas des souris NZB/NZW aucune influence du régime sur la réponse 

lymphoproliférative n’est observée. Les résultats publiés par Calder et al. (2002) confirment 

ces travaux (Tableau X). 

Tableau X: Production des cytokines par les splénocytes de deux souches de souris 

(Calder et al., 2002). 

Concentration (pg/ml) 

Souche de souris IL-2 IFN-γ IL-4 IL-10 

C57BI/6 660 (60) 510 (15) 92 (10) 72 (10) 

Balb/c 1100 (50)* 35 (5)* 275 (25)* 170 (15)* 

*significativement différent de C57BI/6. 

L’influence de l’origine de la population lymphocytaire sur la réponse proliférative a été 

clairement illustrée par l’étude menée par Locniskar et al. (1983). En effet ces auteurs ont 

montré que chez des rats soumis à des régimes riches en AGPI de la série n-6, seule la 

réponse lymphoproliférative aux mitogènes des lymphocytes spléniques était inhibée, et non 

celle des lymphocytes de ganglions cervicaux. Plusieurs études nutritionnelles ont montré 

l’effet des conditions expérimentales sur la réponse proliférative (Marshall et Johnston, 1985; 

Yaqoob et Calder, 1995). En effet, Yaqoob et Calder (1995) rapportent un effet inhibiteur du 

régime enrichi en huile de poisson et en huile de tournesol par rapport aux régimes enrichis en 

huile de coco et d’olive, lorsque les lymphocytes sont cultivés dans un milieu contenant du 

sérum autologue. Cet effet n’est pas obtenu lorsque les cellules sont cultivées en présence de 

sérum de vœu fœtal. 

Meydani et al (1991) ont étudié l’impact d’un régime riche en AGPI n-3 sur la réponse 

proliférative des lymphocytes à la PHA chez des femmes jeunes (22-33 ans) et des femmes 

âgées (51-68 ans). Les résultats montrent une inhibition de la réponse proliférative 

84

uniquement chez les lymphocytes provenant des sujets âgés. Yaqoob (2004) a également 

montré que les sujets âgés sont plus sensibles à l’effet immunosuppresseur de l’huile de 

poisson que les sujets jeunes (Figure 18). 

Indice de stimulation 

Placebo Huile de poison Placebo Huile de poison 

Sujets jeunes 

(Données de Yaqoob et al. 2000) 

Sujets agées 

(Données de Thies et al. 2001b) 

Figure 18: Effet de l’âge sur la réponse proliférative des lymphocytes (Yaqoob, 2004). 

Les sujets âgés sont plus susceptibles à l’effet immunomodulateur de l’huile de poisson que les sujets 

jeunes. Dans l’étude de Yaqoob et al (2000), les auteurs ont montré une absence d’effet de l’ingestion 

de 3,2g/jours d’AGPI n-3 (n=8) sur la réponse proliférative des lymphocytes chez les sujets âgés de 

moins de 60 ans, tandis que Thies et al. (2001b) ont montré un effet inhibiteur significatif sur la 

réponse proliférative des lymphocytes des sujets âgés de plus de 55 ans, avec une ingestion 

journalière d’AGPI n- 3 de 1g (n=8). (), Avant le régime; (), après le régime. Indice de 

stimulation, rapport de la [ 3 H] thymidine incorporée dans l’ADN des cellules stimulées et des cellules 

non stimulées. * indique une différence significative par rapport au placebo P

II-3-7 Mécanismes d’action des AG 

Alors que l’effet immunomodulateur des AGI a été bien démontré, les mécanismes 

moléculaires qui sous-tendent cet effet sont encore mal compris. Plusieurs études se sont 

intéressées au mécanisme par lequel les AGI exercent leur effet immunomodulateur (Miles et 

Calder, 1998; Teilteibaum et Walker, 2001; De Pablo et al., 2002; Calder et al., 2002; Stulnig, 

2003;Yaqoob, 2004) (Figure 19). 

AGPIs 

Acylation des protéines 

Phospholipides membranaires 

Récepteurs nucléaires 


Membranes plasmiques 

totales 

Messagers lipidiques 

Transduction du signal 

Expression de gène 

Fonctions des cellules immunitaires 

Figure 19: Mécanismes d’action des AG (Stulnig, 2003). 

86

II-3-7-1 Effets des AG sur la synthèse d’eicosanoïdes 

Une des cibles principales affectées par les acides gras est la production d’eicosanoïdes, 

médiateurs dérivés des acides gras à 20 atomes de carbone, en particulier les acides dihomoγ−linolénique 

(20:3n-6), arachidonique (20:4n-6) et eicosapentaénoïque (20:5n-3). Ces 

molécules sont impliquées dans la régulation de la réaction inflammatoire et dans certains 

aspects du fonctionnement des neutrophiles, des monocytes/macrophages, des cellules T et B. 

On distingue 3 séries d’eicosanoïdes selon l’AG précurseur. Ainsi, le 20:3n-6 est le 

précurseur des prostaglandines et thromboxanes de la série 1; en tant que substrat de la 15- 

lipoxygénase, il est le précurseur de l’acide 15 hydroxy-gamma linoléique. Le 20:4 n-6, 

l’AGI le plus abondant dans les membranes, constitue la principale source d’eicosanoïdes. En 

tant que substrat de la 5-lipoxygénase, il conduit à la formation des leucotriènes de la série 4 

et au 5-HETE. Via la voie des cyclo-oxygénases, il donne également naissance aux 

prostaglandines et thromboxanes de la série 2 (Figure 20). L’EPA, de son côté, conduit à la 

formation des leucotriènes de la série 5 et aux prostaglandines et thromboxanes de la série 3 

(Figure 20). 

Phospholipides 

Phospholipase A2 

DGLA 

C20: 3n-6 

ARA 

C20: 4n-6 

EPA 

C20: 5n-3 

COX 

LOX 

COX 

LOX 

COX 

LOX 

PG1 

TXA1 

15-OH-GLA 

PG2 

TXA2 

LT4 

5-HPETE 

5-HETE 

PG3 

TXA3 

LT5 

Figure 20: Les différentes séries d’eicosanoïdes. 

Abréviations : DGLA : acide dihomo-γ−linolénique (20:3n-6), ARA : acide arachidonique (20:4n-6), 

EPA : acide eicosapentaénoïque (20:5n-3, COX : cyclooxygénases, LOX : lipoxygénases, PG : 

prostaglandines, TX : thromboxane, LT : leucotriènes, , HPETE : acide hydroperoxyde, HETE : acide 

hydroxyle, 15-OH-GLA : acide 15 hydroxy-gamma linoléique. 

87

Les prostaglandines et leucotriènes ont un effet pro-inflammatoire marqué. Cependant, les 

eicosanoïdes dérivés des AGPI n-3 sont environ 100 fois moins actifs sur le processus 

inflammatoire que ceux dérivés de l’acide arachidonique. Une augmentation de l’apport en 

acides gras n-3 (18:3n-3, EPA, DHA) s’accompagne d’une diminution prononcée de la 

réaction inflammatoire par diminution de la synthèse des leucotriènes de la série 4 due au 

remplacement du 20 :4n-6 par le 20:5n-3 dans les phospholipides membranaires. Ceci peut 

être dû à la compétition entre 18:3n-3 et 18:2n-6 au niveau de la ∆ 6-désaturase, ou à l’apport 

direct d’AGPI n-3 à longue chaîne, le DHA pouvant être rétroconverti en EPA. 

Les AGPI n-3 inhibent la production des cytokines pro-inflammatoires : TNFα, IL-1 et IL-6 

alors que cet effet n’est pas observé avec les AGPI de la série n-6 (Meydani et al., 1993; 

Calder, 2001). Cette inhibition est vraisemblablement due à leur incorporation dans les 

membranes des cellules mononucléées (Calder, 2001). En effet, Caughey et al. (1996) ont 

montré l’existence d’une relation exponentielle inverse entre le contenu en EPA des 

phospholipides membranaires des cellules mononucléées et la production de TNFα et d’IL- 1. 

Figure 21 : Synthèse des eicosanoïdes à partir des précurseurs oméga 6 et oméga 3. 

L’acide arachidonique (AA) et l’acide eicosapentaénoique (EPA) entrent en compétition au niveau des 

cyclooxygénases et lipooxygénases pour former des eicosanoïdes. Les dérivées de l’AA sont pro 

inflammatoires et pro-agrégants alors que ceux dérivés de l’EPA sont anti-inflammatoires et inhibent 

l’agrégation plaquettaire (Din et al., 2004). 

88

II-3-7-2 Effets des AG sur les radeaux lipidiques 

Les lipides membranaires jouent un rôle important dans la formation des radeaux lipidiques. 

Ils contribuent à leur stabilité et interviennent dans leur fonctionnalité (détaillée dans la 

première partie). Plusieurs protéines localisées dans les DRMs présentent des modifications 

lipidiques. En effet, les protéines à ancre GPI sont localisées dans le feuillet externe de la 

membrane plasmique, tandis que dans le feuillet interne les protéines sont acylées 

(palmitoylation ou myristolytaion). Stulnig et al. (1998) ont montré que l’enrichissement des 

lymphocytes T Jurkat en AGPI n-3 « in vitro » induit un déplacement des protéines acylées 

(protéines de la famille Src) du feuillet interne hors des DRMs, sans affecter la localisation 

des protéines à ancre GPI et du ganglioside GM1 dans le feuillet externe (Figure 22). 

Une autre étude a montré que l’enrichissement des cellules T Jurkat en acide arachidonique 

« in vitro », réduit le contenu des DRMs en tyrosine kinases Fyn et Lck et diminue la 

signalisation calcique, et par conséquent la cascade d’activation lymphocytaire (Stulnig et al., 

2001). La protéine adaptatrice LAT, joue un rôle important dans la signalisation. Sous sa 

forme phosphorylée, elle active d’autres protéines de signalisation incluant la PLCγ qui a un 

rôle clef dans l’activation des lymphocytes (Zhang et al., 1998). Le traitement des cellules T 

Jurkat avec de l’EPA, mais pas avec l’acide stéarique, diminue la phosphorylation de LAT et 

de la PLCγ. Il a été montré que cet effet est dû au déplacement de la protéine LAT hors des 

DRMs (Zeyda et al., 2002). Certaines travaux ont montré que ce déplacement est dû à 

l’altération de leur acylation, qui est essentielle à leur localisation dans les DRMs (Webb et 

al., 2000; Liang et al., 2001). Webb et al (2000) ont montré que le traitement des cellules T 

Jurkat avec de l’acide arachidonique, de l’EPA ou du DHA inhibe la palmitoylation et par 

conséquent la localisation de la tyrosine kinase Fyn dans les DRMs. Un autre exemple de 

l’altération des fonctions lymphocytaires, qui résulte de la modulation de la composition en 

AG des DRMs, est le déplacement et par conséquent l’activation de la PLD après 

enrichissement des lymphocytes T en DHA (Diaz et al., 2002). Les auteurs ont suggéré que 

l’activation de la PLD peut être responsable de l’effet antiprolifératif du DHA dans les 

cellules lymphoïdes (Diaz et al., 2002). 

89


Caveole 

La composition lipidique des microdomaines 

est altérée par les AGPI n-3 

La teneur en sphingomyeline est réduite La teneur en cholestérol et en caveoline 1 

est réduite 

La localisation et le recrutement des Protéines dans les microdomaines 

sont altérés, induisant une modulation dans la cascade de signalisation. 

Cholestérol Sphingolipide Protéine Caveoline-1 

Figure 22: Effet des AGPI n-3 sur les radeaux lipidiques (Ma et al., 2004). 

L’incorporation des AGPI n- 3 (EPA et DHA) dans les DRMs et cavéoles induit une délocalisation des 

protéines acylées et par conséquent un changement des événements de signalisation cellulaire. 

90

II-3-7-3 Effets des AG sur la structure et les fonctions membranaires 

Les AGI ont été longtemps décrits comme étant capables de modifier la structure 

membranaire et par conséquent les seconds messagers produits. Ainsi, l’apport en AG 

modifie la composition en AG de la bicouche lipidique membranaire et peut influencer sa 

fluidité, les interactions lipide-protéine, les interactions ligands récepteurs et modifier 

l’activité des seconds messagers : DAG, PA et céramides qui sont des seconds messagers 

importants dans l’activation lymphocytaire. Les DAG et les PA contiennent dans leur formule 

chimique deux AG en position 1 et 2 du Sn-glycérol. Les céramides comportent un seul AG. 

Il est tout à fait concevable que les régimes lipidiques puissent induire des modifications dans 

la composition en AG de ces seconds messagers, et par là, en modifier leur action et donc 

altérer la transduction des signaux conduisant à l’activation lymphocytaire. Plusieurs travaux 

viennent confirmer cette hypothèse. Ainsi, Fowler et al. (1993) ont montré que des régimes 

enrichis en AGPI de la série n-3 (DHA et EPA) modifiaient la composition en espèces 

moléculaires des DAG ainsi que la quantité de DAG produits lors de la stimulation des 

lymphocytes par la ConA. De telles modifications pourraient moduler l’activation des PKC. 

En effet, il est possible que les DAG activent des isoformes différentes de PKC selon l’AG 

estérifié en position sn-2 dans le phospholipide initial. Ainsi, les DAG ayant l’acide oléique 

ou l’acide arachidonique en position 2 sont plus actifs sur la PKC que des DAG comportant 

deux AGS ou un AGS et un AGI (Kishimoto et al., 1980). En outre, les PA ont leur 

composition en AG modifiée au cours de l’activation lymphocytaire (El bawab et al., 1995). 

Plus récemment il a été montré qu’un régime à base d’AGPI de la série n-3 diminuait la 

production de céramides après stimulation lymphocytaire (Jolly et al., 1997). 

II-3-7-4 Effets des AG sur l’expression des gènes 

Il est maintenant reconnu que les AG sont capables de moduler l’expression de certains gènes 

(Jump et al., 1995; Jump et al., 1996; Schoonjans et al., 1996). L’effet des AG peut être soit 

direct suite à leur liaison avec des récepteurs nucléaires, ou indirect via une altération de la 

transduction du signal initiée dans la membrane plasmique, par exemple au niveau du TCR. 

La transcription de certains gènes pourrait être modifiée suite à l’altération de l’activité de 

facteurs de transcription spécifiques. Parmi les récepteurs nucléaires capables de transmettre 

l’effet transcriptionnel des AG. Les récepteurs PPAR « peroxisome proliferator-activated 

receptors » ont été les mieux caractérisés. Plusieurs isoformes de PPAR ont été clonées: les 

PPARα, PPARβ et PPARγ. Initialement caractérisés pour leur capacité à être activés par les 

91

proliférateurs des peroxisomes (xénobiotiques, fibrates), il a été montré plus récemment que 

les récepteurs PPAR étaient également activés par les AG insaturés et certains eicosanoïdes 

(LT de la série 4, dérivés de PGD2) (Desvergne et Wahli, 1999). Le PPAR-γ forme un 

hétérodimère avec le récepteur de l’acide cis-rétinoïque ou RXR. Ce facteur de transcription 

est ligand-dépendant, ce qui signifie que pour exercer son effet sur la transcription des gènes, 

il faut qu’il y ait fixation sur PPAR ou sur RXR d’une molécule activatrice (Kersten et al., 

2000). Les ligands de PPAR-γ sont la 15-δ-PGJ2, l’EPA, les molécules du groupe de la 

glitazone. Dans les macrophages activés, PPAR-γ est surexprimé (Ricote et al., 1998). Les 

ligands de PPAR-γ inhibent aussi la libération et l’expression des cytokines proinflammatoires 

(Jiang et al., 1998) vraisemblablement via une inhibition de NF-κB. Ces 

différents résultats apportent une base moléculaire aux effets cellulaires inhibiteurs des AGPI 

n-3 à longue chaîne vis-à-vis de la production de cytokines par les macrophages. 

II-3-7-5 AG et résistance naturelle aux infections 

Plusieurs études ont montré la capacité des AG à moduler les réponses immunitaires. Ainsi, 

les AG peuvent être utilisés comme des agents anti-inflammatoires naturels dans le traitement 

des maladies autoimmunes caractérisées par des réactions inflammatoires importantes et, en 

général, par une suractivation du système immunitaire. Parmi ces maladies autoimmunes, on 

note l’arthrite rhumatoïde (Kremer et al., 1990), plusieurs types de scléroses (Bates et al., 

1989), etc. Cependant, il a été rapporté que la supplémentation en AG peut produire des 

effets indésirables sur les réponses immunitaires dus à une réduction de la résistance naturelle 

contre les maladies infectieuses. Cette réduction se traduit par une diminution du pourcentage 

de survie des animaux infectés par des agents pathogènes ou par un affaiblissement de 

l’élimination des bactéries. Cet effet indésirable a été sujet à polémiques (Tableau XI). 

Certaines études ont montré que les régimes supplémentés en AG diminuent la résistance 

naturelle de l’hôte. Ainsi, l’altération de la résistance naturelle aux infections bactériennes a 

été montrée chez des modèles animaux pour lesquels l’administration de régimes contenant de 

l’huile de poisson réduit l’élimination des bactéries dans le foie et dans la rate. Il y a aussi une 

réduction significative de la survie durant le traitement de l’infection par Listeria 

monocytogene et par conséquent, l’élimination de l’agent pathogène (bactéries, virus ou 

parasites) devient plus difficile. 

92

Tableau XI : Influence des régimes lipidiques sur les fonctions du système 

immunitaire chez des animaux infectés avec différents pathogènes (De pablo et al., 

2000). 

Une étude récente montre que l’acide linoléique conjugué n’altère pas la résistance naturelle 

des souris après une infection avec Listéria monocytogène (Turnock et al., 2001). De la même 

façon, une étude précédente avait indiqué une absence d’effet sur la survie de souris infectées 

par Pseudomonas aeruginosa et par Salmonella enterica (Clouva-Molyvdas et al., 1992). Une 

autre étude a rapporté que l’administration de régimes contenant de l’huile de poisson ne 

réduit pas le pourcentage de survie après infection avec Klesbsiella pneumoniae (Bjornsson et 

al., 1997). En effet, la supplémentation en huile de poisson augmente la résistance naturelle 

aux infections en améliorant la production de cytokines telles que l’IL-1 et le TNF chez la 

souris (Blok et al., 1996 ; Blok et al., 1997). Cette divergence de résultats pourrait être due à 

de nombreux facteurs comme le type d’huile additionnée (famille d’AG) dans le régime 

expérimental, la durée du régime, la concentration en AG, la population de cellules examinées 

et les agents infectieux utilisés (nature, dose…). 

93

Bien qu’on soit très loin encore d’avoir complètement élucidé et répertorié tous les 

mécanismes et effets des AG sur le système immunitaire, ces exemples montrent que la 

régulation des fonctions immunitaires par les lipides est une réalité. Si la supplémentation en 

AGI a incontestablement des effets qui peuvent être considérés comme positifs à court terme, 

beaucoup d’inconnues demeurent quant aux conséquences d’une telle supplémentation à 

moyen ou long terme. D’autres questions demandent à être abordées comme celles des 

apports optimaux ou des proportions de chacun des AGPI, des meilleures sources lipidiques à 

utiliser, ou encore les phénomènes de peroxydation des AGPI à longue chaîne. 

94

III- MATERIELS ET METHODES 

III-1 Matériels 

III-1-1 Appareils 

Appareil d’électrophorèse: BIORAD Mini Protean II TM 

Appareil d’électrotransfert: HOEFER SCIENTIFIC INSTRUMENTS Semi-Phor TM 

Appareil d’Hybri-dot Manifold BETHESDA 

Bain à ultrasons BIOBLOCK Scientific Vibra-Cell 75034 

Balance de précision: METTLER type B6 

Balance: METTLER PC 2000 

Centrifugeuse basse vitesse: JOUAN GR 4.11 

Centrifugeuse de paillasse: SIGMA 113 et HERAEUS Biofuge Fresco 

Centrifugeuse haute vitesse: ALC 4239R (rotors A 15-C et A 18-C) 

Collecteur de fraction: LKB BROMMA 2112 Redirac 

Chromatographie gazeuse Hewlett packard série HP6890 modèle G 1530 

Evaporateur rotatif: Rotavapor BÜCHI RE 111 couplé à un bain marie BÜCHI 461 

Générateur de tension et de courant: BIORAD Power-Pac 300 

Lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits: BIOTEK INSTRUMENTS, Inc. Power 

Wave X 

Pompe péristaltique: LKB BROMMA 2232 Microperpex S 

Potter Verre-Teflon: BIOBLOCK SCIENTIFIC 

Potter Verre-Verre: BIOBLOCK SCIENTIFIC 

Réfractomètre portable: POLYLABO Brix 103 et 104 

Sonde à ultrasons BRANSON Sonifier Cell-disruptor B15 

Spectrophotomètre: UVIKON 936 

Thermocycleur MWG-BIOTECH Primus 25/96 

Unités de filtrationn Centricon Plus-20, membranes de type NMWL (seuil de coupure 

10000KD): MILIPORE 

Ultracentrifugeuse: KONTRON INSTRUMENTS Centrikon T-1190 (rotor KONTRON TST 

41.14) 

Caméra CCD ImageMaster VDS-CL AMERSHAM BIOTECH couplée au logiciel de 

traitement d’image ImageQuant AMERSHAM BIOTECH 

95

III-1-2 Réactifs 

Acide docosahexaénoïque, acide eicosapentaénoïque, acide oléique, acide linoléique, acide 

palmitique, acide stéarique et acide myristique : proviennent de SIGMA 

Acide phosphatidique (1-arachidonyl, 2-stearoyl) et phosphatidylbutanol : proviennent de 

TEBU 

Acide [5, 6, 8, 11, 12, 14, 15- 3 H] arachidonique (200 Ci/mmol) : provient de Perkin Elmer 

Life Sciences 

Anticorps monoclonal anti-tubiline α : provient de SIGMA 

Anticorps polyclonaux anti-PLD1 et anti-PLD2 ont été généreusement fournis par Dr Sylvain 

Bourgoin (université Laval, Québec, Canada) 

Anticorps anti-PIP2 : provient de Assay Designs, Euromedex 

Anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la peroxydase de raifort et kit ECL : 

proviennent de AMERSHAM PHARMACIA BIOTECK 

Anticorps secondaire anti-IgG de lapin couplé à la peroxydase de raifort : provient de 

BIORAD 

Bleu trypan : provient de SIGMA 

Butylhydroxytoluène : provient de SIGMA 

Cocktail d’inhibiteurs de protéases (Inhibitor cocktail), saccharose et sous-unité B de la toxine 

cholérique couplée à la peroxydase : viennent de SIGMA 

Concanavaline A, Ficoll histopaque, albumine sérine humaine (HSA) delipidée : proviennent 

de SIGMA 

Milieu RPMI 1640 (HEPES 25mM, bicarbonate 2g/l) : provient de GIBCO 

Scintillant liquide Pico Fluor 15 : provient de PACKARD 

Sérum de vœu fœtal, pénicilline, streptomycine et L-glutamine : proviennent de GIBCO 

Taq polymérase et kit MTT de prolifération : proviennent de Roche Applied Science 

Transcriptase inverse M-MLV : vient de PROMEGA 

Tri Reagent : provient de SIGMA 

Triton X-100 : provient de Merck 

96

III-2 Méthodes 

III-2-1 Préparation des régimes et administration aux animaux 

Des rats males Sprague Dawley (OFA) pesant de 140 à 200 g (moyenne 160.24 ± 2.73 ; 

n=70) au début des expériences, sont placés individuellement dans des cages dans une pièce 

contrôlée en température et en lumière (22°C, cycle 12 h lumière/ 12 h obscurité). Après une 

semaine d’acclimatation, les animaux sont séparés au hasard en cinq groupes et sont nourris 

durant quatre semaines avec un régime sans graisse (Unité Alimentaire Rationnelle, UAR) 

additionné de différentes huiles à raison de 10% en poids (10g d’huile pour 100g de régime). 

La composition de base du régime est montrée dans le Tableau XII. 

Pour chaque régime, une quantité minimale (2% en poids) d’huile de tournesol est apportée 

comme source d’acide gras n-6 afin de ne pas induire de déficience en acide linoléique, un 

acide gras essentiel appartenant à la famille n-6. Le régime enrichi en acides gras n-3 (groupe 

poisson) contient 8% en poids d’huile de sardine (Radi Holding, Casablanca, Maroc) et 2% en 

poids d’huile de tournesol. Le régime enrichi en acides gras n-6 et n-9 (groupe argan) contient 

8% en poids d’huile d’argan (association Targanine, Tamanar, Maroc) et 2% en poids d’huile 

de tournesol. Le régime enrichi en acides gras n-9 (groupe olive) contient 8% en poids d’huile 

d’olive (production local, Fès, Maroc) et 2% en poids d’huile de tournesol. Le régime enrichi 

en acides gras saturés (groupe noix de coco) contient 8% en poids d’huile de noix de coco 

(coopération pharmaceutique française, Rhône-Poulenc Rorer, Lyon, France) et 2% en poids 

d’huile de tournesol. Enfin, le régime enrichi en acides gras n-6 (groupe tournesol) contient 

10% en poids d’huile de tournesol. Les régimes sont préparés tous les trois jours et stockés à - 

20°C à l’obscurité. Dans ces conditions de conservation, ils ne subissent que très peu 

d’oxydation. Cela a été vérifié par un test à l’acide thiobarbiturique qui détecte le dialdéhyde 

malonique produit au cours de la peroxydation des acides gras (résultats non montrés). Les 

animaux reçoivent une ration fraîche chaque jour et sont pesés tous les jours. 

97

Tableau XII : Composition des régimes expérimentaux 1 

Régimes 

Ingrédients Poisson Argan Olive Noix de coco Tournesol 

g/100 g de régime 

Caséine délipidée 2 20.25 20.25 20.25 20.25 20.25 

Farine de maïs + 

glucose 

57.0 57.0 57.0 57.0 57.0 

Cellulose 5.50 5.50 5.50 5.50 5.50 

Mélange minéral 3 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 

Mélange 

Vitaminique 4 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 

Huile de poisson 8 0 0 0 0 

Huile d’argan 0 8 0 0 0 

Huile d’olive 0 0 8 0 0 

Huile de noix de coco 0 0 0 8 0 

Huile de tournesol 2 2 2 2 10 

1 Les régimes sont isoenergétiques et fournissent 14,6 Mcal/Kg de régime. 

2 Apport en acides aminés (mg/g de régime) : Arginine, 8,5; Cystéine, 3; Lysine, 17,4; Méthionine, 7,1; 

Tryptophane, 5; Glycine, 1. 

3 Apport minéral (g/Kg de régime):CaHPO 4 .2H 2 O, 30; KCl, 7; MgO, 3; MgSO 4 .7H 2 O, 3.5; Fe 2 O 3 , 0.2; 

FeSO 4 .7H 2 O, 0.35; MnSO 4 .H 2 O, 0.17; CuSO 4 .5H 2 O, 0.03; ZnSO 4 .7H 2 O, 0.14; CoSO 4 .7H 2 O, 0.0003; 

KI stabilisé, 0.0006. 

4 Apport des vitamines: A, 19800; D, 2500UI/Kg de régime (mg/Kg de ׃(‏régime B1, 20; B2, 15; B3, 

70; B6, 10; B7, 150; B12, 0,05; E, 170 ; K, 40; phosphate de pyridoxal, 100; choline, 1360; acide 

folique, 5 ; acide p-aminobenzoïque, 50; biotine, 0.3. 

98

III-2-2 Préparation des échantillons biologiques 

III-2-2-1 Le plasma 

Les animaux sont sacrifiés par décapitation à la fin de la période de régime. Le sang est 

immédiatement collecté dans des tubes plastiques en présence d’héparine (50 U/ ml) ; les 

tubes sont agités doucement puis centrifugés 15 min à 200g. Le plasma obtenu est additionné 

de butylhydroxytoluène (BHT) 5.10 -5 M avant d’être congelé à -80°C pour analyses 

ultérieures. 

III-2-2-2 Préparation des thymocytes 

Les thymus sont prélevés sous atmosphère stérile puis sont lavés dans une solution de NaCl 

0.15M. Ils sont ensuite débarrassés du tissu conjonctif adhérent et homogénéisés dans 20 

volumes de NaCl 0.15M à l’aide d’un potter verre-verre (3 allers- retours). Le reste du tissu 

conjonctif est éliminé par filtration de la suspension à travers une gaze de nylon. 

La séparation des thymocytes se fait par centrifugation sur gradient de densité (Ficoll 

Histopaque) pendant 15 min à 600g. L’anneau de cellules collecté à l’interface est lavé une 

fois dans du NaCl 0.15M et une fois dans du RPMI 1640 par centrifugation à faible vitesse 

(400g pendant 10 min). Les cellules sont comptées sur lame de Thoma. Le test d’exclusion au 

bleu trypan montre une viabilité des cellules >95%. Les cellules sont ensuite suspendues à une 

concentration de 40.10 6 cellules/ml. 

III-2-3 Préparation des complexes acide gras albumine 

Pour enrichir in vitro des cellules en culture, les acides gras ne peuvent pas être apportés sous 

forme libre au milieu de culture à cause de leur pouvoir détergent vis-à-vis des membranes. 

Les acides gras doivent tout d'abord être complexés à une protéine porteuse (l’albumine) 

avant d'être mis en contact avec les cellules. Lors de l'incubation avec la protéine chargée, un 

échange d’acide gras se fait entre la membrane des cellules et la protéine. Les acides gras 

ainsi apportés se trouvent incorporés dans les phospholipides membranaires. 

Pour cela, des solutions éthanoliques contenant des quantités variables de l’acide gras à 

étudier sont évaporées à sec sous azote. Pour l’étude des effets des acides gras sur la 

prolifération des thymocytes, du sérum de veau fœtal est ajouté aux résidus secs pour donner 

des rapports acide gras / albumine de 0,5, 1, 1,5, 2 et 3. Les mélanges sont incubés toute la 

99

nuit sous agitation à 37°C. Une solution témoin de sérum de veau fœtal est incubée dans les 

mêmes conditions sans acide gras. Pour l’étude des effets des acides gras sur l’activité PLD 

des thymocytes in vitro, une solution de sérum albumine humaine (HSA) delipidée est 

préparée à la concentration de 5µM dans du RPMI 1640 et est ajoutée aux résidus secs pour 

donner des concentrations finales en acide gras de 5µM et 15µM, et un rapport acide gras / 

albumine égal à 1 et 3 respectivement. Les solutions sont incubées à 37°C pendant 4h sous 

agitation. Une solution témoin d’HSA 5µM est incubée dans les mêmes conditions. 

III-2-4 Test de prolifération 

Les thymocytes sont suspendus à la concentration de 5.10 6 cellules/ml dans un milieu RPMI 

contenant 2mM de glutamine (Glu), 0.1 mg/ml de streptomycine / pénicilline (S/P)) et 10% de 

sérum de veau fœtal décomplémenté (SVF) (v/v). Pour les manipulations de l’étude in vitro, 

le sérum de veau fœtal est préalablement chargé en acide gras, comme décrit précédemment. 

Les incubations sont réalisées dans des plaques à 96 puits à fond plat. Chaque puits reçoit 

50µl de la suspension cellulaire et 50µl de Concanavaline A (ConA) à une concentration de 

2.5µg/ml ou 50µl de RPMI pour les puits témoins. Toutes les étapes se déroulent stérilement 

sous la hotte à flux laminaire. Les plaques sont incubées au stéricult à 37°C dans une 

atmosphère humide contenant 5% de CO 2 . Après 68h d’incubation, la prolifération cellulaire 

est mesurée selon la méthode décrite par Mosmann (1983) par le test colorimétrique au MTT. 

Ce test est basé sur la transformation du sel de tétrazolium MTT en cristaux de formazan 

violet par les cellules métaboliquement actives (Figure 23). Cette réduction par les enzymes 

cellulaires nécessite les cofacteurs NADH et NADPH. Les cristaux de formazan ainsi formés 

sont solubilisés et l’absorbance de la solution colorée obtenue est quantifiée par 

spectrophotométrie. 

Brièvement, 10µl de bromure de 3-(4-,5-diméthylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltétrazolium (MTT, 

concentration finale de 0.5 mg/ml) sont ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont incubées 

pendant 4h à 37°C sous atmosphère humide. 100µl de solution de solubilisation sont ajoutés 

dans chaque puits et la microplaque est incubée à 37°C toute la nuit. Les densités optiques 

sont lues à 550 et 690 nm à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits 

(Power Wave X). Le nombre de cellules vivantes est proportionnel à la différence des densités 

optiques (DO 550 - DO 690 ). Le pourcentage de prolifération est déterminé par comparaison avec 

les témoins non activés, traités dans les mêmes conditions. 

100

A 

B 

Figure 23: A : Métabolisme du MTT en sel de formazan par les cellules viables. B: 

Comparaison du spectre UV du MTT (ligne pointillée) et du sel de formazan après 

solubilisation (ligne continue). 

101

III-2-5 Dosage de l’activité PLD des cellules intactes 

III-2-5-1 Marquage des cellules avec de l’acide arachidonique tritié 

La suspension cellulaire est incubée avec une dose traceuse d’acide arachidonique tritié 

(1.25µCi/ml) pendant 1h à 37°C, sous agitation. A la fin de la période d’incubation, les 

cellules sont lavées deux fois dans du RPMI afin d’éliminer la radioactivité non incorporée. 

Le rendement moyen d’incorporation est de 60%. Les cellules marquées sont suspendues à la 

concentration de 40.10 6 cellules /ml dans du RPMI. 

Dans l’étude concernant l’effet des acides gras sur l’activité PLD in vitro, les cellules 

marquées sont suspendues à la concentration de 40.10 6 cellules /ml dans du RPMI contenant 

les différents complexes acide gras /albumine aux concentrations de 5µM et 15µM pendant 2h 

à 37°C. Les cellules témoins sont incubées pendant le même temps en présence de HSA 5µM 

seule. A la fin de l’enrichissement, une fraction aliquote de chaque essai est conservée pour 

l’analyse de la composition en acides gras des phospholipides des thymocytes par 

chromatographie en phase gazeuse (CPG). 

