et al
et al
et al
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
วิทยานิพนธ<br />
เรื่อง<br />
การโคลนและการศึกษาลักษณะของยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
1<br />
จาก Streptomyces rimosus R7 ที่ผลิตสารปฏิชีวนะตานเชื้อรา<br />
Cloning and Characterisation of Type I Polyk<strong>et</strong>ide Synthase Gene<br />
from an Anti-fung<strong>al</strong> Antibiotic Producing Streptomyces rimosus R7<br />
โดย<br />
นายประกิตชัย โชติวุฒิมนตรี<br />
เสนอ<br />
บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร<br />
เพื่อความสมบูรณแหงปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต<br />
(พันธุศาสตร)<br />
พ.ศ. 2547<br />
ISBN 974-274-515-3
กิตติกรรมประกาศ<br />
ขอขอบคุณ ผศ.ดร.อรินทิพย ธรรมชัยพิเนต ประธานกรรมการที่ปรึกษา<br />
ที่ไดให<br />
คําแนะนําตางๆ อยางเต็มที่ตลอดระยะเวลาที่ผานมา<br />
ทั้งในดานการทําวิจัย<br />
และการจัดทํา<br />
วิทยานิพนธ จนเสร็จสมบูรณ ขอขอบคุณ รศ.ดร.นิตยศรี แสงเดือน กรรมการที่ปรึกษาที่ไดให<br />
ความเขาใจ ความหวงใย ตลอดจนตรวจแกไขวิทยานิพนธใหสมบูรณ ขอขอบคุณ ดร.สมชัย<br />
พรบันลือลาภ กรรมการที่ปรึกษา<br />
ที่ใหคําแนะนําตางๆ<br />
ในการทําวิจัย และขอขอบคุณ<br />
ดร.สุทธิพันธุ<br />
แกวสมพงษ ผูแทนบัณฑิตวิทยาลัย<br />
ที่ไดใหคําแนะนําในการแกไขวิทยานิพนธ<br />
ขอขอบคุณ Prof. Dr. David Hopwood, John Innes Institute, UK ที่ไดใหความ<br />
อนุเคราะห E. coli สายพันธุ<br />
ET12567 (pUZ8002) และ S17-1 รวมทั้งพลาสมิด<br />
pSET151<br />
และ pSET152 ขอขอบคุณ Dr. Mark Buttner, John Innes Institute, UK ที่ไดใหความ<br />
อนุเคราะหพลาสมิด pIJ8600 และ pIJ8671 และขอขอบคุณ Prof. Dr. Takuya Nihira,<br />
ICBiotech, Osaka University, Japan ที่ไดใหความอนุเคราะหพลาสมิด<br />
pKC1132<br />
ขอขอบคุณคณาจารย เจาหนาที่<br />
พี่ๆ<br />
นองๆ ภาควิชาพันธุศาสตร ที่ไดใหคําปรึกษา<br />
กําลังใจ และความชวยเหลือตางๆ อยางมากมาย ขอบคุณ คุณณัฏฐิกา พูลสวัสดิ์<br />
(พี่ยุย)<br />
คุณกนกอร เยาวดํา (พี่อร)<br />
และคุณเทพิน เดชนันทรัตน (พี่เหนง)<br />
ที่ไดชวยสอนเทคนิคตางๆ<br />
ขอบคุณเพื่อนๆ<br />
คุณศิริรัตน เมียนเกิด (โบ) คุณวิรัตน พิพัฒนพงศภิญโญ (ตี๋)<br />
คุณปราการ<br />
กระถินทอง (ปารค) คุณปยะพงษ เอื้อจิระพงษพันธ<br />
(ยะ) คุณเจนจิรา สกุลคู (เจน)<br />
คุณมณธิรา ศรีจักรโคตร (แตน) คุณอภันตรี ธนิตไธสง (นองสม) และคุณนิรินทรยา สุดตาชาติ<br />
(นองเจี๊ยบ)<br />
ที่ทําใหสบายใจ<br />
หายเหนื่อย<br />
สุดทายตองขอขอบพระคุณ คุณพอ คุณแม พี่และนอง<br />
ที่อดทน<br />
มีความเขาใจ สนับสนุน<br />
ใหกําลังใจ และสอบถามความคืบหนางานวิจัยทุกๆ วัน<br />
ประกิตชัย โชติวุฒิมนตรี<br />
สิงหาคม 2547
สารบัญ<br />
หนา<br />
สารบัญ............................................................................................................... (1)<br />
สารบัญตาราง....................................................................................................... (2)<br />
สารบัญภาพ......................................................................................................... (3)<br />
คํานํา.................................................................................................................. 1<br />
วัตถุประสงค............................................................................................. 2<br />
การตรวจเอกสาร.................................................................................................. 3<br />
Streptomyces........................................................................................... 3<br />
กลุมยีนโพลีคีไทดซินเธส.............................................................................<br />
4<br />
สารออกฤทธิ์ตานเชื้อรา..............................................................................<br />
16<br />
การสงถายพลาสมิดเขาสู<br />
Streptomyces......................................................... 19<br />
การศึกษาหนาที่ของยีนโดยวิธียีนดิสรัปชัน.....................................................<br />
22<br />
อุปกรณและวิธีการ................................................................................................ 24<br />
ผลและวิจารณ...................................................................................................... 46<br />
สรุป................................................................................................................... 103<br />
เอกสารและสิ่งอางอิง.............................................................................................<br />
104<br />
(1)
สารบัญตาราง<br />
่<br />
่<br />
ตารางที<br />
หนา<br />
1 ความยาวคลื่นที่ใหคาการดูดแสงสูงสุดของสารปฏิชีวนะ<br />
กลุมโพลีอีน..................................................................................<br />
18<br />
2 จุลินทรียที่ใชในงานวิจัย...................................................................<br />
24<br />
3 พลาสมิดที่ใชในงานวิจัย..................................................................<br />
24<br />
4 ความเขมขนของยาปฏิชีวนะที่ใชในการเลี้ยง<br />
Streptomyces<br />
และ E. coli ................................................................................. 26<br />
5 ประสิทธิภาพการคอนจูเกชันระหวาง E. coli ET12567<br />
(pUZ8002/pIJ8600) และ S. rimosus R7 ที่กระตุน<br />
การงอกของสปอรที 40 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที..................... 51<br />
6 ขอมูล 4 ลําดับแรก ที่ไดจากการเปรียบเทียบลําดับกรดอะมิโนของ<br />
ชิ้นดีเอ็นเอในพลาสมิด<br />
pATT401 กับฐานขอมูลดวยโปรแกรม BlastP.... 67<br />
7 ขอมูล 4 ลําดับแรก ที่ไดจากการเปรียบเทียบลําดับกรดอะมิโนของ<br />
ชิ้นดีเอ็นเอในพลาสมิด<br />
pATT403 ทางดานไพรเมอร M13 Reverse<br />
กับฐานขอมูลดวยโปรแกรม BlastP................................................... 77<br />
8 การหาลําดับเบสของพลาสมิด pATT403 และ subclone....................... 78<br />
9 กลุมยีน<br />
Type I PKS ที่นํามาใชในการทํา<br />
multiple <strong>al</strong>ignment<br />
และ phylogen<strong>et</strong>ic tree.................................................................... 84<br />
(2)
สารบัญภาพ<br />
่<br />
<br />
ภาพที<br />
หนา<br />
1 ชีวสังเคราะหของสารโพลีคีไทดเปรียบเทียบกับ<br />
การสังเคราะหกรดไขมันสายยาว....................................................... 7<br />
2 การจัดเรียงตัวของกลุมยีนโพลีคีไทดซินเธส........................................<br />
10<br />
3 ตัวอยางสารโพลีคีไทด..................................................................... 11<br />
4 กระบวนการสังเคราะหอีรีโธรมัยซินและการจัดเรียงตัวของ<br />
เอนไซม PKS................................................................................ 13<br />
5 โครงสรางโมเลกุลของไรโมซิดิน........................................................ 18<br />
6 แผนที่พลาสมิด<br />
pIJ8600 ที่ใชศึกษาคอนจูเกชัน..................................<br />
40<br />
7 แผนที่พลาสมิด<br />
pSET152 ที่ใชศึกษาคอนจูเกชัน................................<br />
40<br />
8 แผนที่พลาสมิด<br />
pSET151 ที่ใชในการทํายีนดิสรัปชัน...........................<br />
44<br />
9 แผนที่พลาสมิด<br />
pKC1132 ที่ใชในการทํายีนดิสรัปชัน..........................<br />
44<br />
10 กราฟแสดงการอยูรอดของสปอรเมื่อกระตุนการงอกของสปอร<br />
ที่อุณหภูมิตางๆ.............................................................................<br />
47<br />
11 กราฟแสดงการอยูรอดของสปอรเมื่อกระตุนการงอกของสปอร<br />
ที่อุณหภูมิ<br />
40 และ 45 องศาเซลเซียส ในระยะเวลาตาง ๆ.................... 47<br />
12 การตรวจสอบการทรานสฟอรมพลาสมิด pIJ8600 เขาสู<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส......... 48<br />
13 เอกซคอนจูแกนตที่ไดจากการคอนจูเกชันซึ่งใชจํานวนสปอร<br />
10 8 ่<br />
สปอร<br />
หลังจากบมไวที 30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 วัน............................... 50<br />
14 การตรวจสอบเอกซคอนจูแกนตของ S. rimosus R7 ที่ไดรับ<br />
พลาสมิด pIJ8600 ดวย dot blot hybridisation<br />
โดยใชยีน tsr เปนโพรบ................................................................... 52<br />
15 การตรวจสอบเอกซคอนจูแกนตของ S. rimosus R7 ที่ไดรับ<br />
พลาสมิด pIJ8600 ดวย Southern blot hybridisation<br />
โดยใชยีน tsr เปนโพรบ................................................................... 54<br />
16 การแทรกตัวของพลาสมิด pIJ8600 เขาไปในโครโมโซม<br />
ของ S. rimosus R7........................................................................ 55<br />
17 การตรวจสอบการสรางไรโมซิดินของ S. rimosus R7<br />
บนอาหารแข็งตางๆ จากการเกิดวงใสของ C. <strong>al</strong>bicans.......................... 56<br />
(3)
สารบัญภาพ (ตอ)<br />
่<br />
่<br />
ภาพที<br />
หนา<br />
18 การตรวจสอบการสรางสารไรโมซิดินโดยการเกิดวงใสของ<br />
เอกซคอนจูแกนตของ S. rimosus R7 (pIJ8600) ตอ<br />
C. <strong>al</strong>bicans ดวยวิธี agar plug assay.................................................. 57<br />
19 การตรวจสอบการแยกนัยสตาตินโดย TLC<br />
ภายใตแสงอัลตราไวโอเลต............................................................... 58<br />
20 การตรวจสอบการแยกสารสกัดจาก S. rimosus R7 และ<br />
เอกซคอนจูแกนตดวย TLC ภายใตแสงอัลตราไวโอเลต<br />
และไบโอออโทกราฟ....................................................................... 60<br />
21 การดูดแสงของนัยสตาตินและไรโมซิดินโดยสเปกโทรเมทรี.................... 62<br />
22 ผลการทําพีซีอารดวยไพรเมอร ATT10 และ ATT11 จาก<br />
S. rimosus R7 และการตรวจสอบการโคลนชิ้นดีเอ็นเอ<br />
ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...................................................... 64<br />
23 ทิศทางการหาลําดับเบสของพลาสมิด pATT401<br />
และทิศทางของยีน KS.................................................................... 66<br />
24 ลําดับเบสและลําดับกรดอะมิโนของโดเมน KS จาก S. rimosus R7<br />
ในพลาสมิด pATT401................................................................... 66<br />
25 Phylogen<strong>et</strong>ic tree ที bootstrap 1,000 ครั้ง<br />
ของโดเมน KS<br />
จากพลาสมิด pATT401 (401-KS) เปรียบเทียบกับ KS ของ<br />
ทัยโลซิน (TYL), อีรีโธรมัยซิน (ERY), อะเวอรเมกทิน (AVE),<br />
พิมาริซิน (PIM), นัยสตาติน (NYS) และแอมโฟเทอริซิน (AMP)......... 68<br />
26 การทํา Southern blot hybridisation ของโครโมโซมของ<br />
S. rimosus R7 ดวยโพรบ KS จากพลาสมิด pATT401........................ 69<br />
27 การตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอของ<br />
S. rimosus R7 ที่สกัดจากเจล..................<br />
70<br />
28 การตรวจสอบโคลนของยีน Type I PKS โดย<br />
colony dot blot hybridisation และพีซีอาร......................................... 72<br />
29 การตรวจสอบโคลนของยีน Type I PKS ดวย Southern<br />
blot hybridisation.......................................................................... 73<br />
30 การตัดพลาสมิด pATT403 ดวยเอนไซมตัดจําเพาะ 12 ชนิด................ 75<br />
31 การตรวจสอบโคลนของพลาสมิด pATT406 และ pATT407<br />
ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...................................................... 75<br />
(4)
สารบัญภาพ (ตอ)<br />
่ ภาพที<br />
หนา<br />
32 การตรวจสอบโคลนของพลาสมิด pATT418 และ pATT419<br />
ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...................................................... 76<br />
33 การตรวจสอบโคลนของพลาสมิด pATT420<br />
ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...................................................... 76<br />
34 แผนที่ยีนของโคลน<br />
pATT403 ขนาด 3.7 กิโลเบส.............................. 79<br />
35 ลําดับเบสและลําดับกรดอะมิโนของโคลน pATT403............................ 80<br />
36 Multiple <strong>al</strong>ignment ของโดเมน ACP ในบริเวณ active site................... 85<br />
37 Multiple <strong>al</strong>ignment ของโดเมน KS ในบริเวณ active site..................... 85<br />
38 Phylogen<strong>et</strong>ic tree ที่คา<br />
bootstrap 1,000 ครั้ง<br />
ของโดเมน KS<br />
ของ S. rimosus R7 ที่ใชเปนโพรบ<br />
(401-KS) และที่โคลนได<br />
(403-KS) เปรียบเทียบกับ KS ของสารมาโครไลดและโพลีอีน............. 87<br />
39 การจัดเรียงตัวของกลุมยีน<br />
Type I PKS ของสารกลุมโพลีอีน.................<br />
88<br />
40 โครงสรางของนัยสตาติน................................................................. 88<br />
41 Phylogen<strong>et</strong>ic tree ที่คา<br />
bootstrap 1,000 ครั้ง<br />
ของโดเมน AT<br />
ของ S. rimosus R7 (403-AT) เปรียบเทียบกับ AT<br />
ของสารโพลีคีไทด.......................................................................... 90<br />
42 Multiple <strong>al</strong>ignment ของโดเมน AT ที่จําเพาะตอมาโลนิล-โคเอ<br />
ในบริเวณ active site ..................................................................... 90<br />
43 การตรวจสอบพลาสมิด pATT402 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...... 92<br />
44 แผนที่ของพลาสมิดสายผสมซึ่งใชในการทํายีนดิสรัปชัน<br />
ที่มาจาก<br />
pSET151........................................................................ 92<br />
45 การตรวจสอบพลาสมิด pATT405 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...... 94<br />
46 การตรวจสอบพลาสมิด pATT408 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...... 94<br />
47 พลาสมิด pIJ8671 ที่นํายีนตานยาปฏิชีวนะไธโอสเตรปทอนมาใช...........<br />
95<br />
48 การตรวจสอบพลาสมิด pATT412 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...... 96<br />
49 การตรวจสอบพลาสมิด pATT413 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...... 96<br />
50 การตรวจสอบพลาสมิด pATT410 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...... 98<br />
51 การตรวจสอบพลาสมิด pATT414 และ pATT416<br />
ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...................................................... 98<br />
(5)
สารบัญภาพ (ตอ)<br />
่ ภาพที<br />
หนา<br />
52 แผนที่ของพลาสมิดสายผสมซึ่งใชในการทํายีนดิสรัปชัน<br />
ที่มาจาก<br />
pKC1132....................................................................... 99<br />
53 การตรวจสอบพลาสมิด pATT411 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส...... 100<br />
54 การตรวจสอบพลาสมิด pATT415 และ pATT417<br />
ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส..................................................... 100<br />
55 การตรวจสอบเอกซคอนจูแกนตของ S. rimosus R7 ที่ไดรับ<br />
การสงถายพลาสมิด pATT414 และ pATT415 ดวย<br />
dot blot hybridisation.................................................................... 102<br />
(6)
การโคลนและการศึกษาลักษณะของยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
1<br />
จาก Streptomyces rimosus R7 ที่ผลิตสารปฏิชีวนะตานเชื้อรา<br />
Cloning and Characterisation of Type I Polyk<strong>et</strong>ide Synthase Gene<br />
from an Anti-fung<strong>al</strong> Antibiotic Producing Streptomyces rimosus R7<br />
คํานํา<br />
แบคทีเรีย Streptomyces เปนแหลงของยาปฏิชีวนะกวา 2 ใน 3 ของที่ผลิตไดจาก<br />
แบคทีเรียทั้งหมด<br />
การศึกษากระบวนการสังเคราะหยาปฏิชีวนะในระดับยีน พบวามีกลุมยีนที่ทํา<br />
หนาที่ในการผลิตสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ<br />
(bioactive compound) อยูหลายชนิด<br />
กลุมยีนชนิด<br />
หนึ่ง<br />
เรียกวา กลุมยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
1 (Type I polyk<strong>et</strong>ide synthase gene cluster) ทํา<br />
หนาที่ในการสังเคราะหสารโพลีคีไทด<br />
(polyk<strong>et</strong>ide) ที่มีโครงสรางเปนวงแลคโตน<br />
(lactone ring)<br />
สารในกลุมนี้มีทั้งที่ออกฤทธิ<br />
์เปน สารตานแบคทีเรีย (anti-bacteri<strong>al</strong> agent) สารตานเชื้อรา<br />
(anti-fung<strong>al</strong> agent) สารตานมะเร็ง (anti-tumour agent) และสารกดภูมิคุมกัน<br />
(immunosuppressant agent) สารที่สําคัญ<br />
เชน อีรีโธรมัยซิน (erythromycin) แอมโฟเทอริซิน<br />
บี (amphotericin B) อีโพไธโลน (epothilone) และราพามัยซิน (rapamycin) เปนตน<br />
ความสําคัญของกลุมยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
1 ในการสังเคราะหสารออกฤทธิ์ทาง<br />
ชีวภาพชนิดใหมนั้น<br />
เนื่องมาจากระบบการทํางานของกลุมยีนที่มีการทํางานเปนลําดับขั้น<br />
ทําให<br />
นักวิจัยสามารถดัดแปลงยีนโดยอาศัยขอมูลของยีนที่มีอยู<br />
เพื่อใหเกิดการสังเคราะหสารที่มี<br />
โมเลกุลเปลี่ยนแปลงไปตามที่คาดหมายไวได<br />
ในการศึกษานี้จะไดศึกษายีนโพลีคีไทดซินเธสชนิด<br />
ที่<br />
1 ใน Streptomyces rimosus R7 ที่มีการสังเคราะหสารตานเชื้อราไรโมซิดิน<br />
(rimocidin) ซึ่ง<br />
ผลของการศึกษาจะเพิ่มพูนขอมูลความรูเกี่ยวกับยีนชนิดนี้<br />
ซึ่งอาจจะนําไปใชในการดัดแปลง<br />
โมเลกุลของสารประเภทนี้ตอไป<br />
ทําใหไดสารที่ออกฤทธิ์ไดดีและจําเพาะมากขึ้นในอนาคต<br />
1
วัตถุประสงค<br />
1. ตรวจหาและโคลนยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
1 ใน S. rimosus R7 ที่มีการ<br />
สังเคราะหสารตานเชื้อราไรโมซิดิน<br />
