La Vague N.4 - A3P

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CONFERENCES Retrouvez tous les détails des conférences sur www.a3p.asso.fr 6 etc…), le choix de la technologie est dicté par la nature et le nombre de paramètres (espèces) à rechercher. Dans l’adressage mécanique de type «spotter à ADN» les sondes (oligonucléotides ou produits d’amplification) sont déposées sur le support par un système d’aiguilles, à raison de quelques nanolitres, en points («spots») d’environ 50-100 µm de diamètre, avec un pas (distance entre deux points) d’environ 100-200 µm. Il est ainsi possible de déposer plus de 1000 points de sondes différentes par centimètre carré. Des robots réalisent ces opérations automatiquement avec des débits de plusieurs centaines de lames, comportant près de 3000 points, en une douzaine d’heures. Les principales étapes de l’analyse sur puce à ADN sont les suivantes : l’ADN total de l’échantillon analysé est extrait, marqué directement ou amplifié (PCR, TMA) et marqué pendant l’étape d’amplification, puis dénaturé (rendu simple brin) et mis au contact de la surface du support où sont fixées les sondes (simple brin) pour la réaction d’hybridation dans des conditions définies (stringence). Les brins complémentaires sonde : cible s’hybrident. La sonde capture ainsi la cible qui contient le marqueur de détection. Le support est ensuite lavé afin d’éliminer les brins d’ADN cible marqués qui ne se sont pas hybridés avec les sondes (la complémentarité des séquences sonde : cible n’était pas parfaite) pour ne garder que les hybrides sonde : cible parfaitement complémentaire. La puce est alors analysée dans son ensemble par un système d’analyse d’image (lecteur laser, camera CCD) et les signaux d’hybridation sont interprétés (seuils, témoins, etc…). En raison du très grand nombre de points à interpréter, l’outil informatique est employé pour automatiser cette étape. La lecture, l’interprétation et la quantification des signaux ne prennent pas plus de 2 minutes en général avec les lecteurs laser par exemple pour une puce comportant 3000 points. Au sein d’IDmyk, dans le cadre de nos activités de recherche et développement internes, j’ai choisi une approche puce à ADN pour la détection et l’identification de levures et moisissures d’importance industrielle (contaminants environnementaux, souches process). Elle met en œuvre les sondes spécifiques que j’ai développées depuis plusieurs années (Brevets A. CARLOTTI) et dont la spécificité, la sensibilité et la robustesse ont été établies précédemment (A. CARLOTTI et al. 1994- 2000). Nos premiers prototypes d’étude de faisabilité ont été réalisés selon la technologie de dépôts en points des sondes (« spotter ») sur support nylon immobilisé sur lame de verre (format lame objet de microscope). Les sondes étaient constituées par des produits d’amplification et/ou des oligonucléotides. Chaque sonde était déposée en triple exemplaire à trois concentrations différentes. Le marquage de la cible a été réalisé avec des fluorochromes (e. g. Cyanines Cy3 et Cy5). La détection a été réalisée sur un lecteur laser de type GeneTAC LSIV. Le prototype initial comportait les sondes spécifiques de 7 espèces de levures d’importance majeure : Candia albicans, Candida guilliermondii, Candia krusei, Candida parapsilosis, Candia tropicalis, Debaryomyces hansenii et Geotrichum candidum. Différents témoins internes étaient inclus. Les résultats préliminaires ont montré que notre prototype de puce à ADN permettait bien la détection et l’identification exacte de chacune des 7 espèces, seule ou en mélange en 12-24h, aux trois concentrations de sondes retenues. La plus faible concentration donnait un signal fortement positif, ce qui est en accord avec la sensibilité de détection des marqueurs fluorescents avec le lecteur laser utilisé. Un deuxième prototype, comportant les sondes spécifiques de 19 espèces de levures et moisissures, présentant un vif intérêt pour nos clients, est en cours de développement. La spécificité des sondes est de 100 %, la sensibilité de 3 équivalents génomes (1 à 6 cellules) et la robustesse démontrée pour un rapport de 1 cellule cible d’une espèce à 1000 cellules cibles d’une deuxième espèce. Il est ainsi possible de répondre sur la présence ou l’absence des 19 espèces recherchées spécifiquement en un temps très court. Plus