III-2-5-2 Activation mitogénique des thymocytes 

Les cellules sont incubées pendant 20 min. à 37°C en présence ou en absence de butanol-1 

(1%) et pendant 5 min. en présence ou en absence de ConA (1µg/10 6 cellules). L’arrêt de la 

réaction se fait par refroidissement et addition de 3ml d’éthanol. 

III-2-5-3 Extraction lipidique 

Les lipides sont extraits selon la technique de Boukchache et Lagarde (1982) à l’aide d’un 

mélange éthanol/chloroforme (3/6, v/v) contenant du BHT à la concentration finale de 5.10 5 

M, en milieu acide (pH=3). De l’acide phosphatidique (PA) marqué au [ 14 C], utilisé comme 

standard interne de rendement, et du phosphatidylbutanol (Pbut) non marqué, utilisé comme 

entraîneur, sont ajoutés dans chaque tube. Le mélange est mis à décanter pendant une nuit à 

4°C. Les phases organiques sont évaporées et les résidus secs sont congelés pendant une nuit 

à -20°C. 

102

III-2-5-4 Séparation du Pbut et du PA par CCM 

Les extraits lipidiques sont repris dans un faible volume du mélange méthanol/chloroforme 

(1/2, v/v) et déposés sur plaque de silice G60. Le Pbut et le PA sont séparés des autres 

phospholipides par CCM. La première migration s’effectue dans le système de solvants : 

chloroforme/ méthanol/ ammoniaque 28% (65/35/5,5 ; v/v/v). Après séchage des plaques 

pendant 2h sous atmosphère réduite, le mélange des standards Pbut/PA est déposé. La 

seconde migration s’effectue dans un mélange d’acétate éthyle/isooctane/acide acétique 

(90/50/20/; v/v/v/). Les plaques de CCM sont séchées puis colorées au bleu de Commassie 

0.03% dans une solution de NaCl 0.9% méthanol 20% pendant 15 min sur une table 

oscillante. Les plaques sont ensuite lavées dans une solution de NaCl 0.9%, méthanol 20% 

pendant 15 min et séchées (Figure 24). 

PBu 

PBu 

2ème 

migration 

PA 

PA 

PL totaux 

dépôt du mélange 

standard PA-PBu 

dépôt de l’essai 

1ère migration 

Figure 24: Séparation du PBut et du PA par chromatographie sur couche mince 

bidimensionnelle après révélation au bleu de Coomassie. 

III-2-5-5 Quantification de la radioactivité du [ 3 H]-Pbut et du [ 3 H]-PA 

La silice correspondant aux spots de Pbut, PA et PL totaux est grattée et récupérée. La 

radioactivité est mesurée par scintillation liquide. La radioactivité [ 3 H] associée au Pbut et au 

PA est exprimée en % de la radioactivité incorporée dans les phospholipides totaux pour 

chaque échantillon. 

103

III-2-6 Dosage de l’activité PLD en système acellulaire 

Les thymocytes sont repris dans un tampon de lyse composé de Tris 25mM, NaCl 150mM, 

pH=7.4 et homogénéisés dans un potter verre-teflon (2x20 allers retours). Les surnageants 

sont récupérés après une centrifugation à 900g pendant 10 min et utilisés pour le dosage de 

l’activité en système acellulaire. 

III-2-6-1 Activité PLD oléate sensible 

L’activité PLD oléate sensible a été mesurée selon la méthode décrite par Chalifa et al. 

(1990). Le milieu réactionnel contient 50mM de Na-Hepes pH 7.2, 2.7mM (10 7 cpms par 

essai) de [ 3 H] dipalmitoylphosphatidylcholine, 1mM d’EGTA, 1mM de MgCl 2 . Le milieu 

réactionnel contient ou non de l’oléate de sodium 4mM. La réaction enzymatique est initiée 

par l’ajout de l’homogénat total. Après 1h d’incubation, la réaction est arrêtée par l’addition 

de 2 ml du mélange chloroforme/ méthanol/ acide chlorhydrique (HCl) (50/50/0.3 ; v/v/v). 

Après un temps de repos de 30 min, 350µl d’EGTA 5mM/ HCl 1N sont ajoutés. Le mélange 

est vortexé pendant une minute avant d’être centrifugé à 400g pendant 5 min. La radioactivité 

de la phase aqueuse est mesurée par scintillation liquide. 

III-2-6-2 Activité PLD PIP2 sensible 

La méthode utilisée est inspirée de celle décrite par Brown et al. (1993). Le substrat (PC) est 

fourni à l’enzyme sous forme de vésicules mixtes de phosphatidyléthalonamine/ 

phosphatidylinisitol diphosphate/ phosphatidylcholine dans un rapport molaire 16/1.5/1 

contenant de la [choline-méthyl-3H] dipalmitoylphosphatidylcholine (10 6 cpms/ essais). Le 

dosage consiste à mesurer la radioactivité associée à la choline relarguée après hydrolyse de la 

phosphatidylcholine par l’enzyme. Le volume final du milieu de réaction est de 100µl. Il 

contient 50mM d’HEPES, pH 7.5, 80mM de KCl, 2.5mM de MgCl 2 , 2mM de CaCl 2, 1mM de 

dithiothréitol. Les essais sont réalisés avec ou sans 50µM de GTPγS. La concentration finale 

de PC dans le milieu de réaction est de 8µM. les essais sont incubés durant 30 min à 37°C et 

la réaction est arrêtée par l’addition de 1 ml de chloroforme/ méthanol/ HCL (1/ 1/ 0.002). On 

ajoute ensuite une solution d’HCl 0.1N contenant de l’EGTA 5mM afin de former deux 

phases. Le mélange est vortexé pendant 1 min avant d’être centrifugé à 200 g pendant 10 min. 

500µl de la phase aqueuse supérieure sont comptés par scintillation liquide. 

104

III-2-7 Analyse de la composition en acides gras des phospholipides totaux de 

thymocytes et des triglycérides et phospholipides plasmatiques par 

chromatographie en phase gazeuse (CPG) 

120.10 6 thymocytes isolés à partir des rats qui ont suivi les régimes ou enrichis in vitro, ou 

1ml de plasma préparé selon le protocole décrit au paragraphe (II-2-2) sont extraits selon la 

méthode de Bligh et Dyer (1959) par le mélange chloroforme/méthanol (1/2 ; v/v) en présence 

de BHT (5.10 -5 M). Après agitation et 30 min de repos, un mélange de NaCl/chloroforme 

(1/1 ; v/v) est ajouté. La phase chloroformique est récupérée et évaporée sous jet d’azote ; une 

deuxième extraction est effectuée et les phases organiques obtenues sont réunies puis 

évaporées à sec et conservées sous azote a -20°C. 

Les extraits secs sont repris dans un faible volume du mélange méthanol/chloroforme (1/2 ; 

v/v) et déposés sur plaques de silice G60 préalablement lavées au méthanol et séchées sous la 

hotte. La séparation des lipides est effectuée par migration dans le système de solvants : 

hexane/ éther/ acide acétique (70/30/1 ; v/v/v). Les phospholipides très polaires restent à 

l’origine (Rf=0) alors que les triglycérides migrent plus haut. Après la séparation, les bandes 

de silice correspondant aux phospholipides des thymocytes et du plasma et aux triglycérides 

du plasma sont grattées et récupérées dans des tubes en verre à vis. Les acides gras sont 

transméthylés en présence de 5% d’acide sulfurique dans du méthanol à 100°C dans un bain 

de sable pendant 90 min. La réaction est arrêtée en plongeant les tubes dans la glace et en 

ajoutant 1.5ml de carbonate de potassium (K 2 CO 3 ) afin de neutraliser le milieu. Les esters 

méthyliques d’acides gras ainsi obtenus sont extraits par 2ml d’isooctane. Les phases 

organiques sont récupérées puis évaporées à sec sous jet d’azote. 

Les extraits sont repris dans un volume d’isooctane puis analysés par chromatographie 

gazeuse à l’aide d’une colonne capillaire polaire en silice fondue (Supelco). Les esters 

méthyliques d’acides gras injectés dans la colonne sont entraînés par le gaz vecteur (Hélium). 

Le programme de température du four dans lequel se trouve la colonne est le suivant : la 

température initiale est de 57°C (2 min.) puis augmente à 150°C à raison de 20°C/min (≈5 

min.) ; elle augmente ensuite jusqu’à 215°C à raison de 1.50°C/min. (43.4 min.) et enfin 

jusqu’à 250°C à raison de 10°C/min. (≈4 min.). Les produits sont volatilisés dans l’injecteur à 

230°C et sont détectés en sortie de colonne par un détecteur à ionisation de flamme (DIF) 

dont la température est de 250°C. 

105

La quantification en nmoles est faite à l’aide d’un standard interne, la diheptadécanoyl 

phosphatidylcholine (PC di 17 :0), ajouté dans les échantillons au moment de l’extraction 

lipidique. 

Figure 25 : Schéma récapitulatif d’un chromatographe en phase gazeuse. 

III-2-8 Etude des microdomaines 

III-2-8-1 Isolement des microdomaines à partir des thymocytes de rat 

Ces structures ont été purifiées selon le protocole décrit par Montixi et al. (1998), basé sur 

leur insolubilité dans les détergents non ioniques à 4°C, et leur propriété de flottaison sur un 

gradient de densité conférée par leur enrichissement en sphingolipides et cholestérol. 1.5 10 7 

thymocytes sont homogénéisés dans 1.5ml de tampon Tris 25mM, NaCl 150mM, EDTA 

5mM, pH 7.5 contenant un mélange d’inhibiteurs de protéase (inhibitor cocktail, Sigma), à 

l’aide d’un potter verre-téflon (10x20 allers-retours) puis centrifugés à 900g pendant 10 min à 

4°C. Le surnageant post nucléaire (SPN) est incubé avec du triton X100 (1% final) pendant 1h 

à 4°C sous agitation douce. Après incubation, le lysat est ajouté à un même volume de 

solution de saccharose 2.6M pour avoir une concentration finale de 1.3M en saccharose. Le 

gradient est réalisé par dépôts successifs (1ml) de solutions de saccharose de concentrations 

106

croissantes (0.2M à 0.9M), puis l’homogénat est déposé au fond du tube (tubes SW41, 

Beckman) (Figure 26). L’ultracentrifugation est réalisée à 200000g pendant 16h à 4°C dans 

un rotor à godets oscillants (type SW41, Kontron). A la fin de l’ultracentrifugation, des 

fractions de 1ml sont collectées du fond au sommet du tube (fraction 1 à 11) et sont stockées à 

-20°C pour des analyses ultérieures. La mesure du pourcentage de saccharose dans chaque 

fraction est réalisée sur un aliquote de 10µl à l’aide d’un réfractomètre portable (Brix), 

immédiatement après collecte des fractions. 

Fraction 

11 

10 

9 

8 

7 

6 

5 

4 

Molarité 

0.2 M 

0.3 M 

0.4 M 

0.5 M 

0.6 M 

0.7 M 

0.8 M 

0.9 M 

3 

2 

1 

1.33 M 

Figure 26 : Gradient de saccharose 

III-2-8-2 Dosage du ganglioside GM1 et du PIP2 dans les fractions des gradients 

La quantification du GM1 et du PIP2 se fait par dot blotting. 20µl de chaque fraction sont 

déposés sur une membrane immobilon (Millipore) par aspiration sous vide à l’aide d’un 

appareil hybri-dot relié à une trompe à eau. Les membranes sont ensuite rincées par de l’eau 

déminéralisée pendant 1 min afin d’éliminer l’excès de saccharose, puis saturées dans une 

solution d’albumine sérique bovine (BSA) 5% dans un tapon TBS-T (Tris-HCl 20mM, NaCl 

137mM, pH 7.6, Tween 20 à 0.1%) pendant 2h à température ambiante. Elles sont ensuite 

rincées trois fois dans du tampon TBS-T. 

107

Pour la mise en évidence du ganglioside GM1 : les membranes saturées sont incubées 

pendant 1h30 à température ambiante dans une solution de toxine cholérique (sous unité B) 

liée à la peroxydase de raifort dans un tampon TBS-T (Tris-HCl 20mM, NaCl 137mM, 

pH=7.6, Tween 20 à 0.1%) contenant 1% de BSA. Elles sont ensuite rincées sept fois pendant 

10 min dans un tampon TBS-T puis révélées par chimiluminescence (kit ECL, Amersham). 

Pour la mise en évidence du PIP2 : les membranes saturées sont incubées avec l’anticorps 

anti-PIP2 (Assay Designs, Euromedex) dilué au 1/500 ème dans le TBS-T toute la nuit à 4°C, 

puis lavées sept fois dans du TBS-T. Elles sont ensuite incubées avec l’anticorps secondaire 

anti-souris conjugué à la peroxydase (dilué au 1/10000 ème dans le TBS-T contenant 1% de 

BSA) durant 1h30. Les membranes sont lavées sept fois 10 min avec du TBS-T puis révélées 

par chimiluminescence (kit ECL, Amersham). 

Les luminogrammes sont analysés par un système de caméra CCD (Image MasterVDS-CL, 

Amersham Biotech) et quantifiés par le logiciel Image Quant (Amersham biosciences). 

III-2-8-3 Dosage du cholestérol 

Le dosage du cholestérol est réalisé à l’aide du kit de dosage enzymatique Sigma Diagnostics, 

dont le protocole a été adapté pour permettre la réalisation du dosage en microplaques 96 

puits. Les réactions enzymatiques impliquées dans cette réaction sont les suivantes : 

Cholestérol oxydase 

Cholestérol + O 2 Cholestérol 4-en-3-one + H 2 O 2 . 

2 H 2 O 2 + Amino-4-antipyrine +p-hydroxybenzènesulfonate 

Peroxydase 

Quinonéimine colorée + 4H 2 O. 

50µl de chaque fraction du gradient sont ajoutés à 200µl du mélange enzymatique commercial 

et sont incubés 30 min à 37°C sous agitation, dans une microplaque 96 puits. La densité 

optique est lue à 500 nm dans un lecteur de plaque Power-Wave X (Bio-Tek Instruments). La 

quantification du cholestérol est réalisée par rapport à une gamme étalon de cholestérol 

108

éalisée dans les mêmes conditions. 

III-2-8-4 Dosage des phospholipides 

Les phospholipides de chaque fraction sont dosés d’après la méthode Stewart (1980). Cette 

méthode utilise une détection colorimétrique des phospholipides complexés avec le 

ferrothiocyanate d’ammonium. Les phospholipides totaux présents dans un aliquot de chaque 

fraction sont extraits selon Bligh et Dyer (1959). Les phases organiques sont récupérées et 

évaporées sous jet d’azote. Chaque résidu sec est repris dans 2ml de chloroforme et 2ml de 

ferrothiocyanate puis vortexé vigoureusement. La densité optique des phases chloroformiques 

est lue à 488 nm dans un spectrophotomètre Uvikon 932. La quantification se fait par rapport 

à une gamme étalon de phosphatidylcholine traitée dans les mêmes conditions. 

III-2-8-5 Dosage des protéines 

III-2-8-5-1 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976) 

Ce dosage est basé sur le changement de coloration du bleu de Commassie en présence de 

concentrations variables de protéines. Une fraction de la solution à doser est prélevée et 

complétée à 50µl avec de l’eau ou le tampon constituant la solution à doser. On ajoute 200µl 

de la solution (BioRad protein assay) diluée 5 fois dans l’eau. Après agitation, la densité 

optique est lue à 595 nm dans un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits (Power 

Wave X, BIOTECK INSTRUMENTS). La concentration est déterminée par comparaison à 

une gamme étalon d’albumine sérique bovine (1-20µg de protéines) réalisée dans les mêmes 

conditions. 

III-2-8-5-2 Dosage des protéines par la méthode Schaffner–Weissmann (1973) 

Ce dosage est utilisé lorsque la solution protéique à doser contient des éléments (sels, 

détergents…) pouvant interférer avec le dosage par la méthode de Bradford. Cette technique 

consiste à précipiter les protéines des échantillons par l’acide trichloroacétique (TCA) 60% en 

présence de 0,1 % de SDS. Les échantillons sont ensuite filtrés sur une membrane millipore 

préalablement imprégnée d’une solution de TCA 6%. Les dépôts sont séchés par aspiration 

sous vide (Büchner), puis les membranes sont colorées dans une solution d’Amido-Shwarz 

0,01% dans un mélange méthanol/ eau/ acide acétique (90/ 8/ 2 ; v/ v/v) pendant 15 min. 

Après séchage des membranes, les zones des dépôts sont découpées et placées dans des tubes 

contenant 500µl d’une solution éluante (NaOH 25mM, EDTA 50mM, éthanol 50%) pendant 

109

1h jusqu’à élution complète des dépôts colorés. La densité optique est lue au 

spectrophotomètre à une longueur d’onde de 630 nm. La quantification est réalisée par 

comparaison à une gamme étalon d’albumine sérique bovine traitée dans les mêmes 

conditions. 

III-2-9 Electrophorèse en SDS-PAGE et "Western-blotting" : 

III-2-9-1 Préparation des échantillon : 

Les thymocytes sont homogénéisés dans un tampon de lyse (Tris 25mM, NaCl 50mM, EDTA 

5mM) contenant un mélange d’inhibiteurs de protéases (Inhibitor coktail) dilué au 1/4. Les 

homogénats cellulaires sont ensuite centrifugés (900g pendant 10 min.) et le surnageant post 

nucléaire est récupéré. Le dosage de protéines se fait selon la méthode de Bradford (1976) 

pour les surnageants post-nucléaires, et selon la méthode de Schaffner Weissman pour les 

fractions de gradient 

III-2-9-2 Précipitation des protéines par l’acétone à froid : 

Dans un bain de glace, on ajoute du CaCl 2 afin de faire chuter la température a -25°C. 

Lorsque la température est stabilisée, on place dans un tube 1,5 volume d'acétone sur lequel 

on dépose 1 volume de l'homogénat à précipiter. Le tout est immédiatement vortexé 

vigoureusement, puis replacé à -25°C dans la glace pendant 30 min. Le mélange est de 

nouveau vortexé puis centrifugé à 15000g durant 15 min à 4°C. Le surnageant est éliminé et 

le culot est séché à l'air pendant 5 min. Il est repris dans un volume minimum de tampon 

Laemmli (Tris 125mM, pH=6,8, Saccharose 10%, SDS 2%, mercaptoethanol 1% et bleu de 

bromophénol 0,05%) contenant de l'urée 4M et de l'EDTA 2,5M. Le tout est vortexé 

vigoureusement et soniqué dans un bain à ultrasons (maximum de la puissance de l'appareil), 

jusqu'à dissolution totale du culot. Les échantillons sont ensuite portés à 100°C pendant 1 min 

puis conservés à -20°C avant électrophorèse. 

II-2-9-3 Electrophorèse en SDS-PAGE : 

L’électrophorèse est réalisée sur un gel à 8% de polyacrylamide en présence de 0,1% de SDS 

et d’urée (environ 4M final) grâce à un appareil pour électrophorèse pour minigels Biorad. 

Brièvement, pour deux mini gels, on prépare le gel de séparation en mélangeant dans un tube 

6.9ml d'urée 8M, 4ml d'un mélange d'acrylamide à 30%, 3,8ml de Tris 1,5M pH8,8, 0,15ml 

de SDS 10%, 0,15ml d'ammonium persulfate 10% et 0,009ml de TEMED. Le mélange est 

110

vortexé avant d'être coulé. Après polymérisation, on prépare un gel de concentration en 

mélangeant dans un tube 2,5ml d'urée, 0,9ml d’eau, 0,83ml d'un mélange d'acrylamide à 30%, 

0,63ml de Tris 1M pH6,8, 0,05ml de SDS 10%, 0,05ml d'ammonium persulfate 10% et 

0,005ml de TEMED. Le gel de concentration est coulé au-dessus du gel de séparation. Après 

polymérisation, les gels sont placés dans la cuve de migration du système. Les échantillons 

préparés comme décrit précédemment sont déposés. La migration électrophorétique s’effectue 

à 120V, à voltage constant. La migration peut être suivie grâce au dépôt de marqueurs 

moléculaires précolorés dans un puits de référence. Les masses moléculaires des protéines 

étudiées sont déterminées en référence à ces marqueurs moléculaires. L’électrotransfert sur 

membrane Immobilon Millipore est ensuite réalisé dans un appareil de transfert semi-sec 

Semi-Phor (Hoeffer Scientific Instruments). Le transfert se fait dans un système de « 

sandwich » imbibé de tampon de transfert (25mM de TrisHCl, pH=8,3, 0,19 M de glycine, 

20% de méthanol) par un courant électrique de 40 mA pendant 1h30. Le transfert effectué, les 

marqueurs de masse moléculaire sont également transférés et peuvent servir de contrôle. La 

membrane est rincée par un tampon salin TBS-T puis saturée avec du lait écrémé à 10% 

pendant 2 heures à température ambiante. La membrane est ensuite rincée trois fois par du 

TBS-T durant 10 min, puis incubée à 4°C pendant toute la nuit avec l'anticorps primaire anti- 

PLD1 ou anti-PLD2 (dilution 1/2000). L’anticorps anti-PLD1 est dirigé contre les résidus 1- 

16, 144-162, 967-981, et 1027-1040 de la protéine tandis que l’anticorps anti-PLD2 est dirigé 

contre une séquence d’acides aminés située en N-terminal (résidus 13-33). La membrane est 

rincée 7 fois par du TBS-T puis incubée avec un anticorps secondaire anti-IgG de lapin, 

couplé à la peroxydase (dilution 1/5000). La membrane est soumise à une dernière série de 

lavages avant révélation spécifique des protéines par chimiluminescence (kit ECL 

Amersham). Pour la normalisation, les membranes ont été strippées (décapées de leurs 

anticorps) et ré-incubées avec l’anticorps monoclonal anti-tubiline-α dilué au 1/2000 dans du 

TBS-T ; BSA 0,01% puis avec l’anticorps secondaire anti-IgG de souris dilué au 1/10000. 

III-2-10 Transcription inverse et Réaction en chaîne de la polymérase 

III-2-10-1 Préparation des ARN 

Les ARN totaux des thymocytes sont extraits à l'aide du kit d'extraction Tri Reagent 

(SIGMA). Les thymocytes (40.10 6 cellules) sont culottés à 500g à 4°C. Le culot est repris 

dans 1ml de réactif Tri Reagent et les cellules sont homogénéisées par passage dans une 

seringue. Les homogénats obtenus sont laissés 5 min à température ambiante pour assurer une 

111

dissociation complète des complexes nucléoprotéiques. Ensuite, on ajoute 0,2ml de 

chloroforme et on agite vigoureusement pendant 15 sec. Les échantillons sont laissés 15 min à 

température ambiante puis centrifugés à 12000g pendant 15 min à 4°C. Le mélange se sépare 

alors en une phase organique rouge contenant les protéines, une interphase contenant l’ADN 

et une phase aqueuse incolore contenant l'ARN. La phase aqueuse est transférée dans un autre 

tube auquel on ajoute 0,5ml d'isopropanol. Le mélange est incubé 10 min à température 

ambiante, centrifugé ensuite à 12000g pendant 10 min à 4°C. L'ARN précipité forme un culot 

au fond du tube. Le surnageant est éliminé et le culot est lavé par 1ml d'éthanol 75%. 

L'échantillon est de nouveau centrifugé à 7500g ; le surnageant est éliminé et le culot est 

séché à l'air, avant d'être repris dans un volume minimum d'eau stérile. La quantification des 

ARN est réalisée par lecture spectrophotométrique à la longueur d'onde de 260nm. Les ARN 

sont ensuite conservés à -80°C. 

III-2-10-2 Transcription inverse (RT) 

A partir des ARN préparés comme décrit ci-dessus, l'ADN complémentaire est transcrit à 

l'aide de la transcriptase inverse M-MLV (PROMEGA). La réaction se déroule en deux 

étapes. La première est la dénaturation des ARN en présence des amorces oligo (dT). Dans un 

volume final de 16,5µl, 5µg d'ARN totaux sont incubés en présence de 500µM de dNTP, 

3,5µM d’oligo (dT), pendant 10 min à 70°C. Les tubes sont ensuite placés dans la glace avant 

la deuxième étape de transcription. Dans le milieu de réaction sont alors ajoutés le tampon 

concentré 10X (concentration finale: Tris-HCl 50mM, pH 8,3, 40mM KCl, 8mM, MgCl 2 , 

1mM DTT), l'inhibiteur d'ARNase (1U/µl) ainsi que la transcriptase inverse (1U/µl). Le tout 

est incubé 15 min à 25°C, puis 50 min à 42°C pour permettre la synthèse d’ADNc et enfin 15 

min à 70°C pour dénaturer les complexes ARN/ADNc. 

III-2-10-3 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) 

L'ADNc ainsi synthétisé sert de matrice à l'amplification des transcrits de PLD1, PLD2 et β- 

actine par «Polymerase Chain Reaction» (PCR). Les amorces spécifiques pour l’amplification 

des transcrits de PLD1a et 1b, PLD2 et de la β-actine, sens et antisens, sont présentés dans le 

Tableau XIII. 

112

Tableau XIII: Séquence des amorces utilisées pour la PCR. 

Amorces 

Séquences 

PLD 1a et 1b 

Sens : 5’- AGGACAGTCTCTGGGCTCTC -3’ 

Anti-sens : 5’- TGCCTTTCCGTGAACCACAG -3’ 

PLD2 

Sens : 5’- TGAACAGGGGCAGTGTTTCC -3’ 

Anti-sens : 5’- AGGTCTGGCCAGGTATTTGC -3’ 

β actine 

Sens : 5’- TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3’ 

Anti-sens : 5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG –3’ 

Dans un volume final de réaction de 50µl, on incube 5µl du milieu de réaction de la 

transcription inverse en présence de 200µM de dNTP, 0,4µM de chaque amorce spécifique et 

2 unités d'ADN polymérase Taq (Roche), dans un milieu tamponné Tris-HCl 10mM, pH 8.3, 

50mM KCl, 1,5 mM MgCl 2 . Les conditions d'amplification programmées sur le 

thermocycleur sont présentées dans le Tableau XIV. 

Tableau XIV: Programme de la réaction PCR 

PLD1 (a et b) PLD2 β actine 

Dénaturation 94°C pendant 45s 94°C pendant 45s 94°C pendant 45s 

Hybridation 54°C pendant 45s 56°C pendant 45s 65°C pendant 45s 

Extension 72°C pendant 45s 72°C pendant 45s 72°C pendant 30s 

Nombre de cycle 40 cycles 35cycles 

Extension finale 

72°C pendant 10 min. 

113

III-2-10-4 Electrophorèse sur gel d'agarose des ADN 

Les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont ensuite analysés par électrophorèse sur gel 

d'agarose 2%. Le gel est préparé extemporanément en diluant 1g d'agarose dans 50ml de 

tampon TBE (Tris-Borate 90mM, pH8, EDTA 1mM). La solution est portée à ébullition, puis 

refroidie avant ajout de 5µl d'une solution de bromure d'éthidium (BET) 10 mg/ml. La 

solution encore tiède est coulée dans la cuve de migration horizontale et après 

refroidissement, le gel polymérise. Il est ensuite immergé dans le tampon de migration. Les 

échantillons préparés dans une solution de dépôt (0,05% de bleu de bromophénol, 0,05% de 

xylène cyanol et 6% de glycérol) sont déposés dans les puits du gel d’agarose. La migration 

se fait de la cathode vers l’anode sous tension constante d’environ 100 volts, et en présence de 

marqueurs de taille. Les fragments d’ADN ayant fixé du bromure d’éthidium (BET) sont 

visualisés sous lumière UV et le gel est photographié à l'aide d'une caméra CCD 

(ImageMaster VDS-CL, Amersham Biotech). 

III-2-11 Analyses statistiques des résultats 

Les résultats sont la moyenne ± SEM de n expériences indépendantes. Ils ont été analysés par 

ANOVA (Statview II, Macintoch) et comparés par un test de t protégé. Les variations sont 

considérées comme significatives si la valeur de P est inférieure ou égale à 0,05. Pour les 

expériences relatives à l’effet des acides gras sur l’activité PLD thymocytaire in vitro et pour 

les essais visant à déterminer l’influence du sérum sur la réponse proliférative, les résultats 

sont soumis à une analyse de variance à deux entrées. La valeur de F est donnée dans les 

légendes de la figure et du tableau correspondants. Une différence est considérée comme 

significative lorsque P≤0,05. 

114

IV- RESULTATS 

IV-1 Effet des acides gras «in vitro» sur les fonctions immunes 

De nombreux travaux effectués in vitro ont permis de mettre en évidence un effet 

immunosuppresseur des acides gras ajoutés au milieu de culture des lymphocytes avant 

stimulation par un mitogène. Tsang (1977) fut le premier à décrire l’effet immunosuppresseur 

de l’acide linoléique. Depuis cette date, de nombreux travaux ont montré que les acides gras 

polyinsaturés inhibaient in vitro les fonctions des lymphocytes murins et humains (Calder et 

al., 1992 ; Calder et Newsholme, 1992; Verlengia et al., 2003 ; Verlengia et al., 2004). Des 

résultats contradictoires ont été obtenus concernant l’influence des acides gras sur la réponse 

proliférative des lymphocytes in vitro. En règle générale, les études décrivant une stimulation 

de la réponse proliférative ont utilisé de faibles doses (Kelley et Parker, 1979) alors que 

celles, beaucoup plus nombreuses, qui rapportent un effet inhibiteur ont été réalisées avec des 

concentrations en acides gras plus élevées (Calder et al., 1991 ; Brouard et Pascaud, 1993). 

Les acides gras les plus inhibiteurs sont généralement ceux de la famille n-3 alors que les 

acides gras saturés sont peu ou pas actifs. 

Dans cette première partie de nos travaux, nous nous sommes intéressés aux effets des acides 

gras sur la réponse proliférative de thymocytes de rat à une lectine mitogénique, la 

Concanavaline A. Nous avons comparé les effets des deux acides gras majeurs de l’huile 

d’argan, l’acide oléique (18:1n-9) et l’acide linoléique (18:2n-6) à ceux des acides gras 

polyinsaturés n-3 présents dans les huiles de poisson, les acides eicosapentaénoique (20:5n-3) 

et docosahexaénoique (22:6n-3). Les effets de trois acides gras saturés, les acides myristique 

(14 :0), palmitique (16:0) et stéarique (18:0), présents dans l’huile de noix de coco, ont 

également été étudiés à titre de comparaison. 

IV-1-1 Effet des acides gras « in vitro » sur la réponse proliférative des 

thymocytes de rat. 

Nous avons tout d’abord déterminé la concentration optimale de ConA à utiliser pour obtenir 

une prolifération maximale des thymocytes de rat. Pour cela, des concentrations croissantes 

de ConA ont été ajoutées dans le milieu de culture et la prolifération a ensuite été évaluée par 

un test colorimétrique comme décrit dans Matériels et méthodes. Les résultats ont montré que 

115

la réponse maximale était obtenue avec une dose de ConA de 2.5µg/ml (Figure 27). Cette 

concentration a été retenue pour la suite de notre étude. 

Prolifération des ymocytes 

(D.O550-D.O690) 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

0 2,5 5 10 

ConA (µg/ml) 

Figure 27 : Détermination de la concentration optimale de ConA induisant une réponse 

proliférative maximale 

Les thymocytes (2.5 10 5 cellules/ puits, plaque à 96 puits) sont mis en culture dans un milieu complet 

en absence ou présence de concentrations croissantes de ConA. Après 68h d’incubation, le MTT et la 

solution de solubilisation sont ajoutés dans chaque puits comme décrit dans la partie Matériels et 

Méthodes. La prolifération cellulaire est estimée par la différence des densités optiques mesurés à 550 

et 690. 

Les thymocytes ont ensuite été cultivés en présence de différentes concentrations des acides 

gras d’intérêt, complexés à l’albumine du sérum de veau fœtal, et en présence ou absence de 

ConA comme décrit dans le chapitre méthodes. Tous les acides gras testés, sauf le 18:1n-9 et 

le 22:6n-3 qui sont toxiques au rapport acide gras- albumine 3, ne diminuent que très peu la 

viabilité cellulaire par rapport aux cellules contrôles (-18%), quel que soit le rapport acide 

gras albumine considéré (Figure 28). Ces résultats diffèrent sensiblement de ceux rapportés 

par Cury-Boaventura et al. (2005) montrant que le 18:2n-6 est plus toxique que le 18:1n-9 sur 

les lymphocytes humains. 

116

Viabilité cellulaire 

(% du contrôle) 

150 

100 

50 

22:6n-3 

20:5n-3 

18:1n-9 

18:2n-6 

14:0 

16:0 

18:0 

0 

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 

Acide gras / Albumine 

Figure 28 : Effets des acides gras in vitro sur la viabilité cellulaire des thymocytes de rat. 

Les thymocytes (2.5 10 5 cellules/ puits, plaque à 96 puits) sont mis en culture dans un milieu contenant 

le complexe acide gras albumine à différents rapports allant de 0.5 à 3 (concentrations en acide gras 

de 15 à 90 µM) en absence du mitogène. Après 68h d’incubation, le MTT et la solution de 

solubilisation sont ajoutés dans chaque puits comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes. La 

densité optique est lue à 550 et 690 nm. La viabilité cellulaire est estimée par la différence des 

densités optiques mesurées à 550 et 690 nm (D.O 550 -D.O 690 ) et normalisée par rapport à la différence 

de DO mesurée pour les cellules témoins incubées sans acide gras, considérée comme 100%. Les 

résultats représentent la moyenne de 3 expériences indépendantes, réalisées en 6 exemplaires. Les 

SEM, inférieurs à 10% des valeurs moyennes, ne sont pas montrés sur le graphe. 