2. ศึกษาการสงถายพลาสมิดจาก Escherichia coli เขาสู<br />
S. rimosus R7 โดยวิธี<br />
คอนจูเกชันตางสกุล (intergeneric conjugation)<br />
3. ศึกษาหนาที่ของยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
1 ของ S. rimosus R7 ที่โคลนได<br />
โดยวิธี<br />
ยีนดิสรัปชัน (gene disruption)<br />
2
ลักษณะทั่วไป<br />
การตรวจเอกสาร<br />
Streptomyces<br />
แบคทีเรียสกุล (Genus) Streptomyces จัดอยูในวงศ<br />
(Family) Streptomyc<strong>et</strong>aceae ใน<br />
อันดับ (Order) Actinomyc<strong>et</strong><strong>al</strong>es (Goodfellow, 1989) เปนแบคทีเรียแกรมบวก มีการเจริญ<br />
เปนเสนใย (mycelium) ประกอบไปดวยเสนใยอาหารที่มีการแตกกิ่ง<br />
(branched substrate<br />
mycelium) และเมื่อเจริญเต็มที่จะสรางเสนใยอากาศ<br />
(aeri<strong>al</strong> mycelium) ซึ่งมีการสรางสปอร<br />
บางชนิดอาจพบการสรางสปอรในเสนใยอาหารได เชน S. carpinensis (Cross and Al-Diwany,<br />
1981) มีการสรางรงควัตถุหลายชนิดทําใหเกิดสีในเสนใย สวนใหญเจริญไดดีที่อุณหภูมิ<br />
25-<br />
35 องศาเซลเซียส ที่<br />
pH 6.5-8.0 สามารถพบ Streptomyces ไดทั่วไปในดินและวัสดุอินทรียที่<br />
ยอยสลาย (Williams <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989)<br />
จีโนม (genome) ของ Streptomyces มีขนาดประมาณ 7-9 เมกะเบส และปริมาณ G+C<br />
สูงประมาณ 72 เปอรเซ็นต (Williams <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989) ปจจุบันทราบวาโครโมโซมของ<br />
Streptomyces ซึ่งเดิมคิดวามีโครงสรางเปนวงกลม<br />
(circular chromosome) นั้น<br />
มีโครงสรางแบบ<br />
เสนตรง (linear chromosome) โดย Streptomyces ที่มีการศึกษาแลวทราบวามีโครโมโซมแบบ<br />
เสนตรง ไดแก S. lividans 66 (Lin <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1993), S. coelicolor A3(2) (Redenbach <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1996), S. ambofaciens (Fischer <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997), S. rimosus (Pandza <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997) และ S.<br />
avermitilis (Omura <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001) เปนตน คาดวาโครโมโซมแบบเสนตรงนี้มีผลอยางมากตอ<br />
การเกิดความไมเสถียรทางพันธุกรรม (gen<strong>et</strong>ic instability) (Pandza <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997)<br />
ความสําคัญ<br />
Streptomyces ในธรรมชาติมีความสําคัญในกระบวนการยอยสลายสารอินทรีย มีการนํา<br />
Streptomyces มาใชประโยชนในหลายดาน เชน ทางดานการเกษตร พบวาสามารถใชเปนตัว<br />
ควบคุมทางชีวภาพ (biologic<strong>al</strong> control agent) ตัวอยาง ในกรณีของการให S. griseus ลงในดิน<br />
เพื่อควบคุมโรครากเนา<br />
(black root rot) จากเชื้อ<br />
Phomopis sclerotioides ในแตงกวาซึ่ง<br />
เพาะปลูกในโรงเรือน (Ebben and Spencer, 1978) ใชสําหรับควบคุมโรครากเนาจากเชื้อ<br />
Phytophthora ในอัลฟลฟา (<strong>al</strong>f<strong>al</strong>fa) และถั่วเหลือง<br />
(Xiao <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2002) และใชควบคุม<br />
ประชากรพยาธิตัวกลมที่เปนปรสิตของพืช<br />
(Siddiqui and Mahmood, 1999) เปนตน ดานการ<br />
3
ยอยสลายสาร Streptomyces มีบทบาทสําคัญในการยอยสลายไคทิน (chitin) ซึ่งเปนโพลีแซ็กคา<br />
ไรดที่พบมากเปนอันดับสองในธรรมชาติ<br />
จึงถูกนําไปใชในการผลิตเอนไซมไคทิเนส (chitinase)<br />
(Miyashita <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991) และยังมีการนําไปใชยอยสลายยางธรรมชาติและยางสังเคราะหหลาย<br />
ชนิด (Lacey, 1988) ใชในการยอยสลายของเสียประเภทลิกโนเซลลูโลส (lignocellulose) ซึ่งมี<br />
องคประกอบเปนเซลลูโลส (cellulose), เฮมิเซลลูโลส (hemicellulose) และลิกนิน (lignin) ได<br />
เปนสารที่สามารถนําไปใชประโยชนไดตอไป<br />
(Crawford, 1988) นอกจากนั้นยังมีการนํา<br />
Streptomyces ไปใชในการผลิตเอนไซมหลายชนิด เชน คอเลสเตอรอล ออกซิเดส (cholesterol<br />
oxidase) สําหรับการตรวจสอบปริมาณคอเลสเตอรอลในเลือด อะเซทิลทรานสเฟอเรส<br />
(ac<strong>et</strong>yltransferase) ในการเติมหมูอะเซทิล<br />
(ac<strong>et</strong>yl) ใหกับสารปฏิชีวนะหลายชนิด และใชผลิต<br />
เอนไซมตัดจําเพาะกวา 10 ชนิด (Peczynska-Czoch and Mordarski, 1988; Pir<strong>et</strong> and<br />
Demain, 1988)<br />
Streptomyces มีความสําคัญอยางมาก ในการผลิตสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ<br />
เชน ยา<br />
ปฏิชีวนะ ยาตานมะเร็ง สารกดภูมิคุมกัน<br />
ยาฆาแมลง ยาฆาวัชพืช โดยเฉพาะสารปฏิชีวนะนั้น<br />
มีจํานวนมากถึง 2 ใน 3 ของสารปฏิชีวนะทั้งหมดที่ผลิตไดจากจุลินทรีย<br />
(Lechev<strong>al</strong>ier, 1988;<br />
B<strong>al</strong>tz, 1998)<br />
สารโพลีคีไทด (polyk<strong>et</strong>ide) เปนสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพกลุมหนึ่งที่<br />
Streptomyces<br />
สามารถผลิตได และยีนที่เกี่ยวของกับการสังเคราะหไดมีการศึกษาเปนจํานวนมาก<br />
สารในกลุมนี้<br />
มีความหลากหลายอยางมากของ ขนาดโมเลกุล โครงสรางและหนาที่<br />
สารที่สําคัญ<br />
อาทิ แอม<br />
โฟเทอริซิน บี (amphotericin B) และนัยสตาติน (nystatin) ซึ่งเปนสารตานเชื้อรา<br />
(Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 2000) อีรีโธรมัยซิน (erythromycin) ซึ่งเปนสารตานแบคทีเรีย<br />
(Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991)<br />
และราพามัยซิน (rapamycin) ซึ่งเปนสารกดภูมิคุมกัน<br />
(Schwecke <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1995) โดยจะได<br />
กลาวถึงอยางละเอียดในสวนตอไป<br />
กลุมยีนโพลีคีไทดซินเธส<br />
กลุมยีนโพลีคีไทดซินเธส<br />
(polyk<strong>et</strong>ide synthase gene cluster) พบไดในจุลินทรีย เชื้อรา<br />
และพืช มีหนาที่ในการสังเคราะหสาร<br />
โพลีคีไทดซึ่งเปนสารทุติยภูมิ<br />
(secondary m<strong>et</strong>abolite) ที่<br />
เกิดจากการเชื่อมตอสายคารบอนจากสารในกลุมเอซิล-โคเอนไซมเอ<br />
(acyl-coenzyme A) ทีละ<br />
2 อะตอม เขาไปในคารบอนสายหลักจนเปนสายยาว โดยคารบอนที่เขามาตอเติมในตําแหนงเบ<br />
ตา-คารบอน (β-carbon) นั้นจะประกอบดวยหมูคีโต<br />
(k<strong>et</strong>o) เสมอ แตอาจจะเกิดกระบวนการ<br />
รีดักชัน (reduction) ที่หมูคีโตไดหลายขั้น<br />
หลังจากมีการเชื่อมตอสายคารบอนเขาดวยกันแลว<br />
4
ทําใหหมูคีโตเปลี่ยนเปนหมูไฮดรอกซิล<br />
(hydroxyl) หรือหมูอื่นตอไป<br />
อยางไรก็ดีก็ยังคงมีหมูคี<br />
โตหลงเหลืออยูบางสวนในสายคารบอนหลัก<br />
จึงเปนที่มาของชื่อสารกลุมนี้<br />
(Hopwood and<br />
Sherman, 1990; Hutchinson and Fujii, 1995)<br />
กระบวนการสังเคราะหโพลีคีไทด<br />
Birch (1967) ไดนําเสนอ กระบวนการชีวสังเคราะหของสารโพลีคีไทด ซึ่งมีความ<br />
คลายคลึงกับการสังเคราะหกรดไขมันสายยาว (long-chain fatty acid)<br />
การสังเคราะหกรดไขมันสายยาว (ภาพที่<br />
1) ควบคุมโดยเอนไซมแฟตทีแอซิดซินเธส<br />
(fatty acid synthase; FAS) โดยในโปรคาริโอต จะประกอบไปดวยกลุมเอนไซมที่มีหนาที่ชนิด<br />
เดียว (monofunction<strong>al</strong> enzyme) หลายเอนไซมอยูรวมกัน<br />
และในยูคาริโอตจะเปนเอนไซมเดี่ยว<br />
ขนาดใหญซึ่งมีหลายหนาที่<br />
(multifunction<strong>al</strong> enzyme) โดยทั่วไปการสังเคราะหจะเริ่มจากโดเมน<br />
(domain) ที่ทําหนาที่เปนเอซิลทรานสเฟอเรส<br />
(acyltransferase; AT) นําหนวยเริ่มตน<br />
(starter<br />
unit) ในที่นี้<br />
คือ อะเซทิล-โคเอ (ac<strong>et</strong>yl-CoA) ไปยังบริเวณฟอสโฟแพนทีธีอิน<br />
(phosphopant<strong>et</strong>heine) ของโดเมนเอซิลแคริเออรโปรตีน (acyl carrier protein; ACP) เกิด<br />
พันธะโธโอเอสเทอร (thioester) และเคลื่อนยายไปเกิดพันธะโธโอเอสเทอรใหม<br />
ที่โดเมนเบตา-<br />
คีโตเอซิลซินเธส (β-k<strong>et</strong>oacylsynthase; KS) จากนั้นโดเมน<br />
AT จะนําหนวยตอเติม (extender<br />
unit) คือ มาโลนิล-โคเอ (m<strong>al</strong>onyl-CoA) ไปที่<br />
ACP ที่วางลง<br />
แลวเกิดกระบวนการดีคารบอก<br />
ซิเลทีฟคอนเดนเซชัน (decarboxylative condensation) โดยโดเมน KS เชื่อมหนวยเริ่มตนกับ<br />
หนวยตอเติมบน ACP ไดสายคารบอนที่มีความยาวเพิ่มขึ้น<br />
2 คารบอนจากหนวยตอเติม ตอมา<br />
หมูคีโตที่ตําแหนงเบตาจะเกิดกระบวนการคีโตรีดักชัน<br />
(k<strong>et</strong>oreduction) ดีไฮเดรชัน<br />
(dehydration) และอีโนอิลรีดักชัน (enoyl reduction) ขึ้น<br />
โดยเอนไซมคีโตรีดักเทส<br />
(k<strong>et</strong>oreductase; KR), ดีไฮดราเทส (dehydratase; DH) และอีโนอิลรีดักเทส (enoylreductase;<br />
ER) เปลี่ยนหมูคีโตนั้นใหเปนหมูไฮดรอกซิล<br />
(hydroxyl), หมูอีโนอิล<br />
(enoyl) และหมูอัลคิล<br />
(<strong>al</strong>kyl) ตามลําดับ แลวจึงกลับเขาสูการเชื่อมหนวยตอเติม<br />
ตามขั้นตอนดังกลาวซ้ํากันอีกหลาย<br />
รอบ จนไดสายคารบอนที่มีขนาดยาวตามตองการ<br />
จึงปลดปลอยสายคารบอนออกมาไดเปนกรด<br />
ไขมันอิ่มตัว<br />
(saturated fatty acid) โดยการทํางานของเอนไซมไธโอเอสเธอเรส (thioesterase;<br />
TE) (Hopwood and Sherman, 1990; Horton <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2002)<br />
5
สําหรับการสังเคราะหโพลีคีไทดนั้น<br />
ควบคุมโดยเอนไซมโพลีคีไทดซินเธส (polyk<strong>et</strong>ide<br />
synthase; PKS) การสังเคราะหโดยทั่วไปมีขั้นตอนเชนเดียวกับการสังเคราะหกรดไขมันสายยาว<br />
และปลอยสายคารบอนออกมาโดย TE แตมีความแตกตางสําคัญหลายประการ คือ การที่<br />
เอนไซม PKS สามารถจะเลือกใชหนวยเริ่มตนและหนวยตอเติมไดหลากหลายชนิด<br />
มากกวา<br />
เอนไซม FAS โดยอาจเปน อะเซทิล-โคเอ (ac<strong>et</strong>yl-CoA), มาโลนิล-โคเอ (m<strong>al</strong>onyl-CoA),<br />
เมธิลมาโลนิล-โคเอ (m<strong>et</strong>hylm<strong>al</strong>onyl-CoA), โพรพิโอนิล-โคเอ (propionyl-CoA) หรือ บิวทิ<br />
ริล-โคเอ (butyryl-CoA) เปนตน นอกจากนั้นยังมีการเลือกขั้นตอนของการเปลี่ยนแปลงหมูคี<br />
โต ซึ่งอาจไมเกิดกระบวนการนี้ทําใหไมมีการเปลี่ยนแปลงของหมูคีโต<br />
หรือเกิดเฉพาะคีโต<br />
รีดักชันทําใหไดเปนหมูไฮดรอกซิล<br />
หรือเกิดคีโตรีดักชันและดีไฮเดรชันทําใหไดเปนหมูอีโนอิล<br />
หรือเกิดคีโตรีดักชัน ดีไฮเดรชัน และอีโนอิลรีดักชันทําใหไดเปนหมูอัลคิล<br />
ซึ่งการเกิด<br />
กระบวนการรีดักชันของหมูคีโตนี้<br />
ในแตละตําแหนงสามารถเกิดการเปลี่ยนแปลงของหมูคีโตไดไม<br />
เหมือนกัน และเมื่อไดความยาวที่เหมาะสมก็จะเกิดการเชื่อมตอกันเปนวงของสายโพลีคีไทด<br />
ดวยกระบวนการไซไคลเซชัน (cyclisation) และ อะโรมาไทเซชัน (aromatisation) ไดเปนวง<br />
แหวนอะโรมาติก (aromatic ring) หรืออาจเกิดกระบวนการแลคโตไนเซชัน (lactonisation) ได<br />
เปนวงแลคโตน (lactone ring) นอกจากนั้นการสังเคราะหโพลีคีไทดยังมีกระบวนการดัดแปลง<br />
ภายหลัง (post-modification) อื่นอีก<br />
เชน กระบวนการไฮดรอกซิเลชัน (hydroxylation) ไกลโค<br />
ซิเลชัน (glycosylation) และเมธิลเลชัน (m<strong>et</strong>hylation) เปนตน เพื่อเพิ่มสมบัติการเปนสารออก<br />
ฤทธิ์ทางชีวภาพใหกับโมเลกุลนั้นๆ<br />
ดวยกระบวนการตางๆ ที่กลาวมาซึ่งแตกตางไปจากการ<br />
สังเคราะหกรดไขมันสายยาวนี้<br />
ทําใหเกิดความหลากหลายของโครงสรางของสารโพลีคีไทดเปน<br />
จํานวนมาก (Hopwood and Sherman, 1990; Carreras <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997)<br />
6
ภาพที่<br />
1 ชีวสังเคราะหของสารโพลีคีไทดเปรียบเทียบกับการสังเคราะหกรดไขมันสายยาว<br />
FAS=fatty acid synthase และ PKS=polyk<strong>et</strong>ide synthase ประกอบดวย k<strong>et</strong>osynthase<br />
(KS; ◊) และ acyl carrier protein (ACP; •) การสังเคราะหดําเนินไปดังภาพ โดย<br />
AT=ac<strong>et</strong>yl transferase, TR=acyl transfer reaction, MT=m<strong>al</strong>onyl transferase,<br />
KR=k<strong>et</strong>oreductase, DH=dehydratase, ER=enoylreductase, PT=pamityl transferase<br />
และ TE=thioesterase k, h, e และ a แทนความหลากหลายของการเปลี่ยนแปลง<br />
หมูคีโต<br />
ในการสังเคราะหโพลีคีไทด ทําใหไดหมูคีโตเชนเดิม<br />
หมูไฮดรอกซิล<br />
หมู<br />
อีโนอิลและหมูอัลคิลตามลําดับ<br />
ที่มา:<br />
Hopwood and Sherman, 1990<br />
7
ชนิดของยีนและเอนไซมโพลีคีไทดซินเธส<br />
ระบบเอนไซมโพลีคีไทดซินเธส สามารถแบงออกไดเปน 3 ชนิด คือ ชนิดที่<br />
1, 2 และ 3<br />
(Type I, II, III) (Shen and Hutchinson, 1993) ตามลักษณะการจัดเรียงตัวของกลุมยีนและ<br />
การทํางานของเอนไซมที่มีความแตกตางกัน<br />
โดยในที่นี้จะไดอธิบายเฉพาะในสวนของ<br />
ระบบ<br />
PKS ในแบคทีเรียเทานั้น<br />
โพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
1 (Type I PKS) เปนเอนไซมที่มีลักษณะเปนโปรตีนขนาดใหญ<br />
มีหลายหนาที่<br />
(multifunction<strong>al</strong> protein) ประกอบดวยหลายโดเมนอยูรวมกัน<br />
(ภาพที่<br />
2ก)<br />
ยีนของแตละโดเมนมีการจัดเรียงซ้ํากันเปนชุด<br />
เรียกแตละชุดวา โมดุล (module) ซึ่งจะประกอบ<br />
ไปดวยยีนสรางเอนไซมหลัก คือ คีโตเอซิลซินเธส (KS), เอซิลทรานสเฟอเรส (AT) และเอซิล<br />
แคริเออรโปรตีน (ACP) ทําหนาที่ในการสังเคราะหโครงสรางหลักอะไกลโคน<br />
(aglycone) ของ<br />
สารโพลีคีไทด และอาจมียีนสรางเอนไซมสําหรับการดัดแปลงหมูคีโต<br />
คือ คีโตรีดักเทส (KR)<br />
หรือ คีโตรีดักเทสและดีไฮดราเทส (KR-DH) หรือ คีโตรีดักเทส, ดีไฮดราเทสและอีโนอิลรีดัก<br />
เทส (KR-DH-ER) เปลี่ยนหมูคีโตเปนไฮดรอกซิล,<br />
อีโนอิล และอัลคิล ตามลําดับ<br />
PKS ชนิดนี้ทําหนาที่สังเคราะหสารโพลีคีไทดที่มีโครงสรางเปนวงแลคโตน<br />
(Hopwood and<br />
Sherman, 1990; Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991) เชน อีรีโธรมัยซินที่ผลิตจากเชื้อ<br />
Saccharopolyspora<br />
erythraea (Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991), ราพามัยซินจากเชื้อ<br />
S. hygroscopicus (Schwecke <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1995), นิดดามัยซิน (niddamycin) จากเชื้อ<br />
S. caelestis (Kakavas <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997) และนัยสตา<br />
ตินจากเชื้อ<br />
S. noursei (Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) หรือทําหนาที่ในการสังเคราะหสารโพลีคีไทด<br />
กลุมโพลีอีเธอร<br />
(poly<strong>et</strong>her) เชน นานชางมัยซิน (nanchangmycin) จากเชื้อ<br />
S. nanchangensis<br />
NS3226 (Sun <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003) และโมเนนซิน (monensin) จากเชื้อ<br />
S. cinnamonensis<br />
(Oliynyk <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003) ดังภาพที่<br />
3 ก<br />
โพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
2 (Type II PKS) แตกตางไปจากชนิดที่<br />
1 คือ เอนไซมแตละ<br />
ชนิดจะแยกทําหนาที่เดี่ยว<br />
(monofunction<strong>al</strong> protein) โดยมียีนอยูอยางนอย<br />
3 ยีน (minim<strong>al</strong><br />
PKS) (Hopwood and Sherman, 1990; McDaniel <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1994) คือ คีโตเอซิลซินเธสแอลฟา<br />
(KSα), คีโตเอซิลซินเธสเบตา [KSβ; chain length factor (CLF)] และ ACP (ภาพที่<br />
2 ข)<br />
ทําหนาที่ในการควบคุมการสังเคราะหสายคารบอนหลักของสารโพลีคีไทด<br />
นอกจากนั้นยังมียีน<br />
ของเอนไซมอื่นอีก<br />
คือ KR ทําใหเกิดการรีดักชันเปลี่ยนหมูคีโตเปนไฮดรอกซิลที่ตําแหนงจําเพาะ<br />
ไซเคลส (cyclase) และอะโรมาเทส (aromatase) ที่ทําใหเกิดการสรางวงแหวนอะโรมาติกที่<br />
ถูกตอง ดังนั้นโพลีคีไทดที่สังเคราะหไดจึงมีโครงสรางเปนวงแหวนอะโรมาติก<br />
(Hopwood and<br />
Sherman, 1990; McDaniel <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1994) เชน แอกทิโนโรดิน (actinorhodin) จากเชื้อ<br />
8
S. coelicolor A3(2) (Fernandez-Moreno <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992) , เททราซีโนมัยซิน (t<strong>et</strong>racenomycin)<br />
จากเชื้อ<br />
S. glaucescens (Bibb <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989) และออกซีเททราไซคลิน (oxyt<strong>et</strong>racycline) จาก<br />
เชื้อ<br />
S. rimosus (Butler <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989) ดังภาพที่<br />
3 ข<br />
โพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
3 (Type III PKS) มียีนหลักเพียง 1 ยีน สรางเอนไซมที่<br />
คลายคลึงกับเอนไซมในกลุมชาลโคนซินเธส<br />
(ch<strong>al</strong>cone synthase) ที่พบในพืช<br />
(ภาพที่<br />
2 ค)<br />
การทํางานจะแตกตางไปจาก PKS ชนิดอื่น<br />
เนื่องจากไมอาศัย<br />
ACP แตสามารถทํางานได<br />
โดยตรงจากสารตั้งตนซึ่งเปนโคเอ-ไธโอเอสเทอร<br />
(CoA-thioester) โดยเพิ่งจะมีการคนพบใน<br />
แบคทีเรียเมื่อไมนานมานี้<br />
โดยพบวาเกี่ยวของกับการสังเคราะหสารอะโรมาติกขนาดเล็ก<br />
(Moore<br />
and Hopke, 2001) ตัวอยางเชน 1,3,6,8-เททราไฮดรอกซีแนพธาลีน (1,3,6,8-t<strong>et</strong>rahydroxy<br />
naphth<strong>al</strong>ene; THN) ที่ผลิตจาก<br />
S. griseus (Funa <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1999) และโมโนอะเซทิลโฟลโรกลูซิ<br />
นอล (monoac<strong>et</strong>ylphloroglucinol; MAPG) จากเชื้อ<br />
Pseudomonas fluorescens (Bangera and<br />
Thomashow, 1999) ดังภาพที่<br />
3 ค เปนตน<br />
9
(ก)<br />
(ข)<br />
(ค)<br />
ery<br />
nid<br />
act<br />
tcm<br />
rpp<br />
phl<br />
1 kb<br />
1 kb<br />
ภาพที่<br />
2 การจัดเรียงตัวของกลุมยีนโพลีคีไทดซินเธส<br />
(ก) ยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
1 ของการสังเคราะหอีรีโธรมัยซิน (ery) และ<br />
นิดดามัยซิน (nid)<br />
(ข) ยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
2 ของการสังเคราะหแอกทิโนโรดิน (act) และ<br />
เททราซีโนมัยซิน (tcm)<br />
(ค) ยีนโพลีคีไทดซินเธสชนิดที่<br />
3 ของการสังเคราะห 1,3,6,8-เททราไฮดรอกซี<br />
แนพธาลีน (rpp) และโมโนอะเซทิลโฟลโรกลูซินอล (phl)<br />
1 kb<br />
β-k<strong>et</strong>oacyl synthase α Dehydratase Thioesterase<br />
Acyltransferase Enoylreductase β-k<strong>et</strong>oacyl synthase β<br />
