La Vague N.4 - A3P

a Vague
EVÈNEMENTS
N° SPECIAL 3 e RENCONTRES
DE MICROBIOLOGIE
L A R E V U E
A S S O C I A T I O N
Du sang à Lille
Didier Meyer,
dmeyer@lacalhene.fr
L’addition des aléas n’a pas empêché A3P et
ses partenaires : AES/CHEMUNEX,
BIOMERIEUX et MIILLIPORE d’organiser
leurs 3 es Rencontres de microbiologie les 3 & 4 Juin à Lille.
Pourquoi Lille ? La raison majeure c’est la possibilité qui nous a été offerte
par le Dr Jean-Jacques HUART, directeur de l’Etablissement Français
du Sang (ex CNTS) et par ailleurs administrateur d’A3P, de bénéficier
d’une visite guidée et documentée de son site. La raison, non pas mineure
mais qui renforçait la première, était un rapprochement d’A3P avec
l’association de microbiologistes anglais Pharmig qui outre notre traduction
simultanée bénéficiait de la proximité géographique pour sa participation.
La participation anglaise s’est malheureusement limitée aux
deux excellents conférenciers ; ce n’est que partie remise.
Le président Gérard Rumpler a ouvert ces 2 journées puis a laissé la
parole à Chris Randell de Pharmig qui a replacé les méthodes de microbiologie
rapide (RMM) dans leur contexte réglementaire tant US qu’européen
en explicitant leurs fonctions en cours de process par rapport aux
analyses conventionnelles de fin de process.
John Reed de Millipore Corporation, à l’aide de l’exemple de la bioluminescence
ATP, a exploré le rapport technique TR N° 33 de PDA et 2 textes
USP & pour nous confronter aux limites des acceptations
réglementaires actuelles.
Frédéric Estassy et l’équipe d’A3P Services nous avait préparé une pause
reconstituante avant que les participants se répartissent dans les trois
ateliers d’ AES/CHEMUNEX, de BIOMERIEUX et de MIILLIPORE où des
démonstrations ciblées étaient attentivement organisées.
La partie réglementaire sur un aspect de notre vie quotidienne, la cosmétologie,
était présentée par Yves Cortez de l’Agence Française de la
Sécurité Sanitaire des Aliments et des Produits de Santé (AFSSAPS) qui
EDITORIAL
par Michel Barbe
Vice-Président A3P
Pousses à l’ombre du Beffroi
Nous avions choisi Lille pour permettre
aux participants des 3 es Rencontres A3P
de Microbiologie de visiter
l’Etablissement Français du Sang, ce qui fut fait
sous la houlette dynamique de Jean-Jacques
Huart. Pour le reste, malgré les conditions un
peu particulières de cette période de l’année,
les participants, stands, partenaires des ateliers
intéractifs et conférenciers ont répondu présents
à ce rendez-vous désormais habituel.
Cette troisième mouture a répondu aux attentes
de communication sur le thème des innovations
microbiologiques.
Lieu privilégié d’échange, ces Rencontres A3P permettent à chacun
de faire le point des attentes et des réponses. Cette formule maintenant
rodée atteint les objectifs assignés de
reconnaissance de ce domaine si particulier et
qui retrouve toute son actualité.
En organisant ces Rencontres, A3P permet aux
professionnels de se reconnaître et d’année en
année de mesurer les progrès accomplis dans le
domaine des produits propres. Soumis à une
pression aussi médiatique que réglementaire, il
est important pour les responsables concernés
d’estimer le juste niveau entre les efforts faits et
ceux qui restent à faire.
Rendez-vous à tous l’an prochain pour les
Rencontres A3P de microbiologie dans un autre
lieu tout aussi technique et convivial. En attendant, rendez-vous à
Biarritz les 21, 22 et 23 octobre 2003 pour le 16 e Congrès International. ■
N° SPECIAL 3 e RENCONTRES DE MICROBIOLOGIE
à travers une commission ISO à la composition géographique très éclectique
(présidée par une iranienne) nous a démontré qu’une norme prochainement
publiée aux contours réalistes permettra d’assurer une
bonne qualité mondiale des produits cosmétiques quant à leur contamination
microbiologique.
Eric Petat d’ACM Pharma a mis en avant les aspects pratiques de la soustraitance
analytique en microbiologie qui doit se développer harmonieusement
entre les trois acteurs que sont le donneur d’ordre, le sous-traitant
et la réglementation. Le tout devant se faire dans des conditions économiques
qui ne nuisent pas à la bonne marche des productions, au
maintien réciproque des connaissances techniques et à un haut niveau
de technologie.
Le déjeuner convivial dans l’hôtel nous a mis en situation d’aborder au
mieux cet après midi de travail : la suite des ateliers interactifs débutés
le matin, suivis de l’intervention de Mme
Joëlle Sobhane de bioMérieux qui nous a
présenté les résultats comparatifs des passages
des agents de bio-décontamination à
S O M M A I R E
travers les emballages de boites de Pétri et
du risque inhérent de faux négatifs. Un
Du sang à Lille 1
emballage adéquat à base d’aluminium Pousses à l’ombre du Beffroi 1-2
permet d’obtenir des résultats satisfaisants
vis-à-vis de cultures témoins.
L’ Etablissement Français du Sang de la
partie Nord de la France (200 km autour
de Lille) est le plus important de France
tant quant aux quantités prélevées et
transformées (1500 prélèvements/jour en
moyenne) qu’au rendement qui est 4 fois
supérieur pro capita qu’en Ile de France.
Conférences
Ateliers Intéractifs
Exposants
Visite d’usine
2-7
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10-11
➠ page 2
L’E.F.S. Nord de France 12

2
A l’origine des meilleures techniques de prélèvement,
l’EFS de Jean-Jacques Huart (N° 5 en
Europe) dans son cadre architectural qui mélange
la tradition et l’innovation peut se vanter d’être à
l’origine à la fois pour la transformation et pour les
analyses du «state of the art» de la technologie
mondiale (fractionnement plasmatique, chromatographie,
inactivation, nanofiltration, laboratoire
modulable…). Nous devons remercier l’ensemble
de son personnel pour sa réception didactique et
très documentée.
Le dîner de gala à Achelles était typique d’A3P :
cadre, qualité, quantité et convivialité.
Deuxième jour à 9h les Rencontres ont pu reprendre
avec toujours une attention semblable et les
mêmes esprits affûtés que la veille.
Mme Bienati de Bayer Italie a abordé une question
un peu ésotérique pour les microbiologistes : le
fameux CFR 21 partie 11 c'est-à-dire la validation
de l’électronique des machines. Il semble que la
logique l’est emportée et que le fabricant du Biolog
Microlog 3 et l’utilisateur aient trouvé un
point d’équilibre de validation qui rende son utilisation
routinière aisée.
Richard Antonelli de Genolife a abordé un problème
à la fois médiatique et préoccupant : la détection
des Legionnelles et en particulier la
«Legionella Pneumophila» qui nous guette dans
les douches et les climatisations non entretenues.
Son système par PCR (Polymerase Chain
Reaction) permet d’analyser les prélèvements
dans un temps très court et est donc un outil de
prévention qui peut être utilisé dès à présent dans
les hôpitaux et autres maisons de retraite
Poursuite des ateliers interactifs des partenaires
d’A3P.
Anne-Elise Feuillet de Faure Ingénierie nous a
rendu les résultats des prestations de service de
l’utilisation du ChemScan RDI, attractifs pour à la
fois le contrôle de l’eau ultra-pure et l’eau des
tours de refroidissement. Faure Ingénierie dans sa
salle blanche de démonstration a mis au point une
méthode de contrôle de l’air avec le ChemScan
RDI grâce à un bio-polymère de prélèvement.
Le Dr John Marugg du Centre de Recherche de
Nestlé à Vers Chez Les Blancs nous a présenté les
méthodes de contrôle microbiologique et leurs
validations implantées dans leurs usines pour leurs
différents produits. Les aspects normatifs ont également
été abordés.
Dernier déjeuner en commun.
Suite et fin des ateliers interactifs des partenaires
d’A3P qui ont permis à l’ensemble des
participants d’être informés.
Un pas vers le futur est franchi par Arnaud Carlotti
de Idmyk SA qui nous présente ses puces ADN permettant
la détection qualitative de nombreuses
espèces différentes de levures et moisissures dans
des temps record. Des applications industrielles
sont déjà en fonctionnement.
La validation de l’acticité bactéricide et fongicide
des désinfectants est un problème pratique que
M. Labbé d’Allergan a résolu en utilisant l’ATP bioluminescence
du Pallcheck de Pall Life
Sciences. Les limites de détection et la validation
de l’appareil vis-à-vis des méthodes conventionnelles
on été passées en revue.
Mme le Dr Vialette de l’Institut Pasteur de
Lille qui a conclu les 3 es Rencontres A3P de
Microbiologie nous a parlé de la détection de la
pathogénicité d’organismes naturellement pathogènes
dans les aliments et génétiquement modifiés
par codage de protéines.
Et maintenant nous attendons les 4 es rencontres
prévues dans un an à la même période…» ■
CONFERENCES
Retrouvez tous les détails des conférences sur www.a3p.asso.fr
Chris Randall
randalc@wyeth.com
John Reed
john_reed@millipore.com
L’incidence des
réglementations sur la
microbiologie
pharmaceutique
Chris Randall,
Wyeth Manufacturing
Résumé de conférence non
communiqué. ■
Using Validation
Guidelines to facilitate
the Regulatory
Acceptance of Rapid
Microbiological Test
Methods
John Reed,
Millipore
Voir compte rendu de l’atelier
intéractif Millipore. ■
Yves Cortez
yves.cortez@afssaps.sante.fr
Commission de
normalisation ISO
«Microbiologie-
Produits Cosmétiques »
Yves Cortez,
AFSSAPS
La première réunion de la
commission internationale
ISO, dénommée ISO/TC
217 a eu lieu aux Pays-Bas
à La HAYE en 2000.
Différents sous-groupes y ont été créés, dont celui
de «Microbiologie», l’ISO /TC 217 WG1. Au niveau
français, a d’abord vu le jour la commission AFNOR
S91K, puis le sous-groupe «Microbiologie »,
AFNORS91KGT1, dont la première réunion a eu
lieu à Montpellier-Vendargues sur le site de
l’AFSSAPS . Ce groupe français composé de représentants
de l’université, de l’AFSSAPS, de l’industrie
cosmétique et des consommateurs s’est révélé
rapidement très dynamique avec l’élaboration en
2 ans de 8 normes portant sur la propreté microbiologique
des produits cosmétiques. La délégation
française, composée de 4 experts, a présenté ces
normes au groupe international ISO, présidé par
l’IRAN et composé de 11 pays participants. Ce
groupe «Microbiologie-ISO », également très actif,
a organisé 4 meetings, dont deux à Paris, un à
Bruxelles et un à La Haye. Les normes présentées
par la France ont été très appréciées et pratiquement
adoptées en l’état par le groupe international
; cinq sont à un stade très avancé de committee
draft avant le vote international et 3 à un stade de
working draft.