Tous les acides gras testés, sauf l’acide stéarique (18:0) qui se montre très peu inhibiteur, 

induisent une diminution dose-dépendante de la réponse proliférative des thymocytes de rat à 

la ConA (Figure 29). L’inhibition la plus importante est obtenue avec les acides gras de la 

famille n-3, quel que soit le rapport acide gras-albumine utilisé. A partir des résultats 

présentés dans la figure 29, les rapports acide gras-albumine donnant 50% d’inhibition de la 

réponse proliférative ont pu être extrapolés comme suit : 20:5n-3, 0,35 ; 22:6n-3, 0,5 ; 14 :0, 

0,9 ; 16:0, 1 ; 18:1n-9, 1,5 et 18:2n-6, 2. Il est à noter qu’au rapport acide gras-albumine de 3, 

117

les acides gras insaturés sont plus inhibiteurs que les acides gras saturés, alors qu’aux rapports 

inférieurs à 2, le 14 :0 et le 16:0 sont plus inhibiteurs que le 18:1n-9 et le 18:2n-6. 

Réponse proliférative (%du contrôle) 

150 

100 

50 

22:6n-3 

20:5n-3 

18:1n-9 

18:2n-6 

14:0 

16:0 

18:0 

0 

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 

Acide gras/albumine 

Figure 29 : Effets des acides gras in vitro sur la prolifération mitogénique des thymocytes 

Les thymocytes (2.5 10 5 cellules/ puits, plaque à 96 puits) sont mis en culture dans un milieu contenant 

le complexe acide gras albumine à différents rapports allant de 0,5 à 3 (concentrations en acide gras 

de 15 à 90 µM) en absence et en présence de 2,5µg/ml de ConA. Après 68h d’incubation, le MTT et la 

solution de solubilisation sont ajoutés dans chaque puits comme décrit dans la partie Matériels et 

Méthodes. La densité optique est lue à 550 et 690 nm. La prolifération cellulaire est exprimée par la 

différence des densités optiques des essais avec et sans ConA. Les différences de DO sont normalisées 

par rapport à celle obtenue pour le contrôle sans acide gras considéré comme 100%. Les résultats 

sont la moyenne de 3 expériences indépendantes, réalisées en 6 exemplaires. Les SEM, inférieurs à 

10% des valeurs moyennes, ne sont pas montrés sur le graphe. 

IV-1-2 Effet des AGI « in vitro » sur l’activité PLD des thymocytes de rat. 

Dans les cellules intactes, l’activité PLD peut être facilement dosée grâce à sa propriété de 

transphosphatidylation. En présence d’un alcool primaire, la PLD forme un 

phosphatidylalcool au détriment du PA. Contrairement au PA qui peut être rapidement 

métabolisé et qui peut aussi être formé par des voies parallèles, le phosphatidylalcool est 

118

métaboliquement stable et sa synthèse est spécifique d’une activité PLD. En système a- 

cellulaire (lysats cellulaires) la phosphtidylcholine substrat doit être apportée aux membranes 

sous forme de liposomes ou de vésicules mixtes (voir Matériels et Méthodes). 

IV-1-2-1 Caractérisation de la PLD des thymocytes de rat 

Dans un premier temps, nous avons mesuré l’activité PLD des thymocytes intacts, stimulés ou 

non par la ConA ou par l’ester de phorbol TPA. Pour cela, les thymocytes marqués avec de 

l’acide arachidonique tritié sont incubés 20 min en présence ou en absence de butanol-1 à 1%, 

puis pendant 5 min avec ou sans ConA (1µg/10 6 cellules), le choix de cette concentration 

découle des études antérieures effectuées par l’équipe (Valette et al., 1991), ou pendant 10 

min avec ou sans TPA. On remarque une formation de phosphatidylbutanol, ce qui témoigne 

de la présence d’une activité PLD dans ces cellules (Figure 30). Cette activité est augmentée 

par la ConA et le TPA. 

0,25 

PBut (%de la radioactivité liée aux 

phospholipides totaux) 

0,20 

0,15 

0,10 

0,05 

0 

sans BuOH 

avec BuOH 

Témoins + ConA +TPA 

Figure 30 : Synthèse de phosphatidylbutanol dans les thymocytes de rat. 

Les cellules marquées avec une dose traceuse d’acide arachidonique tritié sont incubées en présence 

ou absence de butanol-1 à 1% pendant 20 min, puis pendant 5 min avec ou sans ConA (1µg/10 6 

cellules), ou 10 min avec ou sans TPA à une concentration finale de 10 -7 M. A la fin du temps 

d’incubation, les lipides sont extraits et séparés par CCM bidimensionnelle comme décrit dans la 

partie Matériels et Méthodes. La radioactivité associée au phosphatidylbutanol est exprimée en 

pourcentage de la radioactivité incorporée dans les PL totaux. 

119

Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé l’activité PLD des lysats cellulaires, ce qui 

permet de déterminer le type de PLD présent dans ces cellules en faisant varier les conditions 

de dosage. 

Afin de déterminer si l’activité PLD présente dans les thymocytes est activable par l’oléate 

(PLD oleate-sensible), nous avons effectué des mesures en absence ou présence d’oléate de 

sodium 4 mM. La Figure 31 montre que l’oléate inhibe la formation de phosphatidylbutanol, 

ce qui indique clairement une absence de PLD oleate-sensible dans les thymocytes de rat. 

0,9 

Activité PLD 

(pmoles de PC hydrolysées/essai) 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

sans oleate 

avec oleate 

Figure 31 : Absence d’activité PLD oléate sensible dans les thymocytes de rat 

Les lysats cellulaires sont incubés à 37°C pendant 30 min et l’activité PLD est mesurée en absence et 

en présence d’oléate de sodium comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés 

en pmoles de PC hydrolysées / essai. Ils représentent la moyenne ± SEM de n=3 expériences 

indépendantes. 

En revanche, la présence de vésicules de PIP2 dans le milieu de dosage stimule fortement 

l’activité PLD. Si l’on ajoute du GTPγS en plus du PIP2 (Figure 32), l’activité PLD observée 

est légèrement augmentée par rapport à l’activité mesurée en présence du PIP2 seul. Ces 

résultats montrent la présence d’une PLD PIP2 sensible activable par les petites protéines G. 

120

14 

Activité PLD 

(pmoles de PC hydrolysées/essai) 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

Sans addition 

+ PIP2 

+PIP2+ GTPγS 

Figure 32 : Activité PLD PIP2-sensible dans les thymocytes de rat. 

Les lysats cellulaires sont incubés à 37°C pendant 30 min. et l’activité PLD est mesurée en présence 

ou absence de PIP2, avec ou sans GTPγS comme decrit dans matériels et méthodes. Les résultats sont 

exprimés en pmoles de PC hydrolysées /essai. Ils représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences 

indépendantes. 

Afin d’identifier les isoformes de PLD exprimées dans les thymocytes, nous avons recherché 

la présence des ARNm de PLD1 et PLD2 grâce à la technique de RT-PCR et l’utilisation 

d’amorces spécifiques de PLD1 et PLD2. Les amorces spécifiques de chaque isoformes ont 

été choisies à partir des séquences publiées de PLD1 (Hammond et al., 1997) et de PLD2 

(Steed et al., 1998). Le couple d’amorces spécifiques de PLD1 entoure la délétion présente 

chez PLD1b, permettant ainsi de révéler à la fois la présence de PLD1a et PLD1b. La 

séquence de PLD2 à amplifier a été choisie dans une zone non homologue à PLD1. Dans la 

RT-PCR réalisée avec les amorces spécifiques de PLD1, on obtient deux bandes d'ADN 

amplifié, de 554 et 437 pb correspondant respectivement aux deux variants rPLD1a et 

rPLD1b. Pour rPLD2, on obtient une bande de 489 pb correspondant au fragment attendu. 

121

PLD1a 

PLD1b 

750 pb 

500 pb 

PLD2 

Thymo 

Thymo 

MT 

Figure 33 : Caractérisation de l’expression des ARNm de PLD dans les thymocytes de rat 

Les ARNm extraits des thymocytes de rat sont soumis à une transcription inverse. Les ADNc ainsi 

obtenus ont été amplifiés par PCR avec des couples d’amorces spécifiques de PLD1 et PLD2. 

Abréviations : Thymo : thymocytes ; MT : marqueurs de taille. 

Comme le montre la Figure 33, les thymocytes de rat expriment les deux isoformes de PLD : 

PLD1 et PLD2. Pour PLD1, les deux variants d’épissage PLD1a et PLD1b sont exprimés. En 

plus, des expériences de western-blotting réalisées sur des homogénats cellulaires des 

thymocytes de rat montrent clairement la présence des protéines PLD1 et PLD2 dans les 

cellules (Figure 34). 

177 KDa 

120 KDa 

PLD1 

177 KDa 

120 KDa 

80 KDa 

80 KDa 

PLD2 

MT 

Thymo 

MT 

Thymo 

Figure 34 : Expression des protéines PLD1 et PLD2 dans les thymocytes de rat. 

Le lysat thymocytaire a été déposé et soumis à une électrophorèse en SDS-PAGE (8% d'acrylamide en 

présence d'urée 4M). Les gels ont été révélés et analysés comme décrit dans la partie Matériels et 

Méthodes. Abréviations : Thymo : thymocytes ; MT : marqueurs de taille. 

122

L’ensemble des résultats concernant la caractérisation de la PLD indique qu’aussi bien 

PLD1a, PLD1b et PLD2 sont présentes dans les thymocytes de rat. En revanche, ces cellules 

semblent être dépourvues d’activité PLD oléate sensible. 

IV-1-2-2 Effet des acides gras «in vitro» sur l’activité PLD 

Afin de déterminer l’effet des acides gras sur l’activité PLD, les thymocytes sont tout d’abord 

préincubés pendant 2h avec les différents acides gras complexés à de l’albumine humaine 

délipidée (rapports acide gras-albumine de 1 et 3 correspondant à des concentrations en acides 

gras de 5 et 15µM, respectivement). A la fin de l’incubation, une aliquote est prélevée afin de 

déterminer le degré d’enrichissement en acides gras des phospholipides par chromatographie 

en phase gazeuse. 

Les phospholipides représentent la classe lipidique majoritaire dans les membranes 

cellulaires, c’est pourquoi nous avons étudié les modifications de leur composition en 

fonction des différents enrichissements réalisés. Une incubation de 2h est suffisante pour 

modifier de façon significative la composition des phospholipides en acides gras (Tableau XV 

a, b et c). L’incubation des thymocytes avec un acide gras donné, sauf pour les acides 

stéarique et oléique, augmente sa proportion dans les phospholipides des cellules. On 

remarque par ailleurs que le 20:5n-3 est l’acide gras le mieux incorporé comparativement aux 

autres acides gras, l’incorporation de l’acide oléique et stéarique étant la moins efficace. 

L’enrichissement se fait d’une manière dose-dépendante. Ainsi, pour le rapport acide gras : 

albumine=1, la quantité de 18:2n-6 augmente de 1,3 fois par rapport au contrôle; celle du 

20:5n-3 augmente de plus de 18 fois. Pour le 22:6n-3, l’augmentation est de 1,5 fois et pour le 

14:0 l’augmentation est de 1,7 fois. Au rapport 3, les augmentations sont de 1,4 fois pour le 

18:2n-6, plus de 36 fois pour le 20:5n-3, 2,5 fois pour le 22:6n-3 et 4,6 fois pour le 14:0. 

Concernant les effets des acides gras sur l’activité PLD (Figure 36), les résultats montrent 

d’une part que le 22:6n-3, le 18:2n-6 et le 14:0 augmentent significativement l’activité PLD 

basale et stimulée (P=0,0001, 0,0002 et 0,027 respectivement). L’effet activateur du 18:1n-9 

n’est pas statiquement significatif probablement en raison de sa faible incorporation dans les 

phospholipides. Le 18:0 et le 20:5n-3 n’ont pas d’effet sur l’activité PLD. Il est à noter que le 

20:5n-3 ne modifie pas l’activité PLD des thymocytes de rat malgré son incorporation 

efficace dans les phospholipides des thymocytes. 

123

Tableau XV a : Composition en acides gras des phospholipides des thymocytes après 

enrichissement par les acides gras de la famille n-3. 

Acides gras Contrôle 22:6 n-3 20:5 n-3 

AG/HSA =1 AG/HSA=3 AG/HSA =1 AG/HSA=3 

14:0 0,58 ± 0,12 0,72 ± 0,47 0,93 ± 0,04 0,85 ± 0,47 0,88 ± 0,11 

16:0 

18:0 

18:1 n-9 

18:1 n-7 

18:2 n-6 

20:4 n-6 

20:5 n-3 

22:5 n-3 

22:6 n-3 

30,12 ± 0,55 

19,86 ± 0,30 

10,69 ± 0,24 

7,45 ± 0,15 

7,35 ± 0,28 

23,29 ± 0,55 

0,07 ± 0,03 a 

0,10 ± 0,03 a 

0,49 ± 0,07 a 29,47 ± 0,42 

19,41 ± 0,28 

10.89 ± 0,28 

7,64 ± 0,55 

7,70 ± 0,97 

23,16 ± 0,97 

0,12 ± 0,06 a 

0,10 ± 0,05 a 

0,80 ± 0,23 a,b 31,31 ± 0,85 

18,64 ± 0,15 

10,41 ± 0,22 

7,40 ± 0,43 

7,74 ± 0,98 

22,01 ± 1,36 

0,16 ± 0,01 a 

0,05 ± 0,05 a 

1,34 ± 0,38 c 29,89 ± 1,40 

19,46 ± 0,40 

10,29 ± 0,35 

7,49 ± 0,30 

6,76 ± 0,35 

23,26 ± 1,15 

1,33 ± 0,15 b 

0,24 ± 0,12 b 

0,42 ± 0,06 a 29,18 ± 1,68 

19,06 ± 0,22 

10,15 ± 0,32 

6,96 ± 0,09 

6,66 ± 0,26 

23,60 ± 1,10 

2,67 ± 0,27 c 

0,40 ± 0,06 b 

0,44 ± 0,06 a 

∑AGS 

∑AGPI n-6 

∑AGPI n-3 

∑AGMI 

50,55 ± 0,56 

30,65 ± 0,41 

0,64 ± 0,10 a 

18,15 ± 0,30 

49,60 ± 0,57 

30,85 ± 0,37 

1,02 ± 0,31 a,b,c 

18,87 ± 0,40 

50,88 ± 0,98 

29,80 ± 1,30 

1,55 ± 0,32 b 

17,81 ± 0,34 

50,20 ± 1,80 

30,02 ± 1,46 

2,00 ± 0,32 c 

17,78 ± 0,20 

49,12 ± 1,95 

30,26 ± 1,30 

3,50 ± 0,37 d 

17,12 ± 0,39 

n-6/n-3 48,86 ± 5,24 a 36,50±10,83 a,b 21,31 ± 5,22 b,c 15,43 ± 2,17 b,c 8,10 ± 0,13 c 

UI 134,8 ± 3,1 132,1 ± 3,8 130,5 ± 5,6 134,8 ± 6,9 142,8 ± 6,9 

Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Les résultats sont 

analysés par ANOVA et les moyennes comparées par un test de t-protégé. Des lettres différentes 

indiquent des différences significatives (P

Tableau XV b: Composition en acides gras des phospholipides des thymocytes après 

enrichissement par les acides linoléique et oléique. 

Acides gras Contrôle 18:1 n-9 18:2 n-6 


14:0 0,58 ± 0,12 0,10 ± 0,10 0,73 ± 0,16 0,88 ± 0,10 0,78 ± 0,14 

16:0 

18:0 

18:1 n-9 

18:1 n-7 

18:2 n-6 

20:4 n-6 

20:5 n-3 

22:5 n-3 

22:6 n-3 

30,12 ± 0,55 

19,86 ± 0,32 

10,70 ± 0,24 

7,45 ± 0,15 

7,35 ± 0,28 a 

23,29 ± 0,55 

0,07 ± 0,03 

0,10 ± 0,03 

0,48 ± 0,07 

29,52 ± 0,36 

19,03 ± 0,65 

11,02 ± 0,37 

7,41 ± 0,29 

7,81± 0,12 a,b,c 

24,08 ± 1,15 

0,23 ± 0,13 

0,29 ± 0,06 

0,51 ± 0,01 

29,48 ± 1,75 

18,77 ± 0,35 

11,49 ± 0,68 

7,33 ± 0,04 

7,03 ± 0,42 a,c 

24,40 ± 0,72 

0,17 ± 0,03 

0,18 ± 0,02 

0,42 ± 0,05 

31,16 ± 1,69 

18,78 ± 0,64 

10,89 ± 1,00 

7,74 ± 0,15 

8,83 ± 0,89 b 

21,00 ± 0,71 

0,13 ± 0,06 

0,13 ± 0,06 

0,46 ± 0,05 

29,74 ± 2,09 

18,84 ± 0,38 

11,10 ± 1,01 

7,68 ± 0,36 

9,33 ± 0,62 b 

21,74 ± 0,22 

0,14 ± 0,07 

0,13 ± 0,07 

0,52 ± 0,04 

∑AGS 

∑ AGPI n-6 

50,55 ± 0,56 

30,65 ± 0,41 

48,65 ± 0,19 

31,90 ± 1,03 

48,99 ± 1,64 

31,44 ± 1,10 

50,84 ± 1,90 

29,82 ± 0,72 

49,35 ± 2,08 

31,04 ± 0,67 

0,64 ± 0,10 1,03 ± 0,19 0,76 ± 0,08 0,71 ± 0,17 0,79 ± 0,15 

∑ AGPI n-3 

18,15 ± 0,30 18,43 ± 0,65 18,81 ± 0,65 18,64 ± 1,12 18,79 ± 1,30 

∑AGMI 

n-6/n-3 48,87 ± 5,23 32,45 ± 7,12 42,38 ± 3,43 50,07 ± 15,96 42,27 ± 8,35 

UI 134,8 ± 3,1 135,2 ± 3,2 134,1 ± 4,5 123,8 ± 3,9 128,4 ± 3,3 



indiquent des différences significatives (P< 0,05). Si aucune lettre n’apparaît dans une ligne, les 

valeurs ne sont pas statistiquement différentes. Abréviations : HSA : albumine sérique humaine, AGS, 

acides gras saturés ; AGMI, acides gras monoinsaturés ; AGPI, acides gras polyinsaturés; UI, index 

d’insaturation (somme des mol% x nombre de doubles liaisons). ). Le rapport AG/HSA=1 correspond 

à une concentration en AG égale à 5µM ; le rapport AG/HSA=3 correspond à une concentration en 

AG égale à 15µM. 

125

Tableau XV c : Composition en acides gras des phospholipides des thymocytes après 

enrichissement par les acides gras saturés. 

Acides gras Contrôle 14:0 18:0 


14:0 0,58 ± 0,12 a 1,01 ± 0,23 b 2,65 ± 0,27 c 0,68 ± 0,10 a,b 0,47 ± 0,14 a,b 

16:0 

18:0 

18:1 n-9 

18:1 n-7 

18:2 n-6 

20:4 n-6 

20:5 n-3 

22:5 n-3 

22:6 n-3 

30,12 ± 0,55 a 

19,86 ± 0,33 

10,70 ± 0,24 

7,45 ± 0,15 

7,35 ± 0,28 

23,29 ± 0,55 

0,07 ± 0,03 

0,10 ± 0,03 

0,49 ± 0,07 

25,43 ± 1,54 b 

19,06 ± 1,07 

11,40 ± 1,13 

7,51 ± 0,70 

7,84 ± 0,41 

27,35 ± 1,05 

0 ± 0 

0 ± 0 

0,39 ± 0,20 

26,10 ± 1,38 b 

18,60 ± 0,74 

10,76 ± 0,89 

7,24 ± 0,64 

7,73 ± 0,43 

26,29 ± 1,27 

0, 08 ± 0,08 

0 ± 0 

0,35 ± 0,18 

27,46 ± 1,68 a,b 

19,56 ± 0,65 

11,23 ± 1,00 

6,70 ± 0,16 

7,61 ± 0,89 

26,43 ± 0,73 

0 ± 0 

0 ± 0 

0,34 ± 0,05 

25,08 ± 2,09 a,b 

20,55 ± 0,39 

10,99 ± 1,02 

6,72 ± 0,37 

7,67 ± 0,62 

28,11 ± 0,24 

0 ± 0 

0 ± 0 

0,39 ± 0,04 

∑AGS 

∑AGPI n-6 

∑AGPI n-3 

∑AGMI 

50,55 ± 0,56 a 

30,65 ± 0,41 

0,64 ± 0,10 

18,15 ± 0,30 

45,51 ± 0,70 b 

35,19 ± 0,80 

0,58 ± 0,04 

19,30 ± 0,60 

47,34 ± 0,81 b 

34,02 ± 0,93 

0,65 ± 0,16 

18,20 ± 0,60 

47,69 ± 1,89 a,b 

34,04 ± 0,74 

0,34 ± 0,11 

17,92 ± 1,12 

46,11 ± 2,07 a,b 

35,79 ± 0,70 

0,39 ± 0,08 

17,71 ± 1,31 

n-6/n-3 48,87 ± 5,23 61,20 ± 6,72 57,19 ± 16,40 99,18 ± 12,88 90,84 ± 5,25 

UI 134,8 ± 3,1 146,31 ± 3,2 141,3 ± 3,9 140.9 ± 3,9 147,9 ± 3,3 



indiquent des différences significatives (P≤0,05). Si aucune lettre n’apparaît dans une ligne, les 

valeurs ne sont pas statistiquement différentes. Abréviations : HSA : albumine sérique humaine, AGS, 

acides gras saturés ; AGMI, acides gras monoinsaturés ; AGPI, acides gras polyinsaturés; UI, index 

d’insaturation (somme des mol% x nombre de doubles liaisons). ). Le rapport AG/HSA=1 correspond 

à une concentration en AG égale à 5µM ; le rapport AG/HSA=3 correspond à une concentration en 

AG égale à 15µM. 

126

PBut (%de la radioactivité des phospholipides 

totaux) 

0.35 

0.30 

0.25 

0.20 

0.15 

0.10 

0.05 

0 

non stimulés 

stimulés avec la ConA 

contrôle 1 3 contrôle 1 3 

22:6n -3 

20:5n -3 

18:1n -9 

18:2n -6 

14:0 

18:0 

Acide gras/albumine 

Figure 35 : Effets des acides gras in vitro sur l’activité phospholipase D des thymocytes. 

Les cellules marquées avec une dose traceuse d’acide arachidonique tritié sont suspendues à une 

concentration de 40 x 10 6 cellules/ ml. Elles sont incubées pendant 2h à 37°C avec de l’albumine seule 

(HSA 5µM) ou avec les différents complexes acide gras-albumine (rapports 1 et 3 correspondant à 5 

et 15 µM d’acide gras, respectivement). Les cellules sont incubées en présence ou absence de butanol- 

1 (concentration finale de 1%) pendant 20 min, puis 5 min avec ou sans ConA (1µg/ 10 6 cellules). La 

réaction est arrêtée par extraction des lipides puis l’extrait lipidique est séparé par CCM 

bidimensionnelle comme décrit dans Matériels et Méthodes. La radioactivité associée au 

phosphatidylbutanol est exprimée en pourcentage de la radioactivité associée aux phospholipides 

totaux. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Les résultats statistiques 

de l‘analyse de variance à deux voies sont les suivants : 

22:6n-3 :effet acide gras vs contrôle : F=12,90, P=0,0001 ; effet ConA vs non stimulé : F=18,31, 

P=0,0002. 

20:5n-3 :effet acide gras vs contrôle : F=0,44, NS ; effet ConA vs non stimulé : F=8,94, P=0,007. 

18:1n-9 :effet acide gras vs contrôle : F=2,38, NS ; effet ConA vs non stimulé : F=18,94, P=0,0002. 

18:2n-6 :effet acide gras vs contrôle : F=12,53, P=0,0002 ; effet ConA vs non stimulé : F=24,13, 

P

De façon intéressante l’activité PLD stimulée par la ConA est négativement corrélée à la 

réponse proliférative, exception faite des résultats concernant les cellules enrichies en 20:5n-3 

(Figure 36). Ces résultats suggèrent qu l’EPA inhibe la prolifération thymocytaire par un 

mécanisme différent de celui des autres acides gras, et sont en faveur de l’hypothèse de notre 

équipe selon laquelle la PLD ttransmettrait des signaux antiprolifératifs dans les cellules 

lymphoïdes (Diaz et al., 2002 et 2005). 

Réponse proliférative 

120 

100 

80 

60 

40 

R= 0,79 , P =0,004 

22:6n - 3 

20:5n - 3 

18:1n - 9 

18:2n - 6 

14:00 

18:00 

20 

0 

0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 

Activité PLD 

Figure 36 : Corrélation négative entre la réponse proliférative et l’activité PLD stimulée 

par la ConA dans les thymocytes de rat. 

Afin de confirmer le rôle antiprolifératif de la PLD dans le lymphocyte, nous avons mesuré la 

réponse proliférative de thymocytes préalablement traités avec du TPA (10 -7 M), un puissant 

activateur de la PLD (Komati et al., 2004 ; Kötter et al., 2000). Les résultats montrent que le 

TPA inhibe fortement (de l’ordre de 68%) la réponse proliférative des thymocytes à la ConA 

(Figure 37). 

128

Prolifération des thymocytes 

(D.O550-D.O690) 

Proliferation ∆D.O 

0,60 

0,50 

0,40 

0,30 

0,20 

0,10 

0 

68% 

Te ConA ConA + TPA 

Figure 37 : Effet du TPA sur la réponse proliférative des thymocytes de rat. 

Les thymocytes sont suspendus dans un milieu complet contenant 10% de sérum de veau fœtal (v/v), à 

une densité de 5x10 5 cellules/puits et cultivés pendant 68h en présence ou absence de ConA (2,5µg/ml) 

et en présence ou absence du TPA (10 -7 M). La prolifération cellulaire est mesurée par un test 

colorimétrique comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM 

de n=3 expériences indépendantes. 

IV-1-3 Caractérisation des DRMs dans les thymocytes de rat 

L’isolement des DRMs à partir de lysats cellulaires est basé sur l’insolubilité de ces structures 

dans les détergents non ioniques à froid et leur flottaison sur un gradient de densité. Lors de 

l’ultracentrifugation sur gradient de saccharose d’un l’homogénat cellulaire traité au triton X- 

100, les DRMs sont isolés dans les fractions de faible densité alors que le reste des 

membranes est concentré dans les fractions de forte densité. C’est la composition lipidique 

particulière des DRMs qui leur confère ce comportement caractéristique. Après 

ultracentrifugation, le gradient est fractionné en aliquotes de 1ml et le pourcentage en 

saccharose de chaque fraction est déterminé. Différents marqueurs caractéristiques des DRMs 

sont ensuite dosés. 

129

IV-1-3-1 Détection du ganglioside GM1 

Parmi les glycosphingolipides présents dans les DRMs, le ganglioside GM1, l’un des plus 

abondants, est le plus souvent utilisé comme marqueur car il est facilement détectable par la 

toxine cholérique. La toxine cholérique est constituée de deux sous-unités : A et B. La sous 

unité B présente la particularité de reconnaître et de se fixer sur le GM1 de façon spécifique. 

L’utilisation de la sous unité B de la toxine couplée de façon covalente à une peroxydase 

(Amersham), permet de visualiser le GM1 présent dans chacune des fractions du gradients par 

dot blot. 

L’analyse densitométrique des spots révélés par ECL a permis de mettre en évidence un 

enrichissement spécifique en GM1 des fractions de faible densité en saccharose (14 à 20%) 

(Figure 38) correspondant aux densités caractéristiques des radeaux lipidiques. En effet, 

environ 60% du GM1 se retrouve dans les DRMs. 

59,57% 

GM1 (% du total) 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

GM1 

% de saccharose 

45 

40 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 


0 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 

0 

n° Fractions 

Figure 38 : Distribution du ganglioside GM1 dans les différentes fractions du gradient de 

saccharose. 

Les microdomaines sont préparés comme décrit dans Matériels et Méthodes et les fractions du 

gradient sont collectées de 1 (fond du tube) à 11 (sommet du tube). 20 µl de chaque fraction sont 

déposés sur membrane immobilon et le GM1 est détecté spécifiquement par la sous unité B de la 

toxine cholérique et révélé par chimiluminescence. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 3 

expériences indépendantes. 

130

IV-1-3-2 Détection du PIP2 

Le PIP2 est un phospholipide qui a été décrit comme principalement localisé dans les radeaux 

lipidiques qu’ils soit enrichis ou non en caveoline (Hope et Pike., 1996 ; Liu et al., 1998 ; Pike 

et casey, 1996). Afin de déterminer sa localisation dans les différentes fractions du gradient, 

nous avons réalisé des expériences de dot Blot en utilisant un anticorps polyclonal anti-PIP2 

spécifique pour l’immunodetection. 

L’analyse densitométrique des spots révélés par ECL a permis de mettre en évidence un 

enrichissement spécifique en PIP2 des fractions de faible densité en saccharose (

IV-1-3-3 Dosage du cholestérol et des phospholipides 

Les microdomaines sont caractérisés par leur richesse en cholestérol qui semble jouer un rôle 

majeur dans la cohésion de leur structure et le recrutement des protéines de signalisation, en 

particulier les protéines à ancre GPI. Le dosage réalisé sur une aliquote de chacune des 

fractions du gradient montre un enrichissement en cholestérol des fractions de faible densité 

(14 à 20%) (Figure 40). L’enrichissement en cholestérol de ces fractions de faible densité est 

cohérent avec les caractéristiques des microdomaines telles qu’elles sont décrites dans la 

littérature. D’autre part, la quantification des phospholipides par la méthode de Stewart 

indique que ceux-ci sont massivement présents dans les fractions denses (d>27%) (Figure 

41). 

30 

25 

Cholestérol 

CST 

% de Saccharose 

40 

35 

30 

Cholestérol CST (µg/ml) (µg/ml) 

20 

15 

10 

5 

25 

20 

15 

10 

5 


0 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 

0 

n° Fraction 

Figure 40 : Distribution du cholestérol dans les différentes fractions du gradient de 

saccharose. 

Les microdomaines sont préparés comme décrit dans Matériels et Méthodes et les fractions sont 

collectées de 1 (fond du tube) à 11 (Sommet du tube). Le cholestérol est dosé par réaction 

enzymatique, comme décrit dans Matériels et méthode, sur chaque fraction du gradient. Les résultats 

sont exprimés en µg/ml et représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. 

132

1,0 

45 

0,9 

40 

Phospholipides (mg/ml) 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 


Phospholipides 

% saccharose 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 

0 

n° Fractions 

Figure 41 : Distribution des phospholipides dans les différentes fractions du gradient de 

saccharose. 

Les microdomaines sont préparés comme décrit dans Matériels et Méthodes et les fractions sont 

collectées de 1 (fond du tube) à 11 (Sommet du tube). Les phospholipides sont dosés par la méthode de 

Stewart, comme décrit dans Matériels et méthode, sur chaque fraction du gradient. Les résultats sont 

exprimés en mg/ml et représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. 

IV-1-3-4 Distribution de la protéine PLD1 dans les radeaux lipidiques 

Dans les lymphocytes humains, la PLD1 apparaît comme préférentiellement associée aux 

radeaux lipidiques alors que la PLD2 est uniquement présente dans les fractions de fortes 

densités correspondant aux protéines solubilisées par le détergent (Diaz et al., 2002). Nous 

avons donc recherché la présence éventuelle de PLD1 dans les DRMs de thymocytes. La mise 

en évidence de la protéine PLD1 dans les fractions du gradient nécessite une étape de 

concentration par précipitation des protéines à l’acétone. Cette étape de concentration permet 

d’obtenir un signal détectable par nos anticorps lors de la révélation ECL. Les résultats 

montrent que la protéine PLD1 est localisée en partie dans les fractions de fortes densités 

mais qu’elle est également présente dans les fractions de faible densité correspondant aux 

DRMs (Figure 42). 

133

PLD1 

1 2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

Figure 42: Détection de PLD1 dans les différentes fractions du gradient de saccharose. 

Les protéines de chacune des fractions ont été précipitées par l’acétone à froid comme indiqué dans 

Matériels et Méthodes. Le précipité protéique est repris dans 20 µl de tampon de Laemmeli contenant 

de l’urée ≈ 4M et de l’EDTA 2,5 mM. Les différentes fractions sont ensuite analysées par Western 

blotting avec un anticorps polyclonal anti-PLD1. 

IV-1-4 Effets de l’enrichissement des cellules en acides gras sur les radeaux 

lipidiques 

Plusieurs travaux ont montré que l’enrichissement des lymphocytes T en acides gras 

insaturés, spécialement ceux de la famille n-3, était capable de modifier l’association aux 

DRMs de certaines protéines comme les tyrosines kinases de la famille Src (Fyn et Lck) 

(Stulnig et al., 1998 ; Stulnig et al., 2001 ; Weeb et al., 2000) et la protéine adaptatrice LAT 

(Zeyda et al., 2002). De plus, des travaux précédents de notre équipe avaient montré que 

l’enrichissement des lymphocytes humains en DHA entraînait une délocalisation de PLD1 

hors des DRMs et que cette délocalisation s’accompagnait d’une stimulation de l’activité de 

la protéine (Diaz et al., 2002). Nous avons sélectionné pour cette étude les deux acides gras 

qui se sont montrés les plus efficaces pour activer la PLD des thymocytes, le 22:6n-3 et le 

18:2n-6. 