Acyl carrier protein K<strong>et</strong>oreductase Cyclase/Aromatase<br />
10
(ก)<br />
(ข)<br />
(ค)<br />
C<br />
H 3<br />
O<br />
HO<br />
N<br />
O<br />
C<br />
H 3<br />
O<br />
OH O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
CH 3<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
Erythromycin<br />
OMe<br />
OMe<br />
O<br />
H C 3<br />
Rapamycin<br />
H<br />
O<br />
H<br />
OH O COOH<br />
C<br />
H 3<br />
O<br />
N<br />
OH<br />
CH3 OH<br />
CH3 CH 3<br />
OH OH<br />
OMe<br />
C<br />
H 3<br />
OH<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
O<br />
CH 3<br />
CH 3 O<br />
HO<br />
HO<br />
C<br />
H 3<br />
O<br />
C<br />
H 3<br />
OH OH<br />
OH<br />
OH NH2 O OH<br />
O<br />
CH3 ภาพที่<br />
3 ตัวอยางสารโพลีคีไทด<br />
(ก) สารโพลีคีไทดชนิดที่<br />
1 : อีรีโธรมัยซิน (erythromycin) ราพามัยซิน (rapamycin)<br />
นัยสตาติน (nystatin) และนานชางมัยซิน (nanchangmycin)<br />
(ข) สารโพลีคีไทดชนิดที่<br />
2 : แอกทิโนโรดิน (actinorhodin) เททราซีโนมัยซิน<br />
(t<strong>et</strong>racenomycin) และออกซีเททราไซคลิน (oxyt<strong>et</strong>racycline)<br />
(ค) สารโพลีคีไทดชนิดที่<br />
3 : 1,3,6,8-เททราไฮดรอกซีแนพธาลีน (1,3,6,8t<strong>et</strong>rahydroxynaphth<strong>al</strong>ene;<br />
THN) และ โมโนอะเซทิลโฟลโรกลูซินอล<br />
(monoac<strong>et</strong>ylphloroglucinol; MAPG)<br />
O<br />
O<br />
CH3 OH<br />
O O OH CH3 OH<br />
OH<br />
OH OH OH<br />
OH O<br />
O CH 3<br />
CO 2 CH 3<br />
Nystatin<br />
HO OH<br />
HO<br />
OH<br />
OH O OH O<br />
OH<br />
Actinorhodin T<strong>et</strong>racenomycin C Oxyt<strong>et</strong>racycline<br />
OH O<br />
THN MAPG<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
Nanchangmycin<br />
HO<br />
O<br />
OH H<br />
OMe<br />
O O CH 3<br />
OH<br />
COOH<br />
O OH<br />
OH<br />
N(CH 3 ) 2<br />
O<br />
OH<br />
NH 2<br />
11
การศึกษาเกี่ยวกับยีน<br />
Type I PKS<br />
กลุมยีน<br />
Type I PKS เริ่มมีการศึกษาครบทั้งระบบครั้งแรกในการสังเคราะหสาร<br />
6deoxyerythronolide<br />
B (6-dEB) ซึ่งเปนโครงสรางอะไกลโคนของอีรีโธรมัยซิน<br />
ที่ผลิตจาก<br />
Saccharopolyspora erythraea โดยใชหนวยเริ่มตนเปนโพรพิโอนิล-โคเอ<br />
1 หนวย เชื่อมกับหนวย<br />
ตอเติม เมธิลมาโลนิล-โคเอ 6 หนวย (Cortes <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1990; Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991; Bevitt <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 1992) Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1991) ใชวิธียีนดิสรัปชัน (gene disruption) ในการศึกษา โดยนํา<br />
ชิ้นดีเอ็นเอที่คาดวามีสวนของยีนที่เกี่ยวของกับการสราง<br />
6-dEB เชื่อมตอเขากับพลาสมิดซึ่ง<br />
จําลองตัวไดนอย แลวถายกลับเขาไปในเชื้อเพื่อใหเกิดโฮโมโลกัสรีคอมบิเนชัน<br />
(homologous<br />
recombination) 1 ครั้ง<br />
สวนของพลาสมิดที่แทรกอยูบนโครโมโซมจะทําให<br />
mRNA เดิมของยีน<br />
ที่เกี่ยวกับการสราง<br />
6-dEB ถูกขัดขวางเปนผลใหสังเคราะหโปรตีนที่ถูกตองไมได<br />
สามารถ<br />
ตรวจสอบสายพันธุกลายไดจากการไมผลิตสาร<br />
6-dEB แสดงวาชิ้นดีเอ็นเอนั้นมีความเกี่ยวของ<br />
กับการสังเคราะหอีรีโธรมัยซิน จากการหาลําดับเบส พบเอนไซม PKS ที่เกี่ยวของจัดเรียงตัวเปน<br />
6 โมดุล อยูบนโปรตีน<br />
3 สาย คือ DEBS1 (6-deoxyerythronolide B synthase 1), DEBS2<br />
และ DEBS3 และจากการทําใหเกิดการกลายโดยการขาดหายไปของยีน คีโตรีดักเทสของโมดุล<br />
ที่<br />
5 พบการเปลี่ยนแปลงของหมูคีโตที่ตําแหนงคารบอนซึ่งคาดวาสัมพันธกับการทํางานในรอบที่<br />
5 จากเดิมเปนหมูไฮดรอกซิลกลับคงหมูคีโตไวในสายพันธุกลาย<br />
(Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991)<br />
แสดงวาแตละโมดุลมีหนาที่เชื่อมตอสายคารบอนในแตละรอบ<br />
โดย AT จะนําหนวยเริ่มตนหรือ<br />
หนวยตอเติมที่จําเพาะเขามาเชื่อม<br />
และ KR, DH และ ER จะกําหนดขั้นตอนของการดัดแปลง<br />
หมูคีโต<br />
ซึ่งการจัดเรียงตัวของโดเมนตางๆ<br />
ในแตละโมดุล ก็จะสอดคลองกับการสังเคราะห<br />
โครงสรางของ 6-dEB (ภาพที่<br />
4) นอกจากนั้นยังพบ<br />
active site motif ของโดเมนตางๆ โดย<br />
KS มี active site สําหรับการเกิดพันธะไธโอเอสเทอร ซึ่งมี<br />
consensus เปน GPxxxxxTACSS<br />
ขณะที่<br />
AT มี active site สําหรับการทําใหเกิด acyl-enzyme intermediate โดยมี consensus เปน<br />
GHSxG สวน ACP มี active site ของบริเวณเขาจับของฟอสโฟแพนทีธีอิน LGxDSLxxVE และ<br />
KR มี active site สําหรับการจับของ NADPH ดวย consensus GxxGxxAxxA (Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1991)<br />
12
ภาพที่<br />
4 กระบวนการสังเคราะหอีรีโธรมัยซินและการจัดเรียงตัวของเอนไซม PKS<br />
DEBS=6-deoxyerythronolide B synthase<br />
ที่มา:<br />
Rodriguez and McDaniel, 2001<br />
13
จากการศึกษาดังกลาว ทําใหความสนใจที่จะศึกษาระบบการทํางานของ<br />
Type I PKS มี<br />
มากขึ้น<br />
เพื่อที่จะทําความเขาใจกระบวนการการทํางานตางๆ<br />
โดยใชระบบของกลุมยีนอีรีโธรมัย<br />
ซินเปนตนแบบ รวมทั้งทําใหมีการศึกษายีนโพลีคีไทดซินเธสในสิ่งมีชีวิตตางๆ<br />
เพิ่มขึ้นอยาง<br />
รวดเร็วในเวลาตอมา ดังที่จะไดกลาวตอไป<br />
ไดมีการศึกษาการทํางานของโดเมนตางๆ ของ DEBS โดยเฉพาะสวนของ active site<br />
ไดแก การทําใหเกิดการกลายที่<br />
active site ของโดเมน AT ที ่จําเพาะตอเมธิลมาโลนิล-โคเอ<br />
เปนผลใหมีการนํามาโลนิล-โคเอ เขามาแทนในการทํางานของโมดุลที่<br />
4 ซึ่งแสดงวา<br />
active site มี<br />
ความจําเพาะตอชนิดของหนวยตอเติมที่จะนําเขามาเชื่อมสายโพลีคีไทด<br />
(Reeves <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001)<br />
โดเมน KR อยูในกลุมของเอนไซม<br />
short chain dehydrogenase/reductase ทําใหเกิดหมูไฮดรอก<br />
ซิลที่มี<br />
configuration แตกตางกัน คืออาจเปน D- หรือ L-configuration ซึ่งคาดวาเกิดจาก<br />
ทิศทางการทํางานของตําแหนง active site ของคีโตรีดักเทส (Reid <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003) สําหรับ ER<br />
เมื่อทําใหเกิดการกลายที<br />
่ active site ในโมดุลที่<br />
4 ทําใหสามารถสังเคราะหสารใหมที่มีโครงสราง<br />
คลายกับอีรีโธรมัยซิน (erythromycin an<strong>al</strong>ogue) โดยพบการเปลี่ยนแปลงจากหมูอัลคิลเดิม<br />
ไป<br />
เปนหมูอีโนอิล<br />
(Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1993) และยังแสดงใหเห็นอีกวาการทํางานของ Type I PKS<br />
นี้<br />
เปนไปตามลําดับของโมดุล และสามารถใชความรูนี้ในการดัดแปลงกลุมยีนเพื่อใหสังเคราะห<br />
สารตัวใหมตามที่คาดหมายไวได<br />
สวนโดเมน TE ที่ทําหนาที่ในการเรงการปลดปลอยสายโพลีคี<br />
ไทดออกจากโมดุลทายนั้น<br />
ไมสามารถทําใหสายโพลีคีไทดเชื่อมกันเปนวงแลคโตนไดโดยตรง<br />
แตตองทํางานรวมกันกับ PKS ดวย (Gokh<strong>al</strong>e <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1999)<br />
การศึกษากระบวนการสังเคราะหอีรีโธรมัยซินของ DEBS นั้น<br />
มีรายงานการศึกษาใน<br />
สวนของโมดุลเริ่มตน<br />
(loading module) โดยพบวาสายพันธุกลายที่ไมมี<br />
AT หรือสายพันธุกลาย<br />
ที่ไมมีทั้ง<br />
AT และ ACP ที่โมดุลเริ่มตน<br />
จะสังเคราะหอีรีโธรมัยซินได ถึงแมจะมีปริมาณที่ลดลง<br />
แสดงวาโมดุลเริ่มตนไมมีความจําเปนในการสังเคราะห<br />
(Perada <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1998) และในสายพันธุ<br />
กลายดังกลาวนาจะสังเคราะหโดยเริ่มจากโมดุลที่<br />
1 โดยตรง และจากการศึกษาของ Lau <strong>et</strong> <strong>al</strong>.<br />
(2000) ก็แสดงวา AT ของโมดุลเริ่มตนนี้<br />
ไมมีความจําเพาะตอหนวยเริ่มตน<br />
คือ สามารถจับกับ<br />
หนวยเริ่มตนไดหลายชนิด<br />
ซึ่งสนับสนุนวาโมดุลเริ่มตนนี้<br />
ไมมีความสําคัญในการสังเคราะหอี<br />
รีโธรมัยซิน<br />
การศึกษาการสงตอสายโพลีคีไทดของ DEBS พบวาในแตละ DEBS การสงตอระหวาง<br />
โมดุลจะตองอาศัยบริเวณระหวางโดเมน ACP และ KS (ACP-KS linker) และในการสงตอ<br />
ระหวาง DEBS จะตองอาศัยความเขากันไดของปลายดานคารบอกซี (C-termin<strong>al</strong>) ของ DEBS<br />
14
กอนหนากับปลายดานอะมิโน (N-termin<strong>al</strong>) ของ DEBS ตอมา จึงจะสามารถเกิดการสงตอสาย<br />
โพลีคีไทดได (Wu <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2002)<br />
นอกจากนั้นยังมีการศึกษาอื่น<br />
ที่เกี่ยวของกับการนํา<br />
DEBS มาประยุกตใช โดย Kao <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>. (1994) สามารถโคลนกลุมยีนทั้งหมดของ<br />
DEBS และนํามาแสดงออกไดใน S. coelicolor<br />
ทําใหเกิดการสังเคราะหสารซึ่งมีโครงสรางคลายกับอีรีโธรมัยซิน<br />
ตางกันที่หนวยเริ่มตนที่เปน<br />
มาโลนิล-โคเอ แทน โพรพิโอนิล-โคเอ เนื่องจากไมมีการสังเคราะหโพรพิโอนิล-โคเอ<br />
ใน S.<br />
coelicolor วิธีการนี้<br />
ชวยใหการศึกษาและการดัดแปลงยีน PKS จากเชื้อตางๆ<br />
เปนไปไดงายขึ้น<br />
เนื่องจาก<br />
S. coelicolor เปนสายพันธุที่งายตอการจัดการทางพันธุวิศวกรรม<br />
โดยตอมามีการ<br />
ดัดแปลงยีน DEBS โดยการแทนที่โดเมนตางๆ<br />
ไดแก AT และ KR ในหลายโมดุล ดวยยีน<br />
ดังกลาวจากกลุมยีนสังเคราะหราพามัยซิน<br />
ใน S. hygroscopicus ทําใหไดสารที่มีโครงสราง<br />
แตกตางกันมากกวา 50 แบบ (McDaniel <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1999) เรียกการสังเคราะหสารเหลานี้วา<br />
combinatori<strong>al</strong> biosynthesis (Khosla and Zawada, 1996) ซึ่งโครงสรางของบางโมเลกุลไม<br />
สามารถสังเคราะหไดดวยวิธีทางเคมี การทดลองนี้ยังแสดงใหเห็นวา<br />
DEBS ทนทานตอการ<br />
ดัดแปลงไดหลายตําแหนงพรอมกัน ถึงแมวาสารที่ผลิตไดจะมีปริมาณนอยลงเมื่อเทียบกับ<br />
wild<br />
type (McDaniel <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1999)<br />
การศึกษายีน Type I PKS นอกเหนือไปจากการสังเคราะหอีรีโธรมัยซิน ไดแก การ<br />
สังเคราะหราพามัยซินใน S. hygroscopicus ซึ่งประกอบดวย<br />
14 โมดุล บนโปรตีน 3 สาย และมี<br />
การทํางานของโดเมน โคเอ-ไลเกส (CoA-ligase) ที่โมดุลเริ่มตนสงผลใหมีการนําหนวยเริ่มตนที่<br />
เปนวงแหวนอะโรมาติกเขามา (Schwecke <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1995) การสังเคราะหอะเวอรเมกทิน<br />
(avermectin) ใน S. avermitilis ซึ่งประกอบไปดวย<br />
12 โมดุล (Ikeda <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1999) การ<br />
สังเคราะห FK520 ใน S. hygroscopicus ซึ่งประกอบไปดวย<br />
10 โมดุล บนโปรตีน 3 สาย (Wu<br />
<strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) และการสังเคราะหนิดดามัยซินซึ ่งประกอบไปดวย 7 โมดุล บนโปรตีน 5 สาย<br />
จากเชื้อ<br />
S. caelestis (Kakavas <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997) เปนตน<br />
การศึกษายีน Type I PKS ที่เพิ่มขึ้นนี้จะชวยใหเกิดความเขาใจกระบวนการทํางานของ<br />
เอนไซมชนิดนี้มากขึ้น<br />
รวมทั้งยังสามารถนําไปประยุกตใชเพื่อผลิตสารโพลีคีไทดชนิดใหมไดอีก<br />
ดวย<br />
15
สารออกฤทธิ์ตานเชื้อรา<br />
สารตานเชื้อราเปนสารที่มีการนําไปใชประโยชนในหลายดาน<br />
ทางดานการแพทยมีความ<br />
ตองการสารตานเชื้อรา<br />
เนื่องจากการรักษาโรคที่เกิดจากการติดเชื้อแบคทีเรียและโรคมะเร็ง<br />
ความ<br />
ชรา หรือภาวะภูมิคุมกันบกพรอง<br />
ทําใหมีโอกาสเสี่ยงสูงที่จะติดเชื้อรา<br />
Candida หรือ Aspergillus<br />
ซึ่งเปนเชื้อฉวยโอกาส<br />
โดยเมื่อมีการติดเชื้อราภายในระบบรางกายก็มักจะทําใหผูปวยเสียชีวิต<br />
ทางดานการสัตวแพทยก็เชนเดียวกัน (Tanaka, 1992) ทางดานการเกษตร โรคจากเชื้อราทําให<br />
มีการสูญเสียผลผลิตในพืชสําคัญ เชน ขาว ขาวสาลี และขาวโพด (Okuda and Tanaka, 1992)<br />
ดังนั้นสารตานเชื้อราจึงเปนสารหนึ่งที่มีความสําคัญ<br />
การคนหาและพัฒนาสารตานเชื้อราใหมๆ<br />
ที่มีประสิทธิภาพเปนไปอยางคอนขางยาก<br />
เมื่อ<br />
เปรียบเทียบกับสารตานเชื้อแบคทีเรีย<br />
เนื่องจากสาเหตุหลักคือ<br />
เชื้อราเปนยูคาริโอต<br />
ทําใหสาร<br />
ตานเชื้อราสวนใหญมีพิษตอมนุษยจนไมสามารถนํามาใชได<br />
(Tanaka, 1992) สารตานเชื้อราที่<br />
ใชอยูในปจจุบันสามารถจัดแบงได<br />
3 กลุม<br />
คือ กลุมสารโพลีอีน<br />
(polyene) เชน แอมโฟเทอริซิน<br />
บี และนัยสตาติน เปนตน กลุมสารอัลลีลเอมีน<br />
(<strong>al</strong>lylamine) เชน นาฟทิฟน (naftifine) และ<br />
เทอรบินาฟน (terbinafine) เปนตน และกลุมสารเอโซล<br />
(azole) เชน ไมโคนาโซล<br />
(miconazole) และฟลูโคนาโซล (fluconazole) เปนตน นอกจากนั้นยังมีสารอื่นที<br />
่ไมอยูในกลุม<br />
ดังกลาว เชน ฟลูไซโทซีน (flucytosine) ซึ่งเปนสารคลายนิวคลีโอไซด<br />
(nucleoside an<strong>al</strong>ogue)<br />
และซอรดาริน (sordarin) เปนตน (Warnock, 1997; Andriole, 2000)<br />
สารโพลีคีไทดที่ออกฤทธิ์ตานเชื้อรา<br />
สารโพลีคีไทดซึ่งออกฤทธิ์ตานเชื้อราเปนสารที่จัดอยูในกลุมโพลีอีน<br />
สารที่สําคัญไดแก<br />
แอมโฟเทอริซิน บี ซึ่งผลิตจากเชื้อ<br />
S. nodosus (Caffrey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001) และนัยสตาติน ซึ่งผลิต<br />
จากเชื้อ<br />
S. noursei (Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) โดยสารเหลานี้จะเขาไปจับตัวไดดีกับเออรโกส<br />
เทอรอล (ergosterol) ซึ่งเปนสารสเทอรอล<br />
(sterol) สวนใหญในเยื่อหุมเซลลของรา<br />
แตจะจับกับ<br />
คอเลสเตอรอล (cholesterol) ในเยื่อหุมเซลลของมนุษยไดไมดี<br />
ผลการจับทําใหเกิดการรั่วของ<br />
เยื่อหุมเซลล<br />
ทําใหเซลลตาย โดยพบวาจํานวนพันธะคูในโครงสรางของโพลีอีน<br />
สงผลตอระดับ<br />
ความรุนแรงของการออกฤทธิ์ตานเชื้อรา<br />
(McGinnis and Rin<strong>al</strong>di, 1996; Andriole, 2000)<br />
เชนการใช แอมโฟเทอริซิน บี และนัยสตาติน ซึ่งมีจํานวนพันธะคู<br />
7 ตําแหนง (heptaene) และ<br />
4 ตําแหนง (t<strong>et</strong>raene) ตามลําดับ จะใหผลการรักษาไดเทากันเมื่อใชแอมโฟเทอริซินดวยความ<br />
เขมขนที่ต่ํากวานัยสตาติน<br />
นอกจากนี้ยังมีสารโพลีอีนอื่นอีกที่เปนสารออกฤทธิ์ตานเชื้อรา<br />
เชน<br />
แคนดิซิดิน (candicidin) ที่ผลิตจากเชื้อ<br />
S. griseus (Campelo and Gil, 2002), พิมาริซิน<br />
16
(pimaricin) จาก S. nat<strong>al</strong>ensis (Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000), ไทรโคมัยซิน (trichomycin) จาก S.<br />
hachijoensis (Hosoya <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1952) รวมทั้งไรโมซิดินจาก<br />
S. rimosus (Davisson <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1951)<br />
การตรวจหาสารออกฤทธิ์ตานเชื้อรา<br />
การตรวจหาสารตานเชื้อราเบื้องตน<br />
สามารถทําโดยใชวิธีทางจุลชีววิทยา ทดสอบสาร<br />
ตัวอยางในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา<br />
เรียกวา วิธีการแพรผานวุน<br />
(agar diffusion<br />
m<strong>et</strong>hod) ทําโดยการเพาะเชื้อราบนจานอาหารแข็ง<br />
ซึ่งนิยมใช<br />
Candida หรือ Saccharomyces<br />
จากนั้นนําสารตัวอยางใสลงบนผิวอาหารใหแพรเขาสูเจล<br />
ซึ่งอาจทําไดหลายวิธี<br />
เชน การวางทอ<br />
ทรงกระบอกบนผิวของจานอาหารแลวเติมสารละลายของสารที่ตองการทดสอบลงไป<br />
การเจาะ<br />
อาหารแข็งออกเปนทรงกระบอกแลวเติมสารละลายลงไป หรือการวางแผนกระดาษกลม (paper<br />
disk) ที่ชุมดวยสารละลายบนอาหารแข็ง<br />
(Brewer and Platt, 1967; Tanaka, 1992)<br />
การตรวจสอบสารตานเชื้อราในกลุมโพลีอีน<br />
สามารถใชวิธีทางเคมี ไดแก thin-layer<br />
chromatography (TLC) และสเปกโทรเมทรี (spectrom<strong>et</strong>ry) โดยการสกัดสารโพลีอีนจากเซลล<br />
หรืออาหารเลี้ยงเชื้อดวยบิวทานอล<br />
(n-butanol) หรือเมธานอล จากนั้นจึงนําไปทํา<br />
TLC หรือวัด<br />
การดูดแสงเปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน (Brewer and Platt, 1967; Tanaka, 1992)<br />
การแยกสารในกลุมโพลีอีนโดย<br />
TLC สามารถใชตัวพา (mobile phase) ไดหลายชนิด<br />
เชน คลอโรฟอรม:เมธานอล (85:15), บิวทานอล:กรดอะซีติก:น้ํา<br />
(4:1:5) และบิวทานอล:<br />
เอธานอล:น้ํา<br />
(1:1:1) (Pandey and Rinehart, 1977; Pandey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1982) เปนตน สามารถ<br />
ตรวจสอบจุดของสารที่แยกไดหลายวิธี<br />
เชน ตรวจสอบภายใตแสงอัลตราไวโอเลต, การรมดวยไอ<br />
ของไอโอดีน (iodine vapor), การพนดวยกรดซัลฟูริก (sulfuric acid spray) และการพนดวยนิน<br />
ไฮดริน (ninhydrin spray) เปนตน หรืออาจนําไปทําไบโอออโทกราฟ (bioautography) โดยการ<br />
การเททับแผนเคลือบดวยอาหารที่มีเชื้อรา<br />
เพื่อตรวจสอบไดอีกดวย<br />
(Lomovskaya <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997;<br />
Campelo and Gil, 2002)<br />
คาการดูดแสงของสารโพลีอีนมีลักษณะเฉพาะ โดยจะมีความยาวคลื่นที่ใหคาการดูดแสง<br />
สูงสุด (λmax) 3 หรือ 4 ตําแหนง (Tanaka, 1992) ซึ่งสารที่มีจํานวนพันธะคูเทากันจะมีการดูด<br />
แสงที่ความยาวคลื่นใกลเคียงกัน<br />
โดยสามารถสรุปการดูดแสงของโพลีอีนทั่วไปไดดังตารางที่<br />
1<br />
17
ตารางที่<br />
1 ความยาวคลื่นที่ใหคาการดูดแสงสูงสุดของสารปฏิชีวนะกลุมโพลีอีน<br />
กลุมสารโพลีอีน<br />
1<br />
λmax (nm)<br />
2 3<br />
T<strong>et</strong>raenes 291 305 319<br />
Pentaenes 318 333 351<br />
Hexaenes 340 358 379<br />
Heptaenes 362 381 405<br />
ที่มา:<br />
Dinya and Sztaricskai, 1986<br />
ไรโมซิดิน<br />
S. rimosus ถูกคนพบวาสามารถสังเคราะหสารตานเชื้อราไรโมซิดิน<br />
(ภาพที่<br />
5) ตั้งแตป<br />
1951 (Davisson <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1951) โดยเริ่มมีรายงานการศึกษาโครงสรางโมเลกุลในป<br />
1965<br />
(Cope <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1965) และทราบโครงสรางทั้งหมดในราวป<br />
1977 (Pandey and Rinehart,<br />
1977; F<strong>al</strong>kowski <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1978) สวนการศึกษา configuration ของหมูตางๆ<br />
มีการรายงานในป<br />