L’objectif de cette commission de normalisation a
été d’établir des méthodes microbiologiques plus
adaptées à la cosmétologie avec l’introduction de
milieux de culture et de réactifs adéquats. Ces
méthodes peuvent également s’ouvrir vers des
méthodes automatiques s’il a été prouvé qu’elles
donnaient des résultats équivalents aux méthodes
traditionnelles. Un choix existe entre les méthodes
de numération et la méthode de détection (présence-absence)
après enrichissement.
Dans chaque norme technique a été introduite la
validation du neutralisant qui permet de démon-

CONFERENCES
trer la capacité de micro-organismes à croître dans
le produit cosmétique contrôlé.
La première norme, la 21148 cd (committee draft),
décrit les recommandations générales pour effectuer
ces contrôles.
La norme 21149 cd traite des méthodes de numération
des bactéries aérobies mésophiles, en boîte
de pétri, après incubation à 32°C, ainsi que d’une
méthode de détection (présence-absence) après
enrichissement sur milieu non sélectif. La validation
du neutralisant est effectuée par mélange d’un
inoculum calibré de Staphylococcus aureus et
d’un inoculum calibré de Pseudomonas aeruginosa
avec l’échantillon neutralisé. La validation
est positive s’il y a mise en évidence d’une croissance
supérieure ou égale à 50% par rapport à un
témoin germe.
La 16212 wd (working draft) traite des méthodes
de numération des levures et moisissures, en boîte
de pétri, après incubation à 25°C.
Les normes 22717cd (Pseudomonas aeruginosa),22718cd
(Staphylococcus aureus), 21150 cd
(Escherichia coli), 18416 wd (Candida albicans)
ont, pour principe, un enrichissement sur un
bouillon non sélectif suivi d’un isolement sur une
gélose sélective et d’une confirmation par des tests
d’identification appropriés.
La dernière norme travaillée est la 18415wd. Elle
traite de la détection globale, dans le cas de faibles
niveaux de contamination, des 4 micro-organismes
spécifiés cités ci-dessus ainsi que de germes non
spécifiés. Le principe consiste à faire un enrichissement
en bouillon non sélectif suivi d’un isolement
sur une gélose non sélective et d’une confirmation
sur des kits d’identification appropriés. ■
Eric A. Petat
acm.epm@wanadoo.fr
La sous-traitance
en microbiologie
Eric A. PETAT,
ACM PHARMA
La volonté de l’industrie
pharmaceutique pour
externaliser de nombreuses
activités périphériques
se poursuit depuis ces dernières
années rejoignant
en cela la politique des
autres grands secteurs
industriels tels que l’automobile, l’aéronautique ou
l’électronique. Les opérations de contrôle analytique
sont particulièrement concernées par cette
tendance avec une spécificité toute particulière
puisque le plus souvent ces contrôles contribuent à
la libération d’un lot pharmaceutique.
Le contrôle microbiologique sous-traité, qu’il
concerne l’amont en production ou le contrôle
libérateur final, n’échappe pas aux règles générales
qui régissent les relations entre donneur d’ordre
et sous-traitant. Les obligations réciproques
relèvent du fonctionnement général des contrats
d’entreprise où l’indépendance du prestataire est
source de sa responsabilité, responsabilité qui
s’exercera aux plans juridique, pénal, disciplinaire
et naturellement pharmaceutique.
Les attentes du donneur d’ordre en microbiologie
sont très variables selon les activités sous-traitées :
contrôles en amont ou pendant les phases de R&D,
contrôles de matières premières ou en cours de
process, contrôles des eaux et de l’environnement,
contrôles libérateurs. Cette diversité exige de la
part du sous-traitant un grand domaine d’expertise
microbiologique et une réelle faculté d’adaptation.
La nature biologique des analyses et le caractère
intrinsèquement instable des échantillons renforcent
l’exigence d’une réflexion approfondie (transport,
stockage, méthode) préalable à la mise en
place du partenariat pour garantir la qualité et la
fiabilité des résultats.
Les moyens mis en œuvre par le sous-traitant en
termes d’équipement, d’assurance qualité, de relations
humaines et de compétences seront le point
de départ indispensable pour réussir un partenariat
où les relations entre donneur d’ordres et soustraitant
sont basées sur le respect des contraintes
de chacun.
Après l’élaboration du contrat, du cahier des charges,
et la connaissance mutuelle des partenaires
souvent initiée au cours d’un audit, une relation de
confiance s’établit entre les partenaires. Au-delà
des inévitables contraintes de mise en place
(réglementaires, logistiques…), l’entreprise qui
choisit l’externalisation retire un gain significatif
en termes d’expertise, d’accessibilité à des méthodes
spécifiques, de réactivité et de souplesse qui
font de la microbiologie une activité de contrôle
souvent sous-traitée. ■
Joëlle Sobhane
joelle.sobhane@eubiomerieux.com
Perméabilité comparée
des emballages
des milieux de culture
aux agents de
bio-décontamination
des isolateurs
Joëlle Sobhane,
bioMérieux
L’Isotechnie est une technologie
très répandue dans
l’industrie pharmaceutique,
en production, pour le contrôle de stérilité et la
recherche et développement.
L’évaluation de la contamination microbiologique
des isolateurs est réalisée quotidiennement en utilisant
des milieux de culture qui sont introduits
directement dans l’isolateur et qui subissent le
cycle de bio-décontamination.
La qualité nutritive des milieux de culture doit être
conservée afin d’écarter tout risque de faux négatifs.
Pour garantir cette fertilité, il est important
d’éviter tout contact entre les milieux de culture
et les agents de bio-décontamination en utilisant
un emballage imperméable.
Une évaluation de la fertilité des géloses de
contact a été effectuée après un traitement à l’acide
peracétique ainsi qu’une comparaison de la
fertilité obtenue entre les géloses de contact en triple
ensachage cellophane et les géloses de contact
en emballage spécifique imperméable (figure).
Soudure
étanche
Dessicant
Aluminium imperméable
Cellophane
Eclaté de
l’emballage
spécifique
imperméable
La société Aventis Pasteur (Marcy l’Etoile, France)
a réalisé le traitement des géloses de contact à l’acide
peracétique dans leur isolateur de contrôle
qualité.
Après avoir été ensemencées par étalement, dans
un délai de 6 heures, à partir d’un inoculum de 10
à 100 UFC, les géloses ont été incubées pendant 72
heures à 28°C - 32°C. A la fin de l’incubation, une
numération des colonies obtenues sur chaque
boîte a été réalisée.
Souches étudiées % de récupération % de récupération
Irradiée ISOLATOR irradiée
Aspergillus Niger
ATCC 16404 121% 88%
Bacillus subtilis
ATCC 6633 106% 110%
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027 33% 62%
Candida albicans
ATCC 10231 111% 96%
Escherichia coli
ATCC 8739 46% 94%
% de récupération = Nombre moyen de colonies sur 12 boîtes
ayant subi le cycle de décontamination / Nombre moyen
de colonies sur 12 boîtes n’ayant pas subi le cycle de décontamination
x 100.
Selon les procédures qualité internes, le pourcentage
de récupération doit être ≥ à 50%. Cette
valeur tient compte d’un inoculum faible.
Les pourcentages de récupération inférieurs à 50%
obtenus pour les souches d’Escherichia coli et de
Pseudomonas aeruginosa avec les géloses de
contact en triple ensachage cellophane ont permis
de mettre en évidence la perméabilité de la cellophane
à l’acide peracétique ; perméabilité responsable
de la diminution de la fertilité des géloses.
Cette étude démontre que seul un emballage spécifique
imperméable à l’acide peracétique permet
de garantir un pourcentage de récupération
conforme à la spécification attendue. Ainsi, cet
emballage imperméable assure une fertilité optimale
garantie jusqu’à l’intérieur de l’isolateur. Ce
maintien de la fertilité des géloses permet d’éviter
tout risque potentiel de faux négatif. ■
Retrouvez tous les détails des conférences sur www.a3p.asso.fr
3

CONFERENCES
Retrouvez tous les détails des conférences sur www.a3p.asso.fr
4
Rita Bienati
rita.bienati.rb1@bayer-ag.de
Microbial
identification :
Implementation of
Biolog Microlog 3 in an
industrial
pharmaceutical
Laboratory for routine
identification
Dr. Bienati,
Bayer S.p.A. (Italy)
The purpose of the presentation
is to explain the criteria used to choose, validate
and make CFR 21, Part 11 compliant the
Microstation TM Identification System 4.2. We were
looking for a system that :
- could provide an identification with a broad database
of microorganisms,
- could permit to create site specific database with
common microorganisms specific for the site
- could potentially be 21 CFR Part11 compliant
The validation has been conducted according the
classic steps of IQ/OQ/PQ ; in particularly has been
focused the implementation of CFR 21, part 11
that in the latest years has been an item of large
interest, to arrive to an informatic management of
analytical data as required by FDA.
The presentation will outline the following areas
- Microbial identification: Issue in the pharmaceutical
Industry
- Validation of the System: Protocols IQ/OQ/PQ
- Approach to compliance CFR 21 Part 11
- Benefits of the system. ■
Richard Antonelli
genolife@genolife.com
Méthode
de quantification
des Legionella
Dr Richard Antonelli,
Société Genolife
A l’heure actuelle la norme
AFNOR de détection des
légionelles se base sur l'utilisation
de milieux sélectifs
permettant la croissance
de ces seules bactéries.
L’inconvénient majeur de cette approche réside
dans le fait qu’il faut 10 jours pour obtenir le résultat
d’analyse. Pour remédier à cela, une nouvelle
méthode de détection de légionelles, basée sur la
technique de PCR quantitative, a été développée
dans nos laboratoires.
Le principe repose sur une quantification du nombre
de légionelles présentes dans un échantillon
par détermination du nombre de copies d'un gène
(nombre de génome) spécifique de la bactérie à
quantifier. Pour cela nous disposons de primers
spécifiques permettant de détecter toutes les
Legionella et plus particulièrement les Legionella
pneumophila. L’ADN total de l’échantillon à tester
est extrait puis analysé par PCR quantitative (voir
la figure ci-après).
Protocole spécifique d'extraction d'ADN sur des
échantillons d'eau :
Un protocole spécifique a été développé suivant un
cahier des charges précis. Pour une récupération
efficace des bactéries présentes dans 1 litre d'eau,
la filtration sur membrane (0,45 µm de porosité) a
été retenue. Cette première étape de récupération
avec un filtre de 47 mm de diamètre implique de
travailler avec des volumes de l'ordre du millilitre
pour pouvoir effectuer efficacement la première
étape de lyse bactérienne. Mais attention, à la fin
du protocole d'extraction, le volume de la solution
d'ADN récupéré doit être le plus petit possible
pour éviter une diminution de la sensibilité de la
détection liée à une dilution de l'ADN extrait.
Notre protocole d'extraction d’ADN a été développé
sur colonnes de silice qui se présentent en barrettes
de 8 au format microplaque 96 positions. Ce
type d'extraction sur matrice de silice permet : (i)
de minimiser le volume de solution d'ADN élué
(inférieur à 100 µl),(ii) d'obtenir des rendements
d'extraction égaux à certains kits commerciaux
tout en étant adapté à des volumes en entrée
importants, et (iii) d’éliminer de façon optimale
les inhibiteurs de type ionique et protéique.