IV-1-4-1 Effet des AG sur la distribution du GM1, du cholestérol et des 

phospholipides 

Nous avons tout d’abord recherché si l’enrichissement en AG des membranes de thymocytes 

modifiait la répartition des constituants lipidiques principaux dans les fractions des gradients. 

Nous observons que le GM1 comme le cholestérol et le PIP2 restent principalement localisés 

dans les fractions de faible densité correspondant aux DRMs (résultats non montrés). 

134

IV-1-4-2 Effet des AG sur la localisation de la protéine PLD1 

Afin de déterminer si un enrichissement en acides gras pouvait modifier la distribution de la 

PLD1 entre les fractions rafts et non-rafts des gradients, des expériences de Western blotting 

ont été réalisées sur des gradients préparés avec des thymocytes préalablement enrichis en 

acides gras. On peut remarquer que dans les cellules enrichies, on ne retrouve pratiquement 

plus de PLD1 dans les fractions comprises entre 15 et 20% de saccharose (fractions 6 et 7) 

correspondant aux DRMs (Figure 43). La protéine est déplacée à la fois vers les fractions 

plus légères (saccharose 30%). Cette 

délocalisation est plus importante après un enrichissement en DHA. Il est important de noter 

que ces changements de distribution de la protéine PLD1 dans les membranes ne 

s’accompagnent d’aucun changement dans la distribution des marqueurs spécifiques des 

microdomaines. 

a- DHA 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 

PLD 1 

b- LA 

1 2 3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

PLD1 

Figure 43 : Effet d’un enrichissement en DHA (a) et en acide linoléique (b) sur la 

distribution de la protéine PLD1 dans les fractions des gradients 

Les protéines de chacune des fractions des gradients préparés à partir de thymocytes préalablement 

enrichis pendant 2h avec les acides gras d’intérêt ont été précipitées par l’acétone à froid comme 

indiqué dans Matériels et Méthodes. Le précipité protéique est repris dans 20 µl de tampon de 

Laemmeli contenant de l’urée ≈ 4M et de l’EDTA 2,5 mM. Les différentes fractions sont ensuite 

analysées par Western blotting avec un anticorps polyclonal anti-PLD1. 

135

IV-2 Etude nutritionnelle comparative de l’effet immunomodulateur des 

huiles de poisson, d’argan et d’olive chez le rat 

Les observations épidémiologiques ainsi que des études nutritionnelles menées chez l’animal 

et chez l’Homme ont montré que les lipides alimentaires modulent les fonctions immunitaires 

et leur régulation (Perez et Alexander, 1988 ; Kelley et al., 2001 ; Calder et al., 2002 ; De 

Pablo et al., 2002). Ces données ont ouvert des perspectives intéressantes en matière de 

prévention et de traitement des maladies cardiovasculaires, inflammatoires et lors des 

transplantations d’organe (Van der Heide et al., 1993 ; Belluzi et al., 1996 ; Grimminger et al., 

1996 ; Belluzi, 2002 ; Calder et al., 2004). La supplémentation des régimes alimentaires par 

divers types de graisses différant par leur composition en acides gras altère certains 

paramètres de la réponse immunitaire, notamment la réponse proliférative des lymphocytes 

aux mitogènes (Zurier et al, 1999 ; Verlengia et al, 2003 et 2004 ; Liu et al, 2003), la 

production de cytokines (Yaqoob et Calder, 1995. Wallace et al, 2001 ; Verlengia et al, 2003 

et 2004), l’activité des cellules Natural Killer (Yaqoob et al, 1994 ; Thies et al, 2001a), la 

production des eicosanoïdes (Kinsella et al, 1990) et la composition en acides gras des 

phospholipides membranaires (Valette et al, 1991; Calder et al, 1994 ; Yaqoob et al, 1995a et 

c). 

Les résultats concernant l’effet des lipides alimentaires sur la réponse proliférative des 

lymphocytes aux mitogènes rapportés dans la littérature sont souvent contradictoires. Suivant 

les conditions expérimentales utilisées, certains travaux montrent une augmentation, une 

diminution ou encore une absence d’effet sur la prolifération des lymphocytes. La quantité et 

la nature des graisses sont toutes les deux importantes dans l’immunomodulation. Ainsi, les 

régimes hyperlipidiques sont généralement plus immunosuppresseurs que les régimes pauvres 

en graisses. De plus, les régimes riches en acides gras insaturés sont plus suppresseurs que 

ceux riches en acides gras saturés. La composition en acides gras des lipides de la membrane 

lymphocytaire peut être modifiée en fonction de la teneur en acides gras du régime 

alimentaire (Valette et al., 1991 ; Calder et al., 1994 ; Yaqoob et al., 1995 a et c). 

L’objectif de la présente étude nutritionnelle a été de comparer les effets immunomodulateurs 

chez le rat de cinq régimes alimentaires enrichis avec les huiles suivantes : poisson, argan, 

olive, noix de coco et tournesol: 

136

L’huile de poisson constitue une source concentrée d’AGPI n-3 à longue chaîne, notamment 

l’acide docosahexaénoïque (DHA) (5,93%) et l’acide eicosapenténoïque (EPA) (18,83%). 

L’huile d’argan est une huile de type oléique/linoléique contenant environ 80% d’AGI dont 

32,20% d’acide linoléique et 45,52% d’acide oléique, ce qui lui confère un intérêt du point de 

vue nutritionnel. 

L’huile d’olive est riche en un acide gras monoinsaturé particulier, l’acide oléique (74,48%). 

C’est un élément clé du régime méditerranéen, préconisé par de nombreux diététiciens. 

L’huile de noix de coco est riche en acides gras saturés (81,18%) 

L’huile de tournesol est riche en acide linoléique (63,49%). 

Ces différents régimes ont été administrés à des rats pendant 4 semaines. A la fin de la 

période d’administration, les paramètres biochimiques et fonctionnels suivants ont été 

étudiés : 

- la composition en acides gras des triglycérides et phospholipides plasmatiques et 

des phospholipides membranaires des thymocytes, 

- la réponse proliférative des thymocytes, 

- l’activité PLD des thymocytes 

- l’expression de la PLD au niveau des ARNm et de la protéine dans les thymocytes 

par RT-PCR et Western blot (WB). 

IV-2-1 Composition en acides gras des régimes 

Le régime de base sans graisse a été additionné des différentes huiles à raison de 8g de l’huile 

désirée + 2g d’huile de tournesol pour 100g de régime comme décrit dans matériels et 

méthodes. Le Tableau XVI montre la composition finale en acides gras des différents 

régimes. Comme attendu, elle reflète celle des huiles utilisées pour leur préparation. Tous les 

régimes contiennent une quantité suffisante d’acide linoléique, acide gras essentiel de la 

famille n-6, grâce à l’apport en huile de tournesol (2% en poids pour chaque régime). 

137

Tableau XVI : Composition en acides gras des régimes expérimentaux 1 

Régimes 

Acides gras Poisson Argan Olive Coco Tournesol 

mole/100 mole d’acides gras 

14:0 8,08 ± 0,28 a 0,42 ± 0,01 b 0,37 ± 0,05 b 29,69 ± 0,65 c 0,36 ± 0,01 b 

16:0 21,39 ± 0,70 a 13,49 ± 0,05 b 11,44 ± 0,17 c 18,33 ± 0,15 d 7,45 ± 0,04 e 

16:1(n-9) ND 2 ND 0,40 ± 0,11 b ND ND 

16:1(n-7) 8,85 ± 0,11 a ND 0,64 ± 0,15 b ND ND 

18:0 4,02 ± 0,14 a 5,40 ± 0,08 b 2,55 ± 0,06 c 5,75 ± 0,13 b 3,44 ± 0,07 d 

18:1(n-9) 14,38 ± 0,41 a 41,19 ± 0,15 b 62,77 ± 0,58 c 20,49 ± 0,39 d 26,49 ± 0,87 e 

18:1(n-7) 4,12 ± 0,06 a ND 0,08 ± 0,08 b ND ND 

18:2(n-6) 16,03 ± 0,35 a 38,90 ± 0,22 b 20,25 ± 0,26 c 25,75 ± 0,50 d 61,49 ± 0,82 e 

18:3(n-3) 0,62 ± 0,02 ND 0,72 ± 0,01 ND ND 

20:2(n-6) 0,22 ± 0,10 0,40 ± 0,02 0,60 ± 0,08 ND 0,23 ± 0,01 

20:3(n-6) 0,19 ± 0,06 a 0,21 ± 0,01 a 0,19 ± 0,01 a ND 0,55 ± 0,02 b 

20:4(n-6) 0,55 ± 0,02 ND ND ND ND 

20:5(n-3) 13,34 ± 0,88 ND ND ND ND 

22:4(n-6) 0,95 ± 0,03 ND ND ND ND 

22:5(n-3) 1,25 ± 0,11 ND ND ND ND 

22:6(n-3) 

5,93 ± 0,46 ND ND ND ND 

AGS 33,49 ± 1,11 a 19,31 ± 0,11 b 14,35 ± 0,28 b 53,76 ± 0,38 c 11,24 ± 0,08 d 

AGMI 27,44 ± 0,70 a 41,19 ± 0,15 b 63,88 ± 0,45 c 20,49 ± 0,39 d 26,49 ± 0,87 a 

∑ AGPI (n-6) 17,93 ± 0,42 a 39,50 ± 0,22 b 21,04 ± 0,33 c 25,75 ± 0,50 d 62,27 ± 0,82 e 

∑ AGPI (n-3) 21,14 ± 1,44 ND 0,72 ± 0,01 ND ND 

(n-6)/(n-3) 0,86 ± 0,05 ND 29,10 ± 0,66 ND ND 

IU 3 176,87 ± 7,69 a 120,40 ± 0,31 b 108,32 ± 0,40 b 71,99 ± 0,81 c 151,58 ± 0,81 d 

1 Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de 3 déterminations. Les résultats sont analysés par ANOVA 

et les moyennes comparées par un test de t-protégé. Des lettres différentes indiquent une différence 

significative, P

IV-2-2 Effets des régimes sur la croissance des rats 

Les cinq régimes utilisés dans cette étude ont été bien tolérés et la consommation journalière 

de nourriture a été similaire dans chaque groupe. Après quatre semaines de régime aucune 

variation de gain de poids corporel n’a été observée entre les cinq groupes (Tableau XVII). 

On remarque cependant une baisse significative du poids de thymus isolé chez les animaux du 

groupe noix de coco par rapport aux quatre autres groupes. Cette diminution du poids de 

thymus n’est pas accompagnée par une réduction du nombre de cellules isolées (Tableau 

XVII). 

Tableau XVII: Influence des différents régimes sur le gain de poids corporel, le poids du 

thymus et le nombre de thymocytes par thymus, 

Groupes de régimes Gain de poids (g) Poids de thymus (g) Thymocytes (x 10 8 ) 

Régime poisson 179,6 ± 3,2 (16) 0,66 ± 0,03 a (16) 6,66 ± 0,87 (16) 

Régime argan 180,1 ± 5,4 (16) 0,65 ± 0,03 a (16) 6,35 ± 0,85 (16) 

Régime olive 182,8 ± 4,8 (16) 0,65 ± 0,02 a (16) 7,23 ± 0,87 (16) 

Régime coco 177,5 ± 5,0 (16) 0,55 ± 0,02 b (16) 5,12 ± 0,33 (16) 

Régime tournesol 175,5 ± 4,1 (6) 0,71 ± 0,05 a (6) 5,46 ± 0,75 (6) 

Les rats sont nourris pendant 4 semaines avec les différents régimes présentés dans le tableau XII 

(Matériels et Méthodes). Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de n=6 pour le régime tournesol 

et n=16 pour les quatre autres groupes. Les résultats sont analysés par ANOVA et les moyennes 

comparées par un test de t-protégé Des lettres différentes indiquent une différence significative, 

P

IV-2-3-1 Modifications lipidiques plasmatiques induites par les régimes 

Des modifications importantes dans la composition en acides gras des triglycérides du plasma 

sont observées selon le régime administré (Tableau XVIII). Les triglycérides isolés du 

plasma des rats nourris avec un régime supplémenté en huile d’olive montrent une quantité 

élevée de 18:1n-9 et une faible proportion des acides gras appartenant à la famille n-6, 

indiquant ainsi que l’enrichissement en 18:1n-9 se fait aux dépens des acides gras de la 

famille n-6. Les principaux acides gras de l’huile d’argan, le 18:1n-9 et le 18:2n-6 sont 

incorporés de façon importante dans les triglycérides des rats nourris avec ce régime. De 

manière intéressante, on remarque que la proportion du 18:2n-6 est maintenue élevée même si 

la proportion du 18:1n-9 augmente dans le même temps. Une alimentation riche en acides 

gras saturés (noix de coco) augmente la proportion des acides gras saturés et diminue celle 

des acides gras polyinsaturés. Par ailleurs une augmentation simultanée du 20:5n-3, du 

22 :5n-3 et du 22:6n-3 dans les triglycérides du plasma est notée chez les animaux nourris 

avec un régime enrichi en huile de poisson, ce qui conduit à une diminution drastique du 

rapport n-6/n-3 comparé à ceux des quatre autres groupes. Les variations de la composition en 

acides gras des phospholipides plasmatiques sont similaires à celles observées dans les 

triglycérides plasmatiques, mais de moins grande amplitude (Tableau XIX). 

IV-2-3-2 Modifications lipidiques des thymocytes de rat induites par les régimes 

Les phospholipides des thymocytes ont un contenu en acides gras monoinsaturés plus élevé 

que les phospholipides du plasma. Ceci est dû principalement à la proportion élevée de 18:1n- 

9 dans les phospholipides des thymocytes par rapport aux phospholipides plasmatiques, quel 

que soit le régime administré (Tableau XX). Les membranes des thymocytes maintiennent 

des proportions relativement constantes d’acides gras saturés dans leurs phospholipides quel 

que soit le régime administré. 

La proportion de 18:2n-6 dans les phospholipides des thymocytes des rats appartenant aux 

groupes noix de coco et olive est faible par rapport à celle observée dans le groupe tournesol 

(-33% et -35% respectivement), tandis qu’elle est maintenue au niveau du groupe tournesol 

chez les rats des groupes argan et poisson (Tableau XX). Par contre, la proportion de 20:4n-6 

est fortement diminuée dans le groupe poisson comparé aux autres groupes. Dans les 

phospholipides des thymocytes de rats nourris avec un régime supplémenté en huile de 

poisson, la proportion de 20:5n-3 est de 4,6 moles pour 100 moles d’acide gras, alors que cet 

140

acide gras est indétectable dans les autres groupes. La consommation d’huile de poisson 

stimule aussi l’incorporation du 22:5n-3 et du 22:6n-3 aux dépens des acides gras à longue 

chaîne de la famille n-6, principalement le 20:4n-6 et le 22:4n-6. Le rapport 20:5n-3 sur 

22:6n-3 dans les phospholipides des thymocytes de rats nourris avec un régime riche en huile 

de poisson est de 5,07, alors que dans le plasma ce rapport est égal à 1,65, suggérant une 

capture préférentielle du 20:5n-3 par les thymocytes. Cette observation est en accord avec 

celles rapportées par Valette et al, (1991). 

141

Tableau XVIII: Effet des régimes sur la composition en acides gras des triglycérides du 

plasma 1 

Régimes 

Acides gras Poisson Argan Olive Noix de coco Tournesol 

mole/100 moles d’acides gras 

14:0 3,41 ± 0,26 a 0,90 ± 0,06 b 1,02 ± 0,06 b 7,01 ± 0,59 c 0,82 ± 0,10 b 

16:0 25,99 ± 0,58 a 22,09 ± 0,55 b,c 23,16 ± 0,43 b 30,53 ± 0,45 d 21,02 ± 1,42 c 

16:1(n-9) 0,24 ± 0,03 a 0,38 ± 0,03 b 0,50 ± 0,05 c 0,32 ± 0,03 a,b 0,31 ± 0,08 a,b 

16:1(n-7) 7,83 ± 0,34 a 2,67 ± 0,15 b 4,09 ± 0,26 c 8,32 ± 072 a 1,40 ± 0,08 b 

18:0 3,12 ± 0,23 a 2,88 ± 0,12 a 1,88 ± 0,10 b 2,34 ± 0,10 c 2,78 ± 0,15 a,c 

18:1 23,54 ± 0,60 a 39,67 ± 0,25 c 54,55 ± 0,41 c 36,32 ± 1,04 d 28,12 ± 0,74 e 

18:2(n-6) 12,86 ± 0,37 a 28,09 ± 0,68 b 12,88 ± 0,33 a 13,23 ± 0,74 a 40,52 ± 2,22 c 

18:3(n-3) 0,13 ± 0,04 a 0,38 ± 0,04 b 0,23 ± 0,02 a,c 0,25 ± 0,04 c 0,26 ± 0,09 a,c 

20:2(n-6) 0,13 ± 0,04 a 0,38 ± 0,06 b 0,35 ± 0,06 b 0,17 ± 0,04 a 0,46 ± 0,15 b 

20:3(n-6) 0,20 ± 0,04 a 0,33 ± 0,04 b 0,16 ± 0,02 a 0,21 ± 0,03 a,c 0,33 ± 0,09 b,c 

20:4(n-6) 1,60 ± 0,24 a 1,56 ± 0,08 a 0,67 ± 0,04 b 0,83 ± 0,12 b 2,93 ± 0,34 c 

20:5(n-3) 11,54 ± 0,50 a 0,02 ± 0,02 b 0,01 ± 0,01 b ND ND 

22:4(n-6) 0,16 ± 0,09 a 0,26 ± 0,05 a,b 0,10 ± 0,02 a 0,11 ± 0,04 a 0,40 ± 0,13 b 

22:5(n-6) 0,06 ± 0,02 a 0,28 ± 0,02 b 0,10 ± 0,01 a 0,29 ± 0,04 b 0,59 ± 0,16 c 

22:5(n-3) 3,40 ± 0,19 a 0,01 ± 0,01 b 0,02 ± 0,01 b 0,02 ± 0,01 b ND 

22:6(n-3) 5,61 ± 0,33 a 0,04 ± 0,01 b 0,09 ± 0,01 b 0,06 ± 0,01 b 0,01 ± 0,01 b 

AGS 2 32,53 ± 0,57 a 25,86 ± 0,63 b 26,06 ± 0,42 b 39,88 ± 0,72 c 24,62 ± 1,50 b 

AGMI 31,62 ± 0,65 a 42,76 ± 0,27 b 59,20 ± 0,37 c 44,97 ± 1,04 d 29,83 ± 0,75 a 

∑ AGPI (n-6) 15,14 ± 0,51 a 31,28 ± 0,79 b 14,48 ± 0,39 a 15,08 ± 0,93 a 45,50 ± 2,12 c 

∑ AGPI (n-3) 20,71 ± 0,61 a 0,10 ± 0,02 b 0,26 ± 0,04 b 0,08 ± 0,02 b 0,05 ± 0,03 b 

(n-6)/(n-3) 0,74 ± 0,03 a 487,71 ± 88,07 b 88,93 ± 18,57 a,c 149,48 ±16,78 c 351,92 ± 77,43 b 

IU 3 174,78 ± 3,35 a 110,97 ± 1,52 b 91,51 ± 0,80 c 78,77 ± 1,73 c 130,04 ± 3,41 e 

1 Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de n=15 pour les groupes Poisson, Argan, Olive et coco, n=6 

pour le groupe tournesol. Des lettres différentes indiquent une différence significative, P< 0,05. Si aucune 

lettre n’apparaît dans une ligne, les valeurs ne sont pas statistiquement différentes. 2 Abréviations : AGS, 

acides gras saturés ; AGMI, acides gras monoinsaturés ; AGPI, acides gras polyinsaturés. 

3 

IU, indice d’insaturation: somme des « mole % multipliée par le nombre de doubles liaisons » 

142

Tableau XIX : Effet des régimes sur la composition en acides gras des phospholipides du plasma 1 . 

Régimes 



14:0 0,58 ± 0,03 a 0,29 ± 0,03 b 0,27 ± 0,02 b 1,17 ± 0,10 c 0,21 ± 0,05 b 

16:0 33,10 ± 0,63 a 26,75 ± 1,20 b 25,77 ± 0,51 b 26,17 ± 0,66 b 25,55 ± 0,79 b 

16:1(n-9) 0,12 ± 0,02 a,b 0,13 ± 0,01 b 0,18 ± 0,01 c 0,10 ± 0,01 a,b 0,02 ± 0,02 d 

16:1(n-7) 1,89 ± 0,11 a 0,52 ± 0,05 b 0,85 ± 0,08 c 1,31 ± 0,12 d 0,31 ± 0,02 b 

18:0 18,12 ± 0,50 a 22,16 ± 0,86 b,c 20,94 ± 0,35 c 22,89 ± 0,68 b 22,24 ± 0,65 b,c 

18:1(n-9) 4,94 ± 0,29 a,b 5,91 ± 0,27 c 9,59 ± 0,25 d 5,16 ± 0,23 a 4,12 ± 0,16 b 

18:1(n-7) 3,63 ± 0,17 a,b 2,74 ± 0,18 c 4,21 ± 0,26 a 3,53 ± 0,24 b 1,96 ± 0,13 c 

18:2(n-6) 12,85 ± 0,35 a 19,23 ± 0,95 b 16,84 ± 0,40 c 19,35 ± 0,57 b 22,14 ± 0,88 d 

18:3(n-6) 0,10 ± 0,03 a,b 0,15 ± 0,02 a 0,15 ± 0,02 a 0,16 ± 0,03 a 0,02 ± 0,02 b 

20:2(n-6) 0,04 ± 0,02 a 0,35 ± 0,04 b 0,31 ± 0,08 b,c 0,19 ± 0,04 a,c 0,45 ± 0,10 b 

20:3(n-6) 0,67 ± 0,14 a 0,77 ± 0,08 a,b 0,89 ± 0,06 b 1,18 ± 0,07 c 0,55 ± 0,04 a 

20:4(n-6) 9,62 ± 0,36 a 17,79 ± 0,70 b,c 16,84 ± 0,46 b 16,27 ± 0,65 b 19,44 ± 0,70 c 

20:5(n-3) 7,53 ± 0,28 a 0,09 ± 0,02 b 0,14 ± 0,02 b 0,08 ± 0,02 b ND 2 

22:4(n-6) 0,62 ± 0,20 0,66 ± 0,16 0,49 ± 0,14 0,25 ± 0,09 0,44 ± 0,03 

22:5(n-6) 0,07 ± 0,04 a 1,63 ± 0,13 b 0,79 ± 0,06 c 1,48 ± 0,11 b 1,46 ± 0,22 b 

22:5(n-3) 1,91 ± 0,11 a 0,12 ± 0,03 b 0,21 ± 0,02 b 0,10 ± 0,02 b 0,16 ± 0,04 b 

22:6(n-3) 4,56 ± 0,22 a 1,15 ± 0,18 b 2,03 ± 0,08 c 1,31 ± 0,07 b 0,93 ± 0,08 b 

AGS 51,81 ± 0,63 a 49,21 ± 1,76 a,b 46,98 ± 0,54 b 50,22 ± 1,21 a 47,99 ± 0,96 a,b 

AGMI 10,61 ± 0,35 a 9,36 ± 0,33 b 14,88 ± 0,29 c 10,14 ± 0,36 a,b 6,41 ± 0,11 d 

∑ AGPI (n-6) 23,58 ± 0,44 a 40,09 ± 1,44 b 35,76 ± 0,50 c 38,16 ± 0,97 b,c 44,50 ± 0,87 d 

∑ AGPI (n-3) 14,01 ± 0,44 a 1,35 ± 0,18 b 2,38 ± 0,07 c 1,48 ± 0,08 b 1,10 ± 0,10 b 

(n-6)/(n-3) 1,71 ± 0,07 a 33,36 ± 2,61 b 15,23 ± 0,43 c 26,51 ± 1,16 d 42,14 ± 3,21 e 

IU 153,40 ± 2,56 a 139,64 ± 4,84 b,c 137,82 ± 2,09 b,c 131,16 ± 5,58 c 146,53 ± 3,32 a,b 

1 Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de n=14 pour les groupes Poisson et Argan, n=16 pour le groupe 

Olive, n=15 pour le groupe Coco, et n=6 pour le groupe Tournesol. Des lettres différentes indiquent une différence 

significative, P

Tableau XX : Effet des régimes sur la composition en acides gras des phospholipides des 

thymocytes 1 . 

Régimes 



14:0 0,86 ± 0,,07 a 0,69 ± 0,05 a 0,67 ± 0,05 a 1,24 ± 0,11 b 0,64 ± 0, 6 a 

16:0 26,34 ± 0,34 26,57 ± 0,77 26,91 ± 0,45 26,50 ± 0,69 27,42 ± 0,16 

16:1(n-9) 0,61 ± 0,02 a 0,45 ± 0,02 b 0,63 ± 0,03 a 0,48 ± 0,03 b 0,42 ± 0,01 b 

16:1(n-7) 1,89 ± 0,05 a 0,83 ± 0,04 b 1,03 ± 0,06 c 1,20 ± 0,07 d 0,82 ± 0,03 b,c 

18:0 17,20 ±0,24 a 18,66 ± 0,31 b 17,70 ± 0,24 a 18,68 ± 0,33 b 17,81 ± 0,24 a,b 

18:1(n-9) 10,89 ± ,39 a 9,04 ± 0,26 b 11,29 ± 0,28 a 8,25 ± 0,30 b 8,68 ± 0,16 b 

18:1(n-7) 8,17 ± 0,24 a 5,61 ± 0,11 b 6,55 ± 0,22 c 7,16 ± 0,26 d 5,04 ± 0,17 b 

18:2(n-6) 8,52 ± 0,28 a 7,09 ± 0,16 b 5,78 ± 0,12 c 5,80 ± 0,15 c 8,89 ± 0,28 a 

18:3(n-6) 0,16 ± 0,04 0,17 ± 0,04 0,18 ± 0,03 0,19 ± 0,04 ND 2 

20:2(n-6) 0,74 ± 0,04 a 1,91 ± 0,08 b 1,09 ± 0,08 c 1,30 ± 0,19 c 2,71 ± 0,15 d 

20:3(n-6) 1,46 ± 0,02 a 1,10 ± 0,03 b,c 1,09 ± 0,05 b,c 1,17 ± 0,05 b,d 0,97 ± 0,08 c 

20:4(n-6) 15,29 ± ,31 a 24,07 ± 0,58 b 24,10 ± 0,35 b 24,74 ± 0,56 b 24,24 ± 0,46 b 

20:5(n-3) 4,36 ± 0,16 a ND ND ND ND 

22:4(n-6) 1,07 ± 0,25 a 2,97 ± 0,30 b 2,58 ± 0,20 b,c 2,53 ± 0,19 b,c 1,94 ± 0,10 a,c 

22:5(n-6) 0,13 ± 0,06 a 0,76 ± 0,08 b 0,34 ± 0,06 c 0,74 ± 0,08 b 0,32 ± 0,09 a,c 

22:5(n-3) 1,47 ± 0,09 ND ND ND ND 

22:6(n-3) 0,86 ± 0,04 a 0,08 ± 0,03 b 0,07 ± 0,03 b 0,02 ± 0,02 b 0,10 ± 0,05 b 

AGS 44,40 ± 0,32 a 45,93 ± 0,82 a,b 45,28 ± 0,31 a,b 46,42 ± 0,91 b 45,87 ± 0,18 b 

AGMI 21,56 ± 0,34 a 15,92 ± 0,23 b 19,50 ± 0,23 c 17,09 ± 0,41 d 14,96 ± 0,15 b 

∑ AGPI (n-6) 27,36 ± 0,35 a 38,07 ± 0,80 b 35,15 ± 0,50 c 36,46 ± 0,64 c 39,07 ± 0,25 b 

∑ AGPI (n-3) 6,68 ± 0,18 a 0,08 ± 0,03 b 0,07 ± 0,03 b 0,02 ± 0,02 b 0,10 ± 0,05 b 

(n-6)/(n-3) 4,15 ± 0,15 214,65 ± 19,55 132,74 ± 0,98 ND 245,28 ± 47,97 

IU 145,26 ± 1,39 149,83 ± 3,04 145,87 ± 1,53 148,27 ± 2,77 148,00 ± 1,19 

1 Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de n=15 pour les groupes Poisson, Argan, Olive, Coco, et n=5 

pour le groupe Tournesol. Des lettres différentes indiquent une différence significative, P< 0,05. Si aucune 

lettre n’apparaît dans une ligne, les valeurs ne sont pas statistiquement différentes. 2 Abréviations : AGS, 

acides gras saturés ; AGMI, acides gras monoinsaturés ; AGPI, acides gras polyinsaturés. 

3 IU, indice d’insaturation : somme des « mole % multipliée par le nombre de doubles liaisons » 

144

IV-2-4 Effets des régimes sur la réponse proliférative des thymocytes 

Dans la littérature, il a été rapporté que l’effet inhibiteur des acides gras présents dans les 

régimes lipidiques sur la réponse proliférative peut être perdu quand les cellules sont cultivées 

dans un milieu contenant du sérum de veau fœtal au lieu du sérum autologue (Yaqoob et 

Calder, 1995). Afin d’étudier l’influence du sérum, nous avons comparé la réponse 

proliférative de thymocytes prélevés chez le même rat et cultivés soit en présence de sérum de 

veau fœtal, soit en présence de sérum autologue, en utilisant 5 rats par groupe de régime. 

L’analyse des résultats montre que la réponse proliférative aux mitogènes des thymocytes de 

rat est la même quelle que soit la nature du sérum utilisé dans le milieu de culture (F=0,58, 

non significatif) (Tableau XXI). Pour des raisons pratiques, le sérum de veau fœtal a donc été 

utilisé dans tous les tests de prolifération durant cette étude. 

Tableau XXI: Effets de la nature du sérum sur la réponse proliférative des thymocytes à 

la ConA. 

Régimes 

Sérum Poisson Argan Olive Noix de coco Tournesol 

DO avec ConA- DO sans ConA 

Veau fœtal 0,200 ± 0,007 0,169 ± 0,011 0,170 ± 0,010 0,156 ± 0,010 0,205 ± 0,008 

Autologue 

0,186 ± 0,014 0,192 ± 0,022 0,174 ± 0,012 0,140 ± 0,019 0,203 ± 0,065 

Les thymocytes sont suspendus dans un milieu complet contenant 10% de sérum de veau fœtal ou 10% 

de sérum autologue à une densité de 2,5x105 6 cellules/puits et cultivés pendant 68h en présence ou 

absence de ConA. La prolifération cellulaire est mesurée par un test colorimétrique comme décrit 

dans Matériels et Méthodes. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences réalisées en 

6 exemplaires avec 5 rats différents par régime. Les résultats sont évalués par une analyse de 

variance à 2 voies. Effet des régimes : F = 2,96, P=0,02 ; effet du sérum : F = 0,58, NS 

En absence de mitogène, la viabilité cellulaire des thymocytes est similaire quel que soit le 

régime administré (résultats non montrés). En présence de ConA, les thymocytes isolés à 

partir des rats du groupe tournesol ont une réponse proliférative plus élevée que celle 

observée chez les animaux des groupes Olive, Argan et noix de coco (P

De la même façon, les thymocytes isolés chez les rats nourris avec un régime enrichi en huile 

de poisson présentent une réponse proliférative plus importante que celle notée dans les 

groupes olive, Argan et noix de coco (P

Proportion de 18:2(n-6) dans les phospholipides 

des thymocytes(mol/100 mol d’acides gras) 

10 

9 

8 

7 

6 

5 

4 

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 

Prolifération des thymocytes (∆DO stim. - ∆DO non stim.) 

Figure 45 : Corrélation positive entre la réponse proliférative et la proportion de 18:2n-6 

présent dans les phospholipides des thymocytes de rat. 

Les résultats sont tirés de ceux présentés dans la figure 44 et le tableau XX.. P=0,01, r=0,957, n=5. 

IV-2-5 Effets des régimes sur l’activité de la phospholipase D 

L’effet des différents régimes sur l’activité PLD des thymocytes a été étudié. L’activité PLD 

mesurée dans les thymocytes activés par la ConA est la plus faible dans les groupes Poisson et 

Tournesol. Inversement, l’activité PLD tend à être plus élevée dans les thymocytes des rats du 

groupe Coco. Dans les groupes Argan et Olive, l’activité PLD des thymocytes est similaire et 

présente une valeur intermédiaire entre celles des groupes Coco et Poisson (Figure 46). 

Une corrélation négative a pu être établie entre l’activité PLD et la réponse proliférative des 

thymocytes de rat (P

0,12 

[ 3 H]Pbut (% de la radioactivité des 


0,10 

0,08 

0,06 

0,04 

0,02 

0 

Poisson Argan Olive Coco Tournesol 

Figure 46 : Effets des régimes sur l’activité PLD stimulée par la ConA des thymocytes de 

rat. 

Les cellules marquées avec une dose traceuse d’acide arachidonique tritié sont incubées en présence 

ou absence de butanol-1 à 1%, puis stimulées ou non par la ConA (1µg/ 10 6 cellules). La réaction est 

arrêtée par extraction des lipides totaux puis les phospholipides sont fractionnés par CCM. La 

radioactivité associée au phosphatidylbutanol est exprimée en pourcentage de la radioactivité 

associée aux phospholipides totaux. Les résultats représentent la moyenne± SEM de n=14 pour les 

groupes Poisson, Argan et Coco ; n=15 pour le groupe Olive et n=6 pour le groupe Tournesol. 

148

[ 3 H]Pbut (% de la radioactivité des 


0,10 

0,08 

0,06 

0,04 

0,02 

0 

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 

Prolifération des thymocytes (∆DOstim. - ∆DO non stim.) 

Figure 47 : Corrélation inverse entre l’activité PLD et la réponse proliférative des 

thymocytes à la ConA. 

Les données sont celles présentées dans les figures 44 et 46. P=0,04, r=0,880, n=5. 