2002 (Volpon and Lancelin, 2002) โดยไรโมซิดินเปนสารโพลีอีนซึ่งมีจํานวนพันธะคู<br />
4<br />
ตําแหนง เชนเดียวกับนัยสตาติน คาการดูดแสงในสารละลายเมธานอลของไรโมซิดิน มีความ<br />
ยาวคลื่นที่ใหคาการดูดแสงสูงสุด<br />
4 ตําแหนง คือ 279, 291, 304 และ 318 นาโนเมตร (Cope<br />
<strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1965)<br />
O<br />
O OH O<br />
OH<br />
R2<br />
ภาพที่<br />
5 โครงสรางโมเลกุลของไรโมซิดิน<br />
R1= CH2-CH3 ; R2= CH2-CH2-CH3 ที่มา:<br />
Volpon and Lancelin, 2002<br />
R1<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
COOH<br />
O O CH3 OH<br />
HO<br />
NH2 18
การสงถายพลาสมิดเขาสู<br />
Streptomyces<br />
การสงถายพลาสมิดเขาสู<br />
Streptomyces สามารถทําไดหลายวิธี อาทิ ทรานสฟอรเมชัน<br />
(transformation), ทรานสดักชัน (transduction) และคอนจูเกชัน (conjugation) ซึ่งจะพบ<br />
ขอจํากัดอยูหลายประการ<br />
เชน การทําทรานสฟอรเมชันจะมีประสิทธิภาพต่ํา<br />
การทําทรานสดัก<br />
ชันทําไดไมแพรหลายเนื่องจากขาดแคลนฝาจ<br />
(phage) ที่สามารถใชกับเชื้อไดหลายชนิด<br />
(Kieser<br />
<strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) จึงมีการพัฒนาวิธีการใหมใหสามารถสงถายพลาสมิด เขาสู<br />
Streptomyces ได<br />
อยางมีประสิทธิภาพ ดังที่จะไดกลาวตอไป<br />
Streptomyces หลายชนิดมีระบบการปองกัน โดยการทําลายดีเอ็นเอแปลกปลอม<br />
(restriction-modification system) (Sanchez <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1985; MacNeil, 1988; Rodicio and<br />
Chater, 1988) ดังนั้นการสงถายดีเอ็นเอที่ไมมีการเติมหมูเมธิลโดยผานดีเอ็นเอนั้นเขาสู<br />
E. coli<br />
สายพันธุที่ขาดการเติมหมูเมธิล<br />
เชน สายพันธุ<br />
ET12567 (MacNeil <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992) เสียกอนแลว<br />
จึงนํามาถายเขาสู<br />
Streptomyces จะทําใหประสิทธิภาพในการสงถายพลาสมิดสูงขึ้น<br />
(MacNeil <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 1992; Fl<strong>et</strong>t <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997)<br />
วิธีการสงถายพลาสมิดเขาสู<br />
Streptomyces ในปจจุบัน<br />
Bibb <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1978) ไดพัฒนาวิธีการทรานสฟอรเมชันของ Streptomyces โดยใชไลโซ<br />
ไซม (lysozyme) ทําใหเสนใยอยูในรูปโพรโทพลาสต<br />
(protoplast) แลวนําดีเอ็นเอเขาสูโพรโท<br />
พลาสตโดยอาศัยการเหนี่ยวนําของโพลีเอธิลีนไกลคอล<br />
(poly<strong>et</strong>hylene glycol; PEG) ซึ่งไดมีการ<br />
นําไปดัดแปลงใชกันอยางกวางขวาง วิธีนี้ตองหาสภาวะที่เหมาะสมในการเตรียมโพรโทพลาสต<br />
และการทําใหคืนสภาพ (regeneration) ซึ่งมีความแตกตางกันไปในแตละสายพันธุ<br />
โดยความถี่<br />
ของการเกิดทรานสฟอรแมนต (transformant) อยูระหวาง<br />
10 6 -10 7 ทรานสฟอรแมนตตอ<br />
ไมโครกรัมของดีเอ็นเอ (Matsushima and B<strong>al</strong>tz, 1985; Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000)<br />
อยางไรก็ตาม Streptomyces บางสายพันธุไมสามารถใชวิธีดังกลาวไดอยางมี<br />
ประสิทธิภาพเนื่องจากความเปราะบางของโพรโทพลาสต<br />
หรือบางสายพันธุก็ไมสามารถเตรียม<br />
โพรโทพลาสตได Pigac and Schrempf (1995) จึงไดพัฒนาวิธีการทรานสฟอรเมชันเขาสูเสน<br />
ใยโดยอาศัยอิเล็กโทรโพเรชัน (electroporation) ซึ่งใหความถี่ของการเกิดทรานสฟอรแมนตสูง<br />
กวาวิธีการทรานสฟอรเมชันของโพรโทพลาสต 10 2 -10 3 เทา โดยแสดงใหเห็นวาสามารถนําดี<br />
เอ็นเอเขาสู<br />
S. venezuelae 13S และสายพันธุกลาย<br />
554W, 601 และ 615 ของ S. rimosus R6<br />
ได ซึ่งทั้ง<br />
4 สายพันธุ<br />
ใชวิธีการทรานสฟอรเมชันของโพรโทพลาสตโดยอาศัยโพลีเอธิลีนไกล<br />
19
คอลไมไดผล อยางไรก็ดีวิธีการนี้ก็ยังจําเปนจะตองศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสมซึ่งแตกตางกันไป<br />
ในแตละสายพันธุ<br />
ตอมา Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1989) ไดนําเสนอวิธีการสงถายพลาสมิดโดยการทําคอนจูเก<br />
ชันตางสกุล (intergeneric conjugation) ระหวาง E. coli และ Streptomyces ซึ่งนิยมใชกันมากใน<br />
การศึกษาหนาที่ของยีนดวยวิธียีนดิสรัปชันและการแทนที่ยีน<br />
(gene replacement) และวิธีคอมพลี<br />
เมนเทชัน (complementation) (Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000)<br />
คอนจูเกชันตางสกุลระหวาง E. coli และ Streptomyces<br />
คอนจูเกชันของแบคทีเรียพบไดทั่วไปในธรรมชาติ<br />
ทั้งที่เปนแกรมลบและแกรมบวก<br />
ทํา<br />
ใหเกิดการสงถายพลาสมิดจากเซลลของผูให<br />
(donor) ไปยังผูรับ<br />
(recipient) คอนจูเกชันใน E.<br />
coli อาศัยการทํางานของ 2 สวนที่สําคัญบนพลาสมิด<br />
คือ กลุมยีน<br />
tra ซึ่งมีหนาที่ในการสราง<br />
โปรตีนที่เกี่ยวของในการสงถายพลาสมิด<br />
และ oriT (origin of transfer) ซึ่งมีหนาที่เปนจุดเริ่มตน<br />
และเปนปลายที่จะกลับมาเชื่อมกันของพลาสมิดในการสงถาย<br />
เรียกพลาสมิดที่มีสมบัติเชนนี้วา<br />
self-transmissible plasmid ซึ่งสามารถเกิดการสงถายพลาสมิดไดดวยตัวเอง<br />
ถาขาดยีน tra จะ<br />
เรียกเปน mobilisable plasmid ซึ่งไมสามารถสงถายพลาสมิดไดดวยตัวเอง<br />
ตองอาศัยยีน tra ที่<br />
อยูในสวนอื่น<br />
เชน บนโครโมโซม, บน self-transmissible plasmid หรือบน non-transmissible<br />
plasmid และการเกิดคอนจูเกชันใน E. coli จะมีการสรางเซ็กซพิลัส (sex pilus) เพื่อใชในการ<br />
สงถาย ซึ่งไมมีรายงานในแบคทีเรียแกรมบวก<br />
(Snyder and Champness, 1997)<br />
การทําคอนจูเกชันตางสกุลระหวาง E. coli และ Streptomyces เดิมอาศัยชัทเทิลพลาสมิด<br />
(shuttle plasmid) ที่มีจุดเริ่มตนของการจําลองดีเอ็นเอ<br />
(origin of replication) ของทั้ง<br />
E. coli<br />
และ Streptomyces จากพลาสมิด pBR322 และ pIJ101 ตามลําดับ ซึ่งการสงถายพลาสมิดจะ<br />
เกิดขึ้นโดยอาศัย<br />
oriT [จากพลาสมิด RK2 (IncP)] บนชัทเทิลพลาสมิด และการทํางานของยีน<br />
tra จากพลาสมิด RP4 ที่อยูใน<br />
E. coli (Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989)<br />
E. coli ที่ใชในการทําคอนจูเกชันตางสกุล<br />
ประกอบไปดวยสายพันธุ<br />
S17-1 ที่มียีน<br />
tra<br />
จากพลาสมิด RP4 อยูบนโครโมโซม<br />
(Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989), สายพันธุ<br />
ET12567 ที่มีพลาส<br />
มิด pUB307 ซึ่งเปน<br />
self-transmissible plasmid (Fl<strong>et</strong>t <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997) และสายพันธุ<br />
ET12567<br />
ที่มีพลาสมิด<br />
pUZ8002 ซึ่งเปน<br />
non-transmissible plasmid (Sia <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1996) โดยสายพันธุ<br />
S17-1 เปนสายพันธุที่มีการเติมหมูเมธิลในดีเอ็นเอตามปกติ<br />
สวนสายพันธุ<br />
ET12567 จะขาด<br />
การเติมหมูเมธิลเนื่องจากมีจีโนไทปเปน<br />
dam - และ dcm - ซึ่งทําให<br />
ET12567 มีประสิทธิภาพใน<br />
20
การสงถายดีเอ็นเอเขาสู<br />
Streptomyces ที่มีระบบการปองกัน<br />
โดยการทําลายดีเอ็นเอแปลกปลอม<br />
ที่มีการเติมหมูเมธิลไดดีกวา<br />
(Fl<strong>et</strong>t <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997) พลาสมิดที่ใชสําหรับการคอนจูเกชันใน<br />
ปจจุบันลวนเปนพลาสมิดที่ไมสามารถจําลองตัวเองไดใน<br />
Streptomyces (non-replicative<br />
plasmid) ซึ่งจะสามารถเขาไปรวมตัวกับโครโมโซมไดก็ตอเมื่อเกิด<br />
site-specific recombination<br />
ของตําแหนง attachment site (attP) ของฝาจ φC31 ที่อยูบนพลาสมิดนั้นกับตําแหนง<br />
attB บน<br />
โครโมโซม (Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992; Thorpe <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) หรือโดยการเกิดโฮโมโลกัสรีคอม<br />
บิเนชันของชิ้นดีเอ็นเอจาก<br />
Streptomyces ที่โคลนเขาไปในพลาสมิด<br />
(Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992)<br />
วิธีการทําคอนจูเกชันตางสกุลระหวาง E. coli และ Streptomyces ทําไดงายโดยการ<br />
เตรียมเซลล E. coli ผูให<br />
และการเตรียมสปอรของ Streptomyces ผูรับ<br />
แลวนํามาผสมกันใน<br />
อัตราสวนที่เหมาะสม<br />
จากนั้นนําไปเกลี่ยบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อ<br />
และคัดเลือกผูรับที่มีพลาสมิด<br />
หรือเอกซคอนจูแกนต (exconjugant) โดยใชยาปฏิชีวนะ (Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) ซึ่งเชื้อแตละ<br />
ชนิดมีสภาวะที่เหมาะสมที่สุดแตกตางกัน<br />
ทําใหตองศึกษาปรับปรุงวิธีการใหเหมาะสมกับเชื้อแต<br />
ละชนิด (Kitani <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000)<br />
อัตราสวนของสปอรของ Streptomyces ผูรับตอเซลล<br />
E. coli ผูให<br />
เปนปจจัยหนึ่งที่<br />
สงผลตอประสิทธิภาพของการคอนจูเกชัน ตัวอยางเชน การทําคอนจูเกชันตางสกุลระหวาง S.<br />
lavendulae FRI-5 และ E. coli ET12567 (pUZ8002) บนอาหารแข็ง ISP2 ที่มี<br />
MgCl2 เขมขน 10 มิลลิโมลาร ประสิทธิภาพที่ไดจะสูงขึ้นเมื่อคาอัตราสวนของผูรับตอผูใหมีคาต่ําลง<br />
(ประสิทธิภาพอยูระหวาง<br />
1.6x10 -5 - 3.9x10 -8 exconjugant/reciepient) (Kitani <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
2000) อยางไรก็ตามอัตราสวนของผูรับตอผูใหยังขึ้นกับชนิดของอาหาร<br />
ตัวอยางในการทดลอง<br />
เดียวกันเมื่อใชอาหารแข็ง<br />
MS ที่มี<br />
MgCl2 เขมขน 10 มิลลิโมลาร ประสิทธิภาพที่ไดจะใกลเคียง<br />
กันในทุกอัตราสวนของผูรับตอผูให<br />
(ประสิทธิภาพประมาณ 10 -6 exconjugant/reciepient) แต<br />
การคอนจูเกชันระหวาง S. toyocaensis และ E. coli S17-1 พบวาอัตราสวนของผูรับตอผูใหมี<br />
ผลตอประสิทธิภาพของการเกิดคอนจูเกชัน (Matsushima and B<strong>al</strong>tz, 1996)<br />
ชนิดของอาหารแข็งจึงเปนอีกปจจัยหนึ่ง<br />
ซึ่งสงผลตอประสิทธิภาพของการคอนจูเกชันตาง<br />
สกุล ตัวอยางเชน การคอนจูเกชันระหวาง S. lavendulae FRI-5 และ E. coli ET12567<br />
(pUZ8002) บนอาหารแข็ง R5 ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร พบวาไมมีการสงถายพลาสมิด<br />
แตสามารถเกิดการสงถายไดดีเมื่อใชอาหารแข็ง<br />
ISP2 และ MS ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร<br />
(Kitani <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) ในการคอนจูเกชันระหวาง S. fradiae และ E. coli S17-1 เมื่อศึกษาโดย<br />
ใชอาหารหลายชนิด คือ AS1, TS และ R2 พบวาอาหารแข็ง AS1 ใหผลดีที่สุด<br />
สวน R2 ไมเกิด<br />
การสงถายพลาสมิด (Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992) ในการคอนจูเกชันระหวาง S. toyocaensis และ E.<br />
21
coli S17-1 บนอาหารแข็ง R2, AS1 และ Bnt พบวาอาหารแข็ง R2 ใหผลดีที่สุด<br />
(Matsushima<br />
and B<strong>al</strong>tz, 1996) สวนการคอนจูเกชันในอาหารเหลวนั้นไมประสบความสําเร็จ<br />
(Mazodier <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 1989)<br />
อุณหภูมิและระยะเวลาที่ใชในการกระตุนการงอกของสปอร<br />
ก็สงผลตอประสิทธิภาพของ<br />
การคอนจูเกชัน ใน S. lividans พบวาการกระตุนสปอรโดยบมที่<br />
50 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10<br />
นาที ทําใหประสิทธิภาพของการคอนจูเกชันสูงขึ้น<br />
5-10 เทา (Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989) อยางไร<br />
ก็ดีใน S. lavendulae FRI-5 พบวาสภาวะที่เหมาะสม<br />
คือ บมที่<br />
40 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10<br />
นาที แตไมไดชวยใหประสิทธิภาพสูงขึ้น<br />
(Kitani <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) สวน S. virginiae ซึ่งไมทนตอ<br />
ความรอน เมื่อคอนจูเกชันโดยไมกระตุนการงอกของสปอร<br />
ก็ใหประสิทธิภาพที่ดี<br />
(Voeykova <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 1998)<br />
นอกจากนั้นยังมีรายงานวา<br />
อุณหภูมิที่ใชในการบมจานอาหารแข็ง<br />
สงผลตอประสิทธิภาพ<br />
ดวยเชนเดียวกัน ในการคอนจูเกชันระหวาง S. fradiae และ E. coli S17-1 พบวาการบมจาน<br />
อาหารที่<br />
37 องศาเซลเซียส ใหประสิทธิภาพดีกวาเมื่อบมที่<br />
29 องศาเซลเซียส 3 เทา (Bierman<br />
<strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992)<br />
นอกจากการคอนจูเกชันโดยอาศัยสปอรแลว ยังอาจสามารถใชเสนใยแทนได โดยการ<br />
คอนจูเกชันระหวาง S. fradiae และ E. coli S17-1 เมื่อใชเสนใยที่ทําใหแตกหักมีประสิทธิภาพ<br />
ของการคอนจูเกชันไมแตกตางจากเมื่อใชสปอร<br />
(Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992) การคอนจูเกชันระหวาง<br />
S. toyocaensis และ E. coli S17-1 พบวาเมื่อใชเสนใยประสิทธิภาพของการคอนจูเกชันจะต่ํา<br />
กวาการใชสปอร (Matsushima and B<strong>al</strong>tz, 1996) และในการคอนจูเกชันโดยใชเสนใยระหวาง<br />
S. peuc<strong>et</strong>ius ซึ่งสรางสปอรไดไมดีและ<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) พบวามีประสิทธิภาพ<br />
1.5 x 10 -4 exconjugant/reciepient (Paranthaman and Dharm<strong>al</strong>ingam, 2003)<br />
การศึกษาหนาที่ของยีนโดยวิธียีนดิสรัปชัน<br />
ยีนดิสรัปชัน (gene disruption) เปนการทําใหเกิดการกลายวิธีหนึ่ง<br />
ที่ตําแหนงยีนจําเพาะ<br />
บนโครโมโซม จึงนิยมใชศึกษาหนาที่ของยีน<br />
วิธีการนี้ทําโดยการแทรกชิ้นดีเอ็นเอเพื่อยับยั้งการ<br />
ทํางานของยีน (insertion<strong>al</strong> inactivation) ทําโดยการนําสวนของยีนเชื่อมเขากับดีเอ็นเอพาหะซึ่ง<br />
มีสมบัติเปน non-replicative ทําใหเกิดการแทรกเขาไปในโครโมโซม ณ ตําแหนงของยีนนั้นโดย<br />
เกิดโฮโมโลกัสรีคอมบิเนชัน โดยทั่วไปจะเกิดครอสซิงโอเวอร<br />
(crossing over) เพียงครั้งเดียว<br />
ทําใหไดสวนของดีเอ็นเอพาหะแทรกอยูบนโครโมโซม<br />
วิธีนี้สามารถใชทําลาย<br />
transcript ของยีน<br />
22
ซึ่งอยูเปนกลุม<br />
(cluster) ได แตถาตองการศึกษาหนาที่ของยีนใดยีนหนึ่ง<br />
โดยทําใหยีนที่ตองการ<br />
ศึกษากลายพันธุ<br />
ก็ตองอาศัยการเกิดรีคอมบิเนชันแบบ double crossing over เพื่อให<br />
แลกเปลี่ยนยีนกลายที่อยูบนพลาสมิดกับยีนปกติบนโครโมโซม<br />
การศึกษาหนาที่ของกลุมยีน<br />
Type I PKS ใน Streptomyces โดยใชวิธียีนดิสรัปชัน ไดมี<br />
การนําไปใชกันอยางแพรหลาย ตัวอยางเชน ในการตรวจสอบหนาที่ของยีน<br />
Type I PKS ในเชื้อ<br />
S. hygroscopicus ATCC 29253 วาเกี่ยวของกับการสังเคราะหราพามัยซินหรือไม<br />
เนื่องจาก<br />
เชื้อดังกลาวสามารถผลิตโพลีคีไทดชนิดที่<br />
1 ได 2 ชนิด คือราพามัยซินและไนเจอริซิน<br />
(nigericin) เมื่อทํายีนดีสรัปชันและการแทนที่ยีนโดยอาศัยฝาจเปนดีเอ็นเอพาหะ<br />
ทําใหเชื้อไม<br />
สามารถสังเคราะหราพามัยซิน และไมสงผลตอลักษณะสัณฐานของเชื้อ<br />
(Lomovskaya <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1997) นอกจากนั้นยังใชในการวิเคราะหยีน<br />
Type I PKS ของการสังเคราะหนิดดามัยซิน จาก<br />
เชื้อ<br />
S. caelestis (Kakavas <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997), พิมาริซิน จากเชื้อ<br />
S. nat<strong>al</strong>ensis (Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1999) และ แอมโฟเทอริซิน จากเชื้อ<br />
S. nodosus (Caffrey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001) เปนตน<br />
ขนาดของดีเอ็นเอที่จะนําไปใชเพื่อทํายีนดิสรัปชันก็มีความสําคัญเชนกัน<br />
พบวาชิ้นดีเอ็น<br />
เอขนาดเล็กที่สุดที่จะสามารถเกิดการรีคอมบิเนชันไดใน<br />
S. viridochromogenes มีขนาดประมาณ<br />
200 คูเบส<br />
ซึ่งนําไปใชทําใหเกิดการกลายของยีน<br />
pat เปนผลใหเกิดการยับยั้งการสังเคราะหสาร<br />
ฟอสฟโนธริซิน-ไทรเปปไทด (phosphinothricin-tripeptide)ใน S. griseus DSM40695<br />
(Hillemann <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991) สําหรับการทํายีนดิสรัปชันของการสังเคราะหมาโครเทโทรไลด<br />
(macrot<strong>et</strong>rolide) ใน S. nat<strong>al</strong>ensis สามารถไดสายพันธุกลายโดยใชชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
700 คูเบส<br />
ที่ไดจากการเพิ่มปริมาณยีน<br />
nonS ดวยวิธีพีซีอาร (Smith <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) การทํายีนดิสรัปชันของ<br />
ยีน pimD ที่คาดวาเกี่ยวของกับการดัดแปลงภายหลังของสารพิมาริซิน<br />
โดยใชชิ้นสวนของยีน<br />
ขนาด 667 คูเบส<br />
ทําใหพิสูจนไดวายีนดังกลาวทําหนาที่สรางเอนไซม<br />
cytochrome P450<br />
epoxidase (Mendes <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001) วิธียีนดิสรัปชันใน S. maritimus ก็ไดใชศึกษาการทํางานของ<br />
ยีน encP ซึ่งเกี่ยวของกับการสังเคราะหหนวยเริ่มตนของสารเอนเทอโรซิน<br />
(enterocin) โดยใช<br />
ชิ้นสวนของยีนขนาด<br />
800 คูเบส<br />
และสงถายพลาสมิดดวยการคอนจูเกชันระหวาง E. coli และ<br />
Streptomyces พบวาสายพันธุ กลายที่ไดไมสามารถสังเคราะหหนวยเริ่มตนได<br />
(Xiang and<br />
Moore; 2002)<br />
23
1. จุลินทรียและพลาสมิดที่ใชในงานวิจัย<br />
อุปกรณและวิธีการ<br />
จุลินทรียและพลาสมิดที่ใชในการวิจัยแสดงสรุปไวในตารางที่<br />
2 และ 3 ตามลําดับ<br />
ตารางที่<br />
2 จุลินทรียที่ใชในงานวิจัย<br />
สายพันธุ<br />
สมบัติ แหลงที่มา/เอกสารอางอิง<br />
Aspergillus niger Wild-type ATCC 6275<br />
Candida <strong>al</strong>bicans Wild-type ATCC 10231<br />
E. coli JM109 endA1 recA1 gyrA96 thi hsdR17 relA1<br />
thi∆(lac-proAB) F’(traD36 proAB+ lacIq lacZ∆M15)<br />
Yanish-Perron <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1985)<br />
E. coli ET12567 dam-13::Tn9 dcm-6 hsdM hsdS Kmr MacNeil <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1992);<br />
(pUZ8002) (tra Cmr ) Sia <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1996)<br />
S. rimosus R7 Rimocidin producer ATCC 10970<br />
ตารางที่<br />
3 พลาสมิดที่ใชในงานวิจัย<br />
พลาสมิด สมบัติ เอกสารอางอิง<br />
Litmus28 Amp r lacZα Evans <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1995)<br />
Litmus38 Amp r lacZα Evans <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1995)<br />
pIJ486 pIJ101 replicon ori pIJ101 T<strong>et</strong> r Thio r Ward <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1986)<br />