Suivant le nombre d'échantillons à traiter, le format
en barrettes de 8 et en plaques de 96 permet
une extraction manuelle ou automatique.
Protocole de quantification des Legionella spp
et Legionella pneumophila :
Comme dans la norme AFNOR actuelle (microbiologique),
la PCR quantitative des Legionella spp
peut être effectuée en premier et seuls les échantillons
positifs en Legionella seront quantifiés en
Legionella pneumophila par une deuxième PCR
quantitative. Un contrôle interne a été incorporé à
la PCR Legionella spp qui permet d’éviter le problème
des faux négatifs dus à la présence d'inhibiteurs
de la PCR. Ces PCR ont été validées sur plusieurs
appareils de PCR quantitative, notamment
le LightCycler de Roche et le SmartCycler de
Cepheid. Une norme AFNOR de quantification des
Legionella et Legionella pneumophila par PCR
quantitative est en phase d'écriture.
Bien sûr le principe de cette méthode peut être
adapté pour la quantification d'autres bactéries
présentes dans des échantillons environnementaux.
Par exemple, nous avons développé un test
de stérilité de semi-quantification des bactéries
viables utilisant la RT-PCR quantitative. ■
Anne-Elise Feuillet
faureingenierie.controle@dial.oleane.com
Faure Ingenierie
Anne-Elise Feuillet
Faure ingénierie est une
entreprise spécialisée dans
la conception, la réalisation
et la validation de
salle blanche. Prestataire
de service dans le domaine
du contrôle environnemental,
Faure Ingénierie propose
aujourd’hui, l’utilisation
d’une technique de
microbiologie alternative pour le dénombrement
de la flore totale, des levures et des moisissures :
le ChemScan RDI.
Le principe de cette technique est le marquage
individuel des micro-organismes, sans étape de
mise en culture, ce qui permet une évaluation plus
fiable, plus sensible et surtout plus rapide du nombre
de germes réellement présents dans l’échantillon.
Celle-ci s’applique parfaitement pour le contrôle
des eaux de process.
Exemple de missions types :
- Le suivi d’un réseau d’eaux de refroidissement
qui permet une nette amélioration de la maîtrise
de la contamination microbienne.
- La qualification d’une centrale de production
d’eau ultra pure lors de sa mise en route ou après
une intervention de maintenance.
De plus, grâce au nouveau «Polym’Air», mis au
point par Chemunex et AES Laboratoire, la technique
ChemScan dispose d’une application permettant
de mesurer l’aérobio-contamination et
bientôt la contamination de surface.
Couramment utilisée depuis maintenant 2 ans
dans le secteur de la microélectronique, Faure
Ingénierie souhaite développer cette technique
dans le domaine pharmaceutique. Pour cela, nous
proposons aux entreprises de réaliser leurs analyses
dans des conditions optimum (personnel expérimenté,
laboratoire ultra-propre dédié à l’activité
de microbiologie.)
Pour finir, certifié ISO9001 version 2000 depuis
mars 2001, l’activité contrôle de Faure Ingénierie
sera en conformité avec la norme ISO 17025 en
octobre 2003.
Pour toutes informations complémentaires vous
pouvez contacter :
Mlle Anne-Elise FEUILLET
faureingenierie.controle@dial.oleane.com. ■

CONFERENCES
John D. Marugg
john.marugg@rdls.nestle.com
Validation of
Alternative Methods
for Detection and
Identification of Foodborne
Pathogens
Dr John D. MARUGG,
NESTLE RESEARCH
CENTER
The development and commercialization
of alternative
or rapid microbiological
methods has been expanding
over recent years. As a result, a great number
of laboratories within the world (including Nestlé)
have been faced with increasing pressure from
manufacturers and suppliers to accept their
methods, kits, or systems. This has led to an
increased number of evaluations, that are, more
often than not, driven by the supplier, rather than
by a real need within the markets or laboratories.
Due to time and cost constraints, many of these
evaluations are limited in scope, and in many cases
they are neither systematically performed following
standardized protocols, nor are they properly
documented. The application of validated alternative
(or new) methods is necessary in accredited
laboratories and is becoming more and more a
requirement of authorities and customers.
The introduction and application of new and alternative
methods requires a standardised and systematic
comparison to reference and standard
methods (e.g. ISO/CEN standards). Several recognized
validation systems exist (e.g. AFNOR,
AOAC, NordVal, MicroVal), or will be implemented
in the near future (CEN/ISO) allowing for the performance
of standardised, formal validation studies.
However, in many cases “official validations”
are limited in scope, only assessing the technical
performance of the method (i.e. reliability, specificity,
sensitivity, accuracy, etc.), while excluding
workload- and cost considerations. Moreover, they
are focused on a small number of matrices, often
not including those that are relevant to Nestlé. For
these reasons, in the late nineties, NesVal (Nestlé
validation) has been introduced to provide a common
framework for the internal evaluation and
validation of new and alternative microbiological
methods. NesVal aims at complementing rather
than replacing recognized validation bodies, and
its procedures are applied to methods for foodborne
pathogens and microorganisms that are included
in release norms and monitoring studies of
processing lines and environment (HACCP). The
technical rules for assessment of the method performance
are based on MicroVal and ISO16140 procedures,
and include comparative and collaborative
trials with specific requirements for number of
samples, matrices, participating laboratories, statistical
evaluations, and reporting. After approval
by a technical expert committee, consisting of
experienced microbiologists, methods are implemented
as official Nestlé standards (Laboratory
Instructions) for general use within all Nestlé
laboratories.
To date, a wide variety of alternative detection
methods have been or are being reviewed by
NesVal. These include protein- (immunocapture,
Elisa), DNA- (PCR, hybridization), and culture-
(dehydrated agar variants, chromogenic media)
based detection methodologies. ■
Arnaud Carlotti
arnaud.carlotti@idmyk.com
Développement et
évaluation d’une puce à
ADN pour la détection
et l’identification de
différentes espèces de
levures et moisissures
en environnement
industriel
Dr. Arnaud CARLOTTI,
PhD, HDR,
IDmyk S.A.
Ces quinze dernières années, la microbiologie a
connu de profonds bouleversements. L’avènement
des techniques de biologie moléculaire a provoqué
des évolutions fondamentales de la taxonomie et
de la phylogénie des micro-organismes. Celles-ci
reposent désormais sur des bases principalement
moléculaires (caractéristiques de l’ADN). En corollaire,
ces évolutions ont eu d’importantes répercussions
dans le domaine de la microbiologie appliquée
avec la mise au point de nouveaux moyens de
diagnostic (sondes nucléiques, méthodes d’amplification
génique [PCR], méthodes de séquençage).
Ces méthodes «génétiques» se sont avérées plus
sensibles, plus fiables, plus rapides, plus justes et
plus robustes que les méthodes traditionnelles
«phénotypiques» de culture. Dans ce contexte, les
puces à ADN représentent l’un des développements
au plus fort potentiel. Elles reposent sur le
principe de l’hybridation moléculaire et marient
les nanotechnologies, l’électronique et l’informatique.
Après avoir donné une définition fonctionnelle
des puces à ADN et expliqué leur principe de
mise en œuvre, nous envisagerons succinctement
les principales technologies disponibles. Nous
aborderons ensuite les applications de ces puces à
ADN pour le diagnostic microbiologique à travers
l’exemple des prototypes de puces à ADN que nous
développons au sein d’IDmyk, pour la détection et
l’identification des levures et moisissures d’importance
industrielle.
Les puces à ADN peuvent être définies comme
étant des supports solides (verre, plastique, nylon)
de quelques centimètres carrés, sur lesquels sont
déposés de façon organisée (« adressage ») puis
fixés, plusieurs dizaines (faible densité) à plusieurs
milliers (haute densité) de fragments d’ADN
simple brin (les sondes).
Les puces à ADN permettent selon le principe de
la réaction d’hybridation*, la détection, l’identification
et la quantification de molécules d’acides
nucléiques de séquences complémentaires (les
cibles) aux séquences sondes. Dans les applications
diagnostic, les sondes «visent» des séquences
cibles spécifiques (d’un genre, d’une espèce, d’un
génotype).
La réaction d’hybridation est la formation de liaisons
hydrogène entre bases complémentaires (A::T
et G:::C) de deux séquences simple brin pour former
une molécule double brin (hybride ou duplex).
La stabilité de l’hybride dépend de la complémentarité
relative des séquences de chaque brin dans
les conditions retenues de force ionique, et de température
(conditions dites de stringence).
La mise en œuvre des puces requièrt le dépôt ou
la synthèse in situ et la fixation stable des séquences
sondes sur le support, l’hybridation avec les
séquences cibles et la détection des hybrides formés.
Celle-ci se fait par incorporation d’un marqueur
(fluorochrome, enzyme, haptène) dans
l’ADN cible préalablement à la réaction d’hybridation.
Le dépôt et la fixation des sondes sur le support
peuvent se faire selon trois méthodologies
principales : l’adressage mécanique (dépôts directes
des sondes sur le support et fixation à une position
déterminée : technologie des «spotter à
ADN») ; l’adressage électrochimique (fixation des
sondes sur des électrodes : technologie CEA-API-
BIO) ou par adressage photochimique (synthèse in
situ des sondes sur le support : technologie
Affymetrix). La détection de l’hybride sonde : cible
marquée se fait alors par mise en évidence d’une
fluorescence, d’une coloration ou d’une émission
de lumière. Les méthodes de détection varient
selon les marqueurs utilisés (lecteur scanner laser
pour les fluorochromes, camera CCD ou microscope
confocal pour les marqueurs générant une
coloration, ou les marqueurs chimioluminescents).
L’interprétation est automatisée avec des systèmes
d’analyse d’image.
La cible hybridée à la sonde apporte le marqueur
au site de fixation de la sonde. Un signal positif se
traduit donc par un point (« spot ») fluorescent,
coloré ou lumineux, selon la nature du marqueur, à
l’emplacement de la sonde sur le support (un
exemple est donné sur la figure 1).
G. candidum S1
G. candidum S2
C. Krusei
G. candidum S3
C1 C2 C3
Fig. 1. Détection-identification spécifiques de deux espèces de levures
simultanément sur le prototype IDmyk pour trois concentrations
décroissantes de sondes. Au total les sondes de 7 espèces différentes
étaient présentes sur la puce.
Cet emplacement est parfaitement déterminé
(adressage). Dans les applications diagnostic, la
spécificité des sondes immobilisées à différents
emplacements étant connue, tous les ADNs recherchés
de l’échantillon analysé sont identifiés simultanément
et par voie de conséquence les espèces
de micro-organismes qui leur correspondent. Il est
possible d’analyser de nombreuses espèces en
mélange (multiplexage) du fait de la spécificité
des sondes, sans culture préalable, sans isolement
et en un seul test. Si une étape d’amplification est
introduite initialement, la sensibilité du test est du
même ordre que celle de la PCR, donc très forte.