IV-2-6 Effets des régimes sur l’expression de la PLD des thymocytes de rat 

Le niveau d’expression des protéines PLD1 et PLD2 a été évalué par Western blotting à l’aide 

d’anticorps polyclonaux spécifiques de chaque isoforme à la fin de la période de régime. La 

quantité de la protéine PLD1 thymocytaire apparaît plus élevée dans les groupes Argan et 

Olive par rapport aux trois autres groupes (Figure 48A). La quantité de la protéine PLD2 est 

significativement plus faible dans les thymocytes des rats du groupe Poisson par rapport aux 

quatre autres groupes (Figure 48B). Il est intéressant de noter que les variations d’activité 

PLD mesurée dans les thymocytes activés (Figure 46) reflètent globalement les variations 

d’expression de la protéine PLD2. 

De façon inattendue, l’expression des ARNm de PLD1 (variants a et b) et de PLD2 varie à 

l’opposé de celle des protéines correspondantes (Figure 49). Il est permis de supposer que 

l’expression soutenue de la protéine PLD2 dans les groupes Argan, Olive, Coco et Tournesol, 

149

à la fin des quatre semaines de régime, induit une down régulation des ARNm et que cette 

down-régulation se traduirait par une baisse de synthèse de la protéine si l’administration des 

régimes avait été poursuivie pendant une période plus longue. La même hypothèse peut être 

formulée concernant l’expression soutenue de PLD1 dans les groupes Argan et Olive à la fin 

des quatre semaines de régime. 

150

A 

PLD1 

PLD1 / tubulin (unités arbitraires) 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

b 

b 

a 

a 

a 


B 

PLD2 

PLD2 / tubulin (unités arbitraires) 

4 

3 

2 

1 

0 

b 

b 

b 

b 

a 


Figure 48 : Effets des différents régimes sur l’expression des protéines PLD1 (A) et PLD2 

(B) dans les thymocytes de rats. 

A la fin de la période de régime les thymocytes sont lysés et l’expression des PLD 1 et 2 est évaluée 

par Western blotting à l’aide d’anticorps polyclonaux spécifiques comme décrit dans Matériels et 

Méthodes. Les blots sont représentatifs de 4 expériences indépendantes. Les graphiques montrent les 

résultats normalisés par rapport au signal de la tubiline endogène. Des lettres différentes indiquent 

une différence significative, P< 0,05. 

151

A 

PLD1/ßactine (Unités Arbitraires) 

1,6 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0 

a 

Poisson 

b b b 

Argan Olive Coco 

a 

Tournesol 

B 

PLD2/ßactine (Unités Arbitraires) 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0 

a 

b 

b b 

b 


Figure 49 : Effets des différents régimes sur l’expression des ARNm de PLD1 (A) et PLD2 

(B) dans les thymocytes de rats. 

A la fin de la période de régime, les ARN totaux des thymocytes sont isolés et soumis à une RT-PCR en 

présence d’amorces spécifiques de PLD1, PLD2 et ß-actine comme décrit dans Matériels et Méthodes. 

Les blots sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Les graphiques montrent les résultats 

normalisés par rapport au signal de la ß-actine. Des lettres différentes indiquent une différence 

significative, P< 0,05. 

152

V- Discussion 

De nombreuses études nutritionnelles et épidémiologiques ont montré que les lipides 

alimentaires sont capables de moduler les fonctions immunitaires (Calder et al., 2002 ; 

Yaqoob, 2003a ; Stulnig, 2003). Plusieurs facteurs interviennent dans l’immunomodulation, et 

particulièrement, l’équilibre entre les acides gras insaturés (AGI) des séries n-6 et n-3, ainsi 

que le rapport acides gras saturés (AGS) / AGI du régime alimentaire. L’huile d’argan, une 

des ressources naturelles du Maroc, se caractérise par sa richesse en acides oléique et 

linoléique, ce qui lui confère une composition en acides gras unique parmi les huiles 

végétales. Elle possède des propriétés hypolipidémiante et antioxydante qui pourraient 

s’avérer bénéfiques dans la prévention des maladies cardiovasculaires (Berrougui et al., 

2003 ; Drissi et al., 2004). Par contre, son rôle potentiel sur les fonctions immunitaires n’est 

pas encore connu. L’objectif des travaux présentés dans ce manuscrit a été de déterminer les 

effets d’une consommation d’huile d’argan sur certains aspects du fonctionnement du système 

immunitaire, chez le rat, comparativement à quatre autres huiles : les huiles de poisson, olive, 

noix de coco et tournesol. 

La première partie de ce travail expérimental porte sur l’étude in vitro des effets des acides 

gras majeurs de l’huile d’argan sur la réponse proliférative des thymocytes de rat à une lectine 

mitogénique de référence, la Concanavaline A. Les acides gras majoritaires des huiles de 

poisson, coco et tournesol ont été inclus dans l’étude à titre de comparaison. 

Nous avons tout d’abord évalué les effets des acides gras sur la réponse proliférative des 

thymocytes de rat. Pour ce faire, les thymocytes ont été cultivés dans un milieu contenant les 

acides gras d’intérêt complexés à l’albumine du sérum. Les résultats montrent que le 18:1n-9 

et le 18:2n-6, les deux acides gras majeurs de l’huile d’argan, inhibent la réponse proliférative 

à la ConA mais moins efficacement que les acides gras de la famille n-3 : le 20:5n-3 et le 

22:6n-3. On note aussi qu’aux rapports acide gras-albumine inférieurs à 1.5 (correspondant à 

une concentration en acide gras de 45µM) l’effet inhibiteur des acides oléique et linoléique est 

moins important que celui des acides myristique et palmitique, alors que l’acide stéarique 

n’exerce aucun effet quelle que soit la concentration utilisée. Ces résultats sont en accord avec 

les résultats des études expérimentales conduites chez l’animal et l’homme in vitro (Calder et 

al., 1991 ; Calder et Newsholme, 1992 ; Kumar et al., 1992 ; Soyland et al., 1993 ; Thanasak 

et al., 2005, pour revue voir Yaqoob, 2004 et Calder, 1997). 

153

Une incubation de courte durée (2h) avec le complexe acide gras-albumine (rapport 1 et 3 

correspondant respectivement à des concentrations en acides gras de 5µM et 15µM) est 

suffisante pour induire une augmentation significative de la proportion de chaque acide gras 

dans les phospholipides des thymocytes, à l’exception des acides oléique et stéarique qui ne 

s’incorporent que faiblement, quel que soit le rapport acide gras/albumine utilisé. La plus 

forte incorporation est obtenue avec le 20:5n-3, qui est élongué efficacement en 22 :5n-3 au 

rapport acide gras/albumine de 3. L’enrichissement des phospholipides en acides gras est 

dose-dépendant, leur incorporation étant plus importante lorsqu’ils sont apportés à une 

concentration de 15µM qu’à 5µM. 

Avant d’examiner l’effet de ces acides gras sur l’activité PLD thymocytaire, nous avons tout 

d’abord caractérisé de façon plus précise les différentes isoformes de PLD présentes dans les 

thymocytes de rat. Le dosage de l’activité PLD dans les lysats de thymocytes montre la 

nécessité de la présence de PIP2 dans le milieu réactionnel pour l’activité enzymatique. Ces 

résultats indiquent la présence de PLD PIP2-sensibles, PLD1 et/ou PLD2, dans ces cellules. 

En outre, cette activité est stimulée par un analogue non-hydrolysable du GTP, le GTPγS, ce 

qui est en faveur d’une PLD activable par les petites protéines G, essentiellement PLD1. Par 

ailleurs, la présence d’oléate de sodium dans le milieu réactionnel n’active pas, mais au 

contraire inhibe, la formation de phosphatidylbutanol, indiquant une absence de PLD oléate 

dépendante dans les thymocytes de rat. Les expériences ultérieures de RT-PCR, réalisées avec 

des amorces spécifiques de PLD1 et PLD2, ont montré que les ARNm des deux isoformes, 

PLD1 et PLD2, étaient exprimés dans les thymocytes de rat. De plus, les deux variants 

d’épissage PLD1a et PLD1b ont pu être mis en évidence. Ces résultats de RT-PCR ont été 

confirmés au niveau des protéines par des expériences de Westen-blotting utilisant des 

anticorps spécifiques dirigés contre PLD1 et PLD2. Ainsi, l’ensemble de nos résultats montre 

la présence de PLD1a, PLD1b et PLD2 dans les thymocytes de rat, alors que la présence 

d’une PLD oléate sensible semble exclue. 

Parmi les acides gras étudiés, seuls le 18 :0 et le 20 :5n-3 n’ont pas d’effet sur l’activité PLD 

des thymocytes de rat stimulés ou non par la ConA. Alors que l’inefficacité du 18 :0 peut 

s’expliquer par un défaut d’incorporation dans les phospholipides cellulaires, l’absence 

d’effet du 20 :5n-3 est plus surprenante car c’est l’acide gras le plus efficacement capté par les 

thymocytes. Sa proportion dans les phospholipides augmente jusqu’à 36 fois au rapport acide 

gras/albumine de 3 par rapport aux thymocytes témoins. Le 18:2n-6, le 22:6n-3 et le 14 :0 

154

augmentent significativement l’activité PLD des thymocytes de rat, le 22:6n-3 ayant l’effet le 

plus important aussi bien en absence qu’en présence de ConA. Par contre, l’effet activateur du 

18:1n-9 reste faible et non significatif. Ces résultats diffèrent sensiblement de ceux rapportés 

par Dai et al. (1995) pour la PLD de cœur de rat. Ces auteurs ont montré que l’acide oléique 

induit une augmentation de l’activité PLD plus importante que celle induite par l’acide 

linoléique. Cela peut être probablement expliqué par la faible incorporation de l’acide oléique 

dans les thymocytes de rat dans nos conditions expérimentales. Cependant, Dai et al. (1995) 

n’ont pas examiné l’effet des acides gras de la famille n-3 sur l’activité PLD du cœur de rat. 

Les résultats obtenus dans notre étude sont en accord avec ceux de Bechoua et al. (1998) 

montrant que le 22:6n-3 stimule l’activité PLD des lymphocytes humains alors que le 20:5n-3 

n’a pas d’effet. 

Les investigations menées dans la suite de notre étude in vitro ont visé à déterminer l’effet 

d’un enrichissement en acide gras sur les radeaux lipidiques des thymocytes de rat. Tout 

d’abord, nous avons caractérisé ces structures dans nos cellules. Les DRMs sont connus pour 

leur composition lipidique particulière, à savoir leur enrichissement en cholestérol et 

glycosphingolipides. L’isolement de ces structures est basé sur leur insolubilité dans les 

détergents non ioniques à 4°C et leurs propriétés de flottaison sur un gradient de densité 

(Montixi et al., 1998). Après fractionnement des lysats de thymocytes traités au triton X-100, 

sur un gradient de densité de saccharose, nous avons utilisé plusieurs marqueurs biochimiques 

permettant de caractériser les complexes enrichis en glycolipides, flottant au niveau des 

fractions de faible densité lors de l’ultracentrifugation. Le ganglioside GM1, couramment 

utilisé pour caractériser les radeaux lipidiques des cellules hématopoïétiques (Brown et 

London, 1998), nous a permis de mettre en évidence ces structures au niveau des fractions de 

faible densité. Nous avons également déterminé la localisation du PIP2 à l’aide d’un anticorps 

anti-PIP2 spécifique, ce phospholipide étant décrit comme présent dans les structures résistant 

aux détergents non ioniques à froid (Pike et Miller, 1998 ; Martin, 2001). Les fractions de 

faible densité isolées par centrifugation entre 15 et 20% de saccharose ont montré un 

enrichissement important en GM1, PIP2 et cholestérol, caractéristique des radeaux lipidiques. 

Notre équipe avait montré antérieurement que dans les lymphocytes humains, la PLD1 

apparaît comme préférentiellement associée aux radeaux lipidiques alors que PLD2 ne l’est 

pas. Après enrichissement des membranes lymphocytaires en DHA et stimulation par la 

ConA, la PLD1 est délocalisée hors des DRMs vers le reste des membranes solubilisées, alors 

que PLD2 n’est pas affectée (Diaz et al., 2002). C’est pourquoi nous avons recherché si la 

155

protéine PLD1 était également localisée au niveau des DRMs dans les thymocytes de rat, et si 

un enrichissement en acide gras pouvait modifier sa localisation. Les résultats montrent 

qu’une proportion significative de la protéine PLD1 est associée aux microdomaines 

membranaires des thymocytes de rat. L‘enrichissement de ces cellules en acides linoléique ou 

docosahexaénoïque, avant l’isolement des DRMs, ne modifient pas la distribution du GM1, 

du PIP2 ou du cholestérol dans les fractions du gradient, alors que la protéine PLD1 est 

partiellement délocalisée hors des DRMs. Cette délocalisation est presque totale lorsque les 

cellules sont enrichies en DHA alors que l’acide linoléique a peu d’effet. Ces résultats sont en 

accord avec ceux obtenus par l’équipe de Stulnig, montrant que les acides gras polyinsaturés 

de la famille n-3 affectent la face cytoplasmique de la bicouche lipidique des DRMs sans 

changer la face ectoplasmique (Stulnig et al., 1998 et 2001). 

La deuxième partie de notre étude a été consacrée à l’étude nutritionnelle visant à déterminer 

les effets d’un régime enrichi en huile d’argan sur certains paramètres de la fonction immune 

chez le rat, comparativement à quatre autres régimes enrichis en huiles de poisson, d’olive, de 

noix de coco et de tournesol. Les résultats de ce travail indiquent qu’une alimentation qui 

varie par ses sources de lipides induit des modifications importantes dans la composition en 

acides gras des triglycérides et phospholipides plasmatiques ainsi que dans celle des 

phospholipides des thymocytes. Les modifications les plus importantes sont observées dans 

les triglycérides du plasma, dont la composition en acides gras, après quatre semaines de 

régime, reflète globalement celle des régimes expérimentaux. Les variations de la 

composition en acides gras observées dans les phospholipides plasmatiques sont similaires à 

celles obtenues dans les triglycérides plasmatiques, mais de moins grande amplitude. Bien 

que les thymocytes soient connus pour contrôler efficacement leur propre composition en 

acides gras (Yaqoob et al., 1995a ; Sasaki et al., 1999), nous avons observé des modifications 

significatives dans la composition en acide gras de leurs phospholipides à la fin de la période 

de régime. Ces résultats sont en bon accord avec ceux obtenus antérieurement par notre 

équipe (Valette et al., 1991). Les thymocytes des rats consommant un régime riche en acide 

gras n-3 ont une proportion d’acide gras saturés inférieure à celle observée chez les rats du 

groupe Coco. Ils présentent également la proportion la plus élevée d’acides gras 

monoinsaturés, ce qui résulte d’une augmentation des proportions de 16:1n-7 et de 18:1n-7. 

Les principales différences entre les groupes Argan et Olive concernent la proportion des 

acides gras monoinsaturés et des acides gras n-6 dans les phospholipides des thymocytes. 

Chez les rats du groupe Argan, on remarque une proportion de monoinsaturés (16:1n-9, 

156

16:1n-7, 18:1n-9 et 18:1n-7) plus faible que chez les animaux du groupe Olive. Inversement, 

on note un niveau plus élevé des acides gras n-6 (18:2n-6, 20 :2n-6 et 22 :5n-6). On note aussi 

que la proportion de 18:2n-6 dans les phospholipides varie entre les différents groupes. La 

quantité la plus élevée est observée dans les groupes Poisson et Tournesol, la plus faible dans 

les groupes Olive et Coco. En revanche, la proportion de 20 :4n-6 est maintenue relativement 

constante dans tous les groupes excepté le groupe Poisson. En effet, la consommation 

d’acides gras n-3 à longue chaîne réduit de façon drastique la proportion du 20 :4n-6 dans les 

phospholipides, et ce malgré une proportion de 18:2n-6 aussi élevée que celle observée dans 

le groupe Tournesol. Cette diminution du 20 :4n-6 est due d’une part à son remplacement par 

les acides gras n-3 à longue chaîne via les réaction d’acylation/déacylation et d’autre part, à 

une inhibition de sa synthèse par élongation/désaturation, et notamment à une inhibition de la 

∆6 désaturase par les n-3. 

Les modifications induites par les différents régimes au niveau des phospholipides des 

thymocytes s’accompagnent de modifications de leur réponse proliférative aux mitogènes. La 

réponse proliférative à la ConA la plus faible est observée dans le groupe Coco tandis que 

celles mesurées dans les groupes Tournesol et Poisson sont les plus fortes. Ces résultats 

montrant que les thymocytes des rats nourris avec un régime enrichi en huile de tournesol ont 

une réponse proliférative élevée sont en bon accord avec les données de la littérature montrant 

que les acides gras de la famille n-6 augmentent l’index de prolifération des cellules 

immunitaires (Miles et Calder, 1998 ; Yaqoob, 2002). En outre, nous observons une 

corrélation positive entre la prolifération des thymocytes et la proportion de 18:2n-6 présent 

dans leurs phospholipides, ce qui renforce l’hypothèse d’un lien entre acides gras n-6 et 

réponse proliférative. Cette réponse tend aussi a être corrélée négativement au rapport 18:1n- 

9/18:2n-6 dans les phospholipides. Des relations similaires ont été rapportées par Jeffery et al. 

(1997), qui ont observé une corrélation négative entre la prolifération des splénocytes et le 

rapport 18:1n-9 / 18:2n-6 des régimes. Au contraire, Moussa et al. (2000) ont rapporté des 

résultats opposés chez des rats nourris avec des régimes enrichis en huiles de noix de coco et 

de soja. 

Bien qu’il soit généralement admis que les régimes enrichis en acides gras saturés ont un 

faible effet sur les fonctions immunitaires, certaines études ont rapporté une diminution de la 

réponse lymphoproliférative chez des rats nourris avec un régime riche en huile de noix de 

coco ou en huile d’olive, comparativement à des animaux nourris avec un régime riche en 

157

huile de tournesol, spécialement aux faibles concentrations de ConA (Yaqoob et al., 1995b). 

Compte tenu de l’effet antiprolifératif marqué des acides docosahexaénoïque et 

eicosapentaénoïque in vitro, il semble surprenant que les animaux nourris avec un régime 

enrichi en huile de poisson aient une réponse proliférative élevée, semblable à celle du groupe 

Tournesol et plus importante que celle des autres groupes. Ces résultats sont en désaccord 

avec les nombreux travaux décrivant un effet inhibiteur des acides gras de la famille n-3 sur la 

réponse proliférative aux mitogènes (Calder et al., 2002 ; Yaqoob et al., 2004). Cependant, 

des variations considérables dans les conditions expérimentales, le type cellulaire, le mitogène 

utilisé et la forme d’apport des acides gras n-3 peuvent être notées. Jeffery et al. (1996a) ont 

montré que, chez des rats consommant des mélanges contenant différentes proportions d’huile 

de tournesol et d’huile de lin, la réponse proliférative des splénocytes diminuait lorsque la 

proportion de 18 :3n-3 augmentait dans les régimes, ces variations s’accompagnant aussi 

d’une diminution significative de la proportion de 18:2n-6 dans les phospholipides des 

splénocytes. Nos résultats sont en accord avec certaines données de la littérature (Jeffery et 

al., 1998 ; Sasaki et al., 1999). Dans l’étude de Jeffery et al. (1998), les réponses prolifératives 

des lymphocytes de rats nourris avec des huiles de tournesol et de poisson sont similaires. 

Chez les rats nourris avec le régime Argan, qui contient des quantités élevées et équivalentes 

d’acides oléique et linoléique, et chez les rats nourris avec le régime Olive, les réponses 

prolifératives sont significativement diminuées par rapport à celles notées chez les rats des 

groupes Poisson et Tournesol. Ces résultats sont en bon accord avec ceux de Jeffery et al. 

(1996a) montrant que la consommation de régimes enrichis en huile d’olive ou enrichis en 

huile de tournesol plus olive diminue la réponse proliférative des splénocytes aux mitogènes, 

comparativement à un régime enrichi en huile de tournesol ou à un régime pauvre en graisse. 

De la même façon, Sierra et al. (2005) ont montré récemment que la réponse 

lymphoproliférative de rats nourris avec un régime riche en acide oléique plus linoléique est 

diminuée par rapport à celle de rats nourris avec un régime enrichi seulement en acide 

linoléique. 

Les différents régimes utilisés dans cette étude modifient en parallèle l’activité PLD des 

thymocytes. Le résultat le plus marquant concerne la corrélation négative obtenue entre 

activité PLD et réponse proliférative. Ces résultats sont en faveur de l’hypothèse de notre 

équipe (Diaz et al., 2002) selon laquelle la PLD pourrait médier des signaux antiprolifératifs 

dans les cellules lymphoïdes. Cette hypothèse est également confortée par plusieurs études 

conduites dans les lymphocytes B (Gilbert et al., 1998 ; Fernando et al., 1999). La question se 

158

posait alors de savoir quelle isoforme de PLD était plus particulièrement affectée par ces 

modifications lipidiques. Dans les lymphocytes humains (Diaz et al., 2002), l’incorporation 

de DHA stimule l’activité PLD1. Nous avons tout récemment confirmé le rôle antiprolifératif 

de PLD1 dans le lymphocyte humain par des expériences montrant que la surexpression de 

PLD1 dans les lymphocytes T de Jurkat diminue l’expression de l’interleukine-2 en réponse à 

l’ester de phorbol TPA et à l’ionophore calcique ionomycine (Diaz et al., 2005). Cependant, 

l’activité hPLD2 recombinante peut aussi être stimulée par les acides gras insaturés apportés 

dans le milieu réactionnel sous forme de sels de sodium (Kim et al., 1999b). A la fin de la 

période de régime, la protéine PLD1 est faiblement exprimée dans les thymocytes du groupe 

Poisson qui montrent une réponse proliférative soutenue et dans ceux du groupe Coco qui ont 

la réponse proliférative la plus faible. Par contre, la protéine PLD2 est la moins exprimée dans 

les thymocytes du groupe Poisson comparé aux quatre autres groupes, alors que son 

expression est la plus forte dans les thymocytes du groupe Coco. Ces résultats indiquent que 

l’activité PLD mesurée dans les thymocytes intacts est mieux corrélée aux variations 

d’expression de la protéine PLD2 que PLD1. 

159

VI- Conclusions générales et perspectives 

De l’ensemble du travail présenté dans ce manuscrit plusieurs points forts peuvent être 

soulignés. Le premier concerne l’absence d’effet néfaste de l’huile d’argan vis à vis de la 

fonction lymphocytaire. L’huile d’argan, une des ressources naturelles du Maroc, se 

caractérise par sa richesse en AGI constituant plus de 80% de la fraction glycérique 

(essentiellement l’acide oléique et l’acide linoléique) et par la présence de composés 

antioxydants comme les tocophérols, des stérols, des polyphénols, des carotènes dans la 

fraction insaponifiable. Cette composition chimique confère à l’huile d’argan, en plus de sa 

qualité nutritionnelle, des vertus pharmacologiques intéressantes dans la prévention des 

maladies cardiovasculaires. Sa consommation peut être recommandée sans restriction 

puisqu’elle est dépourvue d’effets secondaires néfastes au niveau du système immunitaire. 

Le deuxième point concerne l’effet antiprolifératif de la PLD. Cet effet antiprolifératif semble 

être une particularité du modèle lymphocytaire. Nos résultats in vitro et in vivo ont montré 

que l’activité PLD stimulée par la ConA est négativement corrélée à la réponse proliférative. 

Nous avons montré tout récemment que la surexpression de la PLD1 dans la lignée 

lymphocytaire T Jurkat entraîne une inhibition de la prolifération spontanée des cellules et 

une inhibition de l’expression de l’ARNm de l’IL-2 en réponse au TPA et à l’ionomycine. 

Ceci suggère fortement que la PLD est impliquée dans l’inhibition de l’activation 

lymphocytaire. Un nouveau mode de régulation impliquant l’inclusion/ exclusion de la PLD1 

dans les radeaux lipidiques a été mis en évidence dans le lymphocyte humain. 

Une des hypothèses explicatives de l’effet antiprolifératif de la PLD se rapporte au 

cytosquelette. La reconnaissance de l’antigène par le lymphocyte T induit la réorganisation de 

la membrane plasmique et du cytosquelette d’actine. Il se forme alors à la jonction entre les 

lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigène un contact étroit appelé synapse 

immunologique. Celle-ci est caractérisée par une accumulation ordonnée de récepteurs à 

l’antigène des lymphocytes T, des protéines constitutives du cytosquelette et des protéines de 

signalisation cellulaire. De nombreux travaux ont montré l’importance du cytosquelette 

d’actine dans l’activation lymphocytaire. Des mutations de protéines régulant le cytosquelette 

d’actine affectent les réponses immunes. La cytochalasine D, en bloquant la polymérisation 

de l’actine empêche l’activation et la prolifération lymphocytaire. La polymérisation de 

l’actine serait impliquée dans la rigidification de la structure de la synapse immunologique. 

160

Cependant, il a été observé récemment que la formation de la synapse immune nécessite, dans 

un premier temps, une dépolymérisation de l’actine permettant le recrutement des radeaux et 

des protéines de signalisation. Comme il est bien connu que l’acide phosphatidique favorise la 

polymérisation de l’actine dans différents types cellulaires, on peut faire l’hypothèse que 

l’activation de la PLD empêche la dépolymérisation initiale de l’actine, et compromet la 

formation du complexe de signalisation. Une autre hypothèse explicative paraît 

particulièrement attractive. Il est de plus en plus largement accepté que la nature des espèces 

moléculaires du PA, et du DAG qui en découle via sa déphosphorylation, influe sur la 

capacité de ces messagers à transmettre les signaux d’activation cellulaire. Le PA et le DAG 

issus de l’hydrolyse de la phosphatidylcholine par la PLD, riches en AGS, pourraient avoir 

des capacités de signalisation réduites par rapport aux messagers issus de l’hydrolyse du PIP2 

par la phospholipase C, plus riches en acides gras polyinsaturés. Ils pourraient, 

éventuellement par compétition, bloquer les cascades normales de signalisation mises en jeu 

lors de l’activation lymphocytaire. 

Le troisième point intéressant concerne les résultats des cellules enrichies en 20:5n-3. Nos 

résultats montrent que l’EPA inhibe la prolifération thymocytaire sans affecter l’activité PLD 

malgré son importante incorporation dans les phospholipides. Ceci suggère que l’effet 

antiprolifératif de l’EPA résulte d’un mécanisme différent de celui des autres acides gras. 

Plusieurs études ont montré que le DHA et l’EPA ont des effets similaires sur les cellules 

immunitaires tout en opérant par des mécanismes moléculaires différents. Pour approfondir 

cette étude, il serait intéressant de déterminer par quel mécanisme l’EPA inhibe la 

prolifération des thymocytes. Denys et al. (2001) ont montré que l’EPA et le DHA inhibent la 

prolifération des cellules T Jurkat en inhibant l’activation des MAP kinases. Récemment, 

Verlengia et ses collaborateurs (2004) ont conclu que le DHA et l’EPA présentent des effets 

différents sur les paramétres fonctionnels et l’expression des gènes des cellules Jurkat. Ces 

deux acides gras inhibent la prolifération et la production d’IL-2 et d’interféron-γ. Cependant, 

seul l’EPA inhibe la production de l’IL-10. Ainsi, le DHA et l’EPA peuvent avoir des effets 

similaires ou différents suivant le gène cible considéré. 

Dans le prolongement des travaux déjà réalisés, il serait possible d’étudier l’effet des 

différents régimes sur les radeaux lipidiques de thymocyte, en particulier sur les marqueurs 

spécifiques des DRMs tels que le GM1, le cholestérol et le PIP2. Il serait également 

intéressant de déterminer la composition en acides gras des radeaux lipidiques, de leurs 

161

phospholipides et des différentes classes de lipides constitutifs. Il serait aussi possible de 

réaliser un co-immunomarquage de la protéine PLD1 et de marqueurs spécifiques des 

microdomaines tels que le GM1. Ceci permettrait de voir l’effet des régimes sur la 

localisation de la PLD dans les radeaux lipidiques par électrophorèse et par des approches en 

microscopie à fluorescence. Les anticorps anti-PLD1 et PLD2 dont nous disposons pourraient 

être utilisés dans des expériences d’immunofluorescence après perméabilisation des cellules, 

couplage à un anticorps secondaire et fixation des thymocytes sur lames. Cette approche 

permettrait de déterminer s’il existe une relation entre l’enrichissement en acides gras des 

radeaux lipidiques et la délocalisation de la protéine PLD. 

Pour compléter cette étude, il serait intéressant d’étudier les effets des régimes sur la 

composition en acides gras et l’activité PLD d’autres organes (rate, foie, cœur, tissu adipeux). 

Il serait aussi important de confirmer nos résultats obtenus chez le rat par une étude clinique. 

Cette étude pourrait prendre en compte des paramètres supplémentaires fonctionnels comme 

la production de cytokines ou l’activité des cellules NK ou, biochimiques comme la 

production d’eicosanoïdes et l’expression des molécules de surface. 

162

VII- Références bibliographiques 

ABOUSALHAM, A., LIOSSIS, C., O'BRIEN, L., BRINDLEY, D. N. Cell-Permeable 

Ceramides Prevent the Activation of Phospholipase D by Adp-Ribosylation Factor and Rhoa. 

J Biol Chem., 1997, vol. 272(2), p .1069-1075. 

AHMED, S. N., BROWN, D. A., LONDON, E. On the Origin of Sphingolipid/Cholesterol- 

Rich Detergent-Insoluble Cell Membranes: Physiological Concentrations of Cholesterol and 

Sphingolipid Induce Formation of a Detergent-Insoluble, Liquid-Ordered Lipid Phase in 

Model Membranes. Biochemistry., 1997, vol. 36(36), p. 10944-10953. 

ALEXANDER, N. J., SMYTHE, N. L. Dietary Fat Modulation of in Vitro Lymphocyte 

Function. Ann Nutr Metab., 1988, vol. 32(4), p. 192-199. 

ANTHES, J. C., WANG, P., SIEGEL, M. I., EGAN, R. W., BILLAH, M. M. Granulocyte 

Phospholipase D Is Activated by a Guanine Nucleotide Dependent Protein Factor. Biochem 

Biophys Res Commun., 1991, vol. 175(1), p. 236-243. 

BAE, C. D., MIN, D. S., FLEMING, I. N., EXTON, J. H. Determination of Interaction 

Sites on the Small G Protein Rhoa for Phospholipase D. J Biol Chem., 1998, vol. 273(19), p. 

11596-11604. 

BALASUBRAMANIAN, K., SCHROIT, A. J. Aminophospholipid Asymmetry: A Matter of 

Life and Death. Annu Rev Physiol., 2003, vol. 65, p. 701-734. 

BALBOA, M. A., BALSINDE, J., DENNIS, E. A., INSEL, P. A. A Phospholipase D- 

Mediated Pathway for Generating Diacylglycerol in Nuclei from Madin-Darby Canine 

Kidney Cells. J Biol Chem., 1995, vol. 270(20), p. 11738-11740. 

BALBOA, M. A., FIRESTEIN, B. L., GODSON, C., BELL, K. S., INSEL, P. A. Protein 

Kinase C Alpha Mediates Phospholipase D Activation by Nucleotides and Phorbol Ester in 

Madin-Darby Canine Kidney Cells. Stimulation of Phospholipase D Is Independent of 

Activation of Polyphosphoinositide-Specific Phospholipase C and Phospholipase A2. J Biol 

Chem., 1994, vol. 269(14), p. 10511-10516. 

163

BALBOA, M. A., INSEL, P. A. Nuclear Phospholipase D in Madin-Darby Canine Kidney 

Cells. Guanosine 5'-O-(Thiotriphosphate)-Stimulated Activation Is Mediated by Rhoa and Is 

Downstream of Protein Kinase C. J Biol Chem., 1995, vol. 270(50), p. 29843-29847. 

BANG, H. O., DYERBERG, J., HJOORNE, N. The Composition of Food Consumed by 

Greenland Eskimos. Acta Med Scand., 1976, vol. 200(1-2), p. 69-73. 

BANG, H. O., DYERBERG, J., SINCLAIR, H. M. The Composition of the Eskimo Food in 

North Western Greenland. Am J Clin Nutr., 1980, vol. 33(12), p. 2657-2661. 

BANNO, Y., FUJITA, H., ONO, Y., NAKASHIMA, S., ITO, Y., KUZUMAKI, N., 

NOZAWA, Y. Differential Phospholipase D Activation by Bradykinin and Sphingosine 1- 

Phosphate in Nih 3t3 Fibroblasts Overexpressing Gelsolin. J Biol Chem., 1999, vol. 274(39), 

p. 27385-27391. 

BATES, D., CARTLIDGE, N. E., FRENCH, J. M., JACKSON, M. J., NIGHTINGALE, 

S., SHAW, D. A., SMITH, S., WOO, E., HAWKINS, S. A., MILLAR, J. H. A Double- 

Blind Controlled Trial of Long Chain N-3 Polyunsaturated Fatty Acids in the Treatment of 

Multiple Sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry., 1989, vol. 52(1), p. 18-22. 

BECHOUA, S., DUBOIS, M., NEMOZ, G., LAGARDE, M., PRIGENT, A.F. 

Docosahexaenoic Acid Lowers Phosphatidate Level in Human Activated Lymphocytes 

Despite Phospholipase D Activation. J Lipid Res., 1998, vol. 39(4), p. 873-883. 

BELCADI, R., Etude des variations du système antioxydant cellulaire en fonction de l'âge et 

de l'apport alimentaire d'acides gras polyinsaturés, chez le rat. Influence particulière de 

l'ingestion de l'huile d'argan. 1994, Thèse 3ème cycle. Univ. Ibnou Zohr. Agadir 

BELLUZZI, A. N-3 Fatty Acids for the Treatment of Inflammatory Bowel Diseases. Proc 

Nutr Soc., 2002, vol. 61(3), p. 391-395. 

