QUANTA Lite® MPO SC ELISA - inova

QUANTA Lite ®Uniquement pour “Diagnostics In-Vitro“Complexité de CLIA: HautMPO SC ELISA 704655ApplicationCe coffret permet de quantifier in vitro les autoanticorps IgG spécifiques dirigés contre la myélopéroxydase (MPO)dans le sérum humain et apporte une aide pour le diagnostic de certaines vascularites autoimmunes dont lesglomérulonéphrites nécrosantes et les polyartérites microscopiques en tenant compte d’autres facteurs cliniques.Au maximum, il est possible de quantifier 41 sérums en double ou 89 sérums en simple avec une courbe decalibration, un contrôle positif et un contrôle négatif.Informations concernant le testLes auto-anticorps anti-MPO sont l’un des huit precipaux anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA). Laplupart des antigènes cibles des ANCA sont des enzymes dérivées des neutrophiles et incluent : la protéinase 3(PR3), la protéine augmentant la perméabilité bactérienne (BPI), le lysozyme, l’élastase, la lactoferrine, lacathepsine G et l’azurocidine.Les ANCA donnent 3 marquages principaux en immunofluorescence (IF) sur neutrophiles fixés par l’éthanol:périnucléaire (p-ANCA), cytoplasmique (c-ANCA) et anormal ou x-ANCA. MPO est l’antigène principal donnant unmarquage de type p-ANCA.Les autoanticorps anti-MPO sont des marqueurs de maladie et d’activité, dont le taux d’anticorps augmente durantla phase active de la maladie.L’incidence des auto-anticorps anti-MPO dans différentes vascularites et conditions associées sont décrites cidessous:MALADIES FREQUENCE (%)3Glomérulonéphrites envahissantes/Nécrosantes 77 - 1003Vascularites nécrosantes 653Polyangéites microscopiques 453Syndrome de Churg-Strauss 6012Granulomatose de Wegener 103Nodules polyartritiques 60Granulomatoses allergiques **La spécificité des auto-anticorps a pu être associée avec les conditions correspondantes, cependant lepourcentage détaillé des fréquences n’est pas reporté.Bien que la standardisation de l’immunofluorescence (IF) et de l’ELISA soit encore en cours, la procédure suivanteest recommandée: l’immunofluorescence doit être utilisée comme test de dépistage pour déterminer le typed’ANCA : p- ou c-ANCA et le titre. Chaque échantillon ANCA positif doit ensuite être testé en ELISA pourdéterminer la spécificité antigénique précise de l’anticorps présent, par exemple, MPO pour un échantillon p-ANCApositif. Pour plus d’informations lire les références 1, 2 et 4 à 11.Principe du testLes micropuits sont recouverts de l’antigène MPO. Les échantillons dilués, les calibrateurs et les contrôles sontdéposés dans les puits permettant ainsi la liaison spécifique de l’anticorps à l’antigène fixé. Après avoir rincé lespuits pour éliminer toute trace de protéines non accrochées, un anticorps de chèvre anti-IgG humaine purifié paraffinité et conjugué à la peroxydase est déposé. Au cours de l’incubation, le conjugué enzymatique se lie aux IgGayant reconnu la myéloperoxydase. L’excès de conjugué marqué non accroché est éliminé par des lavages. Leconjugué accroché est visualisé en utilisant du 3,3',5,5' tétraméthyl benzidine (TMB). En présence de péroxydase,on obtient une coloration bleue qui vire au jaune après l’ajoût d’une solution d’arrêt. L’intensité de la couleurproduite dépend de la concentration dans l’échantillon d’IgG spécifiques de l’antigène. L’acide sulfurique est ajoutéà chaque puits pour arrêter la réaction. Le produit final induit est coloré en jaune et la densité optique est lue à450nm.Contenu du coffret1. Plaque de microtitration ELISA revêtue d´antigène MPO avec portoir de 12 barrettes de 8 micropuits enpolystyrène sécables, dans un sachet d’aluminium avec un dessiccant2. Contrôle Négatif ELISA pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain sans anticorps humains MPO, dansdu tampon avec du stabilisateur3. Calibrant A ELISA MPO SC, prédilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain avec des anticorps de IgGhumains anti-MPO, dans du tampon avec du stabilisateur4. Calibrant B ELISA MPO SC, prédilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain avec des anticorps de IgGhumains anti-MPO, dans du tampon avec du stabilisateur5. Calibrant C ELISA MPO SC, prédilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain avec des anticorps de IgGhumains anti-MPO, dans du tampon avec du stabilisateur6. Calibrant D ELISA MPO SC, prédilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain avec des anticorps de IgGhumains anti-MPO, dans du tampon avec du stabilisateur7. Calibrant E ELISA MPO SC, prédilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain avec des anticorps de IgGhumains anti-MPO, dans du tampon avec du stabilisateur8. Contrôle positif MPO SC pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain avec des anticorps de IgG humainsanti-MPO, dans du tampon avec du stabilisateur1