particulièrement, nous sommes en mesure de déterminer si l’ADN des espèces fongiques classées au niveau de risque biologique 2 (e.g. C. albicans, C. tropicalis et A. fumigatus) est détecté ou non dans un échantillon, en un seul essai. L’approche puce à ADN permet donc de combiner détection et identification de l’ADN des cellules de levures et de moisissures présentes en mélange dans un échantillon en 12-24h, sans culture préalable. Il s’agit, à notre connaissance des premiers prototypes réalisés de puces à ADN pour le diagnostic des levures et/ou des moisissures, dans le monde. L’intérêt majeur de ces outils diagnostics que sont les puces à ADN, réside dans cette capacité à rechercher spécifiquement en un seul test, rapide, plusieurs espèces simultanément (plusieurs paramètres) sans passer par les étapes longues et fastidieuses d’isolement en culture pure. Ces outils permettront d’étudier des cultures en mélange et donc des micro-flores complexes. Il est maintenant certain que diverses applications seront bientôt à la disposition des microbiologistes industriels pour le diagnostic microbiologique (analyse de l’eau [Lyonnaise des eaux-bioMérieux], analyse des aliments, analyse médicale [bioMérieux]). Les paramètres recherchés comporteront les espèces bactériennes, les gènes de résistance aux antibiotiques, voire les marqueurs de typages (Troesh et al. 1999 ; van Leuwen et al., 2003). En ce qui nous concerne, notre objectif est de développer une puce permettant la détection et l’identification de près de 700 espèces de levures et moisissures d’ici 3 à 5 ans. Notre approche du diagnostic microbiologique devrait donc se voir profondément changée dans le futur proche. ■ Bibliographie • A. CARLOTTI et al., Journal of Clinical Microbiology, 1994, 32, 1691-1699. • A. CARLOTTI et al., Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34, 1726-1731. • A. CARLOTTI et al., Journal of Clinical Microbiology, 1997, 35, 1337-1343. • A. CARLOTTI et al., Current Genetics, 1997, 31, 255-263. • A. TROESCH et al., Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37, 49-55. • W. van LEEUWEN et al., Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41, 3323-3326. Julien Labbe labbe_julien@allergan.com Cinétique d’action anti-microbienne : méthode par ATP bioluminescence Julien Labbe, Allergan R&D Europe L’ATP bioluminescence est une méthode utilisant les propriétés de la réaction enzymatique luciférine - luciférase, c’est-à-dire la consommation d’ATP proportionnelle au dégagement de photons émis. La mesure de la quantité de photons produits permet de définir une quantité d’ATP présent dans un milieu réactionnel. L’ATP étant un marqueur vivant des cellules procaryotes et eucaryotes et elle peut être utilisée comme moyen de mesure d’une concentration microbienne dans un milieu. Méthode Pall chek : La réaction consiste à détruire la membrane cellulaire afin de libérer l’ATP intracellulaire puis de faire réagir la luciférase pour enfin mesurer la quantité de photons émis. Le signal obtenu est exprimé en Relative Light Unit (rlu). En utilisant la méthode par filtration, il est possible de se débarrasser de l’ATP extracellulaire par rinçage de la membrane mais également de pouvoir concentrer des échantillons (prise d’essai de 100 µl à 200 ml suivant la membrane). L’ATP mesurée sur la membrane sera donc intracellulaire. Souches testées Précision Exactitude Spécificité Limite de détection Répétabilitié Qualification : Pour qualifier cette méthode, les références réglementaires suivantes ont été utilisées : la PDA Technical report n°33 ainsi que l’US pharmacopeial previews / In-process revision, Volume 29(1) Jan-Feb 2003 (Tableau ci-dessous). Essais d’équivalence : Le but de ces essais est de déterminer si l’ATP bioluminescence peut être utilisée pour des mesures d’activité bactéricide et fongicide. S. aureus / C. albicans / A. niger Coefficient de Variation (log) < 5% pour échantillons fortement ou faiblement contaminés. Recouvrement de 100% +/- 30% jusqu’à un facteur de dilution de 5 log. (Inoculum de départ : 6-7 log) Signal proportionnel à la quantité de germes dans 4 matrices Allergan et 4 types d’eau de process. Signal non proportionnel pour 2 bouillons de culture. Dépendante du bruit de fond : 100 – 1000 cellules. Signaux similaires que ce soit entre deux techniciens ou deux lots de réactifs.