BELLUZZI, A., BRIGNOLA, C., CAMPIERI, M., PERA, A., BOSCHI, S., MIGLIOLI, 

M. Effect of an Enteric-Coated Fish-Oil Preparation on Relapses in Crohn's Disease. N Engl 

J Med., 1996, vol. 334(24), p. 1557-1560. 

164

BERGER, A., GERMAN, J. B., CHIANG, B. L., ANSARI, A. A., KEEN, C. L., 

FLETCHER, M. P., GERSHWIN, M. E. Influence of Feeding Unsaturated Fats on Growth 

and Immune Status of Mice. J Nutr., 1993, vol. 123(2), p. 225-233. 

BERRADA, Y., SETTAF, A., BADDOURI, K., CHERRAH, A., HASSAR, M. 

Experimental Evidence of an Antihypertensive and Hypocholesterolemic Effect of Oil of 

Argan, Argania Sideroxylon]. Therapie., 2000, vol. 55(3), p. 375-378. 

BERROUGUI, H., ALVAREZ DE SOTOMAYOR, M., PEREZ-GUERRERO, C., 

ETTAIB, A., HMAMOUCHI, M., MARHUENDA, E., HERRERA, M. D. Argan 

(Argania Spinosa) Oil Lowers Blood Pressure and Improves Endothelial Dysfunction in 

Spontaneously Hypertensive Rats. Br J Nutr., 2004, vol. 92(6), p. 921-929. 

BERROUGUI, H., CLOUTIER, M., ISABELLE, M., KHALIL, A. Phenolic-Extract from 

Argan Oil (Argania Spinosa L.) Inhibits Human Low-Density Lipoprotein (Ldl) Oxidation and 

Enhances Cholesterol Efflux from Human Thp-1 Macrophages. Atherosclerosis., 2006; vol. 

184(2), p. 389-396. 

BERROUGUI, H., ETTAIB, A., HERRERA GONZALEZ, M. D., ALVAREZ DE 

SOTOMAYOR, M., BENNANI-KABCHI, N., HMAMOUCHI, M. Hypolipidemic and 

Hypocholesterolemic Effect of Argan Oil (Argania Spinosa L.) in Meriones Shawi Rats. J 

Ethnopharmacol., 2003, vol. 89(1), p. 15-18. 

BESTERMAN, J. M., DURONIO, V., CUATRECASAS, P. Rapid Formation of 

Diacylglycerol from Phosphatidylcholine: A Pathway for Generation of a Second Messenger. 

Proc Natl Acad Sci U S A., 1986, vol. 83(18), p. 6785-6789. 

BILLAH, M. M., PAI, J. K., MULLMANN, T. J., EGAN, R. W., SIEGEL, M. I. 

Regulation of Phospholipase D in Hl-60 Granulocytes. Activation by Phorbol Esters, 

Diglyceride, and Calcium Ionophore Via Protein Kinase- Independent Mechanisms. J Biol 

Chem., 1989, vol. 264(15), p. 9069-9076. 

BISHOP, A. L., HALL, A. Rho Gtpases and Their Effector Proteins. Biochem J., 2000, vol. 

348 (2), p. 241-255. 

165

BJORNSSON, S., HARDARDOTTIR, I., GUNNARSSON, E., HARALDSSON, A. 

Dietary Fish Oil Supplementation Increases Survival in Mice Following Klebsiella 

Pneumoniae Infection. Scand J Infect Dis., 1997, vol. 29(5), p. 491-493. 

BLIGH, E. G., DYER, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. 

Can J Biochem Physiol., 1959, vol. 37(8), p. 911-917. 

BLOK, W. L., DESLYPERE, J. P., DEMACKER, P. N., VAN DER VEN- 

JONGEKRIJG, J., HECTORS, M. P., VAN DER MEER, J. W., KATAN, M. B. Proand 

Anti-Inflammatory Cytokines in Healthy Volunteers Fed Various Doses of Fish Oil for 1 

Year. Eur J Clin Invest., 1997, vol. 27(12), p. 1003-1008. 

BLOK, W. L., KATAN, M. B., VAN DER MEER, J. W. Modulation of Inflammation and 

Cytokine Production by Dietary (N-3) Fatty Acids. J Nutr., 1996, vol. 126(6), p. 1515-1533. 

BLOT, W. J., LANIER, A., FRAUMENI, J. F., JR., BENDER, T. R. Cancer Mortality 

among Alaskan Natives, 1960-69. J Natl Cancer Inst., 1975, vol. 55(3), p. 547-554. 

BOARDER, M. R. A Role for Phospholipase D in Control of Mitogenesis. Trends Pharmacol 

Sci., 1994, vol. 15(2), p. 57-62. 

BOMAN, A. L., KAHN, R. A. Arf Proteins: The Membrane Traffic Police? Trends Biochem 

Sci., 1995, vol. 20(4), p. 147-150. 

BOSCH, R. R., SMEETS, R. L., SLEUTELS, F., PATEL, A. M., EMST-DE VRIES, S. 

E., JOEP, J., DE PONT, H. H.,WILLEMS, P. H. Concerted Action of Cytosolic Ca2+ and 

Protein Kinase C in Receptor-Mediated Phospholipase D Activation in Chinese Hamster 

Ovary Cells Expressing the Cholecystokinin-a Receptor. Biochem J., 1999, vol. 337 ( Pt 2), p. 

263-268. 

BOUKHCHACHE, D., LAGARDE, M. Interactions between Prostaglandin Precursors 

During Their Oxygenation by Human Platelets. Biochim Biophys Acta., 1982, vol. 713(2), p. 

386-392. 

166

BOWMAN, E. P., UHLINGER, D. J., LAMBETH, J. D. Neutrophil Phospholipase D Is 

Activated by a Membrane-Associated Rho Family Small Molecular Weight Gtp-Binding 

Protein. J Biol Chem., 1993, vol. 268(29), p. 21509-21512. 

BRADFORD, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram 

Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem., 1976, 

vol. 72, p. 248-254. 

BRETSCHER, M. S. Membrane Structure: Some General Principles. Science., 1973, vol. 

181(100), p. 622-629. 

BRINDLEY, D. N., WAGGONER, D. W. Phosphatidate Phosphohydrolase and Signal 

Transduction. Chem Phys Lipids., 1996, vol. 80(1-2), p. 45-57. 

BROUARD, C., PASCAUD, M. Modulation of Rat and Human Lymphocyte Function by N- 

6 and N-3 Polyunsaturated Fatty Acids and Acetylsalicylic Acid. Ann Nutr Metab., 1993, vol. 

37(3), p. 146-159. 

BROWN, D. A., LONDON, E. Functions of Lipid Rafts in Biological Membranes. Annu 

Rev Cell Dev Biol., 1998, vol. 14, p. 111-136. 

BROWN, D. A., LONDON, E. Structure of Detergent-Resistant Membrane Domains: Does 

Phase Separation Occur in Biological Membranes? Biochem Biophys Res Commun., 1997, 

vol. 240(1), p. 1-7. 

BROWN, D. A., ROSE, J. K. Sorting of Gpi-Anchored Proteins to Glycolipid-Enriched 

Membrane Subdomains During Transport to the Apical Cell Surface. Cell., 1992, vol. 68(3), 

p. 533-544. 

BROWN, F. D., THOMPSON, N., SAQIB, K. M., CLARK, J. M., POWNER, D., 

THOMPSON, N. T., SOLARI, R., WAKELAM, M. J. Phospholipase D1 Localises to 

Secretory Granules and Lysosomes and Is Plasma-Membrane Translocated on Cellular 

Stimulation. Curr Biol., 1998, vol. 8(14), p. 835-838. 

167

BROWN, H. A., GUTOWSKI, S., KAHN, R. A., STERNWEIS, P. C. Partial Purification 

and Characterization of Arf-Sensitive Phospholipase D from Porcine Brain. J Biol Chem., 

1995, vol. 270(25), p. 14935-14943. 

BROWN, H. A., GUTOWSKI, S., MOOMAW, C. R., SLAUGHTER, C., STERNWEIS, 

P. C. Adp-Ribosylation Factor, a Small Gtp-Dependent Regulatory Protein, Stimulates 

Phospholipase D Activity. Cell., 1993, vol. 75(6), p. 1137-1344. 

CABOT, M. C., WELSH, C. J., CAO, H. T., CHABBOTT, H. The Phosphatidylcholine 

Pathway of Diacylglycerol Formation Stimulated by Phorbol Diesters Occurs Via 

Phospholipase D Activation. FEBS Lett., 1988, vol. 233(1), p. 153-157. 

CALDER, P. C. Dietary Fatty Acids and Lymphocyte Functions. Proc Nutr Soc., 1998, vol. 

57(4), p. 487-502. 

CALDER, P. C. N-3 Fatty Acids and Cardiovascular Disease: Evidence Explained and 

Mechanisms Explored. Clin Sci (Lond)., 2004, vol. 107(1), p. 1-11. 

CALDER, P. C. N-3 Polyunsaturated Fatty Acids and Immune Cell Function. Adv Enzyme 

Regul., 1997, vol. 37, p. 197-237. 

CALDER, P. C. Omega 3 Polyunsaturated Fatty Acids, Inflammation and Immunity. World 

Rev Nutr Diet., 2001, vol. 88, p. 109-116. 

CALDER, P. C., BEVAN, S. J., NEWSHOLME, E. A. The Inhibition of T-Lymphocyte 

Proliferation by Fatty Acids Is Via an Eicosanoid-Independent Mechanism. Immunology., 

1992, vol. 75(1), p. 108-115. 

CALDER, P. C., BOND, J. A., BEVAN, S. J., HUNT, S. V., NEWSHOLME, E. A. Effect 

of Fatty Acids on the Proliferation of Concanavalin a-Stimulated Rat Lymph Node 

Lymphocytes. Int J Biochem., 1991, vol. 23(5-6), p. 579-588. 

168

CALDER, P. C., COSTA-ROSA, L. F., CURI, R. Effects of Feeding Lipids of Different 

Fatty Acid Compositions Upon Rat Lymphocyte Proliferation. Life Sci., 1995, vol. 56(6), p. 

455-463. 

CALDER, P. C., NEWSHOLME, E. A. Influence of Antioxidant Vitamins on Fatty Acid 

Inhibition of Lymphocyte Proliferation. Biochem Mol Biol Int., 1993, vol. 29(1), p. 175-183. 

CALDER, P. C., NEWSHOLME, E. A. Polyunsaturated Fatty Acids Suppress Human 

Peripheral Blood Lymphocyte Proliferation and Interleukin-2 Production. Clin Sci (Lond)., 

1992, vol. 82(6), p. 695-700. 

CALDER, P. C., YAQOOB, P., HARVEY, D. J., WATTS, A., NEWSHOLME, E. A. 

Incorporation of Fatty Acids by Concanavalin a-Stimulated Lymphocytes and the Effect on 

Fatty Acid Composition and Membrane Fluidity. Biochem J., 1994, vol. 300 ( Pt 2), p. 509- 

518. 

CALDER, P. C., YAQOOB, P., THIES, F., WALLACE, F. A., MILES, E. A. Fatty Acids 

and Lymphocyte Functions. Br J Nutr., 2002, vol. 87 (1), p. S31-48. 

CAUGHEY, G. E., MANTZIORIS, E., GIBSON, R. A., CLELAND, L. G., JAMES, M. 

J. The Effect on Human Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin 1 Beta Production of 

Diets Enriched in N-3 Fatty Acids from Vegetable Oil or Fish Oil. Am J Clin Nutr., 1996, vol. 

63(1), p. 116-122. 

CAUMONT, A. S., GALAS, M. C., VITALE, N., AUNIS, D., BADER, M. F. Regulated 

Exocytosis in Chromaffin Cells. Translocation of Arf6 Stimulates a Plasma Membrane- 

Associated Phospholipase D. J Biol Chem., 1998, vol. 273(3), p. 1373-1379. 

CAYGILL, C. P., CHARLETT, A., HILL, M. J. Fat, Fish, Fish Oil and Cancer. Br J 

Cancer., 1996, vol. 74(1), p. 159-164. 

CHALIFA, V., MOHN, H., LISCOVITCH, M. A Neutral Phospholipase D Activity from 

Rat Brain Synaptic Plasma Membranes. Identification and Partial Characterization. J Biol 

Chem., 1990, vol. 265(29), p. 17512-1759. 

169

CHARROUF, Z., GUILLAUME, D. Ethnoeconomical, Ethnomedical, and Phytochemical 

Study of Argania Spinosa (L.) Skeels. J Ethnopharmacol., 1999, vol. 67(1), p. 7-14. 

CHEN, J. S., CHAI, M. Q., CHEN, H. H., ZHAO, S., SONG, J. G. Regulation of 

Phospholipase D Activity and Ceramide Production in Daunorubicin-Induced Apoptosis in a- 

431 Cells. Biochim Biophys Acta., 2000, vol. 1488(3), p. 219-232. 

CHEN, J. S., EXTON, J. H. Regulation of Phospholipase D2 Activity by Protein Kinase C 

Alpha. J Biol Chem., 2004, vol. 279(21), p. 22076-22083. 

CHIGORNO, V., PALESTINI, P., SCIANNAMBLO, M., DOLO, V., PAVAN, A., 

TETTAMANTI, G., SONNINO, S. Evidence That Ganglioside Enriched Domains Are 

Distinct from Caveolae in Mdck Ii and Human Fibroblast Cells in Culture. Eur J Biochem., 

2000, vol. 267(13), p. 4187-4197. 

CHUNG, J. K., SEKIYA, F., KANG, H. S., LEE, C., HAN, J. S., KIM, S. R., BAE, Y. S., 

MORRIS, A. J., RHEE, S. G. Synaptojanin Inhibition of Phospholipase D Activity by 

Hydrolysis of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. J Biol Chem., 1997, vol. 272(25), p. 

15980-15985. 

CLOUVA-MOLYVDAS, P., PECK, M. D., ALEXANDER, J. W. Short-Term Dietary 

Lipid Manipulation Does Not Affect Survival in Two Models of Murine Sepsis. JPEN J 

Parenter Enteral Nutr., 1992, vol. 16(4), p. 343-347. 

COCKCROFT, S. Phospholipase D: regulation by GTPases and protein kinase C and 

physiological relevance. Prog Lipid Res., 1997, vol. 35, p. 345-370. 

COCKCROFT, S., THOMAS, G. M., FENSOME, A., GENY, B., CUNNINGHAM, E., 

GOUT, I., HILES, I., TOTTY, N. F., TRUONG, O., HSUAN, J. J. Phospholipase D: A 

Downstream Effector of Arf in Granulocytes. Science., 1994, vol. 263(5146), p. 523-526. 

COLLEY, W. C., ALTSHULLER, Y. M., SUE-LING, C. K., COPELAND, N. G., 

GILBERT, D. J., JENKINS, N. A., BRANCH, K. D., TSIRKA, S. E., BOLLAG, R. J., 

170

BOLLAG, W. B., FROHMAN, M. A. Cloning and Expression Analysis of Murine 

Phospholipase D1. Biochem J., 1997a, vol. 326 ( Pt 3), p. 745-753. 

COLLEY, W. C., SUNG, T. C., ROLL, R., JENCO, J., HAMMOND, S. M., 

ALTSHULLER, Y., BAR-SAGI, D., MORRIS, A. J., FROHMAN, M. A. Phospholipase 

D2, a Distinct Phospholipase D Isoform with Novel Regulatory Properties That Provokes 

Cytoskeletal Reorganization. Curr Biol., 1997b, vol. 7(3), p. 191-201. 

CONCORIDE, KM., SMITH, JL., BURNS, DJ., EXTON, JH. Phospholipase D activation 

in fibroblast membranes by the α and β isoforms of protein kinase C. FEBS Lett., 1994, vol. 

342, p. 149-153. 

COOK, S. J., WAKELAM, M. J. Epidermal Growth Factor Increases Sn-1,2- 

Diacylglycerol Levels and Activates Phospholipase D-Catalysed Phosphatidylcholine 

Breakdown in Swiss 3t3 Cells in the Absence of Inositol-Lipid Hydrolysis. Biochem J., 1992, 

vol. 285 ( Pt 1), p. 247-253. 

COORSSEN, J. R., HASLAM, R. J. Gtp Gamma S and Phorbol Ester Act Synergistically to 

Stimulate Both Ca(2+)-Independent Secretion and Phospholipase D Activity in Permeabilized 

Human Platelets. Inhibition by Bapta and Analogues. FEBS Lett., 1993, vol. 316(2), p. 170- 

174. 

CURY-BOAVENTURA, M. F., GORJAO, R., DE LIMA, T. M., NEWSHOLME, P., 

CURI, R. Comparative Toxicity of Oleic and Linoleic Acid on Human Lymphocytes. Life 

Sci., 2005, vol. 21(3), p. 395-405. 

CZARNY, M., FIUCCI, G., LAVIE, Y., BANNO, Y., NOZAWA, Y., LISCOVITCH, M. 

Phospholipase D2: Functional Interaction with Caveolin in Low-Density Membrane 

Microdomains. FEBS Lett., 2000, vol. 467(2-3), p. 326-332. 

CZARNY, M., LAVIE, Y., FIUCCI, G., LISCOVITCH, M. Localization of Phospholipase 

D in Detergent-Insoluble, Caveolin-Rich Membrane Domains. Modulation by Caveolin-1 

Expression and Caveolin-182-101. J Biol Chem., 1999, vol. 274(5), p. 2717-2724. 

171

DAI, J., WILLIAMS, S. A., ZIEGELHOFFER, A., PANAGIA, V. Structure-Activity 

Relationship of the Effect of Cis-Unsaturated Fatty Acids on Heart Sarcolemmal 

Phospholipase D Activity. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids., 1995, vol. 52(2-3), p. 

167-171. 

DECKER, C., MIRO OBRADORS, M.J., SILLENCE, D.J., ALLAN, D. Phorbol estersensitive 

phospholipase D is mainly localized in the endoplasmic reticulum of BHK cells. 

Biochem J., 1996, vol 320 ( Pt 3), p. 885-890. 

DENYS, A., HICHAMI, A., KHAN, N. A. Eicosapentaenoic Acid and Docosahexaenoic 

Acid Modulate Map Kinase Enzyme Activity in Human T-Cells. Mol Cell Biochem. 2002, vol. 

232(1-2), p. 143-148. 

DE PABLO MA, A. P. M., ALVAREZ DE CIENFUEGOS G. Immune Cell Functions, 

Lipids and Host Natural Resistance. FEMS Immunol Med Microbiol., 2000, vol. 29(4), p. 

323-328. 

DE PABLO, M. A., PUERTOLLANO, M. A., ALVAREZ DE CIENFUEGOS, G. 

Biological and Clinical Significance of Lipids as Modulators of Immune System Functions. 

Clin Diagn Lab Immunol., 2002, vol. 9(5), p. 945-950. 

DEROUICHE, A., CHERKI, M., DRISSI, A., BAMOU, Y., EL MESSAL, M., IDRISSI- 

OUDGHIRI, A., LECERF, J. M., ADLOUNI, A. Nutritional Intervention Study with Argan 

Oil in Man: Effects on Lipids and Apolipoproteins. Ann Nutr Metab., 2005, vol. 49(3), p. 196- 

201. 

DESVERGNE, B., WAHLI, W. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: Nuclear 

Control of Metabolism. Endocr Rev., 1999, vol. 20(5), p. 649-688. 

DEVAUX, P. F. Static and Dynamic Lipid Asymmetry in Cell Membranes. Biochemistry., 

1991, vol. 30(5), p. 1163-1173. 

DEVAUX, P. F., MORRIS, R. Transmembrane Asymmetry and Lateral Domains in 

Biological Membranes. Traffic., 2004, vol. 5(4), p. 241-246. 

172

DIAZ, O., BERQUAND, A., DUBOIS, M., DI AGOSTINO, S., SETTE, C., 

BOURGOIN, S., LAGARDE, M., NEMOZ, G., PRIGENT, A. F. The Mechanism of 

Docosahexaenoic Acid-Induced Phospholipase D Activation in Human Lymphocytes Involves 

Exclusion of the Enzyme from Lipid Rafts. J Biol Chem., 2002, vol. 277(42), p. 39368-39378. 

DIAZ, O. MEBAREK-AZZAM, S., BENZARIA, A., DUBOIS, M., LAGARDE, M., 

NEMOZ, G., PRIGENT, A.F. Distruption of lipid rafts stimulates phospholipase D activity 

in human lymphocytes: implication in the regulation of immune function. J Immunol., 2005, 

vol. 15; 175(12), p. 8077-8086. 

DIN, J. N., NEWBY, D. E., FLAPAN, A. D. Omega 3 Fatty Acids and Cardiovascular 

Disease--Fishing for a Natural Treatment. Bmj., 2004, vol. 328(7430), p. 30-35. 

DRISSI, A., GIRONA, J., CHERKI, M., GODAS, G., DEROUICHE, A., EL MESSAL, 

M., SAILE, R., KETTANI, A., SOLA, R., MASANA, L., ADLOUNI, A. Evidence of 

Hypolipemiant and Antioxidant Properties of Argan Oil Derived from the Argan Tree 

(Argania Spinosa). Clin Nutr., 2004, vol. 23(5), p. 1159-1166. 

DYERBERG, J., BANG, H. O. Haemostatic Function and Platelet Polyunsaturated Fatty 

Acids in Eskimos. Lancet., 1979, vol. 2(8140), p. 433-435. 

EICHHOLTZ, T., JALINK, K., FAHRENFORT, I., MOOLENAAR, W. H. The 

Bioactive Phospholipid Lysophosphatidic Acid Is Released from Activated Platelets. Biochem 

J., 1993, vol. 291 ( Pt 3), p. 677-680. 

EL BAWAB, S., MACOVSCHI, O., LAGARDE, M., PRIGENT, A. F. Time-Course 

Changes in Content and Fatty Acid Composition of Phosphatidic Acid from Rat Thymocytes 

During Concanavalin a Stimulation. Biochem J., 1995, vol. 308 ( Pt 1), p. 113-118. 

EL MARJOU, M., MONTALESCOT, V., BUZYN, A., GENY, B. Modifications in 

Phospholipase D Activity and Isoform Expression Occur Upon Maturation and 

Differentiation in Vivo and in Vitro in Human Myeloid Cells. Leukemia., 2000, vol. 14(12), 

p.2118-2127. 

173

ENDRES, S., GHORBANI, R., KELLEY, V. E., GEORGILIS, K., LONNEMANN, G., 

VAN DER MEER, J. W., CANNON, J. G., ROGERS, T. S., KLEMPNER, M. S., 

WEBER, P. C., ET AL. The Effect of Dietary Supplementation with N-3 Polyunsaturated 

Fatty Acids on the Synthesis of Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor by Mononuclear 

Cells. N Engl J Med., 1989, vol. 320(5), p. 265-271. 

ENDRES, S., MEYDANI, S. N., GHORBANI, R., SCHINDLER, R., DINARELLO, C. 

A. Dietary Supplementation with N-3 Fatty Acids Suppresses Interleukin-2 Production and 

Mononuclear Cell Proliferation. J Leukoc Biol., 1993, vol. 54(6), p. 599-603. 

ENGLISH, D. Phosphatidic Acid: A Lipid Messenger Involved in Intracellular and 

Extracellular Signalling. Cell Signal., 1996, vol. 8(5), p. 341-347. 

ERICKSON, K. L., MCNEILL, C. J., GERSHWIN, M. E., OSSMANN, J. B. Influence of 

Dietary Fat Concentration and Saturation on Immune Ontogeny in Mice. J Nutr., 1980, vol. 

110(8), p. 1555-1572. 

EXTON, J.H. Phospholipase D: enzymology, mechanisms of regulation, and function. 

Physiol. Rev., 1997a, vol 77 (2), p. 303-320. 

EXTON, J.H. New developments in phospholipase D. J. Biol. Chem., 1997b, vol 272 (25), p. 

15579-15582. 

EXTON, J. H. Regulation of Phospholipase D. FEBS Lett., 2002, vol. 531(1), p. 58-61. 

FERNANDO, K. C., GARGETT, C. E., WILEY, J. S. Activation of the P2z/P2x7 Receptor 

in Human Lymphocytes Produces a Delayed Permeability Lesion: Involvement of 

Phospholipase D. Arch Biochem Biophys., 1999, vol. 362(2), p. 197-202. 

FIELDING, C. J., FIELDING, P. E. Relationship between Cholesterol Trafficking and 

Signaling in Rafts and Caveolae. Biochim Biophys Acta., 2003, vol. 1610(2), p. 219-228. 

FOSTER, D. A., XU, L. Phospholipase D in Cell Proliferation and Cancer. Mol Cancer 

Res., 2003, vol. 1(11), p. 789-800. 

174

FOWLER, K. H., MCMURRAY, D. N., FAN, Y. Y., AUKEMA, H. M., CHAPKIN, R. S. 

Purified Dietary N-3 Polyunsaturated Fatty Acids Alter Diacylglycerol Mass and Molecular 

Species Composition in Concanavalin a-Stimulated Murine Splenocytes. Biochim Biophys 

Acta., 1993, vol. 1210(1), p. 89-96. 

FRA, A. M., WILLIAMSON, E., SIMONS, K., PARTON, R. G. Detergent-Insoluble 

Glycolipid Microdomains in Lymphocytes in the Absence of Caveolae. J Biol Chem., 1994, 

vol. 269(49), p. 30745-30748. 

FREYBERG, Z., SWEENEY, D., SIDDHANTA, A., BOURGOIN, S., FROHMAN, M., 

SHIELDS, D. Intracellular Localization of Phospholipase D1 in Mammalian Cells. Mol Biol 

Cell., 2001, vol. 12(4), p. 943-955. 

FRIDRIKSSON, E. K., SHIPKOVA, P. A., SHEETS, E. D., HOLOWKA, D., BAIRD, 

B., MCLAFFERTY, F. W. Quantitative Analysis of Phospholipids in Functionally 

Important Membrane Domains from Rbl-2h3 Mast Cells Using Tandem High-Resolution 

Mass Spectrometry. Biochemistry., 1999, vol. 38(25), p. 8056-8063. 

FROHMAN, M. A., SUNG, T. C., MORRIS, A. J. Mammalian Phospholipase D Structure 

and Regulation. Biochim Biophys Acta., 1999, vol. 1439(2), p. 175-186. 

FUKAMI, K., TAKENAWA, T. Phosphatidic Acid That Accumulates in Platelet-Derived 

Growth Factor-Stimulated Balb/C 3t3 Cells Is a Potential Mitogenic Signal. J Biol Chem., 

1992, vol. 267(16), p. 10988-10993. 

GASMAN, S., CHASSEROT-GOLAZ, S., BADER, M. F., VITALE, N. Regulation of 

Exocytosis in Adrenal Chromaffin Cells: Focus on Arf and Rho Gtpases. Cell Signal., 2003, 

vol. 15(10), p. 893-839. 

GENY, B., COCKCROFT, S. Synergistic Activation of Phospholipase D by Protein Kinase 

C- and G-Protein-Mediated Pathways in Streptolysin O-Permeabilized Hl60 Cells. Biochem 

J. 1992, vol. 284 ( Pt 2), p. 531-538. 

175

GENY, B., FENSOME, A., COCKCROFT, S. Rat Brain Cytosol Contains a Factor Which 

Reconstitutes Guanine-Nucleotide-Binding-Protein-Regulated Phospholipase-D Activation in 

Hl60 Cells Previously Permeabilized with Streptolysin O. Eur J Biochem., 1993, vol. 215(2), 

p. 389-396. 

GIL, A. Polyunsaturated Fatty Acids and Inflammatory Diseases. Biomed Pharmacother., 

2002, vol. 56(8), p. 388-96. 

GILBERT, J. J., PETTITT, T. R., SEATTER, S. D., REID, S. D., WAKELAM, M. J., 

HARNETT, M. M. Antagonistic Roles for Phospholipase D Activities in B Cell Signaling: 

While the Antigen Receptors Transduce Mitogenic Signals Via a Novel Phospholipase D 

Activity, Phosphatidylcholine-Phospholipase D Mediates Antiproliferative Signals. J 

Immunol., 1998, vol. 161(12), p. 6575-6584. 

GILSON, M. K., STRAATSMA, T. P., MCCAMMON, J. A., RIPOLL, D. R., 

FAERMAN, C. H., AXELSEN, P. H., SILMAN, I., SUSSMAN, J. L. Open "Back Door" 

in a Molecular Dynamics Simulation of Acetylcholinesterase. Science., 1994, vol. 263(5151), 

p. 1276-1280. 

GOLDSBY, R. A., KINDT, T.J, OSBORNE, B.A. Kuby immunology. New York, fourth 

edition New York. W H Freeman and Company, 2000. 

GOMEZ-MUNOZ, A., MARTIN, A., O'BRIEN, L., BRINDLEY, D. N. Cell-Permeable 

Ceramides Inhibit the Stimulation of DNA Synthesis and Phospholipase D Activity by 

Phosphatidate and Lysophosphatidate in Rat Fibroblasts. J Biol Chem., 1994, vol. 269(12), p. 

8937-8943. 

GORODINSKY, A., HARRIS, D. A. Glycolipid-Anchored Proteins in Neuroblastoma Cells 

Form Detergent-Resistant Complexes without Caveolin. J Cell Biol., 1995, vol. 129(3), p. 

619-627. 

GRIMMINGER, F., GRIMM, H., FUHRER, D., PAPAVASSILIS, C., LINDEMANN, 

G., BLECHER, C., MAYER, K., TABESCH, F., KRAMER, H. J., STEVENS, J., 

SEEGER, W. Omega-3 Lipid Infusion in a Heart Allotransplant Model. Shift in Fatty Acid 

176

and Lipid Mediator Profiles and Prolongation of Transplant Survival. Circulation., 1996, vol. 

93(2), p. 365-371. 

GUSTAVSSON, L., HANSSON, E. Stimulation of Phospholipase D Activity by Phorbol 

Esters in Cultured Astrocytes. J Neurochem., 1990, vol. 54(3), p. 737-742. 

HA, K. S., EXTON, J. H. Activation of Actin Polymerization by Phosphatidic Acid Derived 

from Phosphatidylcholine in Iic9 Fibroblasts. J Cell Biol., 1993, vol. 123(6 Pt 2), p. 1789- 

1796. 

HA, K. S., YEO, E. J., EXTON, J. H. Lysophosphatidic Acid Activation of 

Phosphatidylcholine-Hydrolysing Phospholipase D and Actin Polymerization by a Pertussis 

Toxin-Sensitive Mechanism. Biochem J., 1994, vol. 303 ( Pt 1), p. 55-59. 

HAMMOND, S. M., ALTSHULLER, Y. M., SUNG, T. C., RUDGE, S. A., ROSE, K., 

ENGEBRECHT, J., MORRIS, A. J., FROHMAN, M. A. Human Adp-Ribosylation 

Factor-Activated Phosphatidylcholine-Specific Phospholipase D Defines a New and Highly 

Conserved Gene Family. J Biol Chem., 1995, vol. 270(50), p. 29640-29643. 

HAMMOND, S. M., JENCO, J. M., NAKASHIMA, S., CADWALLADER, K., GU, Q., 

COOK, S., NOZAWA, Y., PRESTWICH, G. D., FROHMAN, M. A., MORRIS, A. J. 

Characterization of Two Alternately Spliced Forms of Phospholipase D1. Activation of the 

Purified Enzymes by Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate, Adp-Ribosylation Factor, and 

Rho Family Monomeric Gtp-Binding Proteins and Protein Kinase C-Alpha. J Biol Chem., 

1997, vol. 272(6), p. 3860-3868. 

HAN, J. M., KIM, J. H., LEE, B. D., LEE, S. D., KIM, Y., JUNG, Y. W., LEE, S., CHO, 

W., OHBA, M., KUROKI, T., SUH, P. G., RYU, S. H. Phosphorylation-Dependent 

Regulation of Phospholipase D2 by Protein Kinase C Delta in Rat Pheochromocytoma Pc12 

Cells. J Biol Chem., 2002, vol. 277(10), p. 8290-8297. 

HANAHAN, D. J., CHAIKOFF, I. L. A New Phospholipid-Splitting Enzyme Specific for the 

Ester Linkage between the Nitrogenous Base and the Phosphoric Acid Grouping. J Biol 

Chem., 1947, vol. 169, p. 699-705. 

177

HAREL, M., SCHALK, I., EHRET-SABATIER, L., BOUET, F., GOELDNER, M., 

HIRTH, C., AXELSEN, P. H., SILMAN, I., SUSSMAN, J. L. Quaternary Ligand Binding 

to Aromatic Residues in the Active-Site Gorge of Acetylcholinesterase. Proc Natl Acad Sci 

USA., 1993, vol. 90(19), p. 9031-5. 

HARRIS, T. J., SIU, C. H. Reciprocal Raft-Receptor Interactions and the Assembly of 

Adhesion Complexes. Bioessays., 2002, vol. 24(11), p. 996-1003. 

HILALI, M., CHARROUF, Z., SOULHI AEL, A., HACHIMI, L., GUILLAUME, D. 

Influence of Origin and Extraction Method on Argan Oil Physico-Chemical Characteristics 

and Composition. J Agric Food Chem., 2005, vol. 53(6), p. 2081-2087. 

HINCHLIFFE, K. A., CIRUELA, A., IRVINE, R. F. Pipkins1, Their Substrates and Their 

Products: New Functions for Old Enzymes. Biochim Biophys Acta., 1998, vol. 1436(1-2), p. 

87-104. 

HODGKIN, M. N., CLARK, J. M., ROSE, S., SAQIB, K., WAKELAM, M. J. 

Characterization of the Regulation of Phospholipase D Activity in the Detergent-Insoluble 

Fraction of Hl60 Cells by Protein Kinase C and Small G-Proteins. Biochem J., 1999, vol. 339 

( Pt 1), p. 87-93. 

