La Vague N.4 - A3P

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CONFERENCES Retrouvez tous les détails des conférences sur www.a3p.asso.fr 4 Rita Bienati rita.bienati.rb1@bayer-ag.de Microbial identification : Implementation of Biolog Microlog 3 in an industrial pharmaceutical Laboratory for routine identification Dr. Bienati, Bayer S.p.A. (Italy) The purpose of the presentation is to explain the criteria used to choose, validate and make CFR 21, Part 11 compliant the Microstation TM Identification System 4.2. We were looking for a system that : - could provide an identification with a broad database of microorganisms, - could permit to create site specific database with common microorganisms specific for the site - could potentially be 21 CFR Part11 compliant The validation has been conducted according the classic steps of IQ/OQ/PQ ; in particularly has been focused the implementation of CFR 21, part 11 that in the latest years has been an item of large interest, to arrive to an informatic management of analytical data as required by FDA. The presentation will outline the following areas - Microbial identification: Issue in the pharmaceutical Industry - Validation of the System: Protocols IQ/OQ/PQ - Approach to compliance CFR 21 Part 11 - Benefits of the system. ■ Richard Antonelli genolife@genolife.com Méthode de quantification des Legionella Dr Richard Antonelli, Société Genolife A l’heure actuelle la norme AFNOR de détection des légionelles se base sur l'utilisation de milieux sélectifs permettant la croissance de ces seules bactéries. L’inconvénient majeur de cette approche réside dans le fait qu’il faut 10 jours pour obtenir le résultat d’analyse. Pour remédier à cela, une nouvelle méthode de détection de légionelles, basée sur la technique de PCR quantitative, a été développée dans nos laboratoires. Le principe repose sur une quantification du nombre de légionelles présentes dans un échantillon par détermination du nombre de copies d'un gène (nombre de génome) spécifique de la bactérie à quantifier. Pour cela nous disposons de primers spécifiques permettant de détecter toutes les Legionella et plus particulièrement les Legionella pneumophila. L’ADN total de l’échantillon à tester est extrait puis analysé par PCR quantitative (voir la figure ci-après). Protocole spécifique d'extraction d'ADN sur des échantillons d'eau : Un protocole spécifique a été développé suivant un cahier des charges précis. Pour une récupération efficace des bactéries présentes dans 1 litre d'eau, la filtration sur membrane (0,45 µm de porosité) a été retenue. Cette première étape de récupération avec un filtre de 47 mm de diamètre implique de travailler avec des volumes de l'ordre du millilitre pour pouvoir effectuer efficacement la première étape de lyse bactérienne. Mais attention, à la fin du protocole d'extraction, le volume de la solution d'ADN récupéré doit être le plus petit possible pour éviter une diminution de la sensibilité de la détection liée à une dilution de l'ADN extrait. Notre protocole d'extraction d’ADN a été développé sur colonnes de silice qui se présentent en barrettes de 8 au format microplaque 96 positions. Ce type d'extraction sur matrice de silice permet : (i) de minimiser le volume de solution d'ADN élué (inférieur à 100 µl),(ii) d'obtenir des rendements d'extraction égaux à certains kits commerciaux tout en étant adapté à des volumes en entrée importants, et (iii) d’éliminer de façon optimale les inhibiteurs de type ionique et protéique. Suivant le nombre d'échantillons à traiter, le format en barrettes de 8 et en plaques de 96 permet une extraction manuelle ou automatique. Protocole de quantification des Legionella spp et Legionella pneumophila : Comme dans la norme AFNOR actuelle (microbiologique), la PCR quantitative des Legionella spp peut être effectuée en premier et seuls les échantillons positifs en Legionella seront quantifiés en Legionella pneumophila par une deuxième PCR quantitative. Un contrôle interne a été incorporé à la PCR Legionella spp qui permet d’éviter le problème des faux négatifs dus à la présence d'inhibiteurs de la PCR. Ces PCR ont été validées sur plusieurs appareils de PCR quantitative, notamment le LightCycler de Roche et le SmartCycler de Cepheid. Une norme AFNOR de quantification des Legionella et Legionella pneumophila par PCR quantitative est en phase d'écriture. Bien sûr le principe de cette méthode peut être adapté pour la quantification d'autres bactéries présentes dans des échantillons environnementaux. Par exemple, nous avons développé un test de stérilité de semi-quantification des bactéries viables utilisant la RT-PCR quantitative. ■ Anne-Elise Feuillet faureingenierie.controle@dial.oleane.com Faure Ingenierie Anne-Elise Feuillet Faure ingénierie est une entreprise spécialisée dans la conception, la réalisation et la validation de salle blanche. Prestataire de service dans le domaine du contrôle environnemental, Faure Ingénierie propose aujourd’hui, l’utilisation d’une technique de microbiologie