pIJ8600 ColE1 replicon oriT attP int Apr r Thio r Sun <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1999)<br />
pIJ8671 ColE1 replicon oriT Apr r Thio r Sun <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1999)<br />
pKC1132 ColE1 replicon oriT Apr r lacZα Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1992)<br />
pSET151 ColE1 replicon oriT Amp r Thio r lacZα Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1992)<br />
pSET152 ColE1 replicon oriT attP int Apr r lacZα Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1992)<br />
pUC18 Amp r lacZα Norrander <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1983)<br />
2. สารเคมีและเอนไซมที่ใชในงานวิจัย<br />
สารเคมีและอาหารเลี้ยงเชื้อจากบริษัท<br />
Ameresco (USA), Amersham Pharmacia<br />
Biotech (UK), APS Finechem (Austr<strong>al</strong>ia), Becton Dickinson (USA), Fluka (Switzerland),<br />
FMC bioproduct (USA), Himedia (India), Hispanlab (Spain), Qiagen (Germany),<br />
24
Macherey-Nagel (Germany), Merck (Germany), Promega (USA), Scharlau (Spain),<br />
Sigma (Germany) และดอยคํา (ประเทศไทย) ดีเอ็นเอมาตรฐาน (1 Kb DNA Ladder) จาก<br />
บริษัท Gibco BRL (USA) และ Fermentas (USA)<br />
เอนไซมตัดจําเพาะจากบริษัท Gibco BRL (USA), Fermentas (USA) และ New<br />
England BioLabs (USA) เอนไซม C<strong>al</strong>f Intestine Alk<strong>al</strong>ine Phosphatase (CIAP) จากบริษัท<br />
Amersham Pharmacia Biotech (UK) เอนไซมไลโซไซมจากบริษัท Ameresco (USA) และ<br />
Fluka (Switzerland) เอนไซม RNase A จากบริษัท Ameresco (USA) เอนไซม T4 DNA<br />
ligase จากบริษัท Gibco BRL (USA) และ Fermentas (USA) เอนไซม Taq DNA polymerase<br />
จากบริษัท Promega (USA) และ Invitrogen (USA)<br />
3. วิธีการพื้นฐานที่ใชสําหรับ<br />
Streptomyces<br />
วิธีการพื้นฐานที่ใชสําหรับ<br />
Streptomyces ใชวิธีการตาม Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (2000)<br />
3.1 อาหารและสภาวะที่ใชเลี้ยง<br />
การเลี้ยง<br />
Streptomyces บนอาหารแข็ง ทําโดยใชกานไมพันสําลีปลอดเชื้อเขี่ย<br />
สปอรจาก stock culture มาเกลี่ยบนจานอาหารแข็ง<br />
บมไวที่อุณหภูมิ<br />
30 องศาเซลเซียส เปน<br />
เวลาประมาณ 3-5 วัน อาหารแข็งที่ใช<br />
ไดแก อาหาร Mannitol soya flour (MS; 1l: 20 g<br />
mannitol, 20 g soya flour, 20 g agar; Hobbs <strong>et</strong> <strong>al</strong>, 1989)<br />
การเลี้ยง<br />
Streptomyces ในอาหารเหลว จะเลี้ยงในขวดรูปชมพูที่มีขดลวดสปริง<br />
วนรอบกนขวด เขยา 200 รอบตอนาที ที่อุณหภูมิหอง<br />
โดยใสสารละลายสปอรความเขมขน<br />
10 9 -10 10 สปอรตอมิลลิลิตร ลงในอาหารเหลวในอัตราสวน 1:100 อาหารเหลวที่ใช<br />
ไดแก<br />
Tryptone soya broth (TSB; สําเร็จรูป)<br />
เมื่อเลี้ยง<br />
Streptomyces ที่สามารถตานทานยาปฏิชีวนะ<br />
จะเติมยาปฏิชีวนะที่<br />
เหมาะสมในอาหาร ใหมีความเขมขนดังตารางที่<br />
4<br />
25
ตารางที่<br />
4 ความเขมขนของยาปฏิชีวนะที่ใชในการเลี้ยง<br />
Streptomyces และ E. coli<br />
Antibiotic<br />
Fin<strong>al</strong> concentration in media (µg/ml)<br />
stock solution<br />
S. rimosus R7 E. coli<br />
(mg/ml) Agar Broth Overlay (µg/plate) Agar Broth<br />
Ampicillin (100) - - - 100 50<br />
Apramycin (50) 100 50 100 (2000) 100 50<br />
Chloramphenicol (200) - - - 50 25<br />
Kanamycin (50) - - - 50 25<br />
N<strong>al</strong>idixic acid (25) 25 - 25 (500) - -<br />
Thiostrepton (50 in DMSO) 50 5 50 (1000) - -<br />
3.2 การเก็บสปอรของ Streptomyces<br />
เก็บสปอรจากเชื้อที่เลี้ยงบนอาหารแข็ง<br />
MS เปนเวลาประมาณ 5 วัน โดยเติม<br />
น้ํากลั่นที่ฆาเชื้อแลวประมาณ<br />
10 มิลลิลิตร ลงบนจานอาหารแข็ง แลวใชกานไมพันสําลีถูสปอร<br />
บนผิวอาหารใหหลุดออกเบาๆ จากนั้นนํากอนสําลีวางลงใหซับน้ําและสปอรไว<br />
แลวใชหลอดฉีด<br />
ยาดูดสารละลายสปอรผานกอนสําลี เพื่อกรองเสนใยออก<br />
นําไปปนเหวี่ยงที่<br />
4,000-6,000<br />
รอบตอนาที เปนเวลา 2-5 นาที เทสารละลายทิ้ง<br />
แขวนลอยสปอรในกลีเซอรอลความเขมขน<br />
20 เปอรเซ็นต แลวเก็บรักษาไวที่อุณหภูมิ<br />
–80 องศาเซลเซียส<br />
3.3 การสกัดดีเอ็นเอ<br />
สกัดดีเอ็นเอโดยนําเชื้อที่เลี้ยงในอาหารเหลว<br />
TSB เปนเวลา 3 วัน ปริมาตร<br />
1.5 มิลลิลิตร มาปนเหวี่ยงที่<br />
4,000 รอบตอนาที ในหลอดขนาด 1.5 มิลลิลิตร เปนเวลา 2<br />
นาที แลว เทของเหลวทิ้ง<br />
นําเสนใยที่ไดไปสกัดดีเอ็นเอตามวิธีที่ดัดแปลงจากวิธีการของ<br />
Hopwood <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1985) โดยเติม Lysis solution (0.3 M sucrose, 25 mM Tris-HCl, 25<br />
mM EDTA, pH 8.0) ที่มีไลโซไซม<br />
เขมขน 10 ไมโครกรัมตอไมโครลิตร และ RNase A<br />
เขมขน 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ปริมาตร 500 ไมโครลิตร ใชปเปตตดูดขึ้นลงใหเสนใย<br />
กระจาย นําไปบมที่อุณหภูมิ<br />
37 องศาเซลเซียส เปนเวลาประมาณ 1 ชั้วโมง<br />
โดยจะใชป<br />
เปตตดูดขึ้นลงระหวางบม<br />
2-3 ครั้ง<br />
จากนั้นเติม<br />
sodiumdodecylsulfate (SDS) ความเขมขน<br />
2 เปอรเซ็นต ปริมาตร 250 ไมโครลิตร พลิกหลอดไปมาใหของเหลวผสมกันทันที เติม<br />
สารละลาย ฟนอล: คลอโรฟอรม:ไอโซเอมิล แอลกอฮอล (24:24:1) ปริมาตร 250 ไมโครลิตร<br />
ผสมใหเขากัน นําไปปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 5 นาที ดูดสารละลายสวนบน<br />
26
ถายลงสูหลอดใหม<br />
(อาจทําซ้ํา<br />
2-3 ครั้ง<br />
ถามีปริมาณตะกอนโปรตีนมาก) เติมโซเดียมอะซิเทต<br />
ความเขมขน 3 โมลาร ปริมาตร 0.1 เทา ของปริมาตรสารละลายที่ดูดได<br />
เติมไอโซโพรพานอล<br />
ปริมาตร 1 เทา ผสมโดยพลิกหลอดไปมาเบาๆ ตั้งไวที่อุณหภูมิหองเปนเวลา<br />
5 นาที แลวปน<br />
เหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 10 นาที เทสารละลายออก แลวลางตะกอนดีเอ็นเอดวย<br />
เอธานอล 70 เปอรเซ็นต ปริมาตร 200 ไมโครลิตร ดูดสารละลายออกใหหมด ทิ้งใหตะกอน<br />
แหง แลวละลายตะกอนดีเอ็นเอในบัฟเฟอร TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)<br />
ปริมาตร 20-50 ไมโครลิตร ตามความเหมาะสม เก็บรักษาไวที่อุณหภูมิ<br />
4 องศาเซลเซียส ถา<br />
ตองการเก็บรักษาเปนระยะเวลานานจะเก็บที่<br />
-20 องศาเซลเซียส<br />
4. วิธีการพื้นฐานที่ใชสําหรับ<br />
E. coli<br />
วิธีการพื้นฐานที่ใชสําหรับ<br />
E. coli ใชวิธีการตาม Sambrook and Russell (2001)<br />
4.1 อาหารและสภาวะที่ใชเลี้ยง<br />
การเลี้ยง<br />
E. coli บนจานอาหารแข็ง จะเขี่ยเชื้อลงบนอาหารแข็ง<br />
Luria-Bertani<br />
(LA; 1l: 10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl, 15 g agar, pH 7.2) แลวบมที่<br />
37<br />
องศาเซลเซียส เปนเวลาขามคืน<br />
การเลี้ยงในอาหารเหลว<br />
จะเติมเชื้อลงในขวดรูปชมพูที่มีอาหารเหลว<br />
อัตราสวน<br />
1: 100 โดยใชอาหารเหลว LB (สูตรเหมือน LA แตไมเติม agar) นําไปเขยา 250 รอบตอนาที<br />
ที่<br />
37 องศาเซลเซียส เปนเวลาขามคืน<br />
เมื่อเลี้ยง<br />
E. coli ที่สามารถตานทานยาปฏิชีวนะ<br />
จะเติมยาปฏิชีวนะที่เหมาะสม<br />
ในความเขมขนดังตารางที่<br />
4<br />
4.2 การสกัดพลาสมิด<br />
ใชวิธี Alk<strong>al</strong>ine lysis with SDS ของ Sambrook and Russell (2001) โดยนํา<br />
เชื้อ<br />
E. coli ที่เลี้ยงในอาหาร<br />
LB เปนเวลาขามคืน ปริมาตร 1.5 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดขนาด<br />
1.5 มิลลิลิตร ปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที เพื่อเก็บเซลล<br />
เทอาหารทิ้ง<br />
จากนั้นแขวนลอยตะกอนเซลลใน<br />
Solution I (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl, 10 mM<br />
EDTA, pH 8.0) ที่เย็นจัด<br />
ปริมาตร 100 ไมโครลิตร นําไปแชในน้ําแข็งเปนเวลา<br />
10-15 นาที<br />
27
เติม Solution II [0.2 M NaOH, 1%(w/v) SDS] ที่เตรียมสําหรับใชทันที<br />
200 ไมโครลิตร<br />
พลิกหลอดไปมาทันที จนของเหลวผสมกันดี แลวแชในน้ําแข็งเปนเวลา<br />
5 นาที นําไปเติม<br />
Solution III (3 M potassium, 5 M ac<strong>et</strong>ate) ที่เย็นจัด<br />
ปริมาตร 150 ไมโครลิตร พลิกหลอดไป<br />
มาใหของเหลวผสมกันดี แลวแชในน้ําแข็งเปนเวลา<br />
3-5 นาที ปนเหวี่ยง<br />
12,000 รอบตอนาที<br />
เปนเวลา 5 นาที ดูดสารละลายถายใสหลอดใหม เติม ฟนอล:คลอโรฟอรม:ไอโซเอมิล<br />
แอลกอฮอล (25:24:1) ปริมาตร 1 เทา ของสารละลายที่ดูดได<br />
พลิกหลอดไปมาประมาณ 1<br />
นาที นําไปปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 5 นาที ดูดสารละลายสวนบนใสหลอด<br />
ใหม แลวเติมเอธานอลสัมบูรณ (absolute <strong>et</strong>hanol) ปริมาตร 2 เทาของสารละลายที่ดูดได<br />
พลิก<br />
หลอดไปมาเบาๆ ตั้งไวที่อุณหภูมิหอง<br />
เปนเวลา 2 นาที แลวปนเหวี่ยงเก็บตะกอนดีเอ็นเอที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 5 นาที ลางตะกอนดวยเอธานอล 70 เปอรเซ็นต ปริมาตร 200<br />
ไมโครลิตร ปนเหวี่ยง<br />
1 นาที แลวดูดสารละลายออกใหหมด ทิ้งไวใหตะกอนแหง<br />
จึงละลายดี<br />
เอ็นเอในบัฟเฟอร TE ที่มี<br />
RNase A ความเขมขน 20 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ปริมาตร 20-50<br />
ไมโครลิตร ตามความเหมาะสม เก็บรักษาไวที่<br />
-20 องศาเซลเซียส<br />
4.3 การสกัดพลาสมิดเพื่อนําไปหาลําดับเบส<br />
ใชชุดอุปกรณ QIAprep Miniprep (QIAGEN, Germany) ทําตามวิธีการในคูมือ<br />
โดยนําเชื้อที่เลี้ยงในอาหารเหลวขามคืน<br />
ปริมาตร 1.5 มิลลิลิตร ปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอ<br />
นาที เปนเวลา 1 นาที เทอาหารเหลวทิ้ง<br />
แลวแขวนลอยตะกอนเซลลในบัฟเฟอร P1 ปริมาตร<br />
250 ไมโครลิตร ผสมใหเขากัน แลวเติมบัฟเฟอร P2 ปริมาตร 250 ไมโครลิตร กลับหลอดไป<br />
มา 6 ครั้ง<br />
เติมบัฟเฟอร N3 ปริมาตร 350 ไมโครลิตร แลวผสมทันทีโดยการกลับหลอดไปมา<br />
6 ครั้ง<br />
นําไปปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 10 นาที ดูดสารละลายใสลงใน<br />
QIAprep spin column ที่วางอยูใน<br />
Collection tube นําไปปนเหวี่ยงเปนเวลา<br />
1 นาที เทของเหลว<br />
ทิ้ง<br />
เติมบัฟเฟอร PB ปริมาตร 500 ไมโครลิตร ปนเหวี่ยงเปนเวลา<br />
1 นาที เทของเหลวทิ้ง<br />
เติมบัฟเฟอร PE ปริมาตร 750 ไมโครลิตร ปนเหวี่ยงเปนเวลา<br />
1 นาที เทของเหลวทิ้ง<br />
แลวปน<br />
เหวี่ยงอีกครั้งเพื่อกําจัดของเหลวทั้งหมด<br />
จากนั้นยายคอลัมนไปใสในหลอดขนาด<br />
1.5 มิลลิลิตร<br />
หลอดใหม เติมบัฟเฟอร EB ที่มีอุณหภูมิ<br />
50 องศาเซลเซียส ปริมาตร 30-50 ไมโครลิตร ตาม<br />
ความเหมาะสม ตั้งทิ้งไว<br />
2 นาที หรืออาจนําไปบมที่<br />
50 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที กอน<br />
ปนเหวี่ยงเก็บสารละลายดีเอ็นเอ<br />
เปนเวลา 2 นาที เก็บรักษาดีเอ็นเอไวที่<br />
-20 องศาเซลเซียส<br />
28
4.4 การเตรียมคอมพิเทนตเซลล (Comp<strong>et</strong>ent Cell) ของ E. coli<br />
ทําตามวิธีของ Chung <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1989) โดยนําเชื้อที่เลี้ยงขามคืนในอาหาร<br />
LB<br />
ปริมาตร 500 ไมโครลิตร ลงเลี้ยงในอาหาร<br />
LB ปริมาตร 50 มิลลิลิตร ในขวดรูปชมพูขนาด<br />
250 มิลลิลิตร เขยา 250 รอบตอนาที ที่<br />
37 องศาเซลเซียส จนมีคาดูดแสงที่ความยาวคลื่น<br />
600<br />
นาโนเมตร (OD600) เปน 0.3-0.4 (ประมาณ 2-3 ชั่วโมง)<br />
ถายใสหลอดขนาด 50 มิลลิลิตร<br />
แลวแชน้ําแข็งเปนเวลา<br />
15 นาที จึงนําไปปนเหวี่ยงเก็บเซลล<br />
ที่<br />
4,000 รอบตอนาที อุณหภูมิ 4<br />
องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 นาที เทอาหารทิ้ง<br />
แลวเติม Transformation and storage solution<br />
[TSS; 10 % (w/v) poly<strong>et</strong>hylene glycol (PEG) MW=8000, 5 % dim<strong>et</strong>hylsulphoxide<br />
(DMSO), 50 mM MgCl2, in LB, pH 6.5) ที่เย็นจัด<br />
ปริมาตร 5 มิลลิลิตร แขวนลอยเซลล<br />
ในสารละลาย นําไปปนเหวี่ยงเก็บเซลล<br />
แลวแขวนลอยเซลลใน TSS ปริมาตร 3 มิลลิลิตร<br />
แบงเก็บในหลอดขนาด 1.5 มิลลิลิตร ที่เย็น<br />
หลอดละ 100 ไมโครลิตร แชหลอดทิ้งไวในน้ําแข็ง<br />
เปนเวลา 10 นาที ถายังไมนําไปใชใหเก็บรักษาไวที่<br />
-80 องศาเซลเซียส<br />
4.5 การทรานสฟอรเมชัน (Transformation)<br />
ใชวิธี heat-shock (Sambrook and Russell, 2001) โดยนําคอมพิเทนตเซลล<br />
100 ไมโครลิตร แลวเติมพลาสมิด 1-10 ไมโครลิตร ใชปเปตตผสมเบาๆ ทิ้งไวในน้ําแข็งอีก<br />
20 นาที จึงนําไปบมที่อุณหภูมิ<br />
42 องศาเซลเซียส เปนเวลา 90 วินาที แลวนํากลับไปแชใน<br />
น้ําแข็งทันที<br />
เปนเวลา 5 นาที เติมอาหาร LB ปริมาตร 900 ไมโครลิตร แลวบมที่<br />
37 องศา<br />
เซลเซียส เขยา 250 รอบตอนาที เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
จึงแบงเซลล 100 ไมโครลิตร ไปเกลี่ยลง<br />
อาหาร LA ซึ่งมียาปฏิชีวะนะตามความเหมาะสมเพื่อคัดเลือก<br />
โดยใชความเขมขนของยาปฏิชีวนะ<br />
ตามตารางที่<br />
4 กรณีที่คัดเลือกโดยการทํางานของยีน<br />
lacZ จะเกลี่ยทับอาหารแข็งไวกอนดวย<br />
X-g<strong>al</strong> (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-g<strong>al</strong>actoside) เขมขน 20 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร<br />
ใน dim<strong>et</strong>hylformamide ปริมาตร 40 ไมโครลิตร และ IPTG (isopropylthio-β-D-g<strong>al</strong>actoside)<br />
เขมขน 200 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ปริมาตร 4 ไมโครลิตร จากนั้นบมจานอาหารที่เกลี่ยดวย<br />
เซลลแลวที่<br />
37 องศาเซลเซียส เปนเวลาขามคืน คัดเลือกโคโลนีที่เจริญ<br />
ไปตรวจสอบการ<br />
ไดรับพลาสมิดตอไป<br />
29
5. เทคนิคทางพันธุวิศวกรรม<br />
5.1 อะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส (Agarose Gel Elctrophoresis)<br />
ผสมสารละลายดีเอ็นเอกับ 6x loading buffer [0.25% (w/v) bromophenol<br />
blue, 0.25% (w/v) xylene cyanol, 30% glycerol] ในอัตราสวน 5:1 แลวทําอะกาโรส<br />
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส เทียบกับดีเอ็นเอมาตรฐาน (1 Kb DNA Ladder) โดยใชอะกาโรสความ<br />
เขมขน 0.8 เปอรเซ็นต ในบัฟเฟอร 1x TAE (40 mM Tris-ac<strong>et</strong>ate, 1 mM EDTA) ที่ความ<br />
ตางศักยไฟฟา 100 โวลต ตรวจสอบแถบดีเอ็นเอดวยการยอมในเอธิเดียมโบรไมด (<strong>et</strong>hidium<br />
bromide) ความเขมขน 0.5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตรวจดูแถบดีเอ็นเอและถายภาพภายใตแสง<br />
อัลตราไวโอเลตดวยเครื่อง<br />
BioDoc-It System (UVP, USA)<br />
5.2 การสกัดดีเอ็นเอจากอะกาโรสเจล<br />
ใชชุดอุปกรณ QIAquick Gel Extraction (QIAGEN, Germany) ทําตามวิธีการ<br />
ในคูมือ<br />
โดยตัดอะกาโรสเจลในตําแหนงที่ปรากฏแถบดีเอ็นเอที่ตองการ<br />
ใสลงในหลอดขนาด<br />
1.5 มิลลิลิตร เติมบัฟเฟอร QG ปริมาตรประมาณ 3 เทาของเจล นําไปบมที่<br />
50 องศา<br />
เซลเซียส ประมาณ 10 นาทีหรือจนกวาเจลละลายหมด โดยตองพลิกหลอดไปมาเปนครั้งคราว<br />
ดูดสารละลายทั้งหมดใสลงใน<br />
QIAquick spin column ที่วางอยูใน<br />
Collection tube นําไปปน<br />
เหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที เทของเหลวทิ้ง<br />
เติมบัฟเฟอร PE ปริมาตร 750<br />
ไมโครลิตร ปนเหวี่ยงเปนเวลา<br />
1 นาที เทของเหลวทิ้ง<br />
ปนเหวี่ยงอีกครั้งเพื่อกําจัดของเหลว<br />
ทั้งหมด<br />
จากนั้นยายคอลัมนไปใสในหลอดขนาด<br />
1.5 มิลลิลิตรหลอดใหม เติมบัฟเฟอร EB ที่มี<br />
อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส ปริมาตร 30-50 ไมโครลิตร ตามความเหมาะสม ตั้งทิ้งไว<br />
2 นาที<br />
หรืออาจนําไปบมที่<br />
50 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที กอนปนเหวี่ยงเก็บสารละลายดีเอ็นเอที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที เก็บรักษาดีเอ็นเอไวที่<br />
-20 องศาเซลเซียส<br />
5.3 การทําสารละลายดีเอ็นเอใหบริสุทธิ์โดยใชชุดอุปกรณ<br />
สกัดดีเอ็นเอดวยชุดอุปกรณ QIAquick PCR Purification (QIAGEN,<br />
Germany) ตามขั้นตอนในคูมือ<br />
โดยนําสารละลายดีเอ็นเอไปเติมบัฟเฟอร PB ปริมาตร 5 เทา<br />
ของปริมาตรสารละลายดีเอ็นเอ ผสมใหเขากัน ดูดของเหลวทั้งหมดใสลงใน<br />
QIAquick spin<br />
column ที่วางอยูใน<br />
Collection tube นําไปปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที<br />
เทของเหลวทิ้ง<br />
เติมบัฟเฟอร PE ปริมาตร 750 ไมโครลิตร ปนเหวี่ยงเปนเวลา<br />
1 นาที เท<br />
30
ของเหลวทิ้ง<br />
แลวปนเหวี่ยงอีกครั้งเพื่อกําจัดของเหลวทั้งหมด<br />
จากนั้นยายคอลัมนไปใสในหลอด<br />
ขนาด 1.5 มิลลิลิตรหลอดใหม เติมบัฟเฟอร EB ที่มีอุณหภูมิ<br />
50 องศาเซลเซียส ปริมาตร 30-<br />
50 ไมโครลิตร ตามความเหมาะสม ตั้งทิ้งไว<br />
2 นาที หรืออาจนําไปบมที่<br />
50 องศาเซลเซียส<br />
เปนเวลา 10 นาที กอนปนเหวี่ยงเก็บสารละลายดีเอ็นเอ<br />
เปนเวลา 1 นาที เก็บรักษาดีเอ็นเอไวที่<br />
-20 องศาเซลเซียส<br />
5.4 การหาลําดับเบส<br />
สกัดพลาสมิดโดยใชชุดอุปกรณ QIAprep Miniprep (QIAGEN, Germany)<br />
ตามวิธีการในขอ 4.3 และสงไปหาลําดับเบสที่<br />
หนวยบริการชีวภาพ (BSU) ศูนยพันธุวิศวกรรม<br />
และเทคโนโลยีชีวภาพแหงชาติ สํานักงานพัฒนาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีแหงชาติ<br />
5.5 การตัดและเชื่อมตอดีเอ็นเอ<br />
การตัดดีเอ็นเอ ใชเอนไซมตัดจําเพาะที่เหมาะสม<br />
โดยเตรียมสวนผสมตาม<br />
คําแนะนําในคูมือ<br />
บมในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ<br />
ที่<br />
37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 2 ชั่วโมงถึง<br />
ขามคืน<br />
เมื่อตัดพลาสมิดดวยเอนไซมตัดจําเพาะชนิดเดียว<br />
จะนําไปกําจัดหมูฟอสเฟตที่<br />
ปลาย 5’ ดวยเอนไซม CIAP เติมสวนผสมตามคําแนะนําในคูมือ<br />
นําไปบมไวที่<br />
37 องศา<br />
เซลเซียส ในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ<br />
เปนเวลา 2 ชั่วโมง<br />
แลวหยุดการทํางานของเอนไซมโดย<br />
นําไปบมที่<br />
70 องศาเซลเซียส เปนเวลา 20 นาที<br />
การเชื่อมตอดีเอ็นเอเพื่อสรางพลาสมิดสายผสม<br />
จะนําสารละลายดีเอ็นเอที่ทําให<br />
บริสุทธิ์ตามวิธีการขอ<br />
