La Phosphorylation oxydative - IBMC

Chap VI.
La Phosphorylation oxydative
I. Introduction
1. Question posée
Quel est le lien entre réoxydation de NADH et FADH2, et
phosphorylation d’ADP en ATP ?
Figures tirées de
Lehninger Principles of Biochemistry
Fourth Edition
Copyright © 2004 by W. H. Freeman & Company

Couplage oxydation / phosphorylation
Réponse : Théorie de Mitchell
Théorie chimiosmotique (1961)
Transfert d’e -
Synthèse d’ATP
Couplage par gradient de protons
(potentiel de membrane)
ΔΨ
• organisation vectorielle du transport d’électrons et de l’ATPase
• compartiments fermés
• L’événement primaire conservant l’énergie est le mouvement
des protons à travers la membrane

2. Vue générale
Formation d’ATP // transfert d’e - de NADH / FADH 2 sur O 2
• oxydation et phosphorylation couplées
• ensembles respiratoires contenant de nombreux transporteurs
d’e - (ex : cytochromes)
• transport d’e - pompage de protons hors de la mitochondrie :
force proton motrice
• retour des H+ synthèse ATP
Figures tirées de
Lehninger Principles of Biochemistry
Fourth Edition
Copyright © 2004 by W. H. Freeman & Company

2. Vue générale

3. Description de la mitochondrie
Membrane
externe
Perméables aux petites molécules et aux ions
Mb interne
Matrice
Phosphorylation oxydative
Imperméable aux ions et molécules non
chargées transporteurs d’ADP, ac. gras à
longues chaînes
Krebs, oxydation des acides gras
PORINE

II. Les navettes de transport du NADH et du FADH 2
cytoplasmique
1. La navette glycérol-phosphate
CYTOSOL
MATRICE
L-Glycérol-P
P-OCH 2
-CHOH-CH 2
OH
L-Glycérol-P
P-OCH 2 -CHOH-CH 2 OH
QH 2
O 2
2 ATP
NAD +
c Glycérol-
P DH
NADH
+ H +
FAD
FADH 2
Q
DHAP
P-OCH 2
-CO-CH 2
OH
DHAP
P-OCH 2 -CO-CH 2 OH
mGlycérol-P DH
Bilan : NADH + H + + E-FAD NAD + + E-FADH 2
Membrane
cytoplasmique externemitochondriale
Membrane
cytoplasmique interne
mitochondriale

2. La navette malate / aspartate
3 ATP
+ O 2

III. Les potentiels redox et les variations d’énergie libre
Conversion du
Potentiel de transfert électronique
en
Potentiel de transfert de groupe phosphate
E’ 0
ΔG°’
Rappel :
X + e - X -
oxydant
= forme oxydée
réducteur
= forme réduite
Rq : potentiel rédox :
force +/- importante de capter / donner des e -

Appareil pour mesurer un potentiel rédox
1 M H + en
équilibre avec
1 atm de H 2
gazeux
Solution de
1 M X et 1
M X -

Bilan :
• Potentiel rédox NÉGATIF
Composé a une affinité plus FAIBLE pour les électrons que H 2
REDUCTEUR
• Potentiel rédox POSITIF
Composé a une affinité plus GRANDE pour les électrons que H 2
OXYDANT

Calcul de la variation d’énergie libre à partir des potentiels rédox
a) pyruvate + NADH + H + lactate + NAD +
b) pyruvate + 2 H + + 2 e - lactate
E’ 0 = -0,19 V
c) NAD + + 2 e - + 2 H + NADH + H + E’ 0 = -0,32 V
b - c = a
pyruvate + H + + NADH lactate + NAD +
ΔE’ 0 = E’ 0 b) - E’ 0 c)
= -0,19 - (-0,32)
= +0,13 V

ΔG°’ = - n F ΔE’ 0
n = nombre d’électrons transférés
F = l’équivalent calorique du faraday
= 23,062 kcal V -1 mol -1
ΔE’ 0 = exprimé en volt
ΔG°’ = -2 × 23,062 × 0,13
kcal × Volts
= -6
Volts × mole
= -6 kcal / mole
Rq : ΔE’ 0 positif correspond à réaction exergonique

Oxydation du NADH
a) 1/2 O 2 + 2 H + + 2 e - H 2 O
b) NAD + + H + + 2 e - NADH
E’ 0 = +0,82 V
E’ 0 = -0,32 V
a -b = 1/2 O 2 + H + + NADH H 2 O + NAD +
ΔE’ 0 = +0,82 V + 0,32 V = 1,14 V
ΔG°’ = -2 . 23,062 . 1,14
= - 52,6 kcal / mole