9. Diluant d´échantillons type III, teinté en jaune, 2 flacons de 50 ml contenant du tampon, du Tween 20, desstabilisateurs de protéines et des conservateurs10. Tampon de lavage HRP concentré 40X – tampon Tris salin avec du Tween 20, teinté de rouge, 1 flacon de25 ml. Consulter le paragraphe “Méthode” pour la dilution.11. Conjugué HRP MPO SC IgG, 1 flacon, teinté en bleu, dans du tampon avec des stabilisateurs de protéineset des conservateurs, de 10 ml12. TMB Chromogène, avec stabilisateurs, 1 flacon de 10 ml13. Solution d´arrêt HRP, acide sulfurique 0,344M, non teinté, 1 flacon de 10 mlAvertissements1. ATTENTION: Le contrôles, diluant et le conjugué contiennent 0,02% de chloramphénicol, considérécomme cancérigène dans l’état de Californie. Le diluant d´échantillons contenez Proclin 150. Eviter toutcontact avec la peau ou les yeux et toute inhalation.2. Tout le matériel d'origine humain utilisé pour la préparation des contrôles a été testé et trouvé négatif lorsde la recherche d'anticorps anti-VIH, anti-antigène de surface de l'Hépatite B et anti-Virus de l’Hépatite C àl'aide de tests approuvés par la FDA. Cependant, aucune méthode ne peut donner une garantie complètequant à l'absence de VIH, de VHB, du VHC ou d'autres agents infectieux. En conséquence, tous lessérums humains de contrôle doivent être manipulés avec les mêmes précautions que celles utilisées pourun matériel potentiellement infectieux. 143. L´azide de sodium (NaN 3 ) est utilisé comme conservateur. NaN 3 est un poison et il est toxique en casd´ingestion et de contact avec les yeux et la peau. Eviter de l´exposer aux bases, métaux ou autrescomposants, réagissant avec les acides. Après l´évacuation des réactifs, laver à grande eau afin d´éviterdes dépôts dans les canalisations.4. Le conjugué HRP MPO SC IgG contient un composant chimique dilué qui est un poison corrosif, toxiqueen cas d'ingestion en grande quantité. Pour éviter des brûlures chimiques, il est recommandé d'éviter toutcontact avec la peau ou les yeux.5. Le chromogène TMB est irritant et peut être toxique en cas d'inhalation, d'ingestion et d’absorption engrande quantité. Eviter tout contact avec la peau ou les yeux et toute inhalation.6. La solution d'arrêt HRP est une solution diluée d'acide sulfurique. Eviter de l’exposer aux bases, auxmétaux, aux oxydants ou tout autre composé susceptible de réagir avec les acides. L´acide sulfurique esttoxique et corrosif en cas d´absorption. Eviter le contact avec la peau et les yeux pour éviter toute brûlurechimique.7. Lors de la manipulation de ces produits, utiliser les équipements de protection personnelle appropriés.8. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées immédiatement. Respecter les règlements en vigueurconcernant l´élimination des déchets.Précautions1. Ce test est pour un usage diagnostic in vitro.2. Ces réactifs doivent être utilisés uniquement par un personnel qualifié.3. Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation peut affecter les performancesdu test et les résultats obtenus. Faire attention aux « Notes » spécifiques et aux précautions d’utilisation.4. Les réactifs provenant de différents lots ne sont pas interchangeables. Si un grand nombre de tests estréalisé, s’assurer que tous les réactifs soient du même lot. Toutes les barrettes utilisées doivent provenir dumême emballage aluminium. L’utilisation d’autres composants peut induire des résultats incorrects.5. Afin d’éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement des récipients neufs ou correctement nettoyésen plastique ou en verre. Ne jamais remettre les réactifs non utilisés dans les flacons.6. Ne pas laisser les flacons de réactifs sans bouchon. Une évaporation ou une contamination peut induiredes résultats incorrects.7. Le substrat TMB ne doit pas être exposé à la