HODGKIN, M. N., MASSON, M. R., POWNER, D., SAQIB, K. M., PONTING, C. P., 

WAKELAM, M. J. Phospholipase D Regulation and Localisation Is Dependent Upon a 

Phosphatidylinositol 4,5-Biphosphate-Specific Ph Domain. Curr Biol., 2000, vol. 10(1), p.43- 

46. 

HOER, A., CETINDAG, C., OBERDISSE, E. Influence of Phosphatidylinositol 4,5- 

Bisphosphate on Human Phospholipase D1 Wild-Type and Deletion Mutants: Is There 

Evidence for an Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate with the Putative 

Pleckstrin Homology Domain? Biochim Biophys Acta., 2000, vol. 1481(1), p. 189-201. 

HOPE, H. R., PIKE, L. J. Phosphoinositides and Phosphoinositide-Utilizing Enzymes in 

Detergent-Insoluble Lipid Domains. Mol Biol Cell., 1996, vol. 7(6), p. 843-851. 

178

HOREJSI, V. The Roles of Membrane Microdomains (Rafts) in T Cell Activation. Immunol 

Rev., 2003, vol. 191, p. 148-164. 

HUG, H., SARRE, T. F. Protein Kinase C Isoenzymes: Divergence in Signal Transduction? 

Biochem J., 1993, vol. 291 ( Pt 2), p. 329-343. 

HUGHES, D. A., PINDER, A. C. Influence of N-3 Polyunsaturated Fatty Acids (Pufa) on 

the Antigen-Presenting Function of Human Monocytes. Biochem Soc Trans., 1996, vol. 24(3), 

p. 389S. 

HUGHES, D. A., PINDER, A. C., PIPER, Z., JOHNSON, I. T., LUND, E. K. Fish Oil 

Supplementation Inhibits the Expression of Major Histocompatibility Complex Class Ii 

Molecules and Adhesion Molecules on Human Monocytes. Am J Clin Nutr., 1996, vol. 63(2), 

p. 267-272. 

ILANGUMARAN, S., HE, H. T., HOESSLI, D. C. Microdomains in Lymphocyte 

Signalling: Beyond Gpi-Anchored Proteins. Immunol Today., 2000, vol. 21(1), p. 2-7. 

ITO, Y., NAKASHIMA, S., NOZAWA, Y. Hydrogen Peroxide-Induced Phospholipase D 

Activation in Rat Pheochromocytoma Pc12 Cells: Possible Involvement of Ca2+-Dependent 

Protein Tyrosine Kinase. J Neurochem., 1997, vol. 69(2), p. 729-36. 

IWASAKI, Y., HORIIKE, S., MATSUSHIMA, K., YAMANE, T. Location of the 

Catalytic Nucleophile of Phospholipase D of Streptomyces Antibioticus in the C-Terminal 

Half Domain. Eur J Biochem., 1999, vol. 264(2), p. 577-581. 

IYER, S. S., KUSNER, D. J. Association of Phospholipase D Activity with the Detergent- 

Insoluble Cytoskeleton of U937 Promonocytic Leukocytes. J Biol Chem., 1999, vol. 274(4), p. 

2350-2359. 

JAKEN, S. Protein Kinase C Isozymes and Substrates. Curr Opin Cell Biol., 1996, vol. 8(2), 

p. 168-173. 

179

JAMAL, Z., MARTIN, A., GOMEZ-MUNOZ, A., BRINDLEY, D. N. Plasma Membrane 

Fractions from Rat Liver Contain a Phosphatidate Phosphohydrolase Distinct from That in 

the Endoplasmic Reticulum and Cytosol. J Biol Chem., 1991, vol. 266(5), p. 2988-2996. 

JANEWAY, C., CHARLES, A., TRAVERS, P., WALPORT, M., SHLOMCHIK, M. 

Immunobiology 5 : the immune system in health and disease. New York and London: Garland 

Publishing. 2001, 5th ed. 

JEFFERY, N. M., CORTINA, M., NEWSHOLME, E. A., CALDER, P. C. Effects of 

Variations in the Proportions of Saturated, Monounsaturated and Polyunsaturated Fatty 

Acids in the Rat Diet on Spleen Lymphocyte Functions. Br J Nutr., 1997, vol. 77(5), p. 805- 

823. 

JEFFERY, NM., SANDERSON, P., NEWSHOLME, EA., CALDER, PC. Characteristics 

of lipid and lymphocytes collected from the lymph of rats fed a low fat diet rich in n-6 or n-3 

polyunsatured fatty acids. Nutr Res., 1998, vol. 18, p. 299-308. 

JEFFERY, N. M., SANDERSON, P., SHERRINGTON, E. J., NEWSHOLME, E. A., 

CALDER, P. C. The Ratio of N-6 to N-3 Polyunsaturated Fatty Acids in the Rat Diet Alters 

Serum Lipid Levels and Lymphocyte Functions. Lipids., 1996a, vol. 31(7), p. 737-745. 

JEFFERY, N. M., YAQOOB, P., NEWSHOLME, E. A., CALDER, P. C. The Effects of 

Olive Oil Upon Rat Serum Lipid Levels and Lymphocyte Functions Appear to Be Due to Oleic 

Acid. Ann Nutr Metab., 1996b, vol. 40(2), p. 71-80. 

JENCO, J. M., RAWLINGSON, A., DANIELS, B., MORRIS, A. J. Regulation of 

Phospholipase D2: Selective Inhibition of Mammalian Phospholipase D Isoenzymes by 

Alpha- and Beta-Synucleins. Biochemistry., 1998, vol. 37(14), p. 4901-4909. 

JENKINS, G. H., FISETTE, P. L., ANDERSON, R. A. Type I Phosphatidylinositol 4- 

Phosphate 5-Kinase Isoforms Are Specifically Stimulated by Phosphatidic Acid. J Biol Chem., 

1994, vol. 269(15), p. 11547-11554. 

180

JIANG, C., TING, A. T., SEED, B. Ppar-Gamma Agonists Inhibit Production of Monocyte 

Inflammatory Cytokines. Nature., 1998, vol. 391(6662), p. 82-86. 

JIANG, H., ALEXANDROPOULOS, K., SONG, J., FOSTER, D. A. Evidence That V- 

Src-Induced Phospholipase D Activity Is Mediated by a G Protein. Mol Cell Biol., 1994, vol. 

14(6), p. 3676-3682. 

JOLLY, C. A., JIANG, Y. H., CHAPKIN, R. S., MCMURRAY, D. N. Dietary (N-3) 

Polyunsaturated Fatty Acids Suppress Murine Lymphoproliferation, Interleukin-2 Secretion, 

and the Formation of Diacylglycerol and Ceramide. J Nutr., 1997, vol. 127(1), p. 37-43. 

JONES, M. J., MURRAY, A. W. Evidence That Ceramide Selectively Inhibits Protein 

Kinase C-Alpha Translocation and Modulates Bradykinin Activation of Phospholipase D. J 

Biol Chem., 1995, vol. 270(10), p. 5007-5013. 

JOULAIN, C., MESKINI, N., ANKER, G., LAGARDE, M., PRIGENT, A. F. 

Esterification of 12(S)-Hydroxy-5,8,10,14-Eicosatetraenoic Acid into the Phospholipids of 

Human Peripheral Blood Mononuclear Cells: Inhibition of the Proliferative Response. J Cell 

Physiol., 1995, vol. 164(1), p. 154-163. 

JUMP, D. B., CLARKE, S. D., THELEN, A., LIIMATTA, M., REN, B., BADIN, M. 

Dietary Polyunsaturated Fatty Acid Regulation of Gene Transcription. Prog Lipid Res.1996, 

vol. 35(3), p. 227-241. 

JUMP, D. B., REN, B., CLARKE, S., THELEN, A. Effects of Fatty Acids on Hepatic Gene 

Expression. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids., 1995, vol. 52(2-3), p. 107-111. 

KAM, Y., EXTON, J. H. Phospholipase D Activity Is Required for Actin Stress Fiber 

Formation in Fibroblasts. Mol Cell Biol., 2001, vol. 21(12), p. 4055-4066. 

KANE, L. P., LIN, J., WEISS, A. Signal Transduction by the Tcr for Antigen. Curr Opin 

Immunol., 2000, vol. 12(3), p. 242-249. 

181

KASAI, T., OHGUCHI, K., NAKASHIMA, S., ITO, Y., NAGANAWA, T., KONDO, N., 

NOZAWA, Y. Increased Activity of Oleate-Dependent Type Phospholipase D During 

Actinomycin D-Induced Apoptosis in Jurkat T Cells. J Immunol., 1998, vol. 161(12), p. 6469- 

6474. 

KATAYAMA, K., KODAKI, T., NAGAMACHI, Y., YAMASHITA, S. Cloning, 

Differential Regulation and Tissue Distribution of Alternatively Spliced Isoforms of Adp- 

Ribosylation-Factor-Dependent Phospholipase D from Rat Liver. Biochem J., 1998, vol. 329 

( Pt 3), p. 647-652. 

KELLEY, D. S. Modulation of Human Immune and Inflammatory Responses by Dietary 

Fatty Acids. Nutrition., 2001, vol. 17(7-8), p. 669-673. 

KELLY, J. P., PARKER, C.W. Effects of Arachidonic Acid and Other Unsaturated Fatty 

Acids on Mitogenesis in Human Lymphocytes. J. Immunol., 1979, vol. 122(4), p. 1556-1562. 

KERSTEN, S., DESVERGNE, B., WAHLI, W. Roles of Ppars in Health and Disease. 

Nature., 2000, vol. 405(6785), p. 421-424. 

KESSELS, G. C., ROOS, D., VERHOEVEN, A. J. Fmet-Leu-Phe-Induced Activation of 

Phospholipase D in Human Neutrophils. Dependence on Changes in Cytosolic Free Ca2+ 

Concentration and Relation with Respiratory Burst Activation. J Biol Chem., 1991, vol. 

266(34), p. 23152-23156. 

KEYS, A., MENOTTI, A., KARVONEN, M. J., ARAVANIS, C., BLACKBURN, H., 

BUZINA, R., DJORDJEVIC, B. S., DONTAS, A. S., FIDANZA, F., KEYS, M. H., ET 

AL. The Diet and 15-Year Death Rate in the Seven Countries Study. Am J Epidemiol., 1986, 

vol. 124(6), p. 903-915. 

KHALLOUKI, F., YOUNOS, C., SOULIMANI, R., OSTER, T., CHARROUF, Z., 

SPIEGELHALDER, B., BARTSCH, H., OWEN, R. W. Consumption of Argan Oil 

(Morocco) with Its Unique Profile of Fatty Acids, Tocopherols, Squalene, Sterols and 

Phenolic Compounds Should Confer Valuable Cancer Chemopreventive Effects. Eur J Cancer 

Prev., 2003, vol. 12(1), p. 67-75. 

182

KHAN, N. A., HICHAMI, A. Ionotrophic 5-Hydroxytryptamine Type 3 Receptor Activates 

the Protein Kinase C-Dependent Phospholipase D Pathway in Human T-Cells. Biochem J., 

1999, vol. 344 Pt 1, p. 199-204. 

KIM, J. H., HAN, J. M., LEE, S., KIM, Y., LEE, T. G., PARK, J. B., LEE, S. D., SUH, 

P. G., RYU, S. H. Phospholipase D1 in Caveolae: Regulation by Protein Kinase Calpha and 

Caveolin-1. Biochemistry., 1999a, vol. 38(12), p. 3763-3769. 

KIM, J. H., KIM, Y., LEE, S. D., LOPEZ, I., ARNOLD, R. S., LAMBETH, J. D., SUH, 

P. G., RYU, S. H. Selective Activation of Phospholipase D2 by Unsaturated Fatty Acid. 

FEBS Lett., 1999b, vol. 454(1-2), p. 42-46. 

KIM, Y., HAN, J. M., HAN, B. R., LEE, K. A., KIM, J. H., LEE, B. D., JANG, I. H., 

SUH, P. G., RYU, S. H. Phospholipase D1 Is Phosphorylated and Activated by Protein 

Kinase C in Caveolin-Enriched Microdomains within the Plasma Membrane. J Biol Chem., 

2000, vol. 275(18), p. 13621-13627. 

KINSELLA, J. E., LOKESH, B., BROUGHTON, S., WHELAN, J. Dietary 

Polyunsaturated Fatty Acids and Eicosanoids: Potential Effects on the Modulation of 

Inflammatory and Immune Cells: An Overview. Nutrition., 1990, vol. 6(1), p. 24-44. 

KISHIMOTO, A., TAKAI, Y., MORI, T., KIKKAWA, U., NISHIZUKA, Y. Activation of 

Calcium and Phospholipid-Dependent Protein Kinase by Diacylglycerol, Its Possible 

Relation to Phosphatidylinositol Turnover. J Biol Chem., 1980, vol. 255(6), p. 2273-2276. 

KISS, Z., TOMONO, M. Wortmannin Has Opposite Effects on Phorbol Ester-Induced DNA 

Synthesis and Phosphatidylcholine Hydrolysis. FEBS Lett., 1995, vol. 371(2), p. 185-187. 

KLEIN, J., CHALIFA, V., LISCOVITCH, M. Role of phospholipase D activation in the 

nervous system. Physio and Pathophysio., 1995, vol. 65, p. 1445-1455. 

KODAKI, T., YAMASHITA, S. Cloning, Expression, and Characterization of a Novel 

Phospholipase D Complementary DNA from Rat Brain. J Biol Chem., 1997, vol. 272(17), p. 

11408-11413. 

183

KOMATI, H., MINASI, A., NARO, F., LAGARDE, M., PRIGENT, A. F., ADAMO, S., 

NEMOZ, G. Phorbol ester-induced differentiation of L6 myogenic cells involves 

phospholipase D activation. FEBS Lett., 2004, vol 577(3), p. 409-414. 

KOMATI, H., NARO, F., MEBAREK, S., DE ARCANGELIS, V., ADAMO, S., 

LAGARDE, M., PRIGENT, A. F., NEMOZ, G. Phospholipase D Is Involved in Myogenic 

Differentiation through Remodeling of Actin Cytoskeleton. Mol Biol Cell., 2005, vol. 16(3), p. 

1232-1244. 

KONDO, T., INUI, H., KONISHI, F., INAGAMI, T. Phospholipase D Mimics Platelet- 

Derived Growth Factor as a Competence Factor in Vascular Smooth Muscle Cells. J Biol 

Chem., 1992, vol. 267(33), p. 23609-23616. 

KOTTER, K., JIN, S., KLEIN, J. Inhibition of Astroglial Cell Proliferation by Alcohols: 

Interference with the Protein Kinase C-Phospholipase D Signaling Pathway. Int J Dev 

Neurosci., 2000, vol. 18(8), p. 825-831. 

KOTTER, K., KLEIN, J. Ethanol Inhibits Astroglial Cell Proliferation by Disruption of 

Phospholipase D-Mediated Signaling. J Neurochem., 1999, vol. 73(6), p. 2517-2523. 

KOVBASNJUK, O., EDIDIN, M., DONOWITZ, M. Role of Lipid Rafts in Shiga Toxin 1 

Interaction with the Apical Surface of Caco-2 Cells. J Cell Sci., 2001, vol. 114(Pt 22), p. 

4025-4031. 

KREMER, J. M., LAWRENCE, D. A., JUBIZ, W., DIGIACOMO, R., RYNES, R., 

BARTHOLOMEW, L. E., SHERMAN, M. Dietary Fish Oil and Olive Oil 

Supplementation in Patients with Rheumatoid Arthritis. Clinical and Immunologic Effects. 

Arthritis Rheum., 1990, vol. 33(6), p. 810-820. 

KTISTAKIS, N. T., BROWN, H. A., STERNWEIS, P. C., ROTH, M. G. Phospholipase 

D Is Present on Golgi-Enriched Membranes and Its Activation by Adp Ribosylation Factor Is 

Sensitive to Brefeldin A. Proc Natl Acad Sci U S A., 1995, vol. 92(11), p. 4952-4956. 

184

KTISTAKIS, N. T., BROWN, H. A., WATERS, M. G., STERNWEIS, P. C., ROTH, M. 

G. Evidence That Phospholipase D Mediates Adp Ribosylation Factor-Dependent Formation 

of Golgi Coated Vesicles. J Cell Biol., 1996, vol. 134(2), p. 295-306. 

KUBLER, E., DOHLMAN, H. G., LISANTI, M. P. Identification of Triton X-100 Insoluble 

Membrane Domains in the Yeast Saccharomyces Cerevisiae. Lipid Requirements for 

Targeting of Heterotrimeric G-Protein Subunits. J Biol Chem., 1996, vol. 271(51), p. 32975- 

32980. 

KURIBARA, H., TAGO, K., YOKOZEKI, T., SASAKI, T., TAKAI, Y., MORII, N., 

NARUMIYA, S., KATADA, T., KANAHO, Y. Synergistic Activation of Rat Brain 

Phospholipase D by Adp-Ribosylation Factor and Rhoa P21, and Its Inhibition by 

Clostridium Botulinum C3 Exoenzyme. J Biol Chem., 1995, vol. 270(43), p. 25667-25671. 

KUMAR, GS., DAS, UN., KUMAR, KV., MADHAVI, N., DAS, NP., TAN, BKH. Effect 

of n-6 and n-3 fatty acids on the proliferation of human lymphocytes and their secretion of 

TNF-α and IL-2 in vitro. Nutr Res., 1992, vol. 12, p. 815-823. 

LEE C, K. H., CHUNG JK, SEKIYA F, KIM JR, HAN JS, KIM SR, BAE YS, MORRIS 

AJ, SG., R. Inhibition of Phospholipase D by Clathrin Assembly Protein 3 (Ap3). J Biol 

Chem., 1997a, vol. 272.(25), p. 15986-15992. 

LEE, T.W., COTECCHIA, S., MILLIGAN, G. Up-regulation of the levels of expression 

and function of a constitutively active mutant of the hamster alpha1B-adrenoceptor by ligands 

that act as inverse agonists. Biochem J., 1997b, vol 325 ( Pt 3), p. 733-739 

LEE, C., KIM, S. R., CHUNG, J. K., FROHMAN, M. A., KILIMANN, M. W., RHEE, S. 

G. Inhibition of Phospholipase D by Amphiphysins. J Biol Chem.2000, vol. 275(25), p. 

18751-18758. 

LEE, K. H., HOLDORF, A. D., DUSTIN, M. L., CHAN, A. C., ALLEN, P. M., SHAW, 

A. S. T Cell Receptor Signaling Precedes Immunological Synapse Formation. Science., 2002, 

vol. 295(5559), p. 1539-1542. 

185

LEIROS, I., SECUNDO, F., ZAMBONELLI, C., SERVI, S., HOUGH, E. The First 

Crystal Structure of a Phospholipase D. Structure, 2000, vol. 8(6), p. 655-667. 

LEO, A., WIENANDS, J., BAIER, G., HOREJSI, V., SCHRAVEN, B. Adapters in 

Lymphocyte Signaling. J Clin Invest., 2002, vol. 109(3), p. 301-309. 

LEVENTIS, R., SILVIUS, J. R. Use of Cyclodextrins to Monitor Transbilayer Movement 

and Differential Lipid Affinities of Cholesterol. Biophys J., 2001, vol. 81(4), p. 2257-2267. 

LIANG, X., NAZARIAN, A., ERDJUMENT-BROMAGE, H., BORNMANN, W., 

TEMPST, P., RESH, M. D. Heterogeneous Fatty Acylation of Src Family Kinases with 

Polyunsaturated Fatty Acids Regulates Raft Localization and Signal Transduction. J Biol 

Chem., 2001, vol. 276(33), p. 30987-30994. 

LINOS, A., KAKLAMANIS, E., KONTOMERKOS, A., KOUMANTAKI, Y., GAZI, S., 

VAIOPOULOS, G., TSOKOS, G. C., KAKLAMANIS, P. The Effect of Olive Oil and Fish 

Consumption on Rheumatoid Arthritis--a Case Control Study. Scand J Rheumatol., 1991, vol. 

20(6), p. 419-426. 

LISCOVITCH, M., CHALIFA, V., DANIN, M., ELI, Y. Inhibition of Neural 

Phospholipase D Activity by Aminoglycoside Antibiotics. Biochem J., 1991, vol. 279 ( Pt 1), 

p. 319-321. 

LISCOVITCH, M., CHALIFA, V., PERTILE, P., CHEN, C. S., CANTLEY, L. C. Novel 

Function of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate as a Cofactor for Brain Membrane 

Phospholipase D. J Biol Chem., 1994, vol. 269(34), p. 21403-21406. 

LISCOVITCH, M., CZARNY, M., FIUCCI, G., LAVIE, Y., TANG, X. Localization and 

Possible Functions of Phospholipase D Isozymes. Biochim Biophys Acta., 1999, vol. 1439(2), 

p. 245-263. 

LISCOVITCH, M., CZARNY, M., FIUCCI, G., TANG, X. Phospholipase D: Molecular 

and Cell Biology of a Novel Gene Family. Biochem J., 2000, vol. 345 (Pt 3), p. 401-415. 

186

LIU, Y., CASEY, L., PIKE, L. J. Compartmentalization of Phosphatidylinositol 4,5- 

Bisphosphate in Low-Density Membrane Domains in the Absence of Caveolin. Biochem 


LIU, Y., GONG, L., LI, D., FENG, Z., ZHAO, L., DONG, T. Effects of Fish Oil on 

Lymphocyte Proliferation, Cytokine Production and Intracellular Signalling in Weanling 

Pigs. Arch Tierernahr., 2003, vol. 57(3), p.151-165. 

LOCNISKAR, M., NAUSS, K. M., NEWBERNE, P. M. The Effect of Quality and Quantity 

of Dietary Fat on the Immune System. J Nutr., 1983, vol. 113(5), p. 951-961. 

LOPEZ, I., ARNOLD, R. S., LAMBETH, J. D. Cloning and Initial Characterization of a 

Human Phospholipase D2 (Hpld2). Adp-Ribosylation Factor Regulates Hpld2. J Biol Chem., 

1998, vol. 273(21), p. 12846-12852. 

LUKOWSKI, S., LECOMTE, M. C., MIRA, J. P., MARIN, P., GAUTERO, H., RUSSO- 

MARIE, F., GENY, B. Inhibition of Phospholipase D Activity by Fodrin. An Active Role for 

the Cytoskeleton. J Biol Chem., 1996, vol. 271(39), p. 24164-24671. 

LUKOWSKI, S., MIRA, J. P., ZACHOWSKI, A., GENY, B. Fodrin Inhibits 

Phospholipases A2, C, and D by Decreasing Polyphosphoinositide Cell Content. Biochem 


MA, D. W., SEO, J., SWITZER, K. C., FAN, Y. Y., MCMURRAY, D. N., LUPTON, J. 

R., CHAPKIN, R. S. N-3 Pufa and Membrane Microdomains: A New Frontier in Bioactive 

Lipid Research. J Nutr Biochem., 2004, vol. 15(11), p. 700-706. 

MADORE, N., SMITH, K. L., GRAHAM, C. H., JEN, A., BRADY, K., HALL, S., 

MORRIS, R. Functionally Different Gpi Proteins Are Organized in Different Domains on 

the Neuronal Surface. Embo J., 1999, vol. 18(24), p. 6917-6926. 

MARCIL, J., HARBOUR, D., NACCACHE, P. H., BOURGOIN, S. Human 

Phospholipase D1 Can Be Tyrosine-Phosphorylated in Hl-60 Granulocytes. J Biol Chem., 

1997, vol. 272(33), p. 20660-20664. 

187

MARSHALL, L. A., JOHNSTON, P. V. The Influence of Dietary Essential Fatty Acids on 

Rat Immunocompetent Cell Prostaglandin Synthesis and Mitogen-Induced Blastogenesis. J 

Nutr., 1985, vol. 115(12), p. 1572-1580. 

MARTIN, T. F. Pi(4,5)P(2) Regulation of Surface Membrane Traffic. Curr Opin Cell Biol., 

2001, vol. 13(4), p. 493-499. 

MARTIN-MORENO, J. M., WILLETT, W. C., GORGOJO, L., BANEGAS, J. R., 

RODRIGUEZ-ARTALEJO, F., FERNANDEZ-RODRIGUEZ, J. C., MAISONNEUVE, 

P., BOYLE, P. Dietary Fat, Olive Oil Intake and Breast Cancer Risk. Int J Cancer., 1994, 

vol. 58(6), p. 774-780. 

MASSENBURG, D., HAN, J. S., LIYANAGE, M., PATTON, W. A., RHEE, S. G., 

MOSS, J., VAUGHAN, M. Activation of Rat Brain Phospholipase D by Adp-Ribosylation 

Factors 1,5, and 6: Separation of Adp-Ribosylation Factor-Dependent and Oleate-Dependent 

Enzymes. Proc Natl Acad Sci U S A., 1994, vol. 91(24), p. 11718-11722. 

MCDERMOTT, M., WAKELAM, M. J., MORRIS, A. J. Phospholipase D. Biochem Cell 

Biol., 2004, vol. 82(1), p. 225-253. 

MEIER, K. E., GIBBS, T. C., KNOEPP, S. M., ELLA, K. M. Expression of Phospholipase 

D Isoforms in Mammalian Cells. Biochim Biophys Acta., 1999, vol. 1439(2), p. 199-213. 

MEYDANI, S. N., ENDRES, S., WOODS, M. M., GOLDIN, B. R., SOO, C., MORRILL- 

LABRODE, A., DINARELLO, C. A.,GORBACH, S. L. Oral (N-3) Fatty Acid 

Supplementation Suppresses Cytokine Production and Lymphocyte Proliferation: 

Comparison between Young and Older Women. J Nutr., 1991, vol. 121(4), p. 547-555. 

MEYDANI, S. N., LICHTENSTEIN, A. H., CORNWALL, S., MEYDANI, M., 

GOLDIN, B. R., RASMUSSEN, H., DINARELLO, C. A., SCHAEFER, E. J. 

Immunologic Effects of National Cholesterol Education Panel Step-2 Diets with and without 

Fish-Derived N-3 Fatty Acid Enrichment. J Clin Invest., 1993, vol. 92(1), p. 105-113. 

188

MILES, E. A., CALDER, P. C. Modulation of Immune Function by Dietary Fatty Acids. 

Proc Nutr Soc., 1998, vol. 57(2), p. 277-292. 

MIN, D. S., PARK, S. K., EXTON, J. H. Characterization of a Rat Brain Phospholipase D 

Isozyme. J Biol Chem., 1998, vol. 273(12), p. 7044-7051. 

MITCHELL, R., MCCULLOCH, D., LUTZ, E., JOHNSON, M., MACKENZIE, C., 

FENNELL, M., FINK, G., ZHOU, W.,SEALFON, S. C. Rhodopsin-Family Receptors 

Associate with Small G Proteins to Activate Phospholipase D. Nature., 1998, vol. 392(6674), 

p. 411-414. 

MONTIXI, C., LANGLET, C., BERNARD, A. M., THIMONIER, J., DUBOIS, C., 

WURBEL, M. A., CHAUVIN, J. P., PIERRES, M., HE, H. T. Engagement of T Cell 

Receptor Triggers Its Recruitment to Low-Density Detergent-Insoluble Membrane Domains. 

Embo J., 1998, vol. 17(18), p. 5334-5348. 

MOOLENAAR, W. H. Lysophosphatidic Acid Signalling. Curr Opin Cell Biol., 1995, vol. 

7(2), p. 203-210. 

MORRIS, A. J., ENGEBRECHT, J., FROHMAN, M. A. Structure and Regulation of 

Phospholipase D. Trends Pharmacol Sci., 1996, vol. 17(5), p. 182-185. 

MORRIS, A. J., FROHMAN, M. A., ENGEBRECHT, J. Measurement of Phospholipase 

D Activity. Anal Biochem., 1997a, vol. 252(1), p. 1-9. 

MORRIS, AJ., HAMMOND, SM., COLLEY, C., SUNG, TC., JENCO, JM., SCIORRA, 

VA., RUDGE, SA., FROHMAN, MA. Regulation and function of phospholipase D. 

Biochem Soc Trans., 1997b, vol. 25, p. 1151-1157. 

MOSMANN, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to 

Proliferation and Cytotoxicity Assays. J Immunol Methods., 1983, vol. 65(1-2), p. 55-63. 

189

MOTOIKE, T., BIEGER, S., WIEGANDT, H., UNSICKER, K. Induction of Phosphatidic 

Acid by Fibroblast Growth Factor in Cultured Baby Hamster Kidney Fibroblasts. FEBS 

Lett., 1993, vol. 332(1-2), p. 164-168. 

MOUSSA, M., LE BOUCHER, J., GARCIA, J., TKACZUK, J., RAGAB, J., DUTOT, 

G., OHAYON, E., GHISOLFI, J., THOUVENOT, J. P. In Vivo Effects of Olive Oil-Based 

Lipid Emulsion on Lymphocyte Activation in Rats. Clin Nutr., 2000, vol. 19(1), p. 49-54. 

MUFSON, R. A., OKIN, E., WEINSTEIN, I. B. Phorbol Esters Stimulate the Rapid 

Release of Choline from Prelabelled Cells. Carcinogenesis., 1981, vol. 2(11), p. 1095-1102. 

NAKAMURA, T., ABE, A., BALAZOVICH, K. J., WU, D., SUCHARD, S. J., BOXER, 

L. A., SHAYMAN, J. A. Ceramide Regulates Oxidant Release in Adherent Human 

Neutrophils. J Biol Chem., 1994, vol. 269(28), p. 18384-18389. 

NAKAMURA, Y., NAKASHIMA, S., OJIO, K., BANNO, Y., MIYATA, H., NOZAWA, 

Y. Ceramide Inhibits Ige-Mediated Activation of Phospholipase D, but Not of Phospholipase 

C, in Rat Basophilic Leukemia (Rbl-2h3) Cells. J Immunol., 1996, vol. 156(1), p. 256-262. 

NAKASHIMA, S., IWASAKI, Y., MIZUTANI, T., OHGUCHI, K., NAGATA, K., 

KITAJIMA, Y., NOZAWA, Y. Differential Expression of Protein Kinase C Isozymes and 

Small Gtp-Binding Proteins During Hl60 Cell Differentiation by Retinoic Acid and Cyclic 

Amp: Relation with Phospholipase D (Pld) Activation. Immunobiology., 1996, vol. 196(5), p. 

588-598. 

NAKASHIMA, S., NOZAWA, Y. Possible Role of Phospholipase D in Cellular 

Differentiation and Apoptosis. Chem Phys Lipids., 1999, vol. 98(1-2), p. 153-164. 

NARO, F., DONCHENKO, V., MINOTTI, S., ZOLLA, L., MOLINARO, M., ADAMO, 

S. Role of Phospholipase C and D Signalling Pathways in Vasopressin-Dependent Myogenic 

Differentiation. J Cell Physiol., 1997, vol. 171(1), p. 34-42. 

NISHIZUKA, Y. Membrane Phospholipid Degradation and Protein Kinase C for Cell 

Signalling. Neurosci Res., 1992, vol. 15(1-2), p. 3-5. 

190

NISHIZUKA, Y. The Molecular Heterogeneity of Protein Kinase C and Its Implications for 

Cellular Regulation. Nature., 1988, vol. 334(6184), p. 661-5. 

NOH, D. Y., AHN, S. J., LEE, R. A., PARK, I. A., KIM, J. H., SUH, P. G., RYU, S. H., 

LEE, K. H., HAN, J. S. Overexpression of Phospholipase D1 in Human Breast Cancer 

Tissues. Cancer Lett., 2000, vol. 161(2), p .207-214. 

OHGUCHI, K., BANNO, Y., NAKASHIMA, S., NOZAWA, Y. Activation of Membrane- 

Bound Phospholipase D by Protein Kinase C in Hl60 Cells: Synergistic Action of a Small 

Gtp-Binding Protein Rhoa. Biochem Biophys Res Commun., 1995, vol. 211(1), p. 306-311. 

OHGUCHI, K., BANNO, Y., NAKASHIMA, S., NOZAWA, Y. Regulation of Membrane- 

Bound Phospholipase D by Protein Kinase C in Hl60 Cells. Synergistic Action of Small Gtp- 

Binding Protein Rhoa. J Biol Chem., 1996b, vol. 271(8), p. 4366-4372. 

OHGUCHI, K., BANNO, Y., NAKASHIMA, S., KATO, N., WATANABLE, K., 

LYERLY, DM., NOZAWA, Y. Effects of clostridium difficile toxin A and toxin B on 

phospholipase D activation in human promyelocytic leukemic HL-60 cells. Infect Immun., 

1996a, vol. 64, p. 4433-4437. 

OKAMOTO, T., SCHLEGEL, A., SCHERER, P. E., LISANTI, M. P. Caveolins, a 

Family of Scaffolding Proteins for Organizing "Preassembled Signaling Complexes" at the 

Plasma Membrane. J Biol Chem., 1998, vol. 273(10), p. 5419-5422. 

OKAMURA, S., YAMASHITA, S. Purification and Characterization of 

Phosphatidylcholine Phospholipase D from Pig Lung. J Biol Chem., 1994, vol. 269(49), p. 

31207-31213. 

OLSON, S. C., BOWMAN, E. P., LAMBETH, J. D. Phospholipase D Activation in a Cell- 

Free System from Human Neutrophils by Phorbol 12-Myristate 13-Acetate and Guanosine 5'- 

O-(3-Thiotriphosphate). Activation Is Calcium Dependent and Requires Protein Factors in 

Both the Plasma Membrane and Cytosol. J Biol Chem., 1991, vol. 266(26), p. 17236-17242. 