Oxydation du FADH 2
a) 1/2 O 2 + 2 H + + 2 e - H 2 O
b) FAD + 2 H + + 2 e - FADH 2
E’ 0 = +0,82 V
E’ 0 = -0,1 V
a -b = 1/2 O 2 + FADH 2
H 2 O + FAD
ΔE’ 0 = +0,82 V + 0,10 V = 0,92 V
ΔG°’ = -2 × 23,062 × 0,92
= - 42,4 kcal / mole

IV. Composition de la chaîne respiratoire
V
Complexe I : NADH - ubiquinone réductase
Complexe II : succinate - ubiquinone réductase
Q : Coenzyme Q = Ubiquinone
Complexe III : Ubiquinol - cytochrome c réductase
Complexe IV : Cytochrome c oxydase
Complexe V : ATPase / ATP synthase

Caractéristiques des complexes protéiques de la chaîne
respiratoire de transport d’électrons dans la mitochondrie
Complexe
Protomères
Masse
moléculaire
Nombre de
composants
I.
NADH-ubiquinone
réductase
25
800.000
• 1 FMN
• 22-24 Fe-S ds 5 à 8
centres
II.
Succinate-ubiquinone
réductase
4
125.000
• 1 FAD
• 7-8 Fe-S ds 3 centres
• Cytochrome b 560
III.
Ubiquinol-cytochrome c
réductase
8
220.000
• 2 centres Fe-S
• Cytochrome b 560
• Cytochrome b 566
• Cytochrome c 1
IV.
Cytochrome c oxydase
12
200.000
• Cytochrome a
• Cytochrome a 3
• 2 ions cuivre

Centres Fer - Soufre
4 Soufre, 1 Fer
6 Soufre, 2 Fer
8 Soufre, 4 Fer
Ce sont des micro chemins pour les électrons

Les hèmes des cytochromes
4 groupements pyrrols : liés avec alternance /
coordination d’1 atome de Fe au milieu
différences entre les hèmes : les chaînes latérales
Longue chaîne carbonée (isoprénique)
hydrophobe ancrage dans la membrane

Hème famille cyt. b :
• Petites chaînes latérales
• Hème tient dans une protéine
Hème famille cyt c :
• liaisons covalente avec sa protéine

Le Coenzyme Q
= ubiquitine car ubiquitaire
Ubiquinone (Q)
Forme oxydée
Intermédiaire
Semiquinone
( • QH)
Chaîne isoprénique
(taille variable,
hydrophobe, reste collé à
la membrane)
Ubiquinol (QH 2 )
Forme réduite

FMN (Flavine mononucléotide)
e - + H + e - + H +
Flavine
mononucléotide
(FMN)
forme oxydée
Semiquinone
intermédiaire
Flavine
mononucléotide
(FMNH 2 )
forme réduite

Le complexe I
H + , e - H + , e -
H + , H -
• FMN FMNH 2 FMNH• FMN
• Q
ubiquinone
e - e - , 2 H +
Q •-
semiquinone
QH 2
ubiquinol

Le complexe II
matrice

Le complexe III
Cytochrome bc1 complexe

Le complexe IV

NADH FMN Fe-S Q Fe-S
Cyt b
Succinate FAD Fe-S
-0,4
NADH
Complexe I
-0,2
NAD +
NADH-ubiquinone
réductase
Cyt c 1 Cyt c Cyt a Cyt a 3 O 2
Trajet
des
électrons
ΔG°’
(kcal / mol)
50
40
0
0,2
Succinate
Fumarate
Complexe II
Q
Complexe III
30
0,4
Succinate-ubiquinone
réductase
Cyt c
Complexe IV
20
0,6
Ubiquinol-cytochrome c
réductase
Cytochrome c
oxydase
1/2 O 2
+ 2 H +
10
E°’ (V)
H 2
O

Preuves de la théorie de Mitchell
1. Existence d’un gradient de protons
• pH inter membranaire

Lumière
Vésicule
lipidique
H + H +
H +
F 1 F 0 -ATP
synthase de
mitochondrie
Bactériorhodopsine
• Vésicule hybride
reconstituée, contenant de
l’ATP synthase et de la
bactériorhodopsine. Ce
système a été utilisé par
Stoecknius et Racker pour
confirmer la théorie
chimiosmotique de Mitchell.
ADP + Pi
ATP
H +

2. L’ATP synthase mitochondriale
F 1
α 3 β 3 γδε
F 0
a, b, c
F 1 : • contient le site catalytique pour la synthèse d’ATP
• particule sphérique (côté matriciel)
F 0 : • contient le canal protonique / transmembranaire
Tige entre F 1 et F 0 : • contient les sites de régulation :
- du flux de protons / de la synthèse
(sensibilité à l’oligomycine)

L’ATP synthase mitochondriale

L’ATP synthase mitochondriale

L’ATP synthase mitochondriale

3. Synthèse d’ATP par les sous unités β
“loosly interactive“
“open“
“tight“
Rôle du flux de protons :
- n’intervient pas dans la synthèse d’ATP
- intervient dans la libération d’ATP