CONFERENCES La méthode de référence étant la norme AFNOR EN1040/EN1275, des essais d’activité bactéricide et fongicide ont été réalisés en parallèle sur différents désinfectants. Les spécifications attendues pour la norme AFNOR sont exprimées en terme de réduction logarithmique de la concentration en cfu/ml dans le produit. Pour la méthode alternative, les résultats obtenus sont exprimés en rlu/ml, il est donc nécessaire d’établir la correspondance entre une valeur en cfu et une valeur en rlu. Les correspondances pour les germes utilisés sont : Staphylococcus aureus : une réduction en cfu/ml de 5 log correspond à une réduction en rlu/ml de 4 log. Candida albicans : une réduction en cfu/ml de 4 log correspond à une réduction en rlu/ml de 3.8 log. Les premiers essais concernent 4 produits monoactifs : • Deux (2) alcools : Isopropanol 70% et l’Ethanol 70% • Un (1) oxydant : Le peroxyde d’hydrogène H2O2 30% • Un (1) halogéné chloré : Hypochlorite de sodium «Eau de Javel» 2.5% Ces 4 produits sont testés à différentes dilutions : 100%, 50% et 25% et un contrôle négatif (NaCl 0.9%) est testé en parallèle. L’effet bactéricide est mesuré après un temps de contact de 5 minutes contre 10 minutes pour l’effet fongicide. Les résultats obtenus montrent que sur les 24 essais réalisés au total, une équivalence des résultats de l’ordre de 83% est observée. Pour les résultats divergents (26%), dans tous les cas, la méthode par ATP bioluminescence démontre qu’une concentration en désinfectant plus importante est nécessaire pour avoir un effet bactéricide/fongicide dans les spécifications par rapport à la méthode classique. De ce fait, en tenant compte des résultats obtenus en ATP bioluminescence on maximalise l’effet bactéricide/fongicide du produit. De plus, la méthode alternative permet d’obtenir des résultats en moins de 4 heures au lieu de 24 à 72h pour la méthode classique. Essais de cinétique antimicrobienne sur un mélange poly-actif commercial : Des cinétiques d’activité sont effectuées sur deux produits pour déterminer leur action bactéricide et fongicide en présence de Staphylococcus aureus et Candida albicans. Un témoin positif, hypochlorite à 2.5% est testé en parallèle. Alors que le témoin donne un résultat attendu, c’est-à-dire un effet bactéricide et fongicide conséquent (>4 log de réduction log. en rlu/ml), les deux produits commerciaux donnent en rlu/ml des résultats non satisfaisants puisqu’on ne dépasse pas la réduction logarithmique de 3 log, et cela après un temps de contact de 30 minutes. Si on teste ces mêmes produits par la méthode de référence (AFNOR) ces produits passent les critères attendus. Ce qui voudrait donc signifier que l’ATP bioluminescence permet de déterminer comme la méthode classique une action bactéricide destructrice de la membrane bactérienne (cf résultats du témoin positif), mais elle permet de différencier une action moins destructrice puisque l’on va pouvoir détecter des germes qui sont encore présents mais dont la membrane est fortement altérée au point de libérer son ATP intracellulaire (signal obtenu en rlu) et dans l’incapacité de se multiplier et de former une colonie (résultats obtenus en cfu). Conclusion : La méthode par ATP bioluminescence passe les critères de validation de PDA et s’avère être une méthode simple, rapide, avec des limites variables suivant le microorganisme (100-100 cellules) permettant cependant de détecter de forte concentrations de germes (106 – 108 cellules) Dans le cadre d’une recherche d’activité bactéricide / fongicide, le Pall Chek permet au delà de la simple recherche d’activité germicide, de définir si le mode d’action du désinfectant passe par une destruction complète du germe (lyse de la membrane) ou par une altération de la membrane inhibant ainsi sa multiplication, suivi de sa mort. Dans le cadre par exemple d’une recherche de