De nombreux acteurs interviennent dans ce domaine
des technologies de puces à ADN (AFFYME-
TRIX-bioMérieux, APIBIO, NANOGEN, INCYTE,
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5

CONFERENCES
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6
etc…), le choix de la technologie est dicté par la
nature et le nombre de paramètres (espèces) à
rechercher. Dans l’adressage mécanique de type
«spotter à ADN» les sondes (oligonucléotides ou
produits d’amplification) sont déposées sur le support
par un système d’aiguilles, à raison de
quelques nanolitres, en points («spots») d’environ
50-100 µm de diamètre, avec un pas (distance
entre deux points) d’environ 100-200 µm. Il est
ainsi possible de déposer plus de 1000 points de
sondes différentes par centimètre carré. Des
robots réalisent ces opérations automatiquement
avec des débits de plusieurs centaines de lames,
comportant près de 3000 points, en une douzaine
d’heures. Les principales étapes de l’analyse sur
puce à ADN sont les suivantes : l’ADN total de l’échantillon
analysé est extrait, marqué directement
ou amplifié (PCR, TMA) et marqué pendant l’étape
d’amplification, puis dénaturé (rendu simple brin)
et mis au contact de la surface du support où sont
fixées les sondes (simple brin) pour la réaction
d’hybridation dans des conditions définies (stringence).
Les brins complémentaires sonde : cible
s’hybrident. La sonde capture ainsi la cible qui
contient le marqueur de détection. Le support est
ensuite lavé afin d’éliminer les brins d’ADN cible
marqués qui ne se sont pas hybridés avec les sondes
(la complémentarité des séquences sonde :
cible n’était pas parfaite) pour ne garder que les
hybrides sonde : cible parfaitement complémentaire.
La puce est alors analysée dans son ensemble
par un système d’analyse d’image (lecteur
laser, camera CCD) et les signaux d’hybridation
sont interprétés (seuils, témoins, etc…). En raison
du très grand nombre de points à interpréter, l’outil
informatique est employé pour automatiser
cette étape. La lecture, l’interprétation et la quantification
des signaux ne prennent pas plus de 2
minutes en général avec les lecteurs laser par
exemple pour une puce comportant 3000 points.
Au sein d’IDmyk, dans le cadre de nos activités de
recherche et développement internes, j’ai choisi
une approche puce à ADN pour la détection et
l’identification de levures et moisissures d’importance
industrielle (contaminants environnementaux,
souches process). Elle met en œuvre les sondes
spécifiques que j’ai développées depuis plusieurs
années (Brevets A. CARLOTTI) et dont la
spécificité, la sensibilité et la robustesse ont été
établies précédemment (A. CARLOTTI et al. 1994-
2000). Nos premiers prototypes d’étude de faisabilité
ont été réalisés selon la technologie de dépôts
en points des sondes (« spotter ») sur support
nylon immobilisé sur lame de verre (format lame
objet de microscope). Les sondes étaient constituées
par des produits d’amplification et/ou des oligonucléotides.
Chaque sonde était déposée en triple
exemplaire à trois concentrations différentes.
Le marquage de la cible a été réalisé avec des fluorochromes
(e. g. Cyanines Cy3 et Cy5). La détection
a été réalisée sur un lecteur laser de type
GeneTAC LSIV. Le prototype initial comportait les
sondes spécifiques de 7 espèces de levures d’importance
majeure : Candia albicans, Candida
guilliermondii, Candia krusei, Candida parapsilosis,
Candia tropicalis, Debaryomyces hansenii
et Geotrichum candidum. Différents témoins
internes étaient inclus. Les résultats préliminaires
ont montré que notre prototype de puce à ADN
permettait bien la détection et l’identification
exacte de chacune des 7 espèces, seule ou en
mélange en 12-24h, aux trois concentrations de
sondes retenues. La plus faible concentration donnait
un signal fortement positif, ce qui est en
accord avec la sensibilité de détection des marqueurs
fluorescents avec le lecteur laser utilisé. Un
deuxième prototype, comportant les sondes spécifiques
de 19 espèces de levures et moisissures, présentant
un vif intérêt pour nos clients, est en cours
de développement. La spécificité des sondes est de
100 %, la sensibilité de 3 équivalents génomes (1 à
6 cellules) et la robustesse démontrée pour un rapport
de 1 cellule cible d’une espèce à 1000 cellules
cibles d’une deuxième espèce. Il est ainsi possible
de répondre sur la présence ou l’absence des 19
espèces recherchées spécifiquement en un temps
très court. Plus particulièrement, nous sommes en
mesure de déterminer si l’ADN des espèces fongiques
classées au niveau de risque biologique 2
(e.g. C. albicans, C. tropicalis et A. fumigatus) est
détecté ou non dans un échantillon, en un seul
essai.
L’approche puce à ADN permet donc de combiner
détection et identification de l’ADN des cellules de
levures et de moisissures présentes en mélange
dans un échantillon en 12-24h, sans culture préalable.
Il s’agit, à notre connaissance des premiers
prototypes réalisés de puces à ADN pour le diagnostic
des levures et/ou des moisissures, dans le
monde. L’intérêt majeur de ces outils diagnostics
que sont les puces à ADN, réside dans cette capacité
à rechercher spécifiquement en un seul test,
rapide, plusieurs espèces simultanément (plusieurs
paramètres) sans passer par les étapes longues et
fastidieuses d’isolement en culture pure. Ces outils
permettront d’étudier des cultures en mélange et
donc des micro-flores complexes. Il est maintenant
certain que diverses applications seront bientôt à
la disposition des microbiologistes industriels pour
le diagnostic microbiologique (analyse de l’eau
[Lyonnaise des eaux-bioMérieux], analyse des aliments,
analyse médicale [bioMérieux]). Les paramètres
recherchés comporteront les espèces bactériennes,
les gènes de résistance aux antibiotiques,
voire les marqueurs de typages (Troesh et
al. 1999 ; van Leuwen et al., 2003). En ce qui nous
concerne, notre objectif est de développer une puce
permettant la détection et l’identification de près
de 700 espèces de levures et moisissures d’ici 3 à 5
ans. Notre approche du diagnostic microbiologique
devrait donc se voir profondément changée dans le
futur proche. ■
Bibliographie
• A. CARLOTTI et al., Journal of Clinical Microbiology,
1994, 32, 1691-1699.
• A. CARLOTTI et al., Journal of Clinical Microbiology,
1996, 34, 1726-1731.
• A. CARLOTTI et al., Journal of Clinical Microbiology,
1997, 35, 1337-1343.
• A. CARLOTTI et al., Current Genetics, 1997, 31, 255-263.
• A. TROESCH et al., Journal of Clinical Microbiology,
1999, 37, 49-55.
• W. van LEEUWEN et al., Journal of Clinical Microbiology,
2003, 41, 3323-3326.
Julien Labbe
labbe_julien@allergan.com
Cinétique d’action
anti-microbienne :
méthode par ATP
bioluminescence
Julien Labbe,
Allergan R&D Europe
L’ATP bioluminescence est
une méthode utilisant les
propriétés de la réaction
enzymatique luciférine -
luciférase, c’est-à-dire la
consommation d’ATP proportionnelle au dégagement
de photons émis. La mesure de la quantité de
photons produits permet de définir une quantité
d’ATP présent dans un milieu réactionnel. L’ATP
étant un marqueur vivant des cellules procaryotes
et eucaryotes et elle peut être utilisée comme
moyen de mesure d’une concentration microbienne
dans un milieu.
Méthode Pall chek :
La réaction consiste à détruire la membrane cellulaire
afin de libérer l’ATP intracellulaire puis de
faire réagir la luciférase pour enfin mesurer la
quantité de photons émis. Le signal obtenu est
exprimé en Relative Light Unit (rlu).
En utilisant la méthode par filtration, il est possible
de se débarrasser de l’ATP extracellulaire par
rinçage de la membrane mais également de pouvoir
concentrer des échantillons (prise d’essai de
100 µl à 200 ml suivant la membrane).
L’ATP mesurée sur la membrane sera donc intracellulaire.
Souches testées
Précision
Exactitude
Spécificité
Limite de détection
Répétabilitié
Qualification :
Pour qualifier cette méthode, les références réglementaires
suivantes ont été utilisées : la PDA
Technical report n°33 ainsi que l’US pharmacopeial
previews / In-process revision, Volume 29(1)
Jan-Feb 2003 (Tableau ci-dessous).
Essais d’équivalence :
Le but de ces essais est de déterminer si l’ATP bioluminescence
peut être utilisée pour des mesures
d’activité bactéricide et fongicide.
S. aureus / C. albicans / A. niger
Coefficient de Variation (log) < 5% pour échantillons fortement ou faiblement contaminés.
Recouvrement de 100% +/- 30% jusqu’à un facteur de dilution de 5 log.
(Inoculum de départ : 6-7 log)
Signal proportionnel à la quantité de germes dans 4 matrices Allergan et 4 types d’eau de process.
Signal non proportionnel pour 2 bouillons de culture.
Dépendante du bruit de fond : 100 – 1000 cellules.
Signaux similaires que ce soit entre deux techniciens ou deux lots de réactifs.

CONFERENCES
La méthode de référence étant la norme AFNOR
EN1040/EN1275, des essais d’activité bactéricide
et fongicide ont été réalisés en parallèle sur différents
désinfectants.
Les spécifications attendues pour la norme AFNOR
sont exprimées en terme de réduction logarithmique
de la concentration en cfu/ml dans le produit.
Pour la méthode alternative, les résultats obtenus
sont exprimés en rlu/ml, il est donc nécessaire d’établir
la correspondance entre une valeur en cfu et
une valeur en rlu.
Les correspondances pour les germes utilisés sont :
Staphylococcus aureus : une réduction en cfu/ml de
5 log correspond à une réduction en rlu/ml de 4 log.
Candida albicans : une réduction en cfu/ml de 4 log
correspond à une réduction en rlu/ml de 3.8 log.
Les premiers essais concernent 4 produits monoactifs
:
• Deux (2) alcools : Isopropanol 70% et l’Ethanol
70%
• Un (1) oxydant : Le peroxyde d’hydrogène H2O2
30%
• Un (1) halogéné chloré : Hypochlorite de sodium
«Eau de Javel» 2.5%
Ces 4 produits sont testés à différentes dilutions :
100%, 50% et 25% et un contrôle négatif (NaCl
0.9%) est testé en parallèle.
L’effet bactéricide est mesuré après un temps de
contact de 5 minutes contre 10 minutes pour l’effet
fongicide.
Les résultats obtenus montrent que sur les 24
essais réalisés au total, une équivalence des résultats
de l’ordre de 83% est observée.
Pour les résultats divergents (26%), dans tous les
cas, la méthode par ATP bioluminescence
démontre qu’une concentration en désinfectant
plus importante est nécessaire pour avoir un effet
bactéricide/fongicide dans les spécifications par
rapport à la méthode classique.
De ce fait, en tenant compte des résultats obtenus
en ATP bioluminescence on maximalise l’effet bactéricide/fongicide
du produit.