lumière ou à l’eau.8. Les sérums contaminés par des bactéries, hémolysés ou lipidiques et les échantilllons contenant desparticules de matière ne doivent pas être utilisés.9. Une mauvaise dilution ne peut pas être vérifiée comme les contrôles du coffret sont prêts à l’emploi.L’utilisation de pipettes calibrées et de contrôles de qualité internes est recommandée.10. L’utilisation d’automates, de diluteurs et d’autres équipements automatisés peut induire des différencesdans les résultats en comparaison avec la procédure manuelle. Il est de la responsabilité de tout laboratoirede valider complètement le système et de s’assurer que les résultats soient dans les limites indiquées dansla fiche technique et dans le certificat de contrôle de qualité associé.11. Tout équipement doit être calibré et entretenu suivant les instructions du fabricant.Conditions de conservation1. Le coffret doit être stocké à 2-8°C et ne doit pas être congelé. Un stockage à une température nonappropriée peut donner des résultats erronés.2. Le tampon de lavage dilué peut être stocké à température ambiante (20-26°C) pour 1 semaine.3. La date de péremption figure sur l’étiquette du coffret.Echantillons1. Les échantillons doivent être prélevés par ponction veineuse et le sérum doit être séparé aprèscoagulation.2. Les sérums peuvent être conservés à 2-8°C pendant 7 jours avant les tests 13 ou aliquotés et congelés à -20°C minimum pour une conservation plus longue.3. Congélations et décongélations répétées doivent être évitées.4. Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur, ceci peut induire de faux positifs.2

ProcédureMatériel fourni• MPO SC Coated Wells (Puits) : 12 barrettes de 8 puits sécables recouverts avec l’antigène MPO avec uncode couleur vert. Chaque plaque est emballée dans un étui refermable contenant deux dessicateurs.• Type III Sample Diluent (Diluant de l’échantillon type III) : 2 flacons de 50mL de tampon prêt à l’emploi etcoloré en jaune. Nécessaire à la dilution des échantillons.• HRP Wash Concentrate (Tampon de lavage HRP concentré) : 1 flacon de 25mL de tampon concentré 40fois pour le lavage des puits.• MPO SC Calibrator (Calibrateurs MPO SC) : 5 flacons de 1,2mL de sérum humain prédilué dont lesconcentrations en anticorps anti-MPO sont les suivantes : 100 ; 33,3 ; 11,1 ; 3,7 ; 1,23 U/mL ; chacun étantprêt à l’emploi.• MPO SC Positive Control (Contrôle positif MPO SC) : 1 flacon de 1,2mL de sérum humain prédilué et prêtà l’emploi.• ELISA Negative Control (Contrôle négatif ELISA) : 1 flacon de 1,2mL de sérum humain prédilué et prêt àl’emploi.• HRP MPO SC IgG Conjugate (HRP MPO SC IgG Conjugué) : 1 flacon de 10mL d’antisérum anti-IgGhumaines purifié par affinité et conjugué à la peroxydase. Il est prêt à l’emploi et coloré en bleu.• TMB Chromogène (Chromogène TMB) : 1 flacon de 10mL de TMB prêt à l’emploi.• HRP Stop Solution (Solution d’arrêt HRP) : 1 flacon de 10mL d’acide sulfurique 0,344M prêt à l’emploi.Autre matériel nécessaire non fourni• Laveur automatique de plaque : recommandé, cependant les lavages manuels sont égalementpossibles.• Lecteur de microplaques : capable de mesurer la densité optique à 450nm.• Eau distillée ou eau désionisée : elle doit être de très bonne qualité.• Micropipettes : pour la distribution de volumes de 1000, 100 et 10µL.• Pipette multicanaux : pour la distribution de volumes de 100µL de conjugué, de substrat et de solutiond’arrêt.• Tubes en plastique ou en verre : pour la dilution des échantillons.MéthodePréparation du test1. Ramener le coffret à température ambiante• Ces coffrets sont opérationnels à une température comprise entre 20 et 24°C.• Avant utilisation, laisser le coffret à température ambiante pendant environ 60 minutes. Ne pas retirerles barrettes de leur sachet aluminium durant cette période. Attendre que les barrettes soient àtempérature ambiante. Note : Le coffret peut être gardé à température ambiante au plus une semaine.2. ComposantsTous les réactifs du coffret doivent être agités avant utilisation.3. Préparation du tampon lavageDiluer la totalité de la solution de lavage avec 975 ml d´eau distillée (1/40). La solution de tampon diluéereste stable une semaine à 2-8°C. Si la totalité de la plaque de microtitration n´est pas utilisée en une seulefois, un plus petit volume de tampon sera suffisant, par