5.3 เชื่อมตอโดยใชอัตราสวนของพลาสมิดตอชิ้นดีเอ็นเอ<br />
เทากับ 1:5<br />
ในปฏิกิริยาที่ประกอบดวย<br />
T4 DNA ligase 1 ยูนิต และ 5x Ligation buffer 4 ไมโครลิตร ใน<br />
ปริมาตรสุดทาย 20 ไมโครลิตร บมที่อุณหภูมิ<br />
16 องศาเซลเซียส ในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ<br />
ขามคืน เก็บรักษาไวที่<br />
4 องศาเซลเซียส กอนนําไปใชในการทรานสฟอรเมชันตามวิธีการขอ 4.5<br />
31
5.6 Southern Blot, Dot Blot และ Colony Dot Blot Hybridisation<br />
5.6.1 Southern Blot<br />
ทํา Southern Blot (Southern, 1975) โดยนําเจลที่ทําอะกาโรส<br />
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิสตามวิธีการขอ 5.1 แชในสารละลาย HCl ความเขมขน 0.25 โมลาร เขยา 50<br />
รอบตอนาที เปนเวลา 15 นาที ลางดวยน้ํากลั่น<br />
แลวจึงนําไปแชใน Denaturing solution (0.5<br />
M NaOH, 1.5 M NaCl) เขยา 50 รอบตอนาที เปนเวลา 15 นาที ทําซ้ําอีกครั้ง<br />
โดยเปลี่ยน<br />
Denaturing solution ใหม จากนั้นยายดีเอ็นเอไปสูเมมเบรนแบบ<br />
capillary transfer เปนเวลา<br />
ขามคืน โดยใช Alk<strong>al</strong>ine transfer buffer (0.25 M NaOH, 1.5 M NaCl) เมมเบรนที่ใชคือ<br />
Hybond-N + (Amersham Pharmacia Biotech, UK) เมมเบรนเก็บรักษาไดที่<br />
4 องศาเซลเซียส<br />
กอนนําไปใช<br />
5.6.2 Dot Blot<br />
นําสารละลายดีเอ็นเอ ที่เตรียมใหมีปริมาณดีเอ็นเอประมาณ<br />
1<br />
ไมโครกรัม ในน้ํากลั่นปริมาตรรวม<br />
10 ไมโครลิตร ไปทําใหเสียสภาพในน้ําเดือด<br />
เปนเวลา 5<br />
นาที แลวแชในน้ําแข็งทันที<br />
เปนเวลา 5 นาที จากนั้นจึงหยดสารละลายดีเอ็นเอลงบนเมมเบรน<br />
Hybond-N + ที่ละ<br />
2 ไมโครลิตร จนหมด รอใหเมมเบรนแหงดี เก็บรักษาเมมเบรน ที่<br />
4 องศา<br />
เซลเซียส กอนนําไปใช<br />
5.6.3 Colony Dot Blot<br />
หลังจากคัดเลือกโคโลนีของ E. coli ที่ไดรับการทรานสฟอรมบนจาน<br />
อาหาร LA ที่มียาปฏิชีวนะ<br />
นําโคโลนีที่เจริญไปเกลี่ยใหเต็มเปนพื้นที่ขนาด<br />
0.5x0.5 เซนติเมตร<br />
บนอาหาร LA ที่มียาปฏิชีวนะ<br />
บมไวที่<br />
37 องศาเซลเซียส ขามคืน เขี่ยเชื้อที่เจริญในพื้นที่<br />
ทั้งหมดไปแขวนลอยในน้ํากลั่น<br />
ปริมาตร 10 ไมโครลิตร แลวนําไปหยดลงบนเมมเบรน<br />
Hybond-N + ที่ละ<br />
2 ไมโครลิตร จนหมด รอใหแหงแลวนําไปวางลงบนกระดาษกรอง 3MM<br />
(Whatman, UK) ที่ชุมดวยสารละลาย<br />
SDS เขมขน 10 เปอรเซ็นต โดยหงายดานที่มีโคโลนีไว<br />
ดานบน ทิ้งไวเปนเวลา<br />
3 นาที จึงถายเมมเบรนไปวางบนกระดาษกรอง 3MM ที่ชุมดวย<br />
Denaturing solution เปนเวลา 5 นาที ยายไปวางบนกระดาษกรองใหม รอใหแหง เก็บรักษา<br />
เมมเบรน ที่<br />
4 องศาเซลเซียส กอนนําไปใช<br />
32
5.6.4 การติดฉลากดีเอ็นเอที่ใชเปนโพรบ<br />
ใชชุดอุปกรณ Gene Images random prime labeling module<br />
(Amersham Pharmacia Biotech, UK) ทําตามวิธีการในคูมือ<br />
โดยนําดีเอ็นเอที่ใชทําเปนโพรบ<br />
50 นาโนกรัม ในน้ํากลั่นปริมาตร<br />
34 ไมโครลิตร ไปทําใหเสียสภาพในน้ําเดือด<br />
เปนเวลา 5 นาที<br />
แลวแชในน้ําแข็งทันที<br />
เปนเวลา 5 นาที เติม Nucleotide mix 10 ไมโครลิตร Random primer<br />
5 ไมโครลิตร Klenow 1 ไมโครลิตร ในปริมาตรสุดทาย 50 ไมโครลิตร ผสมใหเขากัน แลวบม<br />
ที่<br />
37 องศาเซลเซียส เปนเวลาขามคืน เก็บรักษาในที่มืด<br />
ที่<br />
-20 องศาเซลเซียส กอนนําไปใช<br />
5.6.5 Hybridisation และการตรวจสอบผล<br />
ใชชุดอุปกรณ Gene Images CDP-star d<strong>et</strong>ection module (Amersham<br />
Pharmacia Biotech, UK) โดยบมเมมเบรนใน Hybridisation buffer [5 % Liquid block, 5x<br />
SSC (20x SSC; 3 M sodium chloride, 0.3 M sodium citrate, pH 7.0), 0.1 % SDS, 5 %<br />
(w/v) dextran sulphate หรือ 1.25 % PEG MW=8000] ที่อุณหภูมิ<br />
68 องศาเซลเซียส เปน<br />
เวลา 1-2 ชั่วโมง<br />
จากนั้นเติมดีเอ็นเอโพรบที่ทําใหเสียสภาพแลว<br />
ปริมาตร 5-10 ไมโครลิตร<br />
ขึ้นกับขนาดของเมมเบรน<br />
(ทําโดยนําดีเอ็นเอโพรบปริมาณที่เหมาะสมเติมลงใน<br />
Hybridisation<br />
buffer 500 ไมโครลิตร แลวนําไปทําใหเสียสภาพในน้ําเดือด<br />
เปนเวลา 5 นาที แลวแชในน้ําแข็ง<br />
ทันที เปนเวลา 5 นาที กอนนําไปเติม) บมไวที่อุณหภูมิเดิมเปนเวลาขามคืน<br />
จากนั้นนําเมม<br />
เบรนมาลางดวยสารละลายที่ประกอบดวย<br />
2x SSC และ SDS เขมขน 0.1 เปอรเซ็นต (w/v) ที่<br />
อุณหภูมิหอง เขยา 50 รอบตอนาที เปนเวลา 20 นาที 2 ครั้ง<br />
แลวลางดวย สารละลาย 0.1x<br />
SSC และ SDS เขมขน 0.1 เปอรเซ็นต (w/v) ที่อุณหภูมิ<br />
68 องศาเซลเซียส 15 นาที 2 ครั้ง<br />
โดยเขยาบางเปนครั้งคราว<br />
จากนั้นนําไปลางในสารละลาย<br />
Washing buffer [0.3% Tween 20<br />
ใน Buffer A (10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl pH 9.5)] เปนเวลา 1-5 นาที จึงนําไปบม<br />
ใน Blocking solution (10 % Liquid block ใน buffer A) ที่อุณหภูมิหอง<br />
เขยา 50 รอบตอนาที<br />
เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
แลวนําไปบมใน Antibody solution [anti-fluorescein <strong>al</strong>k<strong>al</strong>ine phosphatase<br />
conjugate 1: 5000 ใน Buffer A ที่มี<br />
0.5 % bovine serum <strong>al</strong>bumin (BSA)] เขยา 50 รอบตอ<br />
นาที เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
แลวนําเมมเบรนไปลางใน Washing buffer โดยเขยา 50 รอบตอนาที<br />
เปนเวลา 10 นาที 3 ครั้ง<br />
จากนั้นนําเมมเบรนวางบนแผนพลาสติก<br />
เติม CDP-star d<strong>et</strong>ection<br />
agent จนทวมแผนเมมเบรน นําพลาสติกอีกแผนปดทับโดยไมใหมีฟองอากาศ ทิ้งไว<br />
5 นาที รีด<br />
ของเหลวสวนเกินออก แลวนําไปทาบกับฟลม Kodak Medic<strong>al</strong> X-ray Film (Kodak, Japan)<br />
ระยะเวลาตามความเหมาะสม นําฟลมไปลางดวยสารละลาย Kodak Developer and Replenisher<br />
33
เปนเวลา 1 นาที ลางดวยน้ํา<br />
แลวลางฟลมใน Kodak Fixer and Replenisher (Kodak, Austr<strong>al</strong>ia)<br />
อีก 1 นาที ตามลําดับ จากนั้นจึงลางดวยน้ําประปาและตากฟลมใหแหง<br />
5.7 การวิเคราะหลําดับเบสและลําดับกรดอะมิโน<br />
การแปลรหัสลําดับเบสเปนลําดับกรดอะมิโนใชโปรแกรม Six-Frame<br />
Translation (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/Options/sixframe.html) เปลี่ยน<br />
ลําดับเบสเปนสายคูสมโดยโปรแกรม<br />
Reverse Complement (http://searchlauncher.bcm.tmc<br />
.edu/seq-util/Options/revcomp.html) การหาตําแหนงจดจําของเอนไซมตัดจําเพาะบนลําดับ<br />
เบสอาศัยโปรแกรม Webcutter 2.0 (http://www.firstmark<strong>et</strong>.com/cutter/cut2.html) การ<br />
คนหาลําดับที่มีความคลายกันในฐานขอมูลใชโปรแกรม<br />
BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih<br />
.gov/BLAST/; Altschul <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1990) เมื่อตองการเปรียบเทียบความสัมพันธ<br />
ทําโดยการ<br />
คัดเลือกขอมูลในฐานขอมูลจํานวนหนึ่งมาทํา<br />
multiple <strong>al</strong>ignment และ clustering โดยใช<br />
โปรแกรม Clust<strong>al</strong>W 1.82 (http://www.ebi.ac.uk/clust<strong>al</strong>w/; Thompson <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1994)<br />
การทํา bootstrapping ใชโปรแกรม Clust<strong>al</strong>W 1.83 (http://bioweb.pasteur.fr/seqan<strong>al</strong>/<br />
interfaces/clust<strong>al</strong>w.html; Thompson <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1994) สุมเปนจํานวน<br />
1,000 ครั้ง<br />
การวาด<br />
phylogen<strong>et</strong>ic tree ใชโปรแกรม TreeView 1.6.6 (Page, 1996)<br />
6. การตรวจสอบการผลิตสารตานเชื้อราไรโมซิดิน<br />
6.1 ตรวจสอบการเกิดวงใส (Clear Zone) ดวยวิธี Agar Plug Assay<br />
นําเชื้อ<br />
S. rimosus ที่ตองการตรวจสอบเกลี่ยลงบนอาหาร<br />
MS ซึ่งมียาปฏิชีวนะ<br />
ตามความเหมาะสม เลี้ยงโดยบมที่อุณหภูมิ<br />
30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 วัน เจาะเอาอาหารที่<br />
มีเชื้อเจริญอยูดวย<br />
cork borer เปนวงกลมเสนผานศูนยกลาง 5 มิลลิเมตร<br />
เลี้ยง<br />
Candida <strong>al</strong>bicans และ Aspergillus niger โดยเกลี่ยบนอาหารแข็ง<br />
Potato<br />
dextrose agar (PDA; 1l: 200 g potato, 20 g dextrose, 20 g agar, pH 7.2) บมที่<br />
อุณหภูมิหอง เปนเวลา 2-3 วัน สําหรับ Candida และจนกวาจะผลิตสปอรไดดีสําหรับ<br />
Aspergillus เมื่อตองการนําไปทดสอบ<br />
จะนําเซลลของ Candida หรือสปอรของ Aspergillus ไป<br />
แขวนลอยในอาหารกึ่งแข็ง<br />
PDA (สูตรเหมือน PDA แตเพิ่ม<br />
agar 10 กรัม) ที่ละลายและรอให<br />
เย็นลงมีอุณหภูมิประมาณ 50 องศาเซลเซียส นําไปเททับบนจานอาหารแข็ง MS ใหหนา<br />
ประมาณ 2 มิลลิเมตร<br />
34
นําชิ้นอาหารที่เจาะออกมา<br />
วางลงบนจานอาหารแข็ง MS ที่เททับดวยเชื้อแลว<br />
บมไวที่อุณหภูมิหอง<br />
เปนเวลา 2-3 วัน ตรวจสอบการเกิดวงใส เทียบกับ S. rimosus R7 สาย<br />
พันธุ<br />
wild type<br />
6.2 การคัดเลือกอาหารเลี้ยงที่เหมาะสมในการสรางสารไรโมซิดิน<br />
ทดสอบเบื้องตนโดยใชอาหารแข็งชนิดตางๆ<br />
โดยเกลี่ยเชื้อ<br />
S. rimosus R7 สาย<br />
พันธุ<br />
wild type ลงบนจานอาหารแข็ง บมไวที่อุณหภูมิ<br />
30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 วัน กอน<br />
เจาะอาหารไปทดสอบการเกิดวงใสตามวิธีการขอ 6.1<br />
เมื่อคัดเลือกอาหารที่เหมาะสมไดแลว<br />
จึงนําไปทดสอบเลี้ยงเชื้อในอาหารเหลว<br />
ปริมาตร 100 มิลลิลิตร ในขวดรูปชมพูขนาด<br />
250 มิลลิลิตร ซึ่งมีขดลวดสปริงวนรอบกนขวด<br />
โดยบมที่อุณหภูมิหอง<br />
เขยา 200 รอบตอนาที เปนเวลา 3-5 วัน นําน้ําเลี้ยงที่มีเซลลแขวนลอย<br />
ไปทดสอบการผลิตสารไรโมซิดิน โดยตรวจสอบการเกิดวงใสดวยวิธี paper disk assay โดยหยด<br />
น้ําเลี้ยงปริมาตร<br />
50 ไมโครลิตร ลงบนกระดาษกรองเบอร 1 (Whatman, UK) ที่ตัดเปนวงกลม<br />
ขนาดเสนผานศูนยกลาง 5 มิลลิเมตร ซอนกัน 3 แผน ตากใหแหง แลววางลงบนจานอาหารแข็ง<br />
MS ที่เททับดวยเชื้อแลว<br />
ตามวิธีการในขอ 6.1 บมไวที่อุณหภูมิหอง<br />
เปนเวลา 2-3 วัน แลว<br />
ตรวจสอบการเกิดวงใส<br />
6.3 การสกัดสารไรโมซิดิน<br />
เลี้ยงเชื้อในอาหารเหลวที่เหมาะสม<br />
ปริมาตร 100 มิลลิลิตร ในขวดรูปชมพู<br />
ขนาด 250 มิลลิลิตร ซึ่งมีขดลวดสปริงวนรอบกนขวด<br />
โดยบมที่อุณหภูมิหอง<br />
เขยา 200 รอบ<br />
ตอนาที เปนเวลา 5 วัน แยกการสกัดไรโมซิดินเปน 2 สวน คือ น้ําเลี้ยงและเสนใย<br />
โดยกรอง<br />
ดวยกระดาษกรองเบอร 1 เพื่อแยกเสนใยและน้ําเลี้ยง<br />
สกัดไรโมซิดินจากน้ําเลี้ยง<br />
ในขวดรูปชมพูขนาด<br />
250 มิลลิลตร โดยเติม<br />
เอธิลอะซีเทต (<strong>et</strong>hyl ac<strong>et</strong>ate) ปริมาตร 100 มิลลิลิตร ปดฝาดวยแผนฟอยล (foil) ใหสนิด<br />
นําไปเขยา 200 รอบตอนาที เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
ทิ้งใหแยกชั้นแลวดูดเก็บสวนบนไว<br />
นํา<br />
สวนลางไปสกัดซ้ําเชนเดิม<br />
นําของเหลวสวนบนมารวมกัน กําจัดน้ําที่มีอยูออกไปโดยเติม<br />
MgSO4.3H2O จนอิ่มตัว<br />
(ตกตะกอนดี) แลวกรอง MgSO4 ออกดวยกระดาษกรอง Whatman<br />
เบอร 1 นําไประเหยเอธิลอะซีเทตออกโดย เขยา 200 รอบตอนาที ในตูควัน<br />
(fume hood)<br />
35
จนกวาจะแหง (1-2 วัน) ละลายตะกอนในเมธานอล 0.5-1 มิลลิลิตร ตามความเหมาะสม<br />
นําไปเก็บรักษาที่<br />
-20 องศาเซลเซียส<br />
สกัดไรโมซิดินจากเสนใยที่ติดอยูบนกระดาษกรอง<br />
โดยนําไปแชลงในขวดรูป<br />
ชมพูขนาด<br />
250 มิลลิลตร ที่มีบิวทานอล<br />
(n-butanol) ปริมาตร 100 มิลลิลิตร นําไปเขยา 200<br />
รอบตอนาที เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
กรองแยกตะกอนและเก็บสวนสารละลายไว นําตะกอนไปสกัด<br />
ซ้ําเชนเดิม<br />
นําสารละลายมารวมกัน นําไประเหยบิวทานอลออกโดย เขยา 200 รอบตอนาที ใน<br />
ตูควัน<br />
จนกวาจะแหง แลวละลายตะกอนในเมธานอล 0.5-1 มิลลิลิตร ตามความเหมาะสม<br />
นําไปเก็บรักษาที่<br />
-20 องศาเซลเซียส<br />
6.4 ตรวจสอบโดยโครมาโทกราฟแบบแผนเคลือบ<br />
(Thin-Layer Chromatography; TLC)<br />
6.4.1 การคัดเลือกตัวพา (Mobile Phase)<br />
ทดสอบตัวพาในการแยกสารปฏิชีวนะมาโครไลด ชนิดโพลีอีน ดวย<br />
TLC ใชนัยสตาตินเปนสารทดสอบ และแผน TLC เปน Silica gel 60 F254 (Merck, USA) ทํา<br />
โดยจุดสารละลายนัยสตาติน เขมขน 10 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ในเอธานอล ลงบนแผน TLC ที<br />
ละ 2 ไมโครลิตร ปริมาตรรวม 10 ไมโครลิตร (100 ไมโครกรัม) รอใหแหง จึงนําไปทํา TLC<br />
โดยใชตัวพาชนิดตางๆ และตรวจสอบการเคลื่อนที่ของนัยสตาตินภายใตแสงอัลตราไวโอเลต<br />
6.4.2 การทํา TLC และไบโอออโทกราฟ (Bioautography)<br />
นําสารสกัดซึ่งตองการตรวจสอบ<br />
จุดลงบนแผน TLC Silica gel 60<br />
F254 ทีละ 1 ไมโครลิตร รวม 3 ไมโครลิตร สูงจากขอบลาง 1.5 เซนติเมตร เปรียบเทียบกับ<br />
นัยสตาติน 100 ไมโครกรัม ทิ้งไวใหแผน<br />
TLC แหง แลวทํา TLC โดยใชตัวพาที่คัดเลือกได<br />
จากขอ 6.4.1 ตรวจสอบผลภายใตแสงอัลตราไวโอเลต<br />
ทําไบโอออโทกราฟ โดยนําแผน TLC ที่ระเหยตัวพาดีแลว<br />
วางลงใน<br />
กลองปลอดเชื้อ<br />
แลวเททับดวยอาหารกึ่งแข็ง<br />
PDA ที่แขวนลอยดวยสปอรของ<br />
A. niger ใหทั่วทั้ง<br />
แผน บมไวที่อุณหภูมิหอง<br />
เปนเวลา 2-3 วัน ตรวจสอบตําแหนงการเกิดวงใส (Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
2000)<br />
36
6.5 ตรวจสอบโดยสเปกโทรเมทรี (Spectrom<strong>et</strong>ry)<br />
ตรวจสอบการดูดแสงของสารสกัดจากขอ 6.3 ในชวงแสง 200-400 นาโนเมตร<br />
(UV scan) (Cope <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1965; Tanaka, 1992) โดยเครื่อง<br />
Lambda Bio UV/VIS<br />
Spectrom<strong>et</strong>er (Perkin Elmer, Germany) ซึ่งตองเจือจางสารสกัดดวยเอธานอลตามความ<br />
เหมาะสมใหมีคาดูดแสงในชวง 0-2<br />
7. การตรวจหาและโคลนยีน Type I PKS ใน S. rimosus R7<br />
ตรวจหากลุมยีน<br />
Type I PKS โดยการใชโพรบที่จําเพาะตอยีน<br />
Type I PKS ตรวจสอบ<br />
ชิ้นสวนโครโมโซมของ<br />
S. rimosus R7 ที่ไดจากการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะที่เหมาะสม<br />
ดวย<br />
วิธี Southern hybridisation แลวจึงโคลนชิ้นดีเอ็นเอที่คาดวามียีนที่เกี่ยวของตอไป<br />
7.1 การเตรียมดีเอ็นเอโพรบ<br />
เพิ่มปริมาณยีน<br />
Type I PKS จากโครโมโซมของ S. rimosus R7 โดยการทํา<br />
พีซีอาร (PCR; polymerase chain reaction) ดวยไพรเมอรที่จําเพาะตอโดเมน<br />
KS คือ ATT10<br />
5’ TTTGAATTCGAGCCGWTSGCGATCGTSGGYATG 3’ และ ATT11 5’<br />
TTTCTGCAGGATSACGTGSGCGTTGGTG CC 3’ (W=A/T; S=G/C; Y=C/T;<br />
GAATTC, CTGCAG =ตําแหนงตัดของ EcoRI, PstI ตามลําดับ; ณัฏฐิกาและอรินทิพย, 2544)<br />
ในปฏิกิริยาประกอบดวย โครโมโซมของ S. rimosus R7 20 นาโนกรัม ไพรเมอร ATT10<br />
และ ATT11 อยางละ 0.05 พิโคโมล 1x PCR buffer MgCl2 1.5 มิลลิโมลาร dNTP 0.2<br />
มิลลิโมลาร DMSO 10 เปอรเซ็นต Taq DNA polymerase 0.5 ยูนิต ในปริมาตรสุดทาย 20<br />
ไมโครลิตร โดยใชรอบพีซีอาร ดังนี้<br />
รอบที่<br />
1: 94 องศาเซลเซียส เปนเวลา 4 นาที รอบที่<br />
2-<br />
35: 94 องศาเซลเซียส เปนเวลา 30 วินาที 70 องศาเซลเซียส เปนเวลา 1 นาที และ 72 องศา<br />
เซลเซียส เปนเวลา 1 นาที 30 วินาที และรอบที่สุดทาย:<br />
72 องศาเซลเซียส เปนเวลา 4 นาที<br />
นําผลิตภัณฑพีซีอารที่ไดไปแยกขนาดดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
ตาม<br />
วิธีการขอ 5.1 แลวสกัดชิ้นดีเอ็นเอขนาดประมาณ<br />
1.3 กิโลเบส ซึ่งคาดวาเปนสวนยีน<br />
KS<br />
(ณัฏฐิกาและอรินทิพย, 2544) ออกจากเจลตามวิธีการขอ 5.2 จากนั้นนําไปตัดดวยเอนไซมตัด<br />
จําเพาะ EcoRI และ PstI แลวเชื่อมตอกับพลาสมิด<br />
pUC18 ที่ตัดดวยเอนไซมเดียวกันตามวิธีการ<br />
ขอ 5.5 แลวทรานสฟอรมพลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109 ตามวิธีการขอ 4.5 ตรวจสอบ<br />
โคลนที่ได<br />
โดยการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI และ PstI แลวแยกขนาดดวยอะกาโรส<br />
37
เจลอิเล็กโทรโฟริซีส นําโคลนที่คัดเลือกไดไปเลี้ยงแลวสกัดพลาสมิดสงไปหาลําดับเบส<br />
ตาม<br />
วิธีการขอ 4.3 เปรียบเทียบลําดับเบสกับยีน Type I PKS ที่มีในฐานขอมูลดวยโปรแกรม<br />
Blast<br />
จากนั้นจึงนําไปใชเปนดีเอ็นเอโพรบตอไป<br />
7.2 การตรวจสอบดวย Southern Blot Hybridisation<br />
นําโครโมโซมของ S. rimosus R7 ไปตัดใหสมบูรณดวยเอนไซมตัดจําเพาะที่<br />
เหมาะสม แยกขนาดโดยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟริซีส แลวจึงนําไปทํา Southern blot<br />
hybridisation ตามวิธีการขอ 5.6 ตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอที่มีกลุมยีน<br />
Type I PKS ดวยโพรบที่<br />
เตรียมไวในขอ 7.1 โดยติดฉลากตามวิธีการขอ 5.6.4<br />
7.3 การโคลนยีน<br />
เลือกโคลนชิ้นดีเอ็นเอจากผลการทํา<br />
Southern blot hybridisation ในขอ 7.2<br />
โดยตัดเจลบริเวณที่คาดวามีชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการไปสกัดดีเอ็นเอออกจากเจล<br />
นําสารละลายดีเอ็น<br />
เอที่ไดไปตรวจสอบซ้ําเพื่อยืนยันวามีชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการดวยการทํา<br />
dot blot hybridisation ตาม<br />
วิธีการขอ 5.6 โดยใชโพรบเดิมจากขอ 7.2 จากนั้นจึงโคลนเขาไปในพลาสมิด<br />
pUC18 ที่ตัด<br />
ดวยเอนไซมเดียวกัน โดยทรานสฟอรมพลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109 ตรวจสอบโคลน<br />
โดยการนําไปทํา colony dot hybridisation ตามวิธีการขอ 5.6 เลือกโคลนที่ใหผลชัดเจนไป<br />
ตรวจสอบอีกครั้งดวยการทําพีซีอารโดยตรงจากเซลล<br />
โดยเขี่ยเซลลที่เจริญบนอาหารแข็งพื้นที่<br />
ประมาณครึ่งตารางเซ็นติเมตร<br />
แขวนลอยในน้ํา<br />
10 ไมโครลิตร แลวนําไปใชพีซีอาร 2<br />
ไมโครลิตรดวยไพรเมอรจําเพาะตอ KS ตามวิธีการในขอ 13.1 คัดเลือกโคลนที่ใหผลิตภัณทพีซี<br />
อารขนาด 1.3 กิโลเบส สกัดดีเอ็นเอแลวนําไปทํา Southern blot hybridisation โดยตัดดวย<br />
เอนไซมตัดจําเพาะตามความเหมาะสม และตรวจสอบดวยโพรบเดิมจากขอ 7.1 จากนั้นจึงเลือก<br />
โคลนที่ไดไปทําแผนที่ของเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
subclone หาลําดับเบสบางสวน และศึกษาลําดับ<br />
เบสของโคลนโดยเปรียบเทียบกับฐานขอมูล<br />
38
8. การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมสําหรับการเกิดคอนจูเกชันตางสกุลระหวาง<br />
S. rimosus R7<br />
และ E. coli ET12567 (pUZ8002)<br />
ศึกษาปจจัยตางๆ ที่เกี่ยวของกับประสิทธิภาพของการสงถายพลาสมิด<br />
ในการเกิดคอนจู<br />
เกชันตางสกุลระหวาง S. rimosus R7 และ E. coli ET12567 (pUZ8002) ซึ่งไดดัดแปลง<br />
วิธีการมาจาก Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1989) โดยใชพลาสมิด pIJ8600 (ภาพที่<br />
6; Sun <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1999) และ pSET152 (ภาพที่<br />
7; Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992) ซึ่งเปน<br />
mobilisable plasmid ที่มี<br />
attP เมื่อเกิดการสงถายโดยอาศัย<br />
tra บน pUZ8002 ใน E. coli ทําใหสามารถตรวจสอบไดจาก<br />
การแทรกตัวของพลาสมิดเขาไปในโครโมโซมบริเวณ attB<br />
8.1 การศึกษาหาอุณหภูมิและเวลาที่เหมาะสมในการกระตุนการงอกของสปอร<br />
ในการกระตุนการงอกของสปอรใชขั้นตอนตาม<br />
Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (2000) โดยเก็บ<br />
สปอรของ S. rimosus R7 ที่เลี้ยงบนอาหาร<br />
MS ที่อุณหภูมิ<br />
30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3-5<br />
วัน ปรับใหสปอรมีความเขมขนเปน 10 2 -10 3 สปอรตอมิลลิลิตร ในอาหาร 2x YT (1l: 16<br />
g tryptone, 10 g yeast extract, 5 g NaCl 5 g) แลวนําสปอรไปกระตุนการงอก<br />
โดยทดสอบ<br />
อุณหภูมิที่เหมาะสมในเวลาบม<br />
10 นาที ที่อุณหภูมิ<br />
30, 35, 40, 45, 50, 55 และ 60<br />
องศาเซลเซียส เมื่อตองการทดสอบระยะเวลาที่เหมาะสม<br />
จะใชเวลาบม 0, 5, 10, 15 และ<br />
20 นาที ที่อุณหภูมิ<br />
40 และ 45 องศาเซลเซียส จากนั้นทิ้งใหสปอรเย็นลงโดยแชในอางน้ําที่<br />
อุณหภูมิหอง แลวนําไปปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที แขวนลอยตะกอน<br />
ใน 2x YT ปริมาตร 100 ไมโครลิตร แลวนําไปเกลี่ยบนอาหารแข็ง<br />
MS ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโม<br />
ลาร บมไวที่<br />
30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3 วัน บันทึกจํานวนโคโลนีที่เจริญบนอาหาร<br />
8.2 การเตรียม E. coli ET12567 (pUZ8002/pIJ8600)<br />
สกัดพลาสมิด pIJ8600 จาก E. coli S17-1 ตามวิธีการในขอ 4.2 แลวนําไป<br />
ทําทรานสฟอรเมชัน ตามวิธีการในขอ 4.5 เขาสู<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) คัดเลือก<br />
โคลน ในอาหาร LB ที่มี<br />
อะพรามัยซิน (คัดเลือก pIJ8600) คานามัยซิน (คัดเลือก Tn9 ที่ทําให<br />
E. coli มีจีโนไทปเปน dam - ) และคลอแรมฟนิคอล (คัดเลือก pUZ8002) ความเขมขนตาม<br />
ตารางที่<br />
4 นําโคลนที่ไดไปตรวจสอบ<br />
โดยสกัดพลาสมิด แลวตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
BamHI นําไปแยกขนาดโดยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
39
ภาพที่<br />
6 แผนที่พลาสมิด<br />
pIJ8600 ที่ใชศึกษาคอนจูเกชัน<br />
ประกอบดวยยีน oriT (จากพลาสมิด RK2), attP และ int (ของ actinophage φC31),<br />
ยีนตานอะพรามัยซิน [acc(3)IV] และไธโอสเตรปทอน (tsr)<br />
ที่มา:<br />
Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
ภาพที่<br />
7 แผนที่พลาสมิด<br />
pSET152 ที่ใชศึกษาคอนจูเกชัน<br />
ประกอบดวยยีน oriT (จากพลาสมิด RK2), attP และ int (ของ actinophage φC31)<br />
และยีนตานอะพรามัยซิน [acc(3)IV]<br />
ที่มา:<br />
Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
40
8.3 คอนจูเกชันตางสกุล<br />
การทําคอนจูเกชันตางสกุล อาศัยวิธีการของ Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (2000)<br />
8.3.1 การเตรียม E. coli ผูให<br />
นําเชื้อที่เลี้ยงขามคืนในอาหาร<br />
LB ที่มียาปฏิชีวนะที่เหมาะสม<br />
ความ<br />
เขมขนตามวิธีการขอ 4.1 เจือจางเซลล 1:100 ดวยอาหาร LB ที่มียาปฏิชีวนะเชนเดิม<br />
แลว<br />
เลี้ยงตอที่สภาวะเดิม<br />
จนมีคาดูดแสงที่ความยาวคลื่น<br />
600 (OD600) อยูระหวาง<br />
0.4-0.6<br />
(ประมาณ 3 ชั่วโมง)<br />
นําเชื้อที่ได<br />
5 มิลลิลิตร ไปลางดวยอาหาร LB ปริมาตรเทากัน 2 ครั้ง<br />
ตกตะกอนโดยการปนเหวี่ยง<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที แลวแขวนลอยเซลลใน<br />
อาหาร LB ปริมาตร 500 ไมโครลิตร<br />
8.3.2 การเตรียม S. rimosus ผูรับ<br />
เลี้ยงเชื้อ<br />
S. rimosus R7 บนอาหาร MS ที่อุณหภูมิ<br />
30 องศาเซลเซียส<br />
เปนเวลา 3-5 วัน เก็บสปอรตามวิธีการขอ 3.2 ปรับใหมีความเขมขนสปอรเปน 10 9 -10 10<br />
สปอรตอมิลลิลิตรในน้ํา<br />
ดูดสปอรปริมาตร 100 ไมโครลิตร ใสลงในหลอดขนาด 1.5 มิลลิลิตร<br />
ปนเหวี่ยง<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที เทน้ําทิ้ง<br />
แลวแขวนลอยสปอรในอาหาร 2x<br />
YT ปริมาตรเปน 500 ไมโครลิตร แลวนําไปกระตุนการงอกของสปอรตามสภาวะที่ไดจากขอ<br />
8.1<br />
ทิ้งไวใหมีอุณหภูมิเย็นในอางน้ําอุณหภูมิหอง<br />
กอนนําไปใช<br />
8.3.3 การทําคอนจูเกชัน<br />
ผสมผูใหและผูรับอยางละ<br />
500 ไมโครลิตร เขาดวยกัน ในหลอดขนาด<br />
1.5 มิลลิลิตร นําไปปนเหวี่ยง<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที เทของเหลวทิ้ง<br />
แขวนลอยตะกอนในอาหาร 2x YT ปริมาตร 100 ไมโครลิตร แลวเจือจางใหมีความเขมขน<br />
ตางๆ ตามความเหมาะสมดวยอาหาร 2x YT กอนเกลี่ยของผสมลงบนจานอาหารแข็ง<br />
ใน<br />
ปริมาตร 100 ไมโครลิตรตอจานอาหาร บมไวที่อุณหภูมิ<br />
30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 16-20<br />
ชั่วโมง<br />
เมื่อสงถายพลาสมิดที่ตานยาปฏิชีวนะไธโอสเตรปทอน<br />
จะเททับจาน<br />
อาหารที่บมแลวดวยสารละลาย<br />
1 มิลลิลิตร ที่มีไธโอสเตรปทอน<br />
1,000 ไมโครกรัม และกรดนา<br />
41
ลิดิซิก 500 ไมโครกรัม เพื่อคัดเลือก<br />
Strptomyces ที่ไดรับพลาสมิดหรือเอกซคอนจูแกนต<br />
(exconjugant) และกําจัด E. coli ตามลําดับ บมที่<br />
30 องศาเซลเซียส ตอไปอีก 3-5 วัน นํา<br />
โคโลนีของเชื้อเจริญไปเขี่ยลงบนอาหารแข็ง<br />
MS ที่มียาปฏิชีวนะไธโอสเตรปทอนและกรดนาลิดิซิก<br />
ความเขมขนตามตารางที่<br />
4 ซ้ําอีก<br />
1-2 รอบ เพื่อตรวจสอบยืนยันผลการตานยาปฏิชีวนะ<br />
จากพลาสมิดที่ไดรับรวมทั้งกําจัด<br />
E. coli ที่อาจหลงเหลืออยู<br />
เมื่อสงถายพลาสมิดที่ตานยาปฏิชีวนะอะพรามัยซิน<br />
จะนําไปเททับดวย<br />
สารละลาย 1 มิลลิลิตร ซึ่งมีอะพรามัยซิน<br />
2,000 ไมโครกรัม และกรดนาลิดิซิก 500 ไมโครกรัม<br />
บมไวอีก 3-5 วัน จึงเก็บสปอรไปเกลี่ยซ้ําลงบนอาหารแข็ง<br />
TSA (สูตรเหมือน TSB แตมี Agar<br />
15 g/l) ที่มีอะพรามัยซินและกรดนาลิดิซิก<br />
เขมขนตามตารางที่<br />
4 บมไวอีก 3 วัน จึงนําโคโลนี<br />
ของเชื้อเจริญไปเขี่ยลงบนอาหารแข็ง<br />
TSA ที่มียาปฏิชีวนะเชนเดิมซ้ําอีก<br />
1-2 รอบ<br />
8.4 การศึกษาผลของความเขมขนของสปอรและชนิดของอาหาร<br />
ทําคอนจูเกชันตามวิธีการในขอ 8.3 ศึกษาผลของความเขมขนของสปอรที่ใชตอ<br />
ประสิทธิภาพของคอนจูเกชัน โดยใชจํานวนสปอรของ S. rimosus R7 ตางกัน 10 เทา ที่จํานวน<br />
สปอรเปน 10 8 และ 10 9 สปอร ในการทําคอนจูเกชัน แลวนําไปเกลี่ยลงบนอาหารแข็ง<br />
3 ชนิด<br />
เพื่อศึกษาผลของชนิดของอาหาร<br />
โดยใชอาหารแข็ง MS ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร อาหารแข็ง<br />
ISP4 [1l: 10 g soluble starch, 1 g KH2PO4 anhydrous, 1 g MgSO4.7H2O, 1 g NaCl, 1 g<br />
(NH4) 2SO4, 2 g CaCO3, 1 ml trace element (1l: 1 g FeSO4.7H2O, 1 g MnCl2.4H2O, 1 g<br />
ZnSO4.7H2O), 20 g agar, pH 7.2; Shirling and Gottlieb, 1966] ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร<br />
และอาหารแข็ง ISP3 [1 l: 20 g oatme<strong>al</strong>, 1 ml trace element (เหมือน ISP4), 20 g agar, pH<br />
7.2; Shirling and Gottlieb, 1966] ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร<br />
8.5 การตรวจสอบเอกซคอนจูแกนตที่ไดรับพลาสมิด<br />
pIJ8600<br />
นําโคโลนีเอกซคอนจูแกนตที่เจริญไดบนอาหารแข็ง<br />
MS ที่มียาปฏิชีวะนะไปเลี้ยง<br />
ในอาหารเหลว TSB ที่มีไธโอสเตรปทอน<br />
ความเขมขนตามตารางที่<br />
4 เพื่อสกัดดีเอ็นเอ<br />
แลว<br />
นําดีเอ็นเอที่สกัดไดไปตรวจสอบโดยทํา<br />
dot blot hybridisation กับโพรบที่เปนสวนของยีน<br />
tsr<br />
ขนาดประมาณ 2 กิโลเบส ซึ่งไดจากตัดพลาดมิด<br />
pIJ8600 ดวยเอนไซม EcoRI และตรวจสอบ<br />
ตําแหนงของการแทรกตัวในโครโมโซมโดยนําไปทํา Southern blot hybridisation โดยใชโพรบ<br />
เดิม การตรวจสอบการสรางสารไรโมซิดินของเอกซคอนจูแกนต ใชการตรวจสอบการเกิดวงใส<br />
การทํา TLC และสเปกโทรเมทรี ตามวิธีการในขอ 6<br />
42
8.6 การคํานวณหาประสิทธิภาพของการเกิดคอนจูเกชัน<br />
คํานวณจากอัตราสวนของจํานวนสปอรที่ไดรับพลาสมิดกับจํานวนสปอรที่ใช<br />
ทั้งหมด<br />
โดยนับโคโลนีที่ไดรับพลาสมิดจากจานอาหารคัดเลือกเอกซคอนจูแกนต<br />
และจํานวน<br />
สปอรที่ใชทั้งหมดคํานวณไดจากการนับจํานวนโคโลนีที่เจริญ<br />
จากการเจือจางสปอรที่ใชในการทํา<br />
คอนจูเกชันแลวเกลี่ยลงบนอาหาร<br />
MS ที่มี<br />
MgCl2 เขมขน 10 มิลลิโมลาร<br />
9. การศึกษาหนาที่ของยีน<br />
Type I PKS จาก S. rimosus R7<br />
นําชิ้นดีเอ็นเอที่หาลําดับเบสแลวคาดวาจะเปน<br />
Type I PKS ไดแก ชิ้นที่ไดจากการทําพีซี<br />
อาร (ขอ 7.1) และจากโครโมโซม (ขอ 7.3) ไปทํายีนดิสรัปชันเพื่อศึกษาหนาที่ของยีน<br />
โดย<br />
ตรวจผลจากการสังเคราะหสารตานเชื้อราไรโมซิดินของสายพันธุกลายที่ได<br />
9.1 การเตรียมพลาสมิดและการทํายีนดิสรัปชัน<br />
นําชิ้นพีซีอารของโดเมน<br />
KS จากขอ 7.1 และชิ้นดีเอ็นเอที่โคลนไดจาก<br />
โครโมโซมซึ่งเปนสวนประกอบของยีน<br />
PKS จากขอ 7.3 โคลนเขาสูพลาสมิด<br />
pSET151 (ภาพที่<br />
8) และ pKC1132 (ภาพที่<br />
9) ดวยเอนไซมตัดจําเพาะที่เหมาะสม<br />
แลวทําทรานสฟอรเมชันเขาสู<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) ตามวิธีการขอ 4.5 จากนั้นนําไปทําคอนจูเกชัน<br />
(ตามวิธีการขอ<br />
8.3) เขาสู<br />
S. rimosus R7<br />
9.2 การตรวจสอบสายพันธุกลาย<br />
9.2.1 Dot Blot และ Southern Blot Hybridization<br />
ตรวจสอบโดยนําเอกซคอนจูแกนตของ S. rimosus R7 ที่ขึ้นบนจาน<br />
อาหารแข็งที่มียาปฏิชีวนะตามความเหมาะสม<br />
ไปเลี้ยงในอาหารเหลว<br />
TSB ที่มียาปฏิชีวนะ<br />
ที่<br />
อุณหภูมิหอง เขยา 200 รอบตอนาที เปนเวลา 3 วัน แลวสกัดโครโมโซมตามวิธีการในขอ 3.3<br />
นําไปทํา dot blot hybridisation และ Southern blot hybridization ตามวิธีการขอ 5.6 โดยใช<br />
โพรบที่เหมาะสม<br />
43
ภาพที่<br />
8 แผนที่พลาสมิด<br />
pSET151 ที่ใชในการทํายีนดิสรัปชัน<br />
สวนประกอบสําคัญ คือ oriT (จากพลาสมิด RK2) และยีนตานยาปฏิชีวนะไธ<br />
โอสเตรปทอน (tsr)<br />
ที่มา:<br />
Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
ภาพที่<br />
9 แผนที่พลาสมิด<br />
pKC1132 ที่ใชในการทํายีนดิสรัปชัน<br />
ไดมาจากพลาสมิด pOJ620 โดยการตัดชิ้นสวนบริเวณ<br />
KpnI-SpeI ที่มีตําแหนงตัด<br />
ของ DraI ทิ้งออกไป<br />
สวนประกอบสําคัญ คือ oriT (จากพลาสมิด RK2) และยีน<br />
ตานยาปฏิชีวนะอะพรามัยซิน [Am R ; acc(3)IV]<br />
ที่มา:<br />
Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992<br />
44
9.2.2 การตรวจสอบการผลิตไรโมซิดิน<br />
นําสายพันธุกลายที่ได<br />
ไปตรวจสอบการสังเคราะหสารไรโมซิดิน ซึ่ง<br />
เปนสารตานเชื้อราโดยการเกิดวงใสของเชื้อรา<br />
C. <strong>al</strong>bicans และ A. niger ตรวจสอบดวย TLC<br />
และสเปกโทรเมทรี ตามวิธีการในขอ 6<br />
10. สถานที่และระยะเวลาทําการวิจัย<br />
หองปฏิบัติการวิจัย ภาควิชาพันธุศาสตร คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร<br />
วิทยาเขตบางเขน ในระหวางเดือน พฤศจิกายน 2544 - กรกฎาคม 2547<br />
45
ผลและวิจารณ<br />
1. การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมสําหรับการเกิดคอนจูเกชันตางสกุลระหวาง<br />
S. rimosus R7<br />
และ E. coli ET12567 (pUZ8002/pIJ8600)<br />
1.1 อุณหภูมิและระยะเวลาที่เหมาะสมตอการกระตุนการงอกของสปอรของ<br />
S. rimosus R7<br />
ศึกษาอุณหภูมิและระยะเวลาในการกระตุนการงอกของสปอร<br />
S. rimosus R7<br />
ตามวิธีการในขอ 8.1 โดยเมื่อใชเวลาบมสปอรเปนเวลา<br />
10 นาที แปรอุณหภูมิที่<br />
30, 35, 40,<br />
45, 50, 55 และ 60 องศาเซลเซียส ทดลอง 3 ซ้ํา<br />
จากคาเฉลี่ยพบวาการอยูรอดของสปอร<br />
เริ่มลดลงอยางชัดเจนในระหวางชวงอุณหภูมิ<br />
40 และ 45 องศาเซลเซียส (ภาพที่<br />
10) โดย<br />
ลดลงจากการอยูรอดที่<br />
88.66 ± 3.24 เปอรเซ็นต เปน 75.30 ± 9.12 เปอรเซ็นต คาดวา<br />
อุณหภูมิที่เหมาะสมสําหรับการกระตุนสปอรควรอยูระหวางนี้<br />
จากรายงานอุณหภูมิที่ใชในการ<br />
กระตุนการงอกของสปอรของ<br />
Streptomyces โดยทั่วไป<br />
จะอยูที่<br />
50 องศาเซลเซียส เชน S.<br />
lividans (Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989), S. coelicolor (Fl<strong>et</strong>t <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997) และ S. peuc<strong>et</strong>ius<br />
(Paranthaman and Dharm<strong>al</strong>ingam, 2003) เปนตน แตที่อุณหภูมิ<br />
50 องศาเซลเซียส การอยู<br />
รอดของสปอรของ S. rimosus R7 มีคาเปน 57.89 ± 11.05 เปอรเซ็นต จึงเปนอุณหภูมิที่ไม<br />
เหมาะสม และอาจแสดงวาสปอรของ S. rimosus R7 ทนตอความรอนไดไมดี<br />
การศึกษาระยะเวลาในการบมจึงเลือกใชอุณหภูมิที่<br />
40 และ 45 องศาเซลเซียส<br />
บมสปอรเปนระยะเวลา 0, 5, 10, 15 และ 20 นาที ทดลอง 3 ซ้ํา<br />
จากคาเฉลี่ยพบวาการอยู<br />
รอดของสปอรเริ่มลดลงหลังจากบมเปนระยะเวลา<br />
5 นาที ทั้งที่<br />
40 และ 45 องศาเซลเซียส ซึ่ง<br />
ที่<br />
45 องศาเซลเซียส การอยูรอดลดลงมากกวาที่<br />
40 องศาเซลเซียส (ภาพที่<br />
11) โดยเมื่อบม<br />
เปนเวลา 10 นาที การอยูรอดของสปอรที่<br />
40 และ 45 องศาเซลเซียส มีคาเปน 89.49 ± 7.30<br />
เปอรเซ็นต และ 76.27 ± 9.79 เปอรเซ็นต ตามลําดับ<br />
เนื่องจากการบมทําใหการอยูรอดของสปอรลดลง<br />
มีผลตอจํานวนสปอรมีชีวิตที่<br />
จะนําไปใชในการทําคอนจูเกชัน อุณหภูมิและระยะเวลาที่เหมาะสมจึงควรเปนอุณหภูมิต่ําที่สุด<br />
และระยะเวลาสั้นที่สุดที่สามารถกระตุนใหเกิดการงอกของสปอรได<br />
ซึ่งจากการศึกษาของ<br />
Kitani<br />
<strong>et</strong> <strong>al</strong>. (2000) พบวาอุณหภูมิและระยะเวลาที่เริ่มทําใหการอยูรอดของสปอรลดลงสามารถ<br />
กระตุนการงอกของสปอรได<br />
ดังนั้นสําหรับ<br />
S. rimosus R7 อุณหภูมิและระยะเวลาที่เหมาะสม<br />
คือ บมที่อุณหภูมิ<br />
40 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที ซึ่งเปนสภาวะเชนเดียวกับ<br />
S.<br />
46
lavendulae FRI-5 (Kitani <strong>et</strong> <strong>al</strong>.; 2000) แตแตกตางจากสภาวะที่ใชสําหรับ<br />
S. lividans<br />
(Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989) และ S. coelicolor (Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) ซึ่งบมที่อุณหภูมิ<br />
50 องศา<br />
เซลเซียส เปนเวลา 10 นาที ซึ่งการกระตุนการงอกของสปอรนี้จะทําใหประสิทธิภาพของการ<br />
คอนจูเกชันตางสกุลสูงขึ้น<br />
(Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989)<br />
การอยูรอดของสปอร<br />
(%)<br />
ภาพที่<br />
10 กราฟแสดงการอยูรอดของสปอรเมื่อกระตุนการงอกของสปอรที่อุณหภูมิตางๆ<br />
การอยูรอดของสปอร<br />
(%)<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
30 35 40 45 50 55 60<br />
อุณหภูมิ (ºC)<br />
0 5 10 15 20<br />
ระยะเวลา (นาที)<br />
40 ºC<br />
45 ºC<br />
ภาพที่<br />
11 กราฟแสดงการอยูรอดของสปอรเมื่อกระตุนการงอกของสปอรที่อุณหภูมิ<br />
40 และ<br />
45 องศาเซลเซียสในระยะเวลาตางๆ<br />
47
1.2 การเตรียม E. coli ET12567 (pUZ8002/pIJ8600)<br />
สกัดพลาสมิด pIJ8600 ขนาด 8.1 กิโลเบส จาก E. coli S17-1 ตรวจสอบ<br />
โดยการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ BamHI แลวทําอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส (ภาพที่<br />
12 แถว<br />
ที่<br />
2) จากนั้นจึงนําพลาสมิดที่ไดทรานสฟอรมเขาสู<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) คัดเลือก<br />
และตรวจสอบโคลนที่ไดโดยการสกัดพลาสมิดแลวตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
BamHI ซึ่งผล<br />
จากอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสแสดงวามีพลาสมิด pIJ8600 (ภาพที่<br />
12 แถวที่<br />
5 และ 6)<br />
โดย E. coli ET12567 (pUZ8002/pIJ8600) ที่ไดจะนําไปใชในการทําคอนจูเกชันตอไป<br />
10 kb<br />
8 kb<br />
5 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
8.1 kb<br />
ภาพที่<br />
12 การตรวจสอบการทรานสฟอรมพลาสมิด pIJ8600 เขาสู<br />
E. coli ET12567<br />
(pUZ8002) ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pIJ8600 แถวที่<br />
2=pIJ8600/BamHI<br />
แถวที่<br />
3=pUZ8002 แถวที่<br />
4=pUZ8002/BamHI<br />
แถวที่<br />
5=(pUZ8002+pIJ8600) และแถวที่<br />
6=(pUZ8002+pIJ8600)/BamHI<br />
48
1.3 ประสิทธิภาพของคอนจูเกชันตางสกุล<br />
การทดลองนี้จะทําคอนจูเกชันตางสกุลโดยใช<br />
E. coli ET12567<br />
(pUZ8002/pSET152) และ E. coli ET12567 (pUZ8002/pIJ8600) เปนผูให<br />
และ S.<br />
rimosus R7 เปนผูรับ<br />
ตามวิธีการในขอ 8.3 จํานวน 3 ซ้ํา<br />
โดยมีความเขมขนสปอรที่เก็บมาใชอยู<br />
ในชวง 10 9 -10 10 สปอรตอมิลลิลิตร ซึ่งทําใหมีจํานวนสปอรจริงที่ใชผสมกับเซลล<br />
E. coli อยู<br />
ในชวง 10 8 -10 9 สปอร นําไปกระตุนการงอกของสปอรโดยบมที่อุณหภูมิ<br />
40 องศาเซลเซียส<br />
เปนเวลา 10 นาที หลังจากทําคอนจูเกชัน นําไปเกลี่ยลงบนอาหารแข็ง<br />
3 ชนิด คือ MS, ISP3<br />
และ ISP4 ที่มี<br />
MgCl2 เขมขน 10 มิลลิโมลาร แลวคัดเลือกโคลนที่มีพลาสมิด<br />
pSET152 โดย<br />
การเททับดวยยาปฏิชีวนะอะพรามัยซิน 1,000 ไมโครกรัมตอจานอาหาร ซึ่งเปนปริมาณที่ใช<br />
คัดเลือกใน S. coelicolor และ S. lividans (Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) พบวา S. rimosus R7 บน<br />
จานอาหารคัดเลือกสามารถเจริญไดดีพอๆ กับบนจานอาหารที่ไมไดคัดเลือก<br />
จึงไมสามารถ<br />
คัดเลือกดวยยาตามปริมาณดังกลาวได เมื่อเพิ่มปริมาณยาเปน<br />
2,000 ไมโครกรัมตอจาน<br />
อาหาร สามารถคัดเลือกโคโลนีไดจํานวนหนึ่ง<br />
แตเมื่อนําไปเลี้ยงในอาหาร<br />
TSB ที่มียาปฏิชีวนะ<br />