De plus, la méthode alternative permet d’obtenir
des résultats en moins de 4 heures au lieu de 24 à
72h pour la méthode classique.
Essais de cinétique antimicrobienne sur un
mélange poly-actif commercial :
Des cinétiques d’activité sont effectuées sur deux
produits pour déterminer leur action bactéricide
et fongicide en présence de Staphylococcus
aureus et Candida albicans.
Un témoin positif, hypochlorite à 2.5% est testé en
parallèle.
Alors que le témoin donne un résultat attendu,
c’est-à-dire un effet bactéricide et fongicide conséquent
(>4 log de réduction log. en rlu/ml), les deux
produits commerciaux donnent en rlu/ml des
résultats non satisfaisants puisqu’on ne dépasse
pas la réduction logarithmique de 3 log, et cela
après un temps de contact de 30 minutes.
Si on teste ces mêmes produits par la méthode de
référence (AFNOR) ces produits passent les critères
attendus.
Ce qui voudrait donc signifier que l’ATP bioluminescence
permet de déterminer comme la méthode
classique une action bactéricide destructrice de
la membrane bactérienne (cf résultats du témoin
positif), mais elle permet de différencier une
action moins destructrice puisque l’on va pouvoir
détecter des germes qui sont encore présents mais
dont la membrane est fortement altérée au point
de libérer son ATP intracellulaire (signal obtenu
en rlu) et dans l’incapacité de se multiplier et de
former une colonie (résultats obtenus en cfu).
Conclusion :
La méthode par ATP bioluminescence passe les
critères de validation de PDA et s’avère être une
méthode simple, rapide, avec des limites variables
suivant le microorganisme (100-100 cellules) permettant
cependant de détecter de forte concentrations
de germes (106 – 108 cellules)
Dans le cadre d’une recherche d’activité bactéricide
/ fongicide, le Pall Chek permet au delà de la
simple recherche d’activité germicide, de définir si
le mode d’action du désinfectant passe par une
destruction complète du germe (lyse de la membrane)
ou par une altération de la membrane inhibant
ainsi sa multiplication, suivi de sa mort.
Dans le cadre par exemple d’une recherche de
désinfectants pour une salle propre, ce genre de
données peut jouer un rôle important dans le choix
à effectuer. ■
Michèle Vialette
michele.vialette@pasteur-lille.fr
Evaluation de
l’utilisation de souches
d’Escherichia coli
O157 :H7 marquées
à la GFP (Green
Fluorescent Protein)
en milieu liquide et sur
produit alimentaire
Michèle VIALETTE,
Institut Pasteur de Lille
Dans l'industrie agro-alimentaire,
il est important de connaître les écosystèmes
bactériens présents dans les matières premières
et dans les produits finis, et de maîtriser
leur développement au cours des différentes étapes
de fabrication. Sont en particulier très surveillés
les micro-organismes pathogènes pour le
consommateur, comme Listeria, Salmonella, etc.
En conséquence, les industriels étudient leurs processus
de fabrication, et l'influence qu'ils peuvent
avoir sur le développement d'un organisme contaminant
présent dans une matière première. Les
tests réalisés pour mesurer ces effets sont nommés
"challenge-tests".
Le principe du «challenge-test» est d'introduire de
façon expérimentale un micro-organisme donné,
dans une matière première donnée, et d'en observer
le comportement au cours d'un processus de
fabrication. Néanmoins, ce type d'expérience
nécessite de pouvoir identifier l'organisme considéré
dans la flore naturelle de la matière utilisée,
et surtout de le dénombrer afin de mesurer sa
croissance ou sa décroissance au cours de la fabrication.
Cette identification peut poser des difficultés
si l'organisme introduit possède des "proches
parents" dans la matière première (par exemple :
introduction d'un sérotype particulier
d'Escherichia coli dans un produit contenant des
coliformes), la spécificité de la détection pouvant
devenir très difficile, voire impossible. Il est alors
intéressant d'avoir des souches génétiquement
modifiées, présentant un caractère singulier qui,
par conséquent, les rende distinguables de leurs
"proches parents".
Ainsi, des souches d'Escherichia coli O157:H7,
vérotoxinogènes, ont été génétiquement modifiées
: les gènes codant pour la protéine verte fluorescente
de la méduse Aequorea victoria ont été
introduits (par transformation plasmidique), leur
conférant une fluorescence naturelle permettant
une numération spécifique, sans aucune préparation
particulière de l’échantillon. Ces souches sont
alors aisément utilisables dans le cadre de "challenge-tests".
En effet, le caractère GFP les distingue
de leurs éventuels homologues naturels, et de
plus permet un dénombrement de façon fiable et
rapide.
Cette étude a permis de vérifier d’une part, que la
transformation plasmidique n’influençait pas la présence
des gènes de vérotoxines (facteurs déterminants
de la pathogénicité des souches), et d’autre
part, que ce marquage n’influençait pas les caractéristiques
de croissance de la bactérie en fonction de
différents facteurs : la température, le pH, l’activité
de l’eau. La stabilité du plasmide a été démontrée
quel que soit l’environnement (en milieu liquide ou
sur produit alimentaire), et dans des conditions de
variations brusques de température. ■
7
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LA VAGUE - REVUE DE LIAISON DES ADHÉRENTS DE L’ASSOCIATION A3P. • A3P ASSOCIATION, BP 20116 45201 MONTARGIS • DIRECTEUR DE LA PUBLICATION : GÉRARD RUMPLER, PRÉSIDENT DE L’ASSOCIATION A3P •
RÉDACTRICE EN CHEF : MONIQUE DECRULLE • MEMBRES DU COMITÉ DE RÉDACTION : ERIC DRAPÉ, GÉRARD ECOTIERE, DIDIER MEYER. • COORDINATEURS TECHNIQUES : FRÉDÉRIC ESTASSY, THIERRY ZIMMER •
IMPRIMEUR ET GRAPHISTE : PHARMAPOST 573, AVENUE D’ANTIBES, B.P. 401 AMILLY, 45204 MONTARGIS • ASSOCIATION RÉGIE PAR LA LOI DE 1901. DÉPÔT LEGAL : AOÛT 2003. ISSN 1298-0471 • N° DE SIRET 388 277 923 000 16
Les articles publiés dans la revue n’engagent que la responsabilité de leurs auteurs.

ATELIERS INTERACTIFS
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AES/CHEMUNEX
guillaume.romestant@aeslaboratoire.com
Avec cette troisième participation consécutive aux
Rencontres de microbiologie AES laboratoire confirme
son engagement auprès d’A3P ainsi que sa politique de
développement de son offre technologique pour les secteurs
pharmaceutiques et cosmétiques.
Les ateliers interactifs AES laboratoire se sont articulés
autour de présentations théoriques de technologies
innovantes aussi diverses que la détection ou la numération
ultra rapide et sensible par cytométrie (gamme
Chemunex) ou l’identification microbienne fine
(gamme Biolog). Au-delà de ces aspects théoriques, la
présence, au sein de l’atelier, des automates et réactifs
concernés par les présentations ont permis la visualisation
concrète et pratique des technologies concernées,
assurant plus encore la dimension interactive
recherchée.
Identification Microbienne Biolog : performances et
sécurités.
Déjà fortement promue lors des précédentes
Rencontres de microbiologie A3P de Pau, la gamme de
systèmes d’identification Biolog poursuit sa progression
dans les secteurs de l’industrie pharmaceutique, cosmétique
et de leurs laboratoires prestataires.
La vocation d’origine « non exclusivement clinique » de
la technologie Biolog permet au laboratoire d’avoir
accès à l’identification de près de 2000 micro-organismes
dont 600 champignons filamenteux environ et 600
à 800 autres germes habituellement absents des bases
de données des systèmes d’identification plus traditionnels
présents sur le marché.
Par ailleurs, ses performances reconnues pour l’identification
de germes réputés difficiles (Bacillus,
Microcoques, Corynébactéries…) ainsi que la possibilité
offerte à l’utilisateur de réaliser ses propres bases
de données concourent à son succès dans le secteur
pharmaceutique où le monitoring des contaminations
environnementales est un enjeu majeur.
Au-delà de ces aspects primordiaux de performance
analytique, les systèmes Biolog répondent en outre à
des critères drastiques de sécurisation de traçabilité de
leurs logiciels de lecture / interprétation autorisant
leur compatibilité aux exigences cadres du « 21CFR
part 11 » de la FDA.
Ce dernier point a d’ailleurs fait l’objet d’une conférence
proposée en session plénière par Madame Bienati
(BAYER, Milan) venue partager son expérience de la
mise en œuvre et la validation du système Microlog 3
dans son laboratoire.
ChemScan RDI, microbiologie de l’air en temps réel :
La technique Chemunex principalement utilisée dans
le domaine pharmaceutique pour ses applications de
contrôle de biocharge et l’analyse des eaux de process
(résultats en moins de 2 heures) pourra très prochainement
s’étendre à de nouvelles applications. En effet,
ces 3 e rencontres A3P de Lille on été l’occasion pour
Chemunex de présenter son nouveau projet REM
(Rapide Environnemental Monitoring). Cette nouvelle
application reprend les bases de la technologie
Chemunex déjà établies depuis plus de 10 ans. Le
protocole présenté sous forme de film lors des ateliers
interactifs a ainsi permis aux différents participants de
mieux se rendre compte de la simplicité du protocole
et de la rapidité dans l’obtention des résultats.
L’utilisation du ChemScan RDI pour le contrôle de l’aérobiocontamination
est aujourd’hui rendue possible par
l’utilisation d’un Biopolymer hydrosoluble. Après dissolution
du Polym’Air, l’échantillon prélevé devient alors
filtrable et donc applicable au protocole ChemScan
RDI. Le Polym’Air conditionné actuellement sous un
format boîte de pétri (90 mm) est applicable à tout type
d’aérobiocollecteur. Cependant, la technique de fabrication
permettra demain d’envisager une présentation
sur différents formats, tel que boîte contact ou encore
écouvillon. Avec l’arrivée de ce nouveau concept
Polym’AIr, la microbiologie en temps réel permettra
très prochainement d’élargir son champ d’application
à l’ensemble des contrôles d’environnement dans l’industrie
pharmaceutique, Air, Eau et Surface. ■
BIOMÉRIEUX
gregoire_bonnefois@eu.biomerieux.com
BioMérieux conçoit, développe et commercialise une
gamme complète de milieux de culture prêts à l’emploi
et d’automates de bactériologie.
Dans le cadre des Rencontres A3P 2003, l’accent a été
mis sur les techniques rapides d’identification, pour
lesquelles bioMérieux se positionne comme le leader
mondial avec les marques universellement reconnues
API et VITEK.
Comme le précise Grégoire BONNEFOIS, Responsable
de Gamme Pharmaceutique et Cosmétique, l’identification
n’est pas toujours synonyme de « galerie, plaque
ou carte biochimique ». Depuis de nombreuses années,
les milieux de culture chromogènes permettent de
combiner en une seule étape culture et identification.
Le gain de temps et de manipulation induit renforce la
productivité analytique sans altérer la qualité d’identification.
