La Vague N.4 - A3P

CONFERENCES
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Rita Bienati
rita.bienati.rb1@bayer-ag.de
Microbial
identification :
Implementation of
Biolog Microlog 3 in an
industrial
pharmaceutical
Laboratory for routine
identification
Dr. Bienati,
Bayer S.p.A. (Italy)
The purpose of the presentation
is to explain the criteria used to choose, validate
and make CFR 21, Part 11 compliant the
Microstation TM Identification System 4.2. We were
looking for a system that :
- could provide an identification with a broad database
of microorganisms,
- could permit to create site specific database with
common microorganisms specific for the site
- could potentially be 21 CFR Part11 compliant
The validation has been conducted according the
classic steps of IQ/OQ/PQ ; in particularly has been
focused the implementation of CFR 21, part 11
that in the latest years has been an item of large
interest, to arrive to an informatic management of
analytical data as required by FDA.
The presentation will outline the following areas
- Microbial identification: Issue in the pharmaceutical
Industry
- Validation of the System: Protocols IQ/OQ/PQ
- Approach to compliance CFR 21 Part 11
- Benefits of the system. ■
Richard Antonelli
genolife@genolife.com
Méthode
de quantification
des Legionella
Dr Richard Antonelli,
Société Genolife
A l’heure actuelle la norme
AFNOR de détection des
légionelles se base sur l'utilisation
de milieux sélectifs
permettant la croissance
de ces seules bactéries.
L’inconvénient majeur de cette approche réside
dans le fait qu’il faut 10 jours pour obtenir le résultat
d’analyse. Pour remédier à cela, une nouvelle
méthode de détection de légionelles, basée sur la
technique de PCR quantitative, a été développée
dans nos laboratoires.
Le principe repose sur une quantification du nombre
de légionelles présentes dans un échantillon
par détermination du nombre de copies d'un gène
(nombre de génome) spécifique de la bactérie à
quantifier. Pour cela nous disposons de primers
spécifiques permettant de détecter toutes les
Legionella et plus particulièrement les Legionella
pneumophila. L’ADN total de l’échantillon à tester
est extrait puis analysé par PCR quantitative (voir
la figure ci-après).
Protocole spécifique d'extraction d'ADN sur des
échantillons d'eau :
Un protocole spécifique a été développé suivant un
cahier des charges précis. Pour une récupération
efficace des bactéries présentes dans 1 litre d'eau,
la filtration sur membrane (0,45 µm de porosité) a
été retenue. Cette première étape de récupération
avec un filtre de 47 mm de diamètre implique de
travailler avec des volumes de l'ordre du millilitre
pour pouvoir effectuer efficacement la première
étape de lyse bactérienne. Mais attention, à la fin
du protocole d'extraction, le volume de la solution
d'ADN récupéré doit être le plus petit possible
pour éviter une diminution de la sensibilité de la
détection liée à une dilution de l'ADN extrait.
Notre protocole d'extraction d’ADN a été développé
sur colonnes de silice qui se présentent en barrettes
de 8 au format microplaque 96 positions. Ce
type d'extraction sur matrice de silice permet : (i)
de minimiser le volume de solution d'ADN élué
(inférieur à 100 µl),(ii) d'obtenir des rendements
d'extraction égaux à certains kits commerciaux
tout en étant adapté à des volumes en entrée
importants, et (iii) d’éliminer de façon optimale
les inhibiteurs de type ionique et protéique.
Suivant le nombre d'échantillons à traiter, le format
en barrettes de 8 et en plaques de 96 permet
une extraction manuelle ou automatique.
Protocole de quantification des Legionella spp
et Legionella pneumophila :
Comme dans la norme AFNOR actuelle (microbiologique),
la PCR quantitative des Legionella spp
peut être effectuée en premier et seuls les échantillons
positifs en Legionella seront quantifiés en
Legionella pneumophila par une deuxième PCR
quantitative. Un contrôle interne a été incorporé à
la PCR Legionella spp qui permet d’éviter le problème
des faux négatifs dus à la présence d'inhibiteurs
de la PCR. Ces PCR ont été validées sur plusieurs
appareils de PCR quantitative, notamment
le LightCycler de Roche et le SmartCycler de
Cepheid. Une norme AFNOR de quantification des
Legionella et Legionella pneumophila par PCR
quantitative est en phase d'écriture.
Bien sûr le principe de cette méthode peut être
adapté pour la quantification d'autres bactéries
présentes dans des échantillons environnementaux.
Par exemple, nous avons développé un test
de stérilité de semi-quantification des bactéries
viables utilisant la RT-PCR quantitative. ■
Anne-Elise Feuillet
faureingenierie.controle@dial.oleane.com
Faure Ingenierie
Anne-Elise Feuillet
Faure ingénierie est une
entreprise spécialisée dans
la conception, la réalisation
et la validation de
salle blanche. Prestataire
de service dans le domaine
du contrôle environnemental,
Faure Ingénierie propose
aujourd’hui, l’utilisation
d’une technique de
microbiologie alternative pour le dénombrement
de la flore totale, des levures et des moisissures :
le ChemScan RDI.
Le principe de cette technique est le marquage
individuel des micro-organismes, sans étape de
mise en culture, ce qui permet une évaluation plus
fiable, plus sensible et surtout plus rapide du nombre
de germes réellement présents dans l’échantillon.
Celle-ci s’applique parfaitement pour le contrôle
des eaux de process.
Exemple de missions types :
- Le suivi d’un réseau d’eaux de refroidissement
qui permet une nette amélioration de la maîtrise
de la contamination microbienne.
- La qualification d’une centrale de production
d’eau ultra pure lors de sa mise en route ou après
une intervention de maintenance.
De plus, grâce au nouveau «Polym’Air», mis au
point par Chemunex et AES Laboratoire, la technique
ChemScan dispose d’une application permettant
de mesurer l’aérobio-contamination et
bientôt la contamination de surface.
Couramment utilisée depuis maintenant 2 ans
dans le secteur de la microélectronique, Faure
Ingénierie souhaite développer cette technique
dans le domaine pharmaceutique. Pour cela, nous
proposons aux entreprises de réaliser leurs analyses
dans des conditions optimum (personnel expérimenté,
laboratoire ultra-propre dédié à l’activité
de microbiologie.)
Pour finir, certifié ISO9001 version 2000 depuis
mars 2001, l’activité contrôle de Faure Ingénierie
sera en conformité avec la norme ISO 17025 en
octobre 2003.
Pour toutes informations complémentaires vous
pouvez contacter :
Mlle Anne-Elise FEUILLET
faureingenierie.controle@dial.oleane.com. ■