alternative pour le dénombrement de la flore totale, des levures et des moisissures : le ChemScan RDI. Le principe de cette technique est le marquage individuel des micro-organismes, sans étape de mise en culture, ce qui permet une évaluation plus fiable, plus sensible et surtout plus rapide du nombre de germes réellement présents dans l’échantillon. Celle-ci s’applique parfaitement pour le contrôle des eaux de process. Exemple de missions types : - Le suivi d’un réseau d’eaux de refroidissement qui permet une nette amélioration de la maîtrise de la contamination microbienne. - La qualification d’une centrale de production d’eau ultra pure lors de sa mise en route ou après une intervention de maintenance. De plus, grâce au nouveau «Polym’Air», mis au point par Chemunex et AES Laboratoire, la technique ChemScan dispose d’une application permettant de mesurer l’aérobio-contamination et bientôt la contamination de surface. Couramment utilisée depuis maintenant 2 ans dans le secteur de la microélectronique, Faure Ingénierie souhaite développer cette technique dans le domaine pharmaceutique. Pour cela, nous proposons aux entreprises de réaliser leurs analyses dans des conditions optimum (personnel expérimenté, laboratoire ultra-propre dédié à l’activité de microbiologie.) Pour finir, certifié ISO9001 version 2000 depuis mars 2001, l’activité contrôle de Faure Ingénierie sera en conformité avec la norme ISO 17025 en octobre 2003. Pour toutes informations complémentaires vous pouvez contacter : Mlle Anne-Elise FEUILLET faureingenierie.controle@dial.oleane.com. ■
CONFERENCES John D. Marugg john.marugg@rdls.nestle.com Validation of Alternative Methods for Detection and Identification of Foodborne Pathogens Dr John D. MARUGG, NESTLE RESEARCH CENTER The development and commercialization of alternative or rapid microbiological methods has been expanding over recent years. As a result, a great number of laboratories within the world (including Nestlé) have been faced with increasing pressure from manufacturers and suppliers to accept their methods, kits, or systems. This has led to an increased number of evaluations, that are, more often than not, driven by the supplier, rather than by a real need within the markets or laboratories. Due to time and cost constraints, many of these evaluations are limited in scope, and in many cases they are neither systematically performed following standardized protocols, nor are they properly documented. The application of validated alternative (or new) methods is necessary in accredited laboratories and is becoming more and more a requirement of authorities and customers. The introduction and application of new and alternative methods requires a standardised and systematic comparison to reference and standard methods (e.g. ISO/CEN standards). Several recognized validation systems exist (e.g. AFNOR, AOAC, NordVal, MicroVal), or will be implemented in the near future (CEN/ISO) allowing for the performance of standardised, formal validation studies. However, in many cases “official validations” are limited in scope, only assessing the technical performance of the method (i.e. reliability, specificity, sensitivity, accuracy, etc.), while excluding workload- and cost considerations. Moreover, they are focused on a small number of matrices, often not including those that are relevant to Nestlé. For these reasons, in the late nineties, NesVal (Nestlé validation) has been introduced to provide a common framework for the internal evaluation and validation of new and alternative microbiological methods. NesVal aims at complementing rather than replacing recognized validation bodies, and its procedures are applied to methods for foodborne pathogens and microorganisms that are included in release norms and monitoring studies of processing lines and environment (HACCP). The technical rules for assessment of the method performance are based on MicroVal and ISO16140 procedures, and include comparative and collaborative trials with specific requirements for number of samples, matrices, participating laboratories, statistical evaluations, and reporting. After approval by a technical expert committee, consisting of experienced microbiologists, methods are implemented as official Nestlé standards (Laboratory Instructions) for general use within all Nestlé laboratories. To date, a wide variety of alternative detection methods have been or are being reviewed by NesVal. These include protein- (immunocapture, Elisa), DNA- (PCR, hybridization), and culture- (dehydrated agar variants, chromogenic media) based detection methodologies. ■ Arnaud Carlotti arnaud.carlotti@idmyk.com Développement et évaluation d’une puce à ADN pour la détection et l’identification de différentes espèces de levures et moisissures en environnement industriel Dr. Arnaud CARLOTTI, PhD, HDR, IDmyk S.A. Ces quinze dernières années, la microbiologie a connu de profonds bouleversements. L’avènement des techniques de biologie moléculaire a provoqué des évolutions fondamentales