La large gamme actuellement disponible permet
de couvrir les besoins pour une discrimination efficace
de la majeure partie des germes spécifiés, tant
bactériens que fongiques. BioMérieux, initiateur de ce
type de milieux, renforce actuellement sa gamme et
commercialise des boîtes chromogènes de deuxième
génération, aux performances culturales et discriminantes
renforcées.
« Le choix d’un automate d’identification est une étape
souvent décisive dans l’évolution technique des laboratoires
industriels de microbiologie » confie Grégoire
BONNEFOIS. Aussi convient-il de se poser les bonnes
questions lors de la rédaction du cahier des charges.
Les fournisseurs se contentent bien souvent de vanter
les mérites de leur système au regard du simple nombre
de taxons identifiables. « C’est occulter des notions
capitales telles que le mode de construction des bases
de données et la robustesse associée, la gestion du
contrôle qualité à réception, la composition biochimique
des cartes ou plaques qui conditionne directement
les potentiels réels du système et enfin la faculté
du système à établir bilans annuels et suivis de contamination
». Il est donc essentiel d’appréhender un système
selon la technologie biochimique qui lui est propre
et selon sa potentialité réelle à affranchir l’utilisateur
final des coûteuses et fastidieuses étapes de préparation
de l’échantillon et du temps masqué nécessaire
à l’exploitation des résultats sous forme de bilans.
Ces technologies sont les précurseurs des nouvelles
techniques d’identification basées non plus sur des
caractères phénotypiques mais génotypiques. C’est en
ce sens que se développe actuellement la technologie
des puces à ADN, avec une commercialisation prévue
dès le premier semestre 2004. Cette technique innovante,
basée sur la synthèse spécifique sur une puce de
un centimètre carré de plusieurs dizaines de séquences
cibles, permettra une identification quasi instantanée
d’espèces bactériennes, fongiques, virales mais également
la détermination d’espèces animales. « Le principe
même de cette technologie permettra de répondre
à une question ouverte « Qu’y a-t’il dans cet échantillon
? », autorisant par la même occasion une multidétermination
simultanée compatible avec les objectifs
de productivité des industriels. Cette technologie laisse
également place à l’adaptation de la technique au secteur
d’activité puisque la synthèse des oligonucléotides
cibles sur la puce peut être adaptée en fonction des exigences
de recherche ou d’identification. La capacité
maximale théorique de la surface d’une puce est de
400.000 séquences. Les premières applications concerneront
l’identification des espèces animales et OGM
constitutives des échantillons alimentaires, confie
Grégoire BONNEFOIS. ■
MILLIPORE
john_reed@millipore.com
Using Validation Guidelines to Facilitate the Regulatory
Acceptance of Rapid Microbiological Test Methods
In this presentation I will first of all discuss the benefits
of auditing the potential supplier of the Rapid
Microbiology test equipment or system. Then I will discuss
validation of that system using the Validation guidelines
available.
Auditing the Supplier:
A Rapid Microbiology Test System often comprises
many components including equipment (hardware),
consumables and reagents used during each test, a software
package to control the System and finally a
Validation package to facilitate the Validation of the
System. The sourcing, design and reliability of all of
these components should be scrutinized along with the
ability of the supplier to provide detailed technical support
and advice at both the initial installation stage and
on an ongoing basis.
The viability of the Supplier may be an important criteria.
After all if the supplier goes out of business or
undergoes a major re-structuring, then you may no longer
receive any further technical support or even consumable
supply for your Test System. There is of course
no easy way of predicting the future, but if your supplier
has been in this area of business for a long period of
time and has a strong reputation for supporting their

A TELIERS INTERACTIFS
customer base then this particular risk element may be
lower.
When it comes to actually implementing a Rapid
Microbiology Test System a number of criteria will
become very important and the ability of the supplier
to provide these should be established at the audit
stage.
Procedures and documentation for the following should
be available
1. Installation 4. Calibration
2. Operation 5. Service
3. Training
So finally the responsibility of the equipment supplier is
to validate their system according to USP or
, or PDA Technical Report 33 and be able to
provide the data to demonstrate this and to facilitate
customers to do the same.
Using the Validation Guidelines
USP /PDA TR33: Validation of Alternative
Microbiological Methods
These chapters give clear guidance on the following criteria
1. Accuracy 5. Linearity
2. Precision 6. Range
3. Specificity 7. Ruggedness
4. Quantification Limit 8. Robustness
I will discuss some of these criteria using the example
of the Millipore Microstar System. The Microstar is a
complete system for the detection and enumeration of
viable microorganisms in filterable samples. Typically
it takes only 1/4 to 1/3 the time of conventional
methods to achieve a comparable result.
The Microstar uses a traditional microbiology technique
(membrane filtration) coupled with ATP bioluminescence
and CCD image analysis to give you comparable
results to the compendial method, but within a
much shorter time frame. The Microstar can be used
for testing water, in-process product and final product
within the Pharmaceutical Industry.
Accuracy
Accuracy can be defined as the closeness of a test
result to the results predicted by the compendial
method. Accuracy is expressed as the percentage recovery
of microorganisms by the test method.
The alternate method must provide an estimate of not
less than 70% of the estimate provided by the compendial
method.
An example is shown below:
Organism Average Percent Recovery
E. coli 95
A. niger 127
P. aeruginosa 82
C. albicans 104
S. aureus 97
B. subtilis 108
Precision
Precision can be defined as the degree of agreement
among test results when the procedure is applied to
multiple samplings of suspensions of microorganisms
across the range of a test. These have been shown to be
equivalent when using Microstar to compendial
methods
Specificity
Specificity can be defined as the ability to detect a
range of microorganisms, which demonstrate that the
method is fit for purpose.
The method’s compatibility with the different types of
sample matrices should also be shown.
To determine this screen the method against a representative
range of microorganisms and a range of sample
types that are appropriate to the method.
Acceptance Criteria: All microorganisms selected as
representative are successfully detected and enumerated
in the sample matrices. The Microstar System has
successfully been used to detect a very wide range of
organisms in a huge range of sample matrices ranging
from the straightforward such as water to the more
challenging such as mammalian cell culture suspensions
Quantification Limit
Quantification Limit can be defined as the lowest number
of microorganisms that can be determined with
acceptable precision and accuracy under the stated
experimental conditions.
Z-Statistic and p-value determine whether or not data
are statistically similar. The following table illustrates
this.
Organism MicroStar HA MF Statistically
Similar?
E. coli 10.6 9.7 Yes
A. niger 9.6 8.2 Yes
P. aeruginosa 8.8 9.1 Yes
C. albicans 10.4 8.8 Yes
S. aureus 14.5 12.8 Yes
B. subtilis 8.0 7.0 Yes
Linearity and Range
Linearity can be defined as the ability of the test
method to elicit results, which are proportional to the
concentration of microorganisms present in the sample
within a given range. Microstar shows excellent linearity
up to counts of around 100 cfu per membrane. If
higher counts than this are expected a dilution step
may be recommended.
Ruggedness
Ruggedness can be defined as the degree of precision
of test results obtained by analysis of the same samples
under a variety of normal test conditions, such as different
analysts, different instruments, different lots of
reagent, etc. It is often best suited to determination by
the test supplier who has easy access to multiple instruments
and batches of components. Millipore has
conducted extensive testing using different reagent lots
on different Microstar equipment. Extensive shipping
trials have also been conducted on both reagents and
equipment
Robustness
Robustness can be defined as a measure of a method’s
capacity to remain unaffected by small, but deliberate
variations in method parameters, and provides an indication
of its reliability during normal usage. Again this
is often best suited to determination by the equipment
supplier. Millipore has validated many areas of robustness
in relation to the Microstar including false positive
rates and incubation times. The Microstar method has
been shown to be highly robust.
Finally to summarise, the implementation of a Rapid
Microbilogical Test Method can be achieved much more
smoothly by first of all a careful audit of the suppliers
capabilities and then by using these capabilities in
conjunction with the available regulatory guidelines to
validate your new test method. ■
9

EXPOSANTS
10
Charles River Laboratories
pprevost@iffa-credo.fr
La société Charles River Laboratories existe depuis cinquante
ans.
Elle emploie plus de 3000 personnes au niveau mondial,
sur 70 sites, pour un chiffre d’affaires en 2002 de 555
Millions de Dollars. Elle est cotée au New York Stock
Exchange.
Son siège est à Wilmington aux USA, et en France à
Saint-Germain sur l’Arbresles près de Lyon.
La France est la filiale européenne la plus importante,
avec un effectif de 280 personnes.
Ces quinze dernières années, les progrès de la Biologie
en général et de la Biologie Moléculaire en particulier
ont permis de développer de nouvelles plate-formes de
recherche.
Charles River Laboratories est à même d’apporter une
valeur ajoutée avec l’application de ces avancées technologiques
sous forme de produits et de services pour
la recherche pharmaceutique préclinique.
Le domaine du contrôle de qualité microbiologique
commence, lui aussi, à bénéficier de l’évolution des
techniques analytiques et biologiques.
Nous sommes présents sur ce secteur grâce à une équipe
dédiée à la recherche et le développement dans ce
domaine fortement règlementé.
En 2003, deux technologies sont venues compléter la
gamme de détection des pyrogènes pour le contrôle de
qualité pharmaceutique :
- l’IPT, alternative in vitro sur sang humain total au test
pyrogène effectué de façon classique sur le lapin
- le PTS, appareil portable pour doser les endotoxines
En France, une équipe de 15 personnes spécialisées
travaille sur le site.
Outre l’équipe en charge de la vente de réactifs et de
matériel permettant le dosage des agents pyrogènes,
notre laboratoire de service travaille depuis de nombreuses
années avec l’industrie pharmaceutique.
Le souci des exigences de l’assurance qualité et du
respect des délais motive l’équipe responsable du laboratoire.
En conclusion, il faudra retenir que Charles River
Laboratories a su conserver au cours du temps la réactivité
d’une entreprise de proximité tout en assurant
des moyens propres à une grande entreprise.
Nous pourrions parler longuement de l’histoire de cette
société, mais l’essentiel réside dans les faits :
Jim Foster est aujourd’hui CEO de la compagnie fondée
par son père il y a un demi-siècle.
Le journal Forbes et le Boston Globe ont consacré en
2002 l’esprit entrepreneur et les performances de la
société.
C’est donc au quotidien que nous souhaitons évoluer
avec un souci d’amélioration constante.
Pour plus d’information, veuillez consulter notre site
web : www.criver.com ■
ACM PHARMA,
la microbiologie au quotidien
acm.epm@wanadoo.fr
Située au coeur du Loiret à proximité des grands pôles
pharmaceutiques et cosmétiques qui ont donné à la
Région Centre l’un de ces domaines d’excellence, ACM
Pharma dispose d’un laboratoire entièrement dédié à
la microbiologie à l’usage des professionnels de la pharmacie,
de la cosmétique et de l’ultra-propre.