exemple pour traiter 16 puits, diluer 2ml de tamponconcentré dans 78ml d´eau distillée ou deionsée.4. Dilution des échantillonsDiluer 10µL de chaque échantillon avec 1000µL de diluant (1:101) et mélanger. Note: Les dilutions doiventêtre utilisées dans les 8 heures suivant leur préparation.5. Manipulation des barrettesSortir le nombre nécessaire de puits et les enfiler sur le cadre. A partir de la position A1, remplir lescolonnes de gauche à droite. Lors de la manipulation du cadre, le maintenir dans le sens de la longueurafin d’empêcher les barrettes de sortir de leur logement. Note : Les puits non utilisés doivent être remisdans la pochette avec deux dessiccateurs correctement fermée pour protéger de l’humidité. Attention dene pas trouer ou déchirer la pochette, voir ci-dessous. ATTENTION : L’exposition des puits à l’humiditéou la contamination avec de la poussière ou des particules de matière induit une dégradation del’antigène conduisant à une faible précision des résultats et potentiellement à des résultats faux.Exécution du testMaintenir la même séquence de dépôt durant tout le test.1. Dépôt de l’échantillonDéposer 100µL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué (1:101) dans les puits appropriéssuivant le plan de plaque. Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement quepossible afin de minimiser les écarts, le décompte du temps doit commencer aprés l’addition du dernieréchantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.2. Lavage de la plaqueLa procédure de lavage est très importante et requiert une attention spéciale. Une plaque mal lavée peutdonner des résultats incorrects avec une précision faible et un bruit de fond important.Après incubation,laver trois fois les puits avec 200 à 300µL de tampon de lavage en utilisant un laveur automatique oumanuellement comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final, renverser la plaque et sécher les puits entapant la plaque sur du papier absorbant.3

Les plaques peuvent être lavées manuellement de la façon suivante :a. Vider le contenu de la plaque au dessus d’un évier.b. Sécher les puits en tapant la plaque sur du papier absorbant.c. Remplir chaque puits de 200 à 300µL de tampon de lavage à l’aide d’une pipette multicanaux.d. Agiter la plaque sur une surface plane.e. Répéter a-d deux fois.f. Répéter a et b.3. ConjuguéDéposer 100µL de conjugué par puits. Essuyer les bords des puits pour éliminer les éclaboussures.Note : Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de conjugué dans le flacon d’origine.Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.4. Lavage de la plaque(cf. 2).5. Chromogène TMBDéposer 100µL de TMB dans chaque puits. Essuyer les bords des puits pour éliminer les éclaboussures.Note : Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de TMB dans le flacon d’origine. Incuberà température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité.6. Arrêt de la réactionAjouter 100µL de solution d‘arrêt dans chaque puits dans le même ordre que pour le dépôt du substrat.Ceci induit un changement de couleur du bleu au jaune.7. LectureLa densité optique (DO) de chaque puits doit être lue à 450nm à l’aide d’un lecteur de plaque dans les 30minutes suivant l’arrêt de la réaction.Contrôle de qualité1. Contrôle de qualitéAfin de valider la technique, les critères suivants doivent être respectés :• Les calibrateurs et les contrôles doivent être inclus à chaque manipulation.• Les valeurs obtenues pour le contrôle négatif et le contrôle positif doivent être dans la gamme demesure indiquée dans le certificat de contrôle de qualité.• La forme de la courbe doit être similaire à la courbe donnée dans le certificat de contrôle de qualité.Si l’un de ces critères n’est pas respecté, l’essai ne peut être validé et il doit être répété.2. Calcul de la moyenne des densités optiques(Pour les tests ayant été faits en double.)Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer la moyenne des densités optiques des duplicats.Le pourcentage du coefficient de variation (CV en %) pour chaque échantillon doit être < à 15%.3. Tracé de la courbe de calibrationLa courbe peut être tracée manuellement ou de façon automatique en plaçant la DO sur l’échelle linéaire etles concentrations en anticorps anti-MPO sur l’échelle logarithmique.