de la taxonomie et de la phylogénie des micro-organismes. Celles-ci reposent désormais sur des bases principalement moléculaires (caractéristiques de l’ADN). En corollaire, ces évolutions ont eu d’importantes répercussions dans le domaine de la microbiologie appliquée avec la mise au point de nouveaux moyens de diagnostic (sondes nucléiques, méthodes d’amplification génique [PCR], méthodes de séquençage). Ces méthodes «génétiques» se sont avérées plus sensibles, plus fiables, plus rapides, plus justes et plus robustes que les méthodes traditionnelles «phénotypiques» de culture. Dans ce contexte, les puces à ADN représentent l’un des développements au plus fort potentiel. Elles reposent sur le principe de l’hybridation moléculaire et marient les nanotechnologies, l’électronique et l’informatique. Après avoir donné une définition fonctionnelle des puces à ADN et expliqué leur principe de mise en œuvre, nous envisagerons succinctement les principales technologies disponibles. Nous aborderons ensuite les applications de ces puces à ADN pour le diagnostic microbiologique à travers l’exemple des prototypes de puces à ADN que nous développons au sein d’IDmyk, pour la détection et l’identification des levures et moisissures d’importance industrielle. Les puces à ADN peuvent être définies comme étant des supports solides (verre, plastique, nylon) de quelques centimètres carrés, sur lesquels sont déposés de façon organisée (« adressage ») puis fixés, plusieurs dizaines (faible densité) à plusieurs milliers (haute densité) de fragments d’ADN simple brin (les sondes). Les puces à ADN permettent selon le principe de la réaction d’hybridation*, la détection, l’identification et la quantification de molécules d’acides nucléiques de séquences complémentaires (les cibles) aux séquences sondes. Dans les applications diagnostic, les sondes «visent» des séquences cibles spécifiques (d’un genre, d’une espèce, d’un génotype). La réaction d’hybridation est la formation de liaisons hydrogène entre bases complémentaires (A::T et G:::C) de deux séquences simple brin pour former une molécule double brin (hybride ou duplex). La stabilité de l’hybride dépend de la complémentarité relative des séquences de chaque brin dans les conditions retenues de force ionique, et de température (conditions dites de stringence). La mise en œuvre des puces requièrt le dépôt ou la synthèse in situ et la fixation stable des séquences sondes sur le support, l’hybridation avec les séquences cibles et la détection des hybrides formés. Celle-ci se fait par incorporation d’un marqueur (fluorochrome, enzyme, haptène) dans l’ADN cible préalablement à la réaction d’hybridation. Le dépôt et la fixation des sondes sur le support peuvent se faire selon trois méthodologies principales : l’adressage mécanique (dépôts directes des sondes sur le support et fixation à une position déterminée : technologie des «spotter à ADN») ; l’adressage électrochimique (fixation des sondes sur des électrodes : technologie CEA-API- BIO) ou par adressage photochimique (synthèse in situ des sondes sur le support : technologie Affymetrix). La détection de l’hybride sonde : cible marquée se fait alors par mise en évidence d’une fluorescence, d’une coloration ou d’une émission de lumière. Les méthodes de détection varient selon les marqueurs utilisés (lecteur scanner laser pour les fluorochromes, camera CCD ou microscope confocal pour les marqueurs générant une coloration, ou les marqueurs chimioluminescents). L’interprétation est automatisée avec des systèmes d’analyse d’image. La cible hybridée à la sonde apporte le marqueur au site de fixation de la sonde. Un signal positif se traduit donc par un point (« spot ») fluorescent, coloré ou lumineux, selon la nature du marqueur, à l’emplacement de la sonde sur le support (un exemple est donné sur la figure 1). G. candidum S1 G. candidum S2 C. Krusei G. candidum S3 C1 C2 C3 Fig. 1. Détection-identification spécifiques de deux espèces de levures simultanément sur le prototype IDmyk pour trois concentrations décroissantes de sondes. Au total les sondes de 7 espèces différentes étaient présentes sur la puce. Cet emplacement est parfaitement déterminé (adressage). Dans les applications diagnostic, la spécificité des sondes immobilisées à différents emplacements étant connue, tous les ADNs recherchés de l’échantillon analysé sont identifiés simultanément et par voie de conséquence les espèces de micro-organismes qui leur correspondent. Il est possible d’analyser de nombreuses espèces en mélange (multiplexage) du fait de la spécificité des sondes, sans culture préalable, sans isolement et en un seul test. Si une étape d’amplification est introduite initialement, la sensibilité du test est du même ordre que celle de la PCR, donc très forte. De nombreux acteurs interviennent dans ce domaine des technologies de puces à ADN (AFFYME- TRIX-bioMérieux, APIBIO, NANOGEN, INCYTE, Retrouvez tous les détails des conférences sur www.a3p.asso.fr 5
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