La Vague N.4 - A3P

CONFERENCES
La méthode de référence étant la norme AFNOR
EN1040/EN1275, des essais d’activité bactéricide
et fongicide ont été réalisés en parallèle sur différents
désinfectants.
Les spécifications attendues pour la norme AFNOR
sont exprimées en terme de réduction logarithmique
de la concentration en cfu/ml dans le produit.
Pour la méthode alternative, les résultats obtenus
sont exprimés en rlu/ml, il est donc nécessaire d’établir
la correspondance entre une valeur en cfu et
une valeur en rlu.
Les correspondances pour les germes utilisés sont :
Staphylococcus aureus : une réduction en cfu/ml de
5 log correspond à une réduction en rlu/ml de 4 log.
Candida albicans : une réduction en cfu/ml de 4 log
correspond à une réduction en rlu/ml de 3.8 log.
Les premiers essais concernent 4 produits monoactifs
:
• Deux (2) alcools : Isopropanol 70% et l’Ethanol
70%
• Un (1) oxydant : Le peroxyde d’hydrogène H2O2
30%
• Un (1) halogéné chloré : Hypochlorite de sodium
«Eau de Javel» 2.5%
Ces 4 produits sont testés à différentes dilutions :
100%, 50% et 25% et un contrôle négatif (NaCl
0.9%) est testé en parallèle.
L’effet bactéricide est mesuré après un temps de
contact de 5 minutes contre 10 minutes pour l’effet
fongicide.
Les résultats obtenus montrent que sur les 24
essais réalisés au total, une équivalence des résultats
de l’ordre de 83% est observée.
Pour les résultats divergents (26%), dans tous les
cas, la méthode par ATP bioluminescence
démontre qu’une concentration en désinfectant
plus importante est nécessaire pour avoir un effet
bactéricide/fongicide dans les spécifications par
rapport à la méthode classique.
De ce fait, en tenant compte des résultats obtenus
en ATP bioluminescence on maximalise l’effet bactéricide/fongicide
du produit.
De plus, la méthode alternative permet d’obtenir
des résultats en moins de 4 heures au lieu de 24 à
72h pour la méthode classique.
Essais de cinétique antimicrobienne sur un
mélange poly-actif commercial :
Des cinétiques d’activité sont effectuées sur deux
produits pour déterminer leur action bactéricide
et fongicide en présence de Staphylococcus
aureus et Candida albicans.
Un témoin positif, hypochlorite à 2.5% est testé en
parallèle.
Alors que le témoin donne un résultat attendu,
c’est-à-dire un effet bactéricide et fongicide conséquent
(>4 log de réduction log. en rlu/ml), les deux
produits commerciaux donnent en rlu/ml des
résultats non satisfaisants puisqu’on ne dépasse
pas la réduction logarithmique de 3 log, et cela
après un temps de contact de 30 minutes.
Si on teste ces mêmes produits par la méthode de
référence (AFNOR) ces produits passent les critères
attendus.
Ce qui voudrait donc signifier que l’ATP bioluminescence
permet de déterminer comme la méthode
classique une action bactéricide destructrice de
la membrane bactérienne (cf résultats du témoin
positif), mais elle permet de différencier une
action moins destructrice puisque l’on va pouvoir
détecter des germes qui sont encore présents mais
dont la membrane est fortement altérée au point
de libérer son ATP intracellulaire (signal obtenu
en rlu) et dans l’incapacité de se multiplier et de
former une colonie (résultats obtenus en cfu).
Conclusion :
La méthode par ATP bioluminescence passe les
critères de validation de PDA et s’avère être une
méthode simple, rapide, avec des limites variables
suivant le microorganisme (100-100 cellules) permettant
cependant de détecter de forte concentrations
de germes (106 – 108 cellules)
Dans le cadre d’une recherche d’activité bactéricide
/ fongicide, le Pall Chek permet au delà de la
simple recherche d’activité germicide, de définir si
le mode d’action du désinfectant passe par une
destruction complète du germe (lyse de la membrane)
ou par une altération de la membrane inhibant
ainsi sa multiplication, suivi de sa mort.
Dans le cadre par exemple d’une recherche de
désinfectants pour une salle propre, ce genre de
données peut jouer un rôle important dans le choix
à effectuer. ■
Michèle Vialette
michele.vialette@pasteur-lille.fr
Evaluation de
l’utilisation de souches
d’Escherichia coli
O157 :H7 marquées
à la GFP (Green
Fluorescent Protein)
en milieu liquide et sur
produit alimentaire
Michèle VIALETTE,
Institut Pasteur de Lille
Dans l'industrie agro-alimentaire,
il est important de connaître les écosystèmes
bactériens présents dans les matières premières
et dans les produits finis, et de maîtriser
leur développement au cours des différentes étapes
de fabrication. Sont en particulier très surveillés
les micro-organismes pathogènes pour le
consommateur, comme Listeria, Salmonella, etc.
En conséquence, les industriels étudient leurs processus
de fabrication, et l'influence qu'ils peuvent
avoir sur le développement d'un organisme contaminant
présent dans une matière première. Les
tests réalisés pour mesurer ces effets sont nommés
"challenge-tests".
Le principe du «challenge-test» est d'introduire de
façon expérimentale un micro-organisme donné,
dans une matière première donnée, et d'en observer
le comportement au cours d'un processus de
fabrication. Néanmoins, ce type d'expérience
nécessite de pouvoir identifier l'organisme considéré
dans la flore naturelle de la matière utilisée,
et surtout de le dénombrer afin de mesurer sa
croissance ou sa décroissance au cours de la fabrication.
Cette identification peut poser des difficultés
si l'organisme introduit possède des "proches
parents" dans la matière première (par exemple :
introduction d'un sérotype particulier
d'Escherichia coli dans un produit contenant des
coliformes), la spécificité de la détection pouvant
devenir très difficile, voire impossible. Il est alors
intéressant d'avoir des souches génétiquement
modifiées, présentant un caractère singulier qui,
par conséquent, les rende distinguables de leurs
"proches parents".
Ainsi, des souches d'Escherichia coli O157:H7,
vérotoxinogènes, ont été génétiquement modifiées
: les gènes codant pour la protéine verte fluorescente
de la méduse Aequorea victoria ont été
introduits (par transformation plasmidique), leur
conférant une fluorescence naturelle permettant
une numération spécifique, sans aucune préparation
particulière de l’échantillon. Ces souches sont
alors aisément utilisables dans le cadre de "challenge-tests".
En effet, le caractère GFP les distingue
de leurs éventuels homologues naturels, et de
plus permet un dénombrement de façon fiable et
rapide.
Cette étude a permis de vérifier d’une part, que la
transformation plasmidique n’influençait pas la présence
des gènes de vérotoxines (facteurs déterminants
de la pathogénicité des souches), et d’autre
part, que ce marquage n’influençait pas les caractéristiques
de croissance de la bactérie en fonction de
différents facteurs : la température, le pH, l’activité
de l’eau. La stabilité du plasmide a été démontrée
quel que soit l’environnement (en milieu liquide ou
sur produit alimentaire), et dans des conditions de
variations brusques de température. ■
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