désinfectants pour une salle propre, ce genre de données peut jouer un rôle important dans le choix à effectuer. ■ Michèle Vialette michele.vialette@pasteur-lille.fr Evaluation de l’utilisation de souches d’Escherichia coli O157 :H7 marquées à la GFP (Green Fluorescent Protein) en milieu liquide et sur produit alimentaire Michèle VIALETTE, Institut Pasteur de Lille Dans l'industrie agro-alimentaire, il est important de connaître les écosystèmes bactériens présents dans les matières premières et dans les produits finis, et de maîtriser leur développement au cours des différentes étapes de fabrication. Sont en particulier très surveillés les micro-organismes pathogènes pour le consommateur, comme Listeria, Salmonella, etc. En conséquence, les industriels étudient leurs processus de fabrication, et l'influence qu'ils peuvent avoir sur le développement d'un organisme contaminant présent dans une matière première. Les tests réalisés pour mesurer ces effets sont nommés "challenge-tests". Le principe du «challenge-test» est d'introduire de façon expérimentale un micro-organisme donné, dans une matière première donnée, et d'en observer le comportement au cours d'un processus de fabrication. Néanmoins, ce type d'expérience nécessite de pouvoir identifier l'organisme considéré dans la flore naturelle de la matière utilisée, et surtout de le dénombrer afin de mesurer sa croissance ou sa décroissance au cours de la fabrication. Cette identification peut poser des difficultés si l'organisme introduit possède des "proches parents" dans la matière première (par exemple : introduction d'un sérotype particulier d'Escherichia coli dans un produit contenant des coliformes), la spécificité de la détection pouvant devenir très difficile, voire impossible. Il est alors intéressant d'avoir des souches génétiquement modifiées, présentant un caractère singulier qui, par conséquent, les rende distinguables de leurs "proches parents". Ainsi, des souches d'Escherichia coli O157:H7, vérotoxinogènes, ont été génétiquement modifiées : les gènes codant pour la protéine verte fluorescente de la méduse Aequorea victoria ont été introduits (par transformation plasmidique), leur conférant une fluorescence naturelle permettant une numération spécifique, sans aucune préparation particulière de l’échantillon. Ces souches sont alors aisément utilisables dans le cadre de "challenge-tests". En effet, le caractère GFP les distingue de leurs éventuels homologues naturels, et de plus permet un dénombrement de façon fiable et rapide. Cette étude a permis de vérifier d’une part, que la transformation plasmidique n’influençait pas la présence des gènes de vérotoxines (facteurs déterminants de la pathogénicité des souches), et d’autre part, que ce marquage n’influençait pas les caractéristiques de croissance de la bactérie en fonction de différents facteurs : la température, le pH, l’activité de l’eau. La stabilité du plasmide a été démontrée quel que soit l’environnement (en milieu liquide ou sur produit alimentaire), et dans des conditions de variations brusques de température. ■ 7 Retrouvez tous les détails des conférences sur www.a3p.asso.fr LA VAGUE - REVUE DE LIAISON DES ADHÉRENTS DE L’ASSOCIATION A3P. • A3P ASSOCIATION, BP 20116 45201 MONTARGIS • DIRECTEUR DE LA PUBLICATION : GÉRARD RUMPLER, PRÉSIDENT DE L’ASSOCIATION A3P • RÉDACTRICE EN CHEF : MONIQUE DECRULLE • MEMBRES DU COMITÉ DE RÉDACTION : ERIC DRAPÉ, GÉRARD ECOTIERE, DIDIER MEYER. • COORDINATEURS TECHNIQUES : FRÉDÉRIC ESTASSY, THIERRY ZIMMER • IMPRIMEUR ET GRAPHISTE : PHARMAPOST 573, AVENUE D’ANTIBES, B.P. 401 AMILLY, 45204 MONTARGIS • ASSOCIATION RÉGIE PAR LA LOI DE 1901. DÉPÔT LEGAL : AOÛT 2003. ISSN 1298-0471 • N° DE SIRET 388 277 923 000 16 Les articles publiés dans la revue n’engagent que la responsabilité de leurs auteurs.
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