• Automatique – utiliser un logiciel validé approprié et une courbe qui suit les données.• Manuelle – utiliser du papier graphique log/linéaire ; tracer une courbe qui passe par les points (pas unedroite ni une courbe point à point).4. Traitement des points anormauxSi seul un point n’est pas sur la courbe, il peut être supprimé. Si en l’absence de ce point, la courbe a uneforme différente de celle du certificat de contrôle de qualité ou si plusieurs points ne sont pas sur la courbe,le test doit être répété.5. Calcul des valeurs des contrôlesDéduire la concentration en autoanticorps anti-MPO de chaque contrôle à partir de la courbe de calibration.Les valeurs doivent être comprises dans les limites indiquées sur le certificat de contrôle qualité.6. Calcul des concentrations d’anticorps dans les échantillons diluésA partir de la courbe de calibration, en déduire les concentrations en autoanticorps anti-MPO deséchantillons dilués. Note : Tenir compte du facteur de dilution (1:101) des échantillons. Aucune autrecorrection n’est requise.7. CalibrationLe test est calibré en U/ mL par rapport à un calibrateur de référence arbitraire, en l’absence depréparation de référence reconnue internationalement.Limites du test1. Ce coffret est destiné au diagnostic uniquement. Un résultat positif suggère des désordres qui doivent êtreconfirmés par des données cliniques et d’autres tests sérologiques.2. Les résultats obtenus à partir de cet essai ne sont pas une preuve diagnostique de la présence ou del’absence d’un syndrome.Valeur normaleLa valeur normale a été déterminée grâce à 187 donneurs de sang sains. La limite supérieure de la normale estdéterminée comme étant la concentration moyenne + 8 déviations standard. Elle est égale à 9,0 U/mL avec unemoyenne à 1,36 U/mL et une DS de 0,97 U/mL.Cette valeur normale est fournie à titre indicatif. Il est recommandé à chaque laboratoire d’établir ses propresnormes.VALEURS ATTENDUES≤ 9,0 U/ mL résultat négatif> 9,0 U/ mL résultat positif4

Performances SpécifiquesPrécisionLes précisions intra- et inter-essai ont été mesurées en utilisant 3 échantillons à l’intérieur de la gammede la courbe de calibration. Le pourcentage du coefficient de variation (CV en %) pour chaqueéchantillon est donné ci-dessous :PRECISION INTRA-ESSAIn=16 Concentration moyenne (U/mL) C.V. en %Echantillon 1 4,1 9,5Echantillon 2 8,2 2,4Echantillon 3 37,3 3,3PRECISION INTER-ESSAIn=3 Concentration moyenne (U/mL) C.V. en %Echantillon 1 4,8 8,5Echantillon 2 9,4 1,3Echantillon 3 37,3 5,7Gamme Normale187 donneurs de sang adultes sains (90 hommes et 97 femmes) ont été testés pour les anticorps anti-MPO. Avecune valeur seuil positive à >9,0 U/mL, tous les échantillons sont négatifs.La valeur du seuil est fournie à titre indicatif uniquement. Il est recommandé à chaque laboratoire de déterminerses propres normes.Relative Spécificité, Sensibilité, CorrélationLa spécificité, la sensibilité et la corrélation relatives ont été déterminées en utilisant un autre coffret ELISA anti-MPO en utilisant 77 échantillons.Autre ELISA+ -COFFRET ELISA BINDAZYME + 18 2Anti-MPO- 2 55Sensibilité relative 90,0%Spécificité relative 96,5%Correlation relative 94,8%Substances d'InteferingDifférents types de sérums ont été testés pour évaluer l’effet possible de substances interférantes. Les résultats cidessousmontrent le nombre d’échantillons donnant un résultat positif/nombre testé.SérumNb de positif/Nb testésLipidique 0/8Hémolysé 0/10Bilirubine élevée 0/10Hyperprotéinémie (Myélome) 0/10Sensibilité AnalytiqueLa sensibilité a été déterminée comme la concentration moyenne + 2 DS donnée par 16 déterminations du diluantéchantillon. Elle est égale à 0,4 U/mL.Gamme de MesureLa gamme de mesure du test est 1,23 - 100 U/mL.5

Plan de plaque1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGHRésumé de la procédure1. Déposer 100µL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué au 1:101 dans les puitsappropriés.Incuber 30 minutes. Laver.2. Ajouter 100µL de conjugué par puits.Incuber 30 minutes. Laver.3. Ajouter 100µL de substrat par puits.Incuber 30 minutes.4. Ajouter 100µL de solution d’arrêt par puits.Mesurer l’absorbance à 450nm.QUANTA Lite et INOVA QUANTA Lite et INOVA Diagnostics sont des marques déposées Copyright 2012 Tous droits réservés ©6

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