ACM Pharma a été individualisée de la société ACM
créée en 1990 par Martine et Eric Petat dont l’activité
en matière microbiologique couvrait l’ensemble des
secteurs pharmaceutiques et agro-alimentaires jusqu’en
1998. A partir des années 1996 – 1997 il devient
évident que les métiers de la microbiologie dans les
domaines agro-alimentaires et pharmaceutiques doivent
s’individualiser ; en effet si de nombreux points
sont communs entre les deux domaines (types de
micro-organismes, exigences et assurance de qualité,
réactivité…), les mises en œuvre techniques, l’organisation
du laboratoire et les besoins des clients diffèrent.
C’est ainsi qu’au début de l’année 1998 la S.A. ACM
Pharma est créée à Bellegarde sur le site d’ACM, rapidement
sont engagés les travaux de construction d’un
nouveau laboratoire spécialement dédié et adapté aux
exigences du contrôle microbiologique dans le domaine
pharmaceutique et cosmétique. Le nouveau plateau
technique dispose d’un ensemble de laboratoires en
atmosphère contrôlée (niveau classe D) et d’une zone
classe B pour les essais de stérilité. Cette structure est
conçue pour devenir établissement pharmaceutique et
prend en compte toutes les exigences BPF. Toutes les
analyses microbiologiques, contaminations microbiennes
sur produits ou dispositifs médicaux, essais d’efficacité
des conservateurs, essais d’activité antiseptiques,
essais de stérilité, dosages d’antibiotiques, identifications
de microorganismes … sont réalisées dans
des zones dédiées.
Les activités de contrôle microbiologique, qu’elles
soient agro-alimentaires ou pharmaceutiques, ont
conduit naturellement les deux entités à développer
des programmes de formation professionnelle dans les
domaines de la microbiologie, de l’assurance qualité en
laboratoire et des bonnes pratiques pour la maîtrise de
la contamination sur les lignes de production. Avec
l’acquisition de la société UPS Consultants en 1998, l’offre
de formation s’étend et couvre désormais aussi l’ultra-propreté.
UPS Consultants devient le pôle formation
unique des deux structures avec plus de 25 programmes
pour 2003 et de nombreuses nouveautés prévues en
2004. Au-delà des formations inter-entreprises, de nombreux
programmes sont spécialement adaptés en intraentreprise
pour répondre aux besoins de l’entreprise.
Des formations techniques en microbiologie sont développées
sur le site de Bellegarde grâce au plateau technique
d’ACM Pharma qui dispose des infrastructures
pour accueillir les stagiaires et compléter les programmes
théoriques par des applications pratiques mises en
œuvre par les stagiaires eux-mêmes.
Dès sa création le laboratoire engage une politique qualité
globale avec l’accréditation Cofrac et les BPL, l’objectif
final étant l’obtention du statut d’établissement
pharmaceutique pour ACM Pharma. Cet objectif est
atteint en février 2003, il s’agit d’une étape importante
pour l’entreprise qui renforce sa crédibilité auprès de
ses clients.
Au-delà de la mise en œuvre des analyses microbiologiques
traditionnelles en accord avec les principaux
référentiels (PE, USP, normes AFNOR et ISO …) ACM
pharma s’oriente résolument vers le développement de
méthodes alternatives pour répondre aux exigences
toujours croissantes des industriels en matière de
délais et de réactivité. Le laboratoire dispose d’un système
d’impédancemétrie qui a permis le développement
et la validation de méthodes de contrôle de contamination
microbienne sur de nombreux produits en
particulier cosmétiques. La mise en place prochaine
d’un appareil de cytométrie doit permettre d’ouvrir de
nouvelles prestations dans différents domaines dont le
contrôle microbiologique des eaux. Le secteur des identifications
est également constitué de systèmes automatisés
d’aide à l’identification qui donnent au laboratoire
une grande capacité en identification biochimique.
ACM Pharma avec une équipe motivée, des structures
techniques performantes et une grande connaissance
des différents domaines de la microbiologie industriel-

EXPOSANTS
le apporte aux industriels une offre globale en sous-traitance
de l’analyse à la formation en passant par les
conseils et l’assistance technique sur site. ACM Pharma
verra une progression significative de son activité en
2003 pour devenir à moyen terme leader dans sa spécialité
et le partenaire privilégié des industriels de la
pharmacie et de la cosmétique.
Avec ACM sarl qui dispose de deux sites (Bellegarde du
Loiret et Sablé sur Sarthe) et ACM Pharma près de 50
personnes oeuvrent quotidiennement pour répondre
aux attentes toujours plus grandes des industriels dans
les différents domaines de la microbiologie.
ACM PHARMA
Etablissement pharmaceutique fabricant F02/115
34, avenue du 21/08/1944
Contrôle microbiologique des médicaments
45270 BELLEGARDE
Tél : 02 38 90 41 01 - Fax : 02 38 90 25 92
Email : acm.epmf@wanadoo
Site : www.acmpharma.com
Vos interlocuteurs :
Eric A. PETAT, directeur scientifique
Sandrine LEMIUS, pharmacien responsable
Philippe TAILLEZ, Directeur qualité
Véronique ROBIN, Responsable technique du laboratoire ■
IDmyk
la carte d’identité moléculaire
de vos micro-organismes
arnaud.carlotti@idmyk.com
IDmyk est une start-up spécialisée dans l’identification
et le typage des bactéries, levures et moisissures par
méthodes moléculaires. Son objectif offrir aux industriels
une alternative avantageuse au diagnostic microbiologique
classique en ce qui concerne la rapidité d’analyse,
la fiabilité du résultat, la précision de l’identification
et la sensibilité de détection.
Fort de 15 années d’expérience en recherche dans le
domaine du diagnostic des micro-organismes, Arnaud
Carlotti, Maître de conférence des universités, PhD et
HDR, crée en juillet 2000 une entreprise spécialisée
dans l’analyse microbiologique (Pharmacie et
Agro-alimentaire). L’idée de se lancer dans l’aventure
germait depuis la fin des années 90. La loi Allègre
aidant, le soutien de la Chambre de Commerce et
d’Industrie de Lyon, le prix de la Fondation Aventis et
une aide de l’Anvar en poche, poussent la jeune start-up
sur le devant de la scène de l’industrie des biotechnologies.
Grâce à sa maîtrise de techniques de biologie
moléculaire, IDmyk peut réaliser des investigations
poussées (expertises), pour des industriels spécialisés
dans divers domaines. Polyvalente, l’entreprise lyonnaise
intervient, depuis trois ans, pour des grands groupes
comme Aventis ou des plus petits comme certains
industriels spécialisés dans la production de fromage.
Récemment primé dans le cadre du concours national
de la création d’entreprise organisé par le ministère de
la Recherche, Arnaud Carlotti prévoit un développement
rapide de sa société par la mise au point de puces
ADN pour le diagnostic des levures (premier prototype
achevé en 2002). Le diagnostic et le typage moléculaires
des levures et moisissures restent à ce jour son
domaine d’excellence particulier.
Souple de par sa taille, IDmyk est réactive, comme le
souligne son P.D.G., « nous sommes capables d’identifier
plus de 1600 espèces différentes de levures/moisissures
et plus de 2500 espèces différentes de bactéries.
La société peut même réagir dans la journée, quand l’échantillon
testé concerne un produit en cours de fabrication
et les résultats sont délivrés dans un délais de
4 heures à 48 heures selon le degré d’urgence de nos
clients ». Nos outils de typage moléculaire des souches
de micro-organismes (bactéries, levures et moisissures)
nous permettent de tracer pour nos clients les origines
et voies de contaminations de leurs produits, de manière
fiable, sensible, précise et rapide. Nous les aidons
ainsi à mettre en place au plus vite les actions correctives
qui s’imposent.
IDmyk met l’accent sur une activité forte en matière de
R&D et s’inscrit résolument dans une démarche de
prestations de service technique de pointe auprès des
industriels. Elle assure également une activité de formation
auprés de ses clients dans les domaines de la
biologie moléculaire et de la microbiologie. Enfin, des
actions de recherche et développement conjointes sont
en cours avec certains de ses clients.
IDmyk - Arnaud Carlotti - Batîment 4B
1,rue des vergers - 69760 Limonest
Tél : 04 37 49 93 51 - Fax : 04 37 49 93 62 ■
www.idmyk.fr
BD Diagnostic Systems
gaetan_villers@europe.bd.com
Notre objectif : Offrir une technologie toujours plus
innovante pour aider nos clients à mieux vivre leur
quotidien…
Présent sur les marchés de la microbiologie industrielle
et clinique, BD Diagnostic Systems propose à ses
clients des produits de haute qualité associés à une
volonté d'offrir le meilleur service.
En microbiologie clinique, la gamme BD Diagnostic
Systems s'adresse aux laboratoires de biologie médicale
privés et hospitaliers. Précurseur et novateur, BD est
un acteur majeur du diagnostic in-vitro avec un large
choix de réactifs et d'automates.
En microbiologie industrielle, BD propose un grand
choix de produits et de services destinés aux laboratoires
pharmaceutiques, cosmétiques et aux industries
agroalimentaires.
En 1997, l'acquisition des Laboratoires DIFCO a permis
à BD DS de compléter sa gamme de produits pour le
contrôle microbiologique, la recherche et développement,
ou encore la fermentation et la culture cellulaire.
Fort de son expérience, BD s'appuie sur un outil de production
unique au monde. Avec ses deux principales
unités situées en Allemagne et aux Etats-Unis, certifiées
ISO et FDA, BD offre ainsi à ses clients la qualité
et la rigueur qu'ils exigent.
Outre les milieux de routine conformes à la pharmacopée,
BD propose également une large gamme pour le
contrôle de stérilité. Géloses gamma irradiées, en double
et triple emballages pour le contrôle d'environnement
complètent l'offre de BD Diagnostic Systems. Aux
produits prêts à l'emploi, BD ajoute un grand nombre
de réactifs, milieux de culture DCM, ingrédients et peptones
pour vos applications en contrôle microbiologique,
R&D ou en bioproduction.
Enfin BD est également présent en identification grâce
à son nouvel automate BD Phoenix et son système de
galeries BD Crystal associées au lecteur automatique
BD Crystal Autoreader.
Dans un souci constant de mieux satisfaire ses clients,
BD s'engage, et dispose de nombreux services toujours
plus accessibles grâce aux nouvelles technologies de
l'information. Fortement impliqué dans le e-business,
BD met à votre disposition ses certificats d'analyses en
ligne et offre des services de passation et de suivi de
commande via internet.
Pour vous aider au quotidien, un attaché de clientèle
est à votre disposition pour répondre à vos questions
scientifiques et techniques. Un département Assurance
Qualité et Affaires Réglementaires peut aussi répondre
à vos demandes.
11

VISITE D’USINE
12
J.J. Huart
Directeur Général
de l’EFS Nord de France
jean-jacques.huart@efs.sante.fr
F. Schooneman
Responsable Enseignement
de l’EFS Nord de France
Après bien des hésitations et
des errances pendant plusieurs
siècles, la transfusion
sanguine n'a réellement pris
son essor qu'après la deuxième
guerre mondiale.