3 ATP synthétisés à partir de 1 NADH + H+
2 ATP synthétisés à partir de 1 FADH2

4. Synthèse d’ATP
ADP 3- + Pi 2- + H +
ATP 4- + H 2 O
O
O
O
R
O
P
O
P
O
+ O P OH + H +
O
ADP
O
O
Pi
intermédiaire
pentacovalent
R
O
O
P
O
O
O
P
O
O
O O
P
O
O
H
H +
O
O
O
ATP
R
O
P
O
P
O
P
O
+ H 2 O
O
O
O

5. Le transport transmembranaire de l’ADP et de l’ATP

6. Bilan total glycolyse + cycle de Krebs
• Glucose + 2 NAD + + 2 Pi + 2 ADP
2 Pyruvate + 2 NADH + 2 H + + 2 ATP + 2 H 2 O
• 2 Pyruvate + 2 NAD + + 2 HS-CoA
2 Acétyl-CoA + 2 CO 2 + 2 NADH + 2 H +
• 2 Acétyl-CoA + 4 H 2 O + 6 NAD + + 2 FAD + 2 GDP + 2 Pi
4 CO 2 + 6 NADH + 2 FADH 2 + 2 GTP + 4 H + + 2 CoA
Glucose + 10 NAD + 6 CO 2
+ 4 Pi + 10 NADH
+ 2 ADP + 6 H +
+ 2 GDP + 2 ATP
+ 2 H 2 O + 2 GTP
+ 2 FAD + 2 FADH 2

or
Chaque NADH
Chaque FADH 2
3 ATP
2 ATP
1 glucose 10 × 3 = 30 (NADH)
+ 2 × 2 = 4 (FADH 2 )
+ 2 = 2 (ATP)
+ 2 = 2 (GTP)
38 ATP
ΔG° = -688 kcal / mole pour le glucose
Synthèse d’ATP = 38 × -7,3 = -277,4 kcal / mole
100 × 277,4
L’efficacité est de
= 40,3 %
688
60 % de l’énergie se retrouvent sous forme de chaleur

Bilan
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
Palmitate + CoASH + ATP + 7 FAD + 7 NAD +
+ 7 CoASH + 7 H 2 O
8 CH 3 CO~S.CoA + AMP + PPi + 7 FADH 2 + 7 NADH + 7 H +

or 1 NADH 3 ATP
1 FADH 2 2 ATP
1 CH 3 CO~S.CoA 12 ATP
8 × 12 = 96
7 × 2 = 14 131 ATP formés
7 × 3 = 21
or 2 liaisons riches en énergie consommées
129 ATP

Rendement de conservation en énergie
énergie calculée : 129 × - 7,3 = - 940 kcal
énergie mesurée : - 2340 kcal
- 940 × 100
Rendement = = 40 %
- 2340
1 Glucose 1 Palmitate
38 ATP 129 ATP
38
6
= 6,33 ATP par
carbone
129
16
= 8,06 ATP par
carbone

VI. Régulation de la chaîne respiratoire
par vitesse de retour des H +
par vitesse de consommation de O 2
Régulateurs principaux = [ADP] [ATP]
Découplages
H + reviennent dans matrice SANS passer par ATP synthase
I
III
H + H + H + H +
IV
V
• déplacement d’e -
• gradient de protons
• retour des protons
PAS de synthèse d’ATP FORTE PRODUCTION de CHALEUR

Agents découplants naturels
nouveaux nés
mammifères adaptés au froid
animaux en hibernation
• tissus adipeux brun
spécialisé en thermogenèse contient Thermogénine
activée par acides gras libres, acides gras libérés par noradrénaline
Découplage sous contrôle hormonal
• “Aposère fétide“ = plante, chauffage des pointes florales
évaporation des molécules odoriférantes
attraction des insectes

Blocage des pompes à protons
• Complexe I : roténone, anytal
attention
n’interfèrent pas avec oxydation du succinate
• Complexe III : antimycine A
blocage contournable par ascorbate
• Complexe IV : CN -
N 3
CO
cyanures
azides
oxyde de carbone

Élimination des dérivés toxiques de O 2
O 2
e - H +
O
-•
2 HO
•
2
anion
superoxyde
radical
hydroperoxyl
HO 2
•
O 2
H 2 O 2
peroxyde
d’hydrogène
DESTRUCTEUR
SUPEROXYDE DISMUTASE
2 H +
O
-•
2 + O
-•
2 H 2 O 2 + O 2
CATALASE H 2 O 2 + H 2 O 2 2 H 2 O + O 2
PÉROXYDASES H 2 O 2 + AH 2 2 H 2 O + A