191

PAI, J. K., DOBEK, E. A., BISHOP, W. R. Endothelin-1 Activates Phospholipase D and 

Thymidine Incorporation in Fibroblasts Overexpressing Protein Kinase C Beta 1. Cell 

Regul., 1991, vol. 2(11), p. 897-903. 

PAI, J. K., SIEGEL, M. I., EGAN, R. W., BILLAH, M. M. Phospholipase D Catalyzes 

Phospholipid Metabolism in Chemotactic Peptide-Stimulated Hl-60 Granulocytes. J Biol 

Chem., 1988, vol. 263(25), p. 12472-12477. 

PARK, S. K., PROVOST, J. J., BAE, C. D., HO, W. T., EXTON, J. H. Cloning and 

Characterization of Phospholipase D from Rat Brain. J Biol Chem., 1997, vol. 272(46), p. 

29263-29271. 

PARTON, R. G. Caveolae and Caveolins. Curr Opin Cell Biol., 1996, vol. 8(4), p. 542-548. 

PEREZ, R. V., ALEXANDER, J. W. Immune Regulation by Lipids. Transplant Proc., 1988, 

vol. 20(6), p. 1162-1165. 

PERTILE, P., LISCOVITCH, M., CHALIFA, V., CANTLEY, L. C. Phosphatidylinositol 

4,5-Bisphosphate Synthesis Is Required for Activation of Phospholipase D in U937 Cells. J 

Biol Chem., 1995, vol. 270(10), p. 5130-5135. 

PIERCE, S. K. Lipid Rafts and B-Cell Activation. Nat Rev Immunol., 2002, vol. 2(2), p. 96- 

105. 

PIKE, L. J., CASEY, L. Localization and Turnover of Phosphatidylinositol 4,5- 

Bisphosphate in Caveolin-Enriched Membrane Domains. J Biol Chem., 1996, vol. 271(43), p. 

26453-26456. 

PIKE, L. J., MILLER, J. M. Cholesterol Depletion Delocalizes Phosphatidylinositol 

Bisphosphate and Inhibits Hormone-Stimulated Phosphatidylinositol Turnover. J Biol Chem., 

1998, vol. 273(35), p. 22298-22304. 

PIZZO, P., VIOLA, A. Lipid Rafts in Lymphocyte Activation. Microbes Infect., 2004, vol. 

6(7), p. 686-92. 

192

PLEVIN, R., COOK, S. J., PALMER, S., WAKELAM, M. J. Multiple Sources of Sn-1,2- 

Diacylglycerol in Platelet-Derived-Growth-Factor-Stimulated Swiss 3t3 Fibroblasts. 

Evidence for Activation of Phosphoinositidase C and Phosphatidylcholine-Specific 

Phospholipase D. Biochem J., 1991, vol. 279 ( Pt 2), p. 559-565. 

PONTING, C. P., KERR, I. D. A Novel Family of Phospholipase D Homologues That 

Includes Phospholipid Synthases and Putative Endonucleases: Identification of Duplicated 

Repeats and Potential Active Site Residues. Protein Sci., 1996, vol. 5(5), p. 914-922. 

PRINETTI, A., CHIGORNO, V., TETTAMANTI, G., SONNINO, S. Sphingolipid- 

Enriched Membrane Domains from Rat Cerebellar Granule Cells Differentiated in Culture. A 

Compositional Study. J Biol Chem., 2000, vol. 275(16), p. 11658-11665. 

PURKISS, J., MURRIN, R. A., OWEN, P. J., BOARDER, M. R. Lack of Phospholipase D 

Activity in Chromaffin Cells: Bradykinin-Stimulated Phosphatidic Acid Formation Involves 

Phospholipase C in Chromaffin Cells but Phospholipase D in Pc12 Cells. J Neurochem., 

1991, vol. 57(3), p. 1084-1087. 

RACOOSIN, E. L., DAVIES, S. J., PEARCE, E. J. Caveolae-Like Structures in the 

Surface Membrane of Schistosoma Mansoni. Mol Biochem Parasitol., 1999, vol. 104(2), p. 

285-297. 

RANDALL, R. W., BONSER, R. W., THOMPSON, N. T., GARLAND, L. G. A Novel 

and Sensitive Assay for Phospholipase D in Intact Cells. FEBS Lett., 1990, vol. 264(1), p. 87- 

90. 

REINHOLD, SL., PRESCOTT, SM., ZIMMERMAN, GA., MC INTYRE, TM. 

Activation of human neutrophil phospholipase D by three separable mechanisms. FASEB J., 

1990, vol. 4, p. 208-214. 

RICOTE, M., LI, A. C., WILLSON, T. M., KELLY, C. J., GLASS, C. K. The Peroxisome 

Proliferator-Activated Receptor-Gamma Is a Negative Regulator of Macrophage Activation. 

Nature., 1998, vol. 391(6662), p. 79-82. 

193

RIETVELD, A., NEUTZ, S., SIMONS, K., EATON, S. Association of Sterol- and 

Glycosylphosphatidylinositol-Linked Proteins with Drosophila Raft Lipid Microdomains. J 

Biol Chem., 1999, vol. 274(17), p. 12049-12054. 

RUMENAPP, U., GEISZT, M., WAHN, F., SCHMIDT, M., JAKOBS, K. H. Evidence 

for Adp-Ribosylation-Factor-Mediated Activation of Phospholipase D by M3 Muscarinic 

Acetylcholine Receptor. Eur J Biochem., 1995, vol. 234(1), p. 240-244. 

SA, G.,DAS, T. Basic Fibroblast Growth Factor Stimulates Cytosolic Phospholipase A2, 

Phospholipase C-Gamma1 and Phospholipase D through Distinguishable Signaling 

Mechanisms. Mol Cell Biochem., 1999, vol. 198(1-2), p. 19-30. 

SAITO, M., KANFER, J. Phosphatidohydrolase Activity in a Solubilized Preparation from 

Rat Brain Particulate Fraction. Arch Biochem Biophys., 1975, vol. 169(1), p. 318-323. 

SAITO, M., KANFER, J. Solubilization and Properties of a Membrane-Bound Enzyme from 

Rat Brain Catalyzing a Base-Exchange Reaction. Biochem Biophys Res Commun., 1973, vol. 

53(2), p. 391-398. 

SANDERSON, P., YAQOOB, P., CALDER, P. C. Dietary Lipid Modulation of Cell 

Mediated Immunity in the Rat. Biochem Soc Trans., 1995, vol. 23(2), p. 273S. 

SARGIACOMO, M., SUDOL, M., TANG, Z., LISANTI, M. P. Signal Transducing 

Molecules and Glycosyl-Phosphatidylinositol-Linked Proteins Form a Caveolin-Rich 

Insoluble Complex in Mdck Cells. J Cell Biol., 1993, vol. 122(4), p. 789-807. 

SASAKI, T., KANKE, Y., KUDOH, K., MISAWA, Y., SHIMIZU, J., TAKITA, T. 

Effects of Dietary Docosahexaenoic Acid on Surface Molecules Involved in T Cell 

Proliferation. Biochim Biophys Acta., 1999, vol. 1436(3), p. 519-530. 

SCHAFFNER, W., WEISSMANN, C. A Rapid, Sensitive, and Specific Method for the 

Determination of Protein in Dilute Solution. Anal Biochem., 1973, vol. 56(2), p. 502-514. 

194

SCHERER, P. E., OKAMOTO, T., CHUN, M., NISHIMOTO, I., LODISH, H. F., 

LISANTI, M. P. Identification, Sequence, and Expression of Caveolin-2 Defines a Caveolin 

Gene Family. Proc Natl Acad Sci U S A., 1996, vol. 93(1), p. 131-135. 

SCHMIDT, M., VOSS, M., THIEL, M., BAUER, B., GRANNASS, A., TAPP, E., 

COOL, RH., DE GUNZBURG, J., VON EICHEL-STREIBER, C., JACOBS, KH. 

Specific inhibition of phorbol ester-stimulated phospholipase D by clostridium sordelli lethal 

toxin and clostridium difficile toxin B-1470 in HEK-293 cell. J Biol Chem., 1998, vol. 273, p. 

7413-7422. 

SCHOONJANS, K., STAELS, B., AUWERX, J. The Peroxisome Proliferator Activated 

Receptors (Ppars) and Their Effects on Lipid Metabolism and Adipocyte Differentiation. 

Biochim Biophys Acta., 1996, vol. 1302(2), p. 93-109. 

SCHROEDER, R. J., AHMED, S. N., ZHU, Y., LONDON, E., BROWN, D. A. 

Cholesterol and Sphingolipid Enhance the Triton X-100 Insolubility of 

Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Proteins by Promoting the Formation of Detergent- 

Insoluble Ordered Membrane Domains. J Biol Chem., 1998, vol. 273(2), p. 1150-1157. 

SCIORRA, V. A., RUDGE, S. A., PRESTWICH, G. D., FROHMAN, M. A., 

ENGEBRECHT, J., MORRIS, A. J. Identification of a Phosphoinositide Binding Motif 

That Mediates Activation of Mammalian and Yeast Phospholipase D Isoenzymes. Embo J., 

1999, vol. 18(21), p. 5911-5921. 

SHAPIRO, J. A., KOEPSELL, T. D., VOIGT, L. F., DUGOWSON, C. E., KESTIN, M., 

NELSON, J. L. Diet and Rheumatoid Arthritis in Women: A Possible Protective Effect of 

Fish Consumption. Epidemiology., 1996, vol. 7(3), p. 256-263. 

SHENOY-SCARIA, A. M., DIETZEN, D. J., KWONG, J., LINK, D. C., LUBLIN, D. M. 

Cysteine3 of Src Family Protein Tyrosine Kinase Determines Palmitoylation and Localization 

in Caveolae. J Cell Biol., 1994, vol. 126(2), p. 353-363. 

SHIN, J. S., ABRAHAM, S. N. Caveolae as Portals of Entry for Microbes. Microbes Infect., 

2001, vol. 3(9), p. 755-761. 

195

SHIN, J. S., GAO, Z., ABRAHAM, S. N. Involvement of Cellular Caveolae in Bacterial 

Entry into Mast Cells. Science., 2000, vol. 289(5480), p. 785-788. 

SIERRA, S., LARA-VILLOSLADA, F., OLIVARES, M., JIMENEZ, J., BOZA, J., 

XAUS, J. Increased Immune Response in Mice Consuming Rice Bran Oil. Eur J Nutr., 2005, 

vol. 44(8), p. 509-516. 

SILVIUS, J. R. Role of Cholesterol in Lipid Raft Formation: Lessons from Lipid Model 

Systems. Biochim Biophys Acta. 2003, vol. 1610(2), p. 174-183. 

SIMONS, K., EHEHALT, R. Cholesterol, Lipid Rafts, and Disease. J Clin Invest., 2002, 

vol. 110(5), p. 597-603. 

SIMONS, K., IKONEN, E. Functional Rafts in Cell Membranes. Nature., 1997, vol. 

387(6633), p. 569-572. 

SIMONS, K.,TOOMRE, D. Lipid Rafts and Signal Transduction. Nat Rev Mol Cell Biol., 

2000, vol. 1(1), p. 31-39. 

SINGER, S. J., NICOLSON, G. L. The Fluid Mosaic Model of the Structure of Cell 

Membranes. Science., 1972, vol. 175(23), p. 720-731. 

SINGER, W. D., BROWN, H. A., JIANG, X., STERNWEIS, P. C. Regulation of 

Phospholipase D by Protein Kinase C Is Synergistic with Adp-Ribosylation Factor and 

Independent of Protein Kinase Activity. J Biol Chem., 1996, vol. 271(8), p.4504-4510. 

SINGER, W. D., BROWN, H. A., STERNWEIS, P. C. Regulation of Eukaryotic 

Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase C and Phospholipase D. Annu Rev Biochem., 

1997, vol. 66, p. 475-509. 

SLAABY, R., DU, G., ALTSHULLER, Y. M., FROHMAN, M. A., SEEDORF, K. 

Insulin-Induced Phospholipase D1 and Phospholipase D2 Activity in Human Embryonic 

Kidney-293 Cells Mediated by the Phospholipase C Gamma and Protein Kinase C Alpha 

Signalling Cascade. Biochem J., 2000, vol. 351 Pt 3, p. 613-619. 

196

SMART, E. J., GRAF, G. A., MCNIVEN, M. A., SESSA, W. C., ENGELMAN, J. A., 

SCHERER, P. E., OKAMOTO, T., LISANTI, M. P. Caveolins, Liquid-Ordered Domains, 

and Signal Transduction. Mol Cell Biol., 1999, vol. 19(11), p. 7289-7304. 

SONG, J., JIANG, Y. W., FOSTER, D. A. Epidermal Growth Factor Induces the 

Production of Biologically Distinguishable Diglyceride Species from Phosphatidylinositol 

and Phosphatidylcholine Via the Independent Activation of Type C and Type D 

Phospholipases. Cell Growth Differ., 1994, vol. 5(1), p. 79-85. 

SOYLAND, E., NENSETER, M. S., BRAATHEN, L., DREVON, C. A. Very Long Chain 

N-3 and N-6 Polyunsaturated Fatty Acids Inhibit Proliferation of Human T-Lymphocytes in 

Vitro. Eur J Clin Invest., 1993, vol. 23(2), p. 112-121. 

STEED, P. M., CLARK, K. L., BOYAR, W. C., LASALA, D. J. Characterization of 

Human Pld2 and the Analysis of Pld Isoform Splice Variants. Faseb J., 1998, vol. 12(13), p. 

1309-1317. 

STEFANOVA, I., HOREJSI, V. Association of the Cd59 and Cd55 Cell Surface 

Glycoproteins with Other Membrane Molecules. J Immunol., 1991, vol. 147(5), p. 1587-1592. 

STEWART, J. C. Colorimetric Determination of Phospholipids with Ammonium 

Ferrothiocyanate. Anal Biochem., 1980, vol. 104(1), p. 10-14. 

STONEHAM, M., GOLDACRE, M., SEAGROATT, V., GILL, L. Olive Oil, Diet and 

Colorectal Cancer: An Ecological Study and a Hypothesis. J Epidemiol Community Health., 

2000, vol. 54(10), p. 756-760. 

STUCKEY, J. A., DIXON, J. E. Crystal Structure of a Phospholipase D Family Member. 

Nat Struct Biol., 1999, vol. 6(3), p. 278-284. 

STULNIG, T. M. Immunomodulation by Polyunsaturated Fatty Acids: Mechanisms and 

Effects. Int Arch Allergy Immunol., 2003, vol. 132(4), p. 310-321. 

197

STULNIG, T. M., BERGER, M., SIGMUND, T., RAEDERSTORFF, D., 

STOCKINGER, H., WALDHAUSL, W. Polyunsaturated Fatty Acids Inhibit T Cell Signal 

Transduction by Modification of Detergent-Insoluble Membrane Domains. J Cell Biol., 1998, 

vol. 143(3), p. 637-644. 

STULNIG, T. M., HUBER, J., LEITINGER, N., IMRE, E. M., ANGELISOVA, P., 

NOWOTNY, P., WALDHAUSL, W. Polyunsaturated Eicosapentaenoic Acid Displaces 

Proteins from Membrane Rafts by Altering Raft Lipid Composition. J Biol Chem., 2001, vol. 

276(40), p. 37335-37340. 

SUNG, T. C., ALTSHULLER, Y. M., MORRIS, A. J., FROHMAN, M. A. Molecular 

Analysis of Mammalian Phospholipase D2. J Biol Chem., 1999a, vol. 274(1), p. 494-502. 

SUNG, T. C., ROPER, R. L., ZHANG, Y., RUDGE, S. A., TEMEL, R., HAMMOND, S. 

M., MORRIS, A. J., MOSS, B., ENGEBRECHT, J., FROHMAN, M. A. Mutagenesis of 

Phospholipase D Defines a Superfamily Including a Trans-Golgi Viral Protein Required for 

Poxvirus Pathogenicity. Embo J., 1997, vol. 16(15), p. 4519-4530. 

SUNG, T. C., ZHANG, Y., MORRIS, A. J., FROHMAN, M. A. Structural Analysis of 

Human Phospholipase D1. J Biol Chem., 1999b, vol. 274(6), p. 3659-3666. 

SUOMALAINEN, M. Lipid Rafts and Assembly of Enveloped Viruses. Traffic., 2002, vol. 

3(10), p. 705-709. 

SWEENEY, B., PURI, P., REEN, D. J. Modulation of Immune Cell Function by 

Polyunsaturated Fatty Acids. Pediatr Surg Int., 2005, vol. 21(5), p. 335-340. 

TAKAHASHI, K., TAGO, K., OKANO, H., OHYA, Y., KATADA, T., KANAHO, Y. 

Augmentation by Calmodulin of Adp-Ribosylation Factor-Stimulated Phospholipase D 

Activity in Permeabilized Rabbit Peritoneal Neutrophils. J Immunol., 1996, vol. 156(3), p. 

1229-1234. 

TAKI, T., KANFER, J. N. Partial Purification and Properties of a Rat Brain 

Phospholipase. J Biol Chem., 1979, vol. 254(19), p. 9761-9765. 

198

TEITELBAUM, J. E., ALLAN WALKER, W. Review: The Role of Omega 3 Fatty Acids 

in Intestinal Inflammation. J Nutr Biochem., 2001, vol. 12(1), p. 21-32. 

THANASAK, J., MULLER, K. E., DIELEMAN, S. J., HOEK, A., NOORDHUIZEN, J. 

P., RUTTEN, V. P. Effects of Polyunsaturated Fatty Acids on the Proliferation of Mitogen 

Stimulated Bovine Peripheral Blood Mononuclear Cells. Vet Immunol Immunopathol., 2005, 

vol. 104(3-4), p. 289-295. 

THIES, F., NEBE-VON-CARON, G., POWELL, J. R., YAQOOB, P., NEWSHOLME, 

E. A., CALDER, P. C. Dietary Supplementation with Eicosapentaenoic Acid, but Not with 

Other Long-Chain N-3 or N-6 Polyunsaturated Fatty Acids, Decreases Natural Killer Cell 

Activity in Healthy Subjects Aged >55 Y. Am J Clin Nutr., 2001a, vol. 73(3), p. 539-548. 

THIES, F., NEBE-VON-CARON, G., POWELL, JR., YAQOOB, P., NEWSHOLME, 

EA., CALDER, PC. Dietary supplementation with γ-linolenic acid or fish oil decrases T 

lymphocyte proliferation in heathly older humans. J nutr., 2001b, vol. 131, p. 1918-1927. 

TRICHOPOULOU, A., LAGIOU, P., KUPER, H.,TRICHOPOULOS, D. Cancer and 

Mediterranean Dietary Traditions. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 2000, vol. 9(9), p. 

869-873. 

TSANG, W. M., WEYMAN, C., SMITH, A. D. Effect of Fatty Acid Mixtures on 

Phytohaemagglutinin-Stimulated Lymphocytes of Different Species. Biochem Soc Trans., 

1977, vol. 5(1), p. 153-154. 

TSUI-PIERCHALA, B. A., ENCINAS, M., MILBRANDT, J., JOHNSON, E. M., JR. 

Lipid Rafts in Neuronal Signaling and Function. Trends Neurosci., 2002, vol. 25(8), p. 412- 

417. 

TURNOCK, L., COOK, M., STEINBERG, H., CZUPRYNSKI, C. Dietary 

Supplementation with Conjugated Linoleic Acid Does Not Alter the Resistance of Mice to 

Listeria Monocytogenes Infection. Lipids., 2001, vol. 36(2), p. 135-138. 

199

UCHIDA, N., OKAMURA, S., KUWANO, H. Phospholipase D Activity in Human Gastric 

Carcinoma. Anticancer Res., 1999, vol. 19(1B), p. 671-675. 

UCHIDA, N., OKAMURA, S., NAGAMACHI, Y., YAMASHITA, S. Increased 

Phospholipase D Activity in Human Breast Cancer. J Cancer Res Clin Oncol., 1997, vol. 

123(5), p. 280-285. 

VALETTE, L., CROSET, M., PRIGENT, A. F., MESKINI, N., LAGARDE, M. Dietary 

Polyunsaturated Fatty Acids Modulate Fatty Acid Composition and Early Activation Steps of 

Concanavalin a-Stimulated Rat Thymocytes. J Nutr., 1991, vol. 121(11), p. 1844-1859. 

VAN CORVEN, E. J., GROENINK, A., JALINK, K., EICHHOLTZ, T., 

MOOLENAAR, W. H. Lysophosphatidate-Induced Cell Proliferation: Identification and 

Dissection of Signaling Pathways Mediated by G Proteins. Cell., 1989, vol. 59(1), p. 45-54. 

VAN DER HEIDE, J. J., BILO, H. J., DONKER, J. M., WILMINK, J. M., TEGZESS, 

A. M. Effect of Dietary Fish Oil on Renal Function and Rejection in Cyclosporine-Treated 

Recipients of Renal Transplants. N Engl J Med., 1993, vol. 329(11), p.769-773. 

VAN DIJCK PW, D. K. B., VAN DEENEN LL, DE GIER J, DEMEL RA. The 

Preference of Cholesterol for Phosphatidylcholine in Mixed Phosphatidylcholine- 

Phosphatidylethanolamine Bilayers. Biochim Biophys Acta., 1976, vol. 455(2), p. 576-587. 

VENABLE, M. E., BIELAWSKA, A., OBEID, L. M. Ceramide Inhibits Phospholipase D 

in a Cell-Free System. J Biol Chem., 1996, vol. 271(40), p. 24800-24805. 

VERLENGIA, R., GORJAO, R., KANUNFRE, C. C., BORDIN, S., DE LIMA, T. M., 

CURI, R. Effect of Arachidonic Acid on Proliferation, Cytokines Production and Pleiotropic 

Genes Expression in Jurkat Cells--a Comparison with Oleic Acid. Life Sci., 2003, vol. 

73(23), p. 2939-2951. 

VERLENGIA, R., GORJAO, R., KANUNFRE, C. C., BORDIN, S., MARTINS DE 

LIMA, T., MARTINS, E. F., CURI, R. Comparative Effects of Eicosapentaenoic Acid and 

200

Docosahexaenoic Acid on Proliferation, Cytokine Production, and Pleiotropic Gene 

Expression in Jurkat Cells. J Nutr Biochem., 2004, vol. 15(11), p. 657-665. 

VIRELLA, G., FOURSPRING, K., HYMAN, B., HASKILL-STROUD, R., LONG, L., 

VIRELLA, I., LA VIA, M., GROSS, A. J., LOPES-VIRELLA, M. Immunosuppressive 

Effects of Fish Oil in Normal Human Volunteers: Correlation with the in Vitro Effects of 

Eicosapentanoic Acid on Human Lymphocytes. Clin Immunol Immunopathol., 1991, vol. 

61(2 Pt 1), p. 161-176. 

VITALE, N., CAUMONT, A. S., CHASSEROT-GOLAZ, S., DU, G., WU, S., 

SCIORRA, V. A., MORRIS, A. J., FROHMAN, M. A., BADER, M. F. Phospholipase 

D1: A Key Factor for the Exocytotic Machinery in Neuroendocrine Cells. Embo J., 2001, vol. 

20(10), p. 2424-2434. 

WALLACE, F. A., MILES, E. A., EVANS, C., STOCK, T. E., YAQOOB, P., CALDER, 

P. C. Dietary Fatty Acids Influence the Production of Th1- but Not Th2-Type Cytokines. J 

Leukoc Biol., 2001, vol. 69(3), p. 449-457. 

WAY, M., PARTON, R. G. M-Caveolin, a Muscle-Specific Caveolin-Related Protein. FEBS 

Lett., 1995, vol. 376(1-2), p. 108-112. 

WEBB, Y., HERMIDA-MATSUMOTO, L., RESH, M. D. Inhibition of Protein 

Palmitoylation, Raft Localization, and T Cell Signaling by 2-Bromopalmitate and 

Polyunsaturated Fatty Acids. J Biol Chem., 2000, vol. 275(1), p. 261-270. 

WHATMORE, J., CRONIN, P., COCKCROFT, S. Arf1-Regulated Phospholipase D in 

Human Neutrophils Is Enhanced by Pma and Mgatp. FEBS Lett., 1994, vol. 352(2), p. 113- 

117. 

WHATMORE, J., MORGAN, C. P., CUNNINGHAM, E., COLLISON, K. S., 

WILLISON, K. R., COCKCROFT, S. Adp-Ribosylation Factor 1-Regulated Phospholipase 

D Activity Is Localized at the Plasma Membrane and Intracellular Organelles in Hl60 Cells. 

Biochem J., 1996, vol. 320 ( Pt 3), p. 785-794. 

201

XAVIER, R., BRENNAN, T., LI, Q., MCCORMACK, C., SEED, B. Membrane 

Compartmentation Is Required for Efficient T Cell Activation. Immunity., 1998, vol. 8(6), p. 

723-732. 

XIE, Z., HO, W. T., EXTON, J. H. Association of N- and C-Terminal Domains of 

Phospholipase D Is Required for Catalytic Activity. J Biol Chem., 1998, vol. 273(52), p. 

34679-34782. 

XIE, Z., HO, W. T., EXTON, J. H. Association of the N- and C-Terminal Domains of 

Phospholipase D. Contribution of the Conserved Hkd Motifs to the Interaction and the 

Requirement of the Association for Ser/Thr Phosphorylation of the Enzyme. J Biol Chem., 

2000, vol. 275(32), p. 24962-24969. 

XU, L., SHEN, Y., JOSEPH, T., BRYANT, A., LUO, J. Q., FRANKEL, P., ROTUNDA, 

T., FOSTER, D. A. Mitogenic Phospholipase D Activity Is Restricted to Caveolin-Enriched 

Membrane Microdomains. Biochem Biophys Res Commun., 2000, vol. 273(1), p. 77-83. 

XU, Y., SEET, L. F., HANSON, B., HONG, W. The Phox Homology (Px) Domain, a New 

Player in Phosphoinositide Signalling. Biochem J., 2001, vol. 360(Pt 3), p. 513-530. 

YAMAZAKI, M., ZHANG, Y., WATANABE, H., YOKOZEKI, T., OHNO, S., 

KAIBUCHI, K., SHIBATA, H., MUKAI, H., ONO, Y., FROHMAN, M. A., KANAHO, 

Y. Interaction of the Small G Protein Rhoa with the C Terminus of Human Phospholipase D1. 

J Biol Chem., 1999, vol. 274(10), p. 6035-6038. 

YANG, S. F., FREER, S., BENSON, A. A. Transphosphatidylation by Phospholipase D. J 

Biol Chem., 1967, vol. 242(3), p. 477-484. 

. 

YAQOOB, P. Fatty Acids as gatekeepers of immune cell regulation. Trends Immunol., 

2003a, vol. 24, p. 639-645. 

YAQOOB, P. Lipids and the immune response : from molecular mechanisms to clinical 

applications. Curr Opin in Clin Nutr and Metab Care., 2003b, vol.6, p. 133-150. 

202

YAQOOB, P. Fatty Acids and the Immune System: From Basic Science to Clinical 

Applications. Proc Nutr Soc., 2004, vol. 63(1), p. 89-104. 

YAQOOB, P. Monounsaturated Fats and Immune Function. Braz J Med Biol Res., 1998, 

vol. 31(4), p. 453-465. 

YAQOOB, P. Monounsaturated Fatty Acids and Immune Function. Eur J Clin Nutr., 2002, 

vol. 56 Suppl 3, p. S9-S13. 

YAQOOB, P., CALDER, P. C. The Effect of Dietary Lipid Manipulation on the Production 

of Murine T-Cell Derived Cytokines. Biochem Soc Trans., 1995, vol. 23(2), p. 279S. 

YAQOOB, P., NEWSHOLME, EA., CALDER, PC. The effect of dietary lipid 

manipulation on rat lymphocyte subsets and proliferation. Immunol., 1994, vol. 82, p. 603- 

610. 

YAQOOB, P., NEWSHOLME, E. A., CALDER, P. C. Influence of Cell Culture 

Conditions on Diet-Induced Changes in Lymphocyte Fatty Acid Composition. Biochim 

Biophys Acta., 1995a, vol. 1255(3), p. 333-340. 

YAQOOB, P., NEWSHOLME, EA., CALDER, PC. The effect of fatty acid on leucocyte 

subsets and proliferation in rat whole blood. Nutrit Res., 1995b, vol. 15, p. 279-287. 

YAQOOB, P., PALA, HS., CORTINA-BORJA, M., NEWSHOLME, EA., CALDER, 

PC. Encapsulated fish oil enriched in α- tocopherol alters plasma phospholipid an 

mononuclear cell fatty acid compositions but not mononuclear cell functions. Eur J Clin 

Nutr., 2000, vol. 30, p. 260-274. 

YAQOOB, P., NEWSHOLME, E. A., CALDER, P. C. Inhibition of Natural Killer Cell 

Activity by Dietary Lipids. Immunol Lett., 1994, vol. 41(2-3), p. 241-247. 

YAQOOB, P., SHERRINGTON, E. J., JEFFERY, N. M., SANDERSON, P., HARVEY, 

D. J., NEWSHOLME, E. A., CALDER, P. C. Comparison of the Effects of a Range of 

203

Dietary Lipids Upon Serum and Tissue Lipid Composition in the Rat. Int J Biochem Cell 

Biol., 1995c, vol. 27(3), p. 297-310. 

YEAGLE, P. L., YOUNG, J. E. Factors Contributing to the Distribution of Cholesterol 

among Phospholipid Vesicles. J Biol Chem., 1986, vol. 261(18), p. 8175-8181. 

YU, C. H., LIU, S. Y., PANAGIA, V. The Transphosphatidylation Activity of Phospholipase 

D. Mol Cell Biochem., 1996, vol. 157(1-2), p. 101-105. 

ZEYDA, M., STAFFLER, G., HOREJSI, V., WALDHAUSL, W., STULNIG, T. M. Lat 

Displacement from Lipid Rafts as a Molecular Mechanism for the Inhibition of T Cell 

Signaling by Polyunsaturated Fatty Acids. J Biol Chem., 2002, vol. 277(32), p. 28418-28423. 

ZHANG, W., TRIBLE, R. P., SAMELSON, L. E. Lat Palmitoylation: Its Essential Role in 

Membrane Microdomain Targeting and Tyrosine Phosphorylation During T Cell Activation. 

Immunity., 1998, vol. 9(2), p. 239-246. 

ZHAO, Y., EHARA, H., AKAO, Y., SHAMATO, M., NAKAGAWA, Y., BANNO, Y., 

DEGUCHI, T., OHISHI, N., YAGI, K., NOZAWA, Y. Increased activity and intranuclear 

expression of phospholipase D2 in human renal cancer. Biochem Biophys Res Comm., 2000, 

vol. 278, p. 140-143. 

ZHU, T., LING, L., LOBIE, P. E. Identification of a Jak2-Independent Pathway Regulating 

Growth Hormone (Gh)-Stimulated P44/42 Mitogen-Activated Protein Kinase Activity. Gh 

Activation of Ral and Phospholipase D Is Src-Dependent. J Biol Chem., 2002, vol. 277(47), 

p. 45592-45603. 

ZURIER, R. B., ROSSETTI, R. G., SEILER, C. M., LAPOSATA, M. Human Peripheral 

Blood T Lymphocyte Proliferation after Activation of the T Cell Receptor: Effects of 

Unsaturated Fatty Acids. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids., 1999, vol. 60(5-6), p. 

371-375. 

204

RESUME 

L’huile d’argan est extraite de l’arganier « Argania spinosa L. » (Skeels). Cette huile est 

caractérisée par sa composition lipidique unique et sa richesse en acides oléique et linoléique. 

Alors qu’elle suscite un intérêt croissant pour ses effets bénéfiques dans la prévention des 

maladies cardiovasculaires, son rôle potentiel sur les fonctions immunitaires n’est pas connu. 

C’est pourquoi, nous avons réalisé une étude nutritionnelle visant à comparer l’effet 

immunomodulateur d’un régime enrichi en huile d’argan (HA) à ceux de régimes riches en 

huiles de poisson (HP), d’olive (HO), de noix de coco (HC) et de tournesol (HT), administrés 

pendant quatre semaines chez le rat. 

Nos résultats ont montré que les différents régimes induisent des changements dans la 

composition en acides gras des triglycérides et des phospholipides plasmatiques, et à un degré 

moindre dans les phospholipides des thymocytes. Les thymocytes des rats nourris avec un 

régime enrichi en huile de coco ont une réponse proliférative significativement diminuée par 

rapport aux autres groupes, alors que les réponses les plus fortes sont observées chez les 

animaux des groupes poisson et tournesol. De plus, une corrélation positive a été établie entre 

la réponse proliférative aux mitogènes et la proportion de 18 :2n-6 dans les phospholipides 

cellulaires, quel que soit le régime. Cette réponse proliférative est aussi corrélée négativement 

avec l’activité phospholipase D (PLD) thymocytaire. Les résultats de Western blotting 

indiquent que les variations d’activité PLD induites par les différents régimes reflètent 

essentiellement les variations d’expression de la protéine PLD2. Parallèlement, des travaux 

ont été réalisés in vitro afin de vérifier les effets des acides gras majeurs des différentes huiles 

sur la prolifération et l’activité PLD. Nous avons mis en évidence une corrélation négative 

entre la réponse proliférative aux mitogènes et l’activité PLD. 

L’ensemble de nos résultats indique que l’huile d’argan est dépourvue d’effets majeurs sur la 

prolifération lymphocytaire et que son profil immunomodulateur est proche de celui de l’huile 

d’olive. L’huile d’argan s’étant montrée par ailleurs plus efficace dans la prévention des 

maladies cardiovasculaires, sa consommation peut être recommandée sans restriction 

puisqu’elle est dépourvue d’effets secondaires au niveau du système immunitaire. 

MOTS-CLES : Huile d’argan, thymocytes de rat, immunomodulation, prolifération, 

phospholipase D, acide linoléique, acide oléique. 

205

Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?