Elle est en effet devenue une
discipline médicale à part
entière aux carrefours de
nombreuses spécialités :
hématologie, immunologie,
virologie, génétique, biochimie,
physique…
Au travers de nombreuses réformes, les statuts juridiques et médico-techniques
des centres de transfusion ont évolué pour aboutir à
l'établissement unique "l'E.F.S." dans lequel se trouvent des E.F.S.
régionaux dont l'E.F.S. Nord de France (1 er janvier 2000). Après ces
périodes mouvementées, la transfusion sanguine doit retrouver ses
différents métiers en consolidant ses acquis (préparation de produits
sanguins labiles destinés à être transfusés) et en innovant :
fabrication de nouveaux produits sanguins, automatisation de certaines
technologies, études sur l'inactivation des agents pathogènes,
développement d'activités annexes (produits à usage non thérapeutique,
programme de thérapie cellulaire).
QUELQUES RAPPELS HISTORIQUES
Le C.R.T.S. de Lille a été fondé en 1947 (50 dons furent recueillis
cette année). Le professeur Maurice Goudemand, hématologue et
coagulationniste en a été le créateur et c’est à lui que l’on doit l’essentiel
de l’innovation de la Transfusion Sanguine Française.
1969 : Nouveaux locaux – Rue Camille Guérin – Lille. Dès lors, le
C.R.T.S. peut exercer pleinement l'ensemble des prérogatives de ses
domaines d'activités : collecte, contrôle, recherche, production,
fractionnement du plasma, fabrication de réactifs et enseignement.
Dans les années 1980, le C.R.T.S. connaît son apogée avec notamment
une industrie de fractionnement du plasma parmi les plus
importantes du monde (générant de nombreux brevets : 30). A cette
époque, le C.R.T.S. représente un pôle majeur d'activité avec 1500
personnes.
Beaucoup de produits de fractionnement ont été mis au point par
les équipes de Lille (restant d’ailleurs uniques en Europe et dans
le monde) : facteurs VIII et IX de très haute pureté (traitement des
hémophiles A et B), facteur XI, protéine C, alpha 1 anti trypsine.
C'est dans ce centre qu'ont été mises en place, pour la première fois
en France, les techniques d'inactivation virale dès 1984.
C’est donc ce Centre dont la devise est « du meilleur usage du sang
bénévolement donné qu’a été mise au point une chaîne longue de
fractionnement essentiellement basée sur la chromatographie
industrielle amenant à la purification d’une quinzaine de protéines
à usage thérapeutique les plus pures. Cette grande diversité de dérivés
plasmatiques permettant ainsi de répondre au concept d’hémothérapie
sélective amenant à chaque déficit son substitut spécifique
(facteurs VIII, IX, XI, VII, anti -thrombine III, protéine C, immunoglobulines
etc…….).
C’est à LILLE qu’a été décrite et appliquée en première mondiale la
technique validée d’inactivation virale (chauffage à sec en 1984,
traitement des fractions par solvant détergent SD à partir de 1986)
ou de diminution de la charge virale, voire prionique par nanofiltration
en 1991.
Ce même centre peut rappeler qu’il traitait dans ces périodes difficiles
et pleines d’incertitudes des années 80 une population de
malades atteints de déficit de la coagulation dont le taux de contamination
virale est un des plus faibles du monde civilisé.
Cette expérience de 20 ans permet de rappeler que plus de 80% des
malades français contaminés par les fractions coagulantes l’ont été
à partir de plasma étranger notamment par la plupart des leaders
du fractionnement mondial américain, allemand autrichien...
Cet élément a pratiquement et très curieusement passé sous silence.
Puis vint le temps des réformes (1993-2000).
A partir de 1993, les modifications ont visé à regrouper le maximum
de centres de transfusion sur tout le territoire.
C'est ainsi que le C.R.T.S. de Lille devient la plaque névralgique
d'un Groupement d'Intérêt Public régional Nord-Pas de Calais en
1995 de 180 sites de natures diverses et variées, on est donc passé à
40 GIP régionaux.
Ces GIP n'étaient qu'une étape sur la voie d'une véritable nationalisation
de l'activité transfusionnelle. C'est ainsi que naquit, le
1 er Janvier 2000, l'Etablissement Français du Sang (E.F.S.) opérateur
unique de la transfusion sanguine en France, regroupant 14
établissements régionaux en métropole et 14 en Outremer.
L'ancien GIP Nord-Pas de Calais se vit, quant à lui, adjoindre les
départements des Ardennes, de la Marne, de l'Aisne, de la Somme
et de l'Oise pour former l'E.F.S. Nord de France dont le siège est à
Lille.
SITUATION DE L'E.F.S. NORD DE FRANCE
C'est un établissement public de l'état dépendant directement du
Ministère de la Santé.
Il exerce de plein droit son autorité sur l'ensemble des activités
transfusionnelles : collecte, préparation, qualification et distributions
des produits sanguins aux établissement de soins.
A ces activités de base, s'ajoutent des activités connexes : activités
de soins, thérapie cellulaire (recueil de cellules souches périphériques),
activités de laboratoires (virologie, immuno-hématologie,
recherche et développement), fabrication de réactifs déjà initialisés
par la création de DIAGAST, pôle d’excellence dans l’art de la
transformation et la culture cellulaire.
SITUATION GEOGRAPHIQUE
E.F.S. Nord de France : 950 salariés
QUELQUES CHIFFRES
• 310 000 prélèvements/an ;
• 16 sites fixes de prélèvements ;
• 5800 collectes de sang ;
• 250 véhicules.
LES DEPARTEMENTS :
• Pas de Calais ;
• Nord ; 6.7 Millions d'habitants
• Oise ; 450 associations
• Aisne ; de donneurs de sang
• Ardennes ;
• Marne.
LE DONNEUR DE SANG
Il est au centre du dispositif transfusionnel. Son altruisme et sa
générosité ne se sont jamais relâchés au cours de notre longue histoire
transfusionnelle.
La notion de donneur de sang en France est fondée sur le bénévolat,
le volontariat, l'anonymat et le non profit.
Un service de promotion du don développé est nécessaire pour
informer, recruter et fidéliser les donneurs de sang.
De même, les associations de donneurs ont un rôle primordial pour
dynamiser les dons, informer et prendre part activement à l'organisation
de nos collectes mobiles.
Le donneur de sang doit être âgé de 18 à 65 ans (sang total et plasma)
et de 18 à 60 ans pour les autres types de dons.
Il doit être en bonne santé et ne doit pas avoir de contre-indication
au don qui pourrait nuire notamment au receveur (information prédon,
entretien médical pré-don, information post-don).
L'anonymat du donneur est préservé grâce à des numéros uniques
du donneur (le lien don/donneur est assuré à l'issue de l'entretien
médical).
Les critères d'éligibilité du donneur sont stricts et permettent d'assurer,
à la fois la sécurité transfusionnelle maximale et le respect
du principe de précaution.
Toute anomalie biologique diagnostiquée chez un donneur suscite
immédiatement une information et une orientation pour sa prise en
charge médicale.
LES DONS ET LES PRODUITS
Le prélèvement du sang se fait soit par technique manuelle (sang
total), soit par aphérèse (plasma, plaquettes). Cette technique d'aphérèse
nécessite une machine (séparateur de cellules) qui permet
d'obtenir le produit directement sans passer par les différentes étapes
de préparation. Le don de globules rouges d'aphérèse et l'aphérèse
combinée (2 produits) récemment validés se mettent en place
actuellement.
Le sang total passe par des différentes étapes (plateau de préparation).
La séparation des différents produits s'effectue par centrifugation.
L’E.F.S. Nord de France
Une entité publique au service des malades
Au terme de ces différentes séquences, on obtient 3 types de produits
sanguins labiles :
- concentré de globules rouges (conservé à +4°C) ;
- concentré de plaquettes (conservé à +22°C ± 2°C en agitation lente) ;
- plasma (conservé à –25°C – 30°C).
Tous ces produits doivent être déleucocytés.
La qualité de ces différentes prestations doit être conforme aux
bonnes pratiques de prélèvements et de préparation des produits
sanguins labiles (PSL).
LES MEDICAMENTS DERIVES DU SANG
Obtenus par fractionnement du plasma, c'est le LFB qui est en charge
de les fabriquer. Il s'agit essentiellement des facteurs de la
coagulation (VIII, IX, etc…) d'immunoglobulines et d'albumine.
Ils obéissent à la législation du médicament et sont distribués aux
pharmacies des hôpitaux.
LA QUALIFICATION
Des tests biologiques de qualification des PSL sont effectués sur
chaque produit issu du don. Il s'agit essentiellement de recherche
de présence de marqueurs viraux indirects ou directs, de détecter
toute anomalie du sang ou de ses composants (VIH, VHC, VHB,
syphilis, etc…).
On vérifie également le groupe sanguin érythrocytaire (rhésus ou
autre si besoin).
Passés ces tests de qualification, nous sommes soumis également à
des bonnes pratiques.
Les produits validés et étiquetés sont ensuite conservés et distribués
aux malades. Ceci nécessite un contrôle des conditions de
conservation et de transport (surtout respect de la température).
Une ordonnance nominative est nécessaire pour la cession des produits.
Toute information concernant le don est gardée en mémoire
dans notre informatique. Ces paramètres sont nécessaires au cas
où une enquête ascendante est initiée suite à un receveur
contaminé.
LA SECURITE TRANSFUSIONNELLE
Comme nous l'avons vu, elle s'exerce à tous les niveaux et doit permettre
de diminuer le risque de transmission de maladies infectieuses.
Ce risque résiduel demeure très faible actuellement. De
nombreuses mesures ont été également prises et préconisées dans
le cadre d'agent pouvant être transmis par le sang, prions, virus du
SRAS, agent de la fièvre du Nil.
Actuellement, de nouvelles mesures vont certainement être prises
pour diagnostiquer le risque bactérien (directement sur le produit,
technique d'inactivation des agents pathogènes Î Bleu de
Méthylène).
LES ACTIVITES ANNEXES
Parmi nos missions essentielles, l'autosuffisance et la valorisation
du don sont prioritaires. Nous développons donc un important secteur
de produits sanguins à usage non thérapeutique permettant à
des laboratoires de fabriquer des réactifs indispensables pour la
réalisation des tests biologiques.
Notre E.F.S. accueille des malades dans le cadre de son activité de
soins (saignées, échanges plasmatiques), soit dans le cadre de
recueil de cellules souches pour auto-greffe.
Nous comptons développer cette activité dans le cadre de la thérapie
cellulaire (photochimiothérapie extracorporelle, immunothérapie
adoptive).
Nous avons également une importante activité d'immuno-hématologie
receveurs (9 laboratoires) en cours d’accréditation.
L'E.F.S. Nord de France prend part également au développement
des nouvelles technologies de séparation du sang (évolution de nouveaux
séparateurs).
CONCLUSION
L'E.F.S. Nord de France assure, en priorité, ses missions de mise à
disposition de produits sanguins labiles pour les malades dans notre
région et la région Ile de France (solidarité inter-E.F.S.) et une multitude
d'autres activités permettant de valoriser notre région et
d'être toujours à la pointe de notre discipline.
Pour améliorer la qualité de nos prestations ainsi qu'harmoniser et
standardiser nos procédés, nous nous sommes engagés, depuis plusieurs
mois, dans la Certification. ■