อะพรามัยซิน 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร พบวาไมมีโคลนใดสามารถที่จะเจริญได<br />
แสดง<br />
วาอะพรามัยซินเปนยาปฏิชีวนะที่ไมเหมาะสม<br />
ทําให S. rimosus R7 เจริญไดดี จากการ<br />
ตรวจสอบขอมูลเพิ่มเติมพบวา<br />
มีรายงานขอมูลของยีน aminoglycoside N(3')-ac<strong>et</strong>yltransferase<br />
VII [acc(3)VII] จากเชื้อ<br />
S. rimosus subsp. paromomycinus (Lopez-Cabrera <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989;<br />
Perez-Gonz<strong>al</strong>ez <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989) ซึ่งมีสมบัติในการเติมหมูอะเซทิลใหกับอะพรามัยซินได<br />
เชนเดียวกับยีน acc(3)IV ที่มีในพลาสมิด<br />
คาดวา S. rimosus R7 ที่เจริญไดบนอาหารแข็งที่มี<br />
ยาปฏิชีวนะอะพรามัยซินนาจะมีการทํางานของยีนดังกลาว ทําใหสามารถตานอะพรามัยซินได<br />
เมื่อคัดเลือกโคลนที่มีพลาสมิด<br />
pIJ8600 โดยการเททับดวยยาปฏิชีวนะไธ<br />
โอสเตรปทอน นับจํานวนโคโลนีที่เจริญไดบนอาหาร<br />
(ภาพที่<br />
13) และคํานวณประสิทธิภาพคอน<br />
จูเกชันตางสกุล พบวาการทําคอนจูเกชันบนอาหาร MS ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร ให<br />
ประสิทธิภาพสูงสุดที่<br />
1.91 x 10 -4 เอกซคอนจูแกนตตอผูรับ<br />
โดยประสิทธิภาพอยูในชวง<br />
10 -5 -<br />
10 -4 เอกซคอนจูแกนตตอผูรับ<br />
(ตารางที่<br />
5) ซึ่งมีคาไมแตกตางกันเมื่อใชสปอรแตกตางกัน<br />
10<br />
เทา เชนเดียวกับการแปรจํานวนสปอรในการทําคอนจูเกชันของ S. nodosus บนอาหาร MS<br />
(Nikodinovic <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003) เมื่อเปรียบเทียบกับคอนจูเกชันของ<br />
S. rimosus R7บนอาหาร MS<br />
และ ISP4 ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร พบวาประสิทธิภาพคอนจูเกชันบนอาหาร MS ดีกวาบน<br />
อาหาร ISP4 ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร ซึ่งใหประสิทธิภาพอยูในชวง<br />
10 -7 -10 -5 เอกซคอนจู<br />
แกนตตอผูรับ<br />
(ตารางที่<br />
5) โดยบนอาหาร ISP4 เมื่อใชจํานวนสปอรแตกตางกันจะให<br />
ประสิทธิภาพแตกตางกัน โดยประสิทธิภาพจะลดลงเมื่ออัตราสวนของผูรับตอผูใหเพิ่มขึ้น<br />
49
(ก)<br />
(ข)<br />
1 2 3<br />
4 5<br />
1 2 3<br />
4 5<br />
ภาพที่<br />
13 เอกซคอนจูแกนตที่ไดจากการคอนจูเกชันซึ่งใชจํานวนสปอร<br />
10 8 สปอร หลังจากบม<br />
ไวที่<br />
30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 วัน<br />
(ก) บนอาหาร MS ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร (ข) บนอาหาร ISP4 ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร (1) สปอรที่ไมไดรับการคอนจูเกชันเมื่อคัดเลือกดวยไธ<br />
โอสเตรปทอน (negative control) (2, 3) คอนจูเกชันที่สปอรเจือจาง<br />
10 1 และ 10 2<br />
เทา ตามลําดับ และไมเททับดวยไธโอสเตรปทอน (4, 5) คอนจูเกชันที่สปอรเจือจาง<br />
10 1 และ 10 2 เทา ตามลําดับ และเททับดวยไธโอสเตรปทอน 1,000 ไมโครกรัม<br />
50
ตารางที่<br />
5 ประสิทธิภาพการเกิดคอนจูเกชันระหวาง E. coli ET12567 (pUZ8002/pIJ8600)<br />
และ S. rimosus R7 ที่กระตุนการงอกของสปอรที่<br />
40 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10<br />
นาที<br />
Number of recipient spores<br />
Exconjugants per recipient<br />
MS+10 mM MgCl2 ISP4+10 mM MgCl2 10 9 (5.81 ± 7.76) x 10 -5 (5.57 ± 5.17) x 10 -7<br />
10 8 (1.91 ± 2.24) x 10 -4 (2.32 ± 2.26) x 10 -5<br />
สวนบนอาหาร ISP3 ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร ไมพบเอ็กซคอนจูเกนท แสดงวา ISP3 เปน<br />
อาหารที่ไมเหมาะสมในการเกิดคอนจูเกชันของ<br />
S. rimosus R7 กับ E. coli<br />
ประสิทธิภาพการสงถายพลาสมิด pIJ8600 ซึ่งมีขนาด<br />
8.1 กิโลเบส เขาสู<br />
S.<br />
rimosus R7 บนอาหาร MS ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร นั้นอยูในชวง<br />
10 -6 -10 -4 เอกซคอนจู<br />
แกนตตอผูรับ<br />
ซึ่งมีคาสูงกวาคอนจูเกชันของ<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002/pSET152) และ<br />
S. lavendulae FRI-5 เพื่อสงถายพลาสมิด<br />
pSET152 ซึ่งมีขนาดเล็กกวา<br />
(5.5 กิโลเบส) โดย<br />
ประสิทธิภาพบนอาหาร MS อยูในชวง<br />
10 -6 เอกซคอนจูแกนตตอผูรับ<br />
และบนอาหาร ISP2 อยู<br />
ในชวง 10 -8 -10 -5 เอกซคอนจูแกนตตอผูรับ<br />
(Kitani <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) อยางไรก็ตามประสิทธิภาพ<br />
การสงถายพลาสมิด pIJ8600 เขาสู<br />
S. rimosus R7 นั้น<br />
มีคาใกลเคียงกับการเกิดคอนจูเกชัน<br />
ของ pTO1 ขนาด 8.8 กิโลเบส โดยใช E. coli S17-1 (มีการเติมเมธิล) เขาสู<br />
Streptomyces<br />
จํานวน 16 สายพันธุ<br />
โดยมีประสิทธิภาพอยูในชวง<br />
10 -5 - 10 -3 เอกซคอนจูแกนตตอผูรับ<br />
ซึ่ง<br />
รวมไปถึง S. rimosus ATCC 23955 ซึ่งใหประสิทธิภาพ<br />
1 x 10 -4 เอกซคอนจูแกนตตอผูรับ<br />
(Voeykova <strong>et</strong> <strong>al</strong>.; 1998)<br />
จากผลการทดลองนี้จะเลือกใชอาหารแข็ง<br />
MS ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโมลาร ใน<br />
การทําคอนจูเกชันของ S. rimosus R7 ตอไป<br />
51
1.4 การตรวจสอบเอกซคอนจูแกนตดวย Dot Blot และ Southern Blot Hybridisation<br />
เลือกเอกซคอนจูแกนตจํานวน 46 โคลน มาตรวจสอบดวย dot blot<br />
hybridisation โดยใชยีน tsr เปนโพรบ มีขนาด 2 กิโลเบส ที่ไดจากการตัดพลาสมิด<br />
pIJ8600<br />
ดวยเอนไซม EcoRI จากผลการทดลองพบวาเอกซคอนจูแกนตจํานวน 41 โคลน ใหผลเปนบวก<br />
(ภาพที่<br />
14) จึงสุมเลือกเอกซคอนจูแกนต<br />
11 โคลน ไปตรวจสอบดวย Southern blot<br />
hybridisation กับโพรบเดิม โดยตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ 2 ชนิด คือ EcoRV และ KpnI เพื่อ<br />
ตรวจสอบรูปแบบการแทรกตัวของพลาสมิด pIJ8600 ในโครโมโซม<br />
− + <br />
<br />
<br />
<br />
ภาพที่<br />
14 การตรวจสอบเอกซคอนจูแกนตของ S. rimosus R7 ที่ไดรับพลาสมิด<br />
pIJ8600 ดวย<br />
dot blot hybridisation โดยใชยีน tsr เปนโพรบ<br />
(-) = S. rimosus R7 (+) = pIJ8600 = เอกซคอนจูแกนต<br />
52
ผลของ Southern blot hybridisation (ภาพที่<br />
15) แสดงวาเอกซคอนจูแกนต<br />
ไดรับพลาสมิด pIJ8600 ซึ่งแทรกตัวเขาไปในโครโมโซม<br />
โดยเมื่อตัดดวยเอนไซม<br />
EcoRV ให<br />
แถบดีเอ็นเอ 2 แถบ ขนาดใหญมากกวา 10 กิโลเบส (ภาพที่<br />
15 แถวที่<br />
3, 5 และ 7) ขณะที่<br />
pIJ8600 ใหแถบดีเอ็นเอ 1 แถบ ขนาด 8.1 กิโลเบส (ภาพที่<br />
15 แถวที่<br />
9) แสดงวาบน<br />
โครโมโซม จะมีตําแหนงตัดของ EcoRV อยูหางออกไปทางซายและขวาของ<br />
pIJ8600 ที่แทรก<br />
ตัวอยู<br />
(ภาพที่<br />
16) เมื่อตัดดวยเอนไซม<br />
KpnI ใหแถบดีเอ็นเอ 2 แถบ ขนาด 0.6 กิโลเบส และ<br />
ขนาดประมาณ 8 กิโลเบส (ภาพที่<br />
15 แถวที่<br />
4, 6 และ 8) ขณะที่<br />
pIJ8600 ใหแถบดีเอ็นเอ 2<br />
แถบ ขนาด 0.6 และ 7.5 กิโลเบส (ภาพที่<br />
15 แถวที่<br />
10) แสดงวามีตําแหนงตัดของ KpnI อยู<br />
หางออกไปทางดานซายของ pIJ8600 ที่แทรกตัวอยู<br />
(ภาพที่<br />
16) จากการตรวจสอบเอกซคอนจู<br />
แกนต 11 โคลน พบวารูปแบบของ Southern blot hybridisation มีรูปแบบเดียวกันทั้งหมด<br />
แสดงวาตําแหนงการแทรกตัวของพลาสมิดเขาไปในตําแหนง attB ของ φC31 บนโครโมโซมเปน<br />
ตําแหนงเดียวกัน เชนเดียวกับที่มีรายงานใน<br />
S. ambofaciens (Kuhstoss <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991) S.<br />
toyocaensis (Matsushima and B<strong>al</strong>tz, 1996) S. clavuligerus (Fouces <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) และ S.<br />
lavendulae (Kitani <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) อยางไรก็ตามจากการศึกษาของ Combes <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (2002)<br />
แสดงวาโครโมโซมของ Streptomyces มีตําแหนง attB ของ φC31 อยูหลายตําแหนง<br />
แตการที่<br />
ตรวจสอบพบการแทรกตัวที่ตําแหนงเดียวกันเสมอนั้น<br />
เนื่องจากความถี่ในการแทรกตัวในแตละ<br />
ตําแหนงมีความแตกตางกัน โดยพบการแทรกที่ตําแหนงแรกมากกวาตําแหนงที่<br />
2 ถึง 300 เทา<br />
53
(ก) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M<br />
10 kb<br />
8 kb<br />
0.6 kb<br />
>10 kb<br />
>10 kb<br />
(ข) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M<br />
8.1 kb<br />
7.5 kb<br />
0.6 kb<br />
8.1 kb<br />
7.5 kb<br />
0.6 kb<br />
ภาพที่<br />
15 การตรวจสอบเอกซคอนจูแกนตของ S. rimosus R7 ที่ไดรับพลาสมิด<br />
pIJ8600 ดวย<br />
Southern blot hybridisation โดยใชยีน tsr เปนโพรบ<br />
(ก) อะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสของโครโมโซมที่ถูกตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
(ข) Southern hybridisation M=1 kb ladder แถวที่<br />
1= S. rimosus R7/EcoRV<br />
แถวที่<br />
2= S. rimosus R7/KpnI แถวที่<br />
3, 5, 7 =เอกซคอนจูแกนต 1-3/EcoRV<br />
แถวที่<br />
4, 6, 8=เอกซคอนจูแกนต 1-3/KpnI แถวที่<br />
9= pIJ8600/EcoRV แถวที่<br />
10=pIJ8600/KpnI<br />
54
E5 K<br />
tsr<br />
pIJ8600<br />
attP<br />
attB<br />
chromosome<br />
site-specific recombination<br />
probe<br />
cut with EcoRV<br />
cut with KpnI<br />
ภาพที่<br />
16 การแทรกตัวของพลาสมิด pIJ8600 เขาไปในโครโมโซมของ S. rimosus R7<br />
E1=EcoRI E5=EcoRV K=KpnI<br />
X<br />
E1 E5 K<br />
3.6 kb 1.5 kb 3.3 kb<br />
4.5 kb<br />
2.0 kb<br />
> 10 kb > 10 kb<br />
8 kb 0.6 kb<br />
K/E1 E5<br />
55
1.5 การคัดเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อสําหรับการสรางไรโมซิดินจาก<br />
S. rimosus<br />
คัดเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมกับการผลิตไรโมซิดินในเบื้องตน<br />
โดยเลี้ยง<br />
S. rimosus ในอาหารแข็ง 7 ชนิด ไดแก MS, PDA, ISP3, ISP4, Waksman agar (1l: 20 g<br />
glucose, 5 g peptone, 3 g yeast extract, 5 g meat extract, 5 g NaCl, 3 g CaCO3, 20 g<br />
agar, pH 7.0), Nutrient agar (NA; 1 l: 5 g peptone, 3 g meat extract, 15 g agar, pH 7.0)<br />
และ TSA ทดสอบการเกิดวงใสดวยวิธี agar plug assay (วิธีการขอ 6.1) ตอเชื้อ<br />
C. <strong>al</strong>bicans<br />
พบวา อาหารที่ใหวงใสกวางที่สุด<br />
คือ Waksman agar ซึ่งคาดวาเหมาะสมในการผลิตไรโมซิดิน<br />
(ภาพที่<br />
17) ขณะที่<br />
ISP4 และ TSB ไมพบการสรางวงใส (ไมไดแสดงผล)<br />
จากนั้นจึงทดสอบเลี้ยง<br />
S. rimosus ในอาหารเหลว Waksman broth (สูตร<br />
เชนเดียวกับ Waksman agar แตไมเติม agar) ตามวิธีการขอ 6.2 ผลของการทดสอบการเวิดวง<br />
ใสดวยวิธี paper disk assay ของน้ําเลี้ยงเชื้อในวันที่<br />
3, 4 และ 5 ตอเชื้อ<br />
C. <strong>al</strong>bicans พบวาเกิด<br />
วงใสจากน้ําเลี้ยงเชื้อทั้งหมด<br />
โดยน้ําเลี้ยงเชื้อในวันที่<br />
3 ใหวงใสขนาดเล็กกวาของวันที่<br />
4 และ 5<br />
แสดงวาไรโมซิดินมีการผลิตแลวตั้งแตวันที่<br />
3 ในการเลี้ยงดวยสภาวะนี้<br />
6<br />
5<br />
2<br />
1<br />
4<br />
3<br />
ภาพที่<br />
17 การตรวจสอบการสรางไรโมซิดินของ S. rimosus R7 บนอาหารแข็งตางๆ จากการ<br />
เกิดวงใสของ C. <strong>al</strong>bicans<br />
(1) = MS, (2) = Waksman agar, (3) = ISP3, (4) = ISP4, (5) = PDA และ<br />
(6) = NA<br />
56
1.6 การตรวจสอบสัณฐานวิทยาและการสรางสารไรโมซิดินของเอกซคอนจูแกนต<br />
จากการศึกษาลักษณะสัณฐานวิทยาของเอกซคอนจูแกนต ไดแก ลักษณะโคโลนี<br />
สีของสปอร การสรางสปอรบนอาหารแข็ง พบวามีลักษณะเหมือน wild type ทุกประการ และ<br />
เมื่อนําเอกซคอนจูแกนตไปทดสอบการสรางสารไรโมซิดินโดยวิธี<br />
agar plug assay ตรวจสอบการ<br />
เกิดวงใสตอเชื้อ<br />
A. niger และ C. <strong>al</strong>bicans เปรียบเทียบกับ wild type พบวายังคงสามารถสราง<br />
สารตานเชื้อราไรโมซิดินไดเทากับ<br />
wild type (ภาพที่<br />
18) แสดงวาการแทรกตัวของพลาสมิดเขา<br />
ไปในโครโมโซมในตําแหนง attB ที่เกิดขึ้นนั้น<br />
ไมมีผลตอลักษณะทางฟโนไทปของ S. rimosus<br />
R7 และไมไดขัดขวางการสังเคราะหไรโมซิดิน<br />
2<br />
3<br />
1<br />
5<br />
4<br />
ภาพที่<br />
18 การตรวจสอบการสรางสารไรโมซิดินโดยการเกิดวงใสของเอกซคอนจูแกนตของ S.<br />
rimosus R7 (pIJ8600) ตอ C. <strong>al</strong>bicans ดวยวิธี agar plug assay<br />
(1) = S. rimosus R7 (2)-(4) =เอกซคอนจูแกนตที่<br />
1-3 (5) = MS ที่มีไธ<br />
โอสเตรปทอน 25 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (negative control)<br />
57
1.7 การทํา Thin-Layer Chromatography (TLC)<br />
1.7.1 การคัดเลือกตัวพา (Mobile Phase)<br />
ทดสอบการแยกสารปฏิชีวนะมาโครไลด กลุมโพลีอีน<br />
ดวย TLC<br />
ใชนัยสตาติน 100 ไมโครกรัม เปนสารทดสอบ โดยใชแผน TLC เปน Silica gel 60 F254 (Merck, USA) ความยาว 10 เซนติเมตร ทดสอบตัวพา 2 ชนิด คือ chloroform:m<strong>et</strong>hanol<br />
(85:15) และ n-butanol:ac<strong>et</strong>ic acid:H2O (4:1:5) (ทิ้งไวใหแยกชั้น<br />
นําสวนบนมาใช)<br />
(Pandey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1977; Pandey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1982) จากการตรวจสอบการเคลื่อนที่ของนัยสตาติน<br />
ภายใตแสงอัลตราไวโอเลต พบวา chloroform:m<strong>et</strong>hanol (85:15) และ n-butanol:ac<strong>et</strong>ic<br />
acid:H2O (4:1:5) ใหคา Rf เปน 0.03 และ 0.36 ตามลําดับ (ภาพที่<br />
19) ดังนั้นตัวพาที่<br />
เหมาะสมสําหรับการแยกสารโพลีอีน คือ n-butanol:ac<strong>et</strong>ic acid:H2O (4:1:5) ซึ่งทําใหเกิดการ<br />
เคลื่อนที่ไดดีกวา<br />
(ก) (ข)<br />
Rf = 0.03<br />
เริ่มตน<br />
R f = 0.36<br />
เริ่มตน<br />
ภาพที่<br />
19 การตรวจสอบการแยกนัยสตาตินโดย TLC ภายใตแสงอัลตราไวโอเลต<br />
(ก) ตัวพาคือ chloroform:m<strong>et</strong>hanol (85:15)<br />
(ข) ตัวพาคือ n-butanol:ac<strong>et</strong>ic acid:H2O (4:1:5)<br />
58
1.7.2 การแยกสารโดย TLC และไบโอออโทกราฟ<br />
นําสารละลายที่ไดจากการสกัดไรโมซิดินในขอ<br />
6.3 มาทํา TLC ตาม<br />
วิธีการขอ 6.4.2 โดยใชแผน TLC เปน Silica gel 60 F254 (Merck, USA) ความยาว 20<br />
เซนติเมตร โดยใชตัวพาเปน n-butanol:ac<strong>et</strong>ic acid:H2O (4:1:5) ทํา TLC เปรียบเทียบกับ<br />
นัยสตาติน 100 ไมโครกรัม เมื่อนําไปตรวจสอบผลภายใตแสงอัลตราไวโอเลต<br />
พบวาสารละลาย<br />
ที่ไดจากการสกัดจากเสนใยและอาหารเลี้ยงเชื้อประกอบไปดวยสารตางชนิดกัน<br />
(ภาพที่<br />
20 ก)<br />
และผลที่ไดจากการทําไบโอออโทกราฟ<br />
(ภาพที่<br />
20 ข) แสดงใหเห็นวาสารที่ทําใหเกิดวงใสของ<br />
เชื้อ<br />
A. niger ที่คาดวาเปนไรโมซิดินนั้น<br />
เคลื่อนที่ไดเร็วกวานัยสตาติน<br />
(Rf 0.24) และมีคา Rf เปน 0.31 และพบวามีสารอีกชนิดที่สกัดได<br />
ซึ่งทําใหเกิดวงใสเชนเดียวกัน<br />
และสามารถเคลื่อนที่<br />
ไดไกลกวาไรโมซิดินเล็กนอย (มีคา Rf เปน 0.41) คาดวานาจะเปนสารอนุพันธของไรโมซิดิน<br />
จากผลการทดลองพบวาไรโมซิดินที่สกัดไดจากเสนใยมีปริมาณมากกวาที่สกัดไดจากอาหารเลี้ยง<br />
เชื้อ<br />
เมื่อนําสารละลายที่สกัดไดจากเอกซคอนจูแกนตมาทํา<br />
TLC และไบโอ<br />
ออโทกราฟนี้<br />
พบวาเอกซคอนจูแกนตของพลาสมิด pIJ8600 ยังคงสามารถผลิตไรโมซิดินและ<br />
ทําใหเกิดวงใสได ดังนั้นการแทรกตัวของพลาสมิด<br />
pIJ8600 ที่ตําแหนง<br />
attP จึงไมไดสงผลตอ<br />
การสังเคราะหไรโมซิดิน<br />
59
0.41<br />
0.31<br />
ก) ข)<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6<br />
ภาพที่<br />
20 การตรวจสอบการแยกสารสกัดจาก S. rimosus R7 และเอกซคอนจูแกนตดวย TLC ภายใตแสงอัลตราไวโอเลตและไบโอออโทกราฟ<br />
(ก) TLC, (ข) ไบโอออโทกราฟ<br />
(1-5) =สารสกัดจากเสนใย, (7-11) =สารสกัดจากน้ําเลี้ยงเชื้อ,<br />
(1,7) =S. rimosus R7, (2-5, 8-11)=เอกซคอนจูแกนต pIJ8600,<br />
(6, 12) =นัยสตาติน 100 ไมโครกรัม<br />
0.41<br />
0.31<br />
0.24<br />
0.24<br />
60
1.8 การทําสเปกโทรเมทรี<br />
เมื่อนําสารสกัดจากเสนใยและน้ําเลี้ยง<br />
ไปเจือจางในเอธานอลแลวนําไปวัดการ<br />
ดูดแสงชวง 200-400 นาโนเมตร ดวยเครื่อง<br />
Lambda Bio UV/VIS Spectrom<strong>et</strong>er (Perkin<br />
Elmer, Germany) เปรียบเทียบกับนัยสตาติน พบวานัยสตาตินใหคาการดูดแสงสูงสุด (λmax) ที่<br />
280.0, 290.8, 304.0 และ 318.8 นาโนเมตร (ภาพที่<br />
21 ก) สวนไรโมซิดินที่สกัดไดใหคา<br />
λmax ที่<br />
278.0, 289.6, 303.2 และ 317.6 นาโนเมตร ใกลเคียงกับรายงานของ Cope <strong>et</strong> <strong>al</strong>.<br />
(1965) ซึ่งใหคา<br />
λmax ที่<br />
279, 291, 304 และ 318 นาโนเมตร โดยสารสกัดที่ไดจากเสนใยให<br />
คาการดูดแสงและความชัดเจนของกราฟมากกวาสารสกัดที่ไดจากน้ําเลี้ยง<br />
ซึ่งแสดงปริมาณของไร<br />
โมซิดินที่สกัดไดจากเสนใยมีมากกวาที่สกัดไดจากน้ําเลี้ยงประมาณ<br />
10 เทา (ภาพที่<br />
21)<br />
61
ก) ข)<br />
ค) ง) จ)<br />
ภาพที่<br />
21 การดูดแสงของนัยสตาตินและไรโมซิดินโดยสเปกโทรเมทรี<br />
(ก) นัยสตาติน (10 µg/ml) (ข) ไรโมซิดินที่สกัดจากเสนใยของ<br />
S. rimosus R7<br />
เจือจาง 1,000 เทา (ค) ไรโมซิดินจากน้ําเลี้ยงของ<br />
S. rimosus R7 เจือจาง 100<br />
เทา (ง) ไรโมซิดินจากเสนใยของเอกซคอนจูแกนต (pIJ8600) เจือจาง 1,000 เทา<br />
(จ) ไรโมซิดินจากน้ําเลี้ยงของเอกซคอนจูแกนต<br />
(pIJ8600) เจือจาง 100 เทา<br />
Absorbance nm<br />
Absorbance nm<br />
62
2. การโคลนยีน Type I PKS จาก S. rimosus R7<br />
จากโครงสรางของไรโมซิดิน (ภาพที่<br />
5) คาดวาการสังเคราะหอาศัยกลุมยีน<br />
Type I PKS<br />
จํานวน 13 โมดุล เมื่อไมรวมโมดุลเริ่มตน<br />
โดยเชื่อมหนวยเริ่มตนที่เปน<br />
บิวทีริล-โคเอ กับหนวย<br />
ตอเติม ไดแก มาโลนิล-โคเอ จํานวน 11 หนวย เมธิลมาโลนิล-โคเอ จํานวน 1 หนวย และ<br />
เอธิลมาโลนิล-โคเอ จํานวน 1 หนวย การทดลองนี้จะโคลนยีน<br />
Type I PKS ที่เกี่ยวของกับการ<br />
สรางไรโมซิดิน โดยการสรางโพรบจากโดเมน KS<br />
2.1 การเตรียมดีเอ็นเอโพรบ<br />
ชิ้นดีเอ็นเอที่นํามาเตรียมเปนโพรบ<br />
ไดจากการทําพีซีอารดวยไพรเมอรซึ่ง<br />
จําเพาะตอยีน Type I PKS ในสวนของโดเมน KS จากรายงานของ ณัฏฐิกาและอรินทิพย<br />
(2544) ตามวิธีการในขอ 7.1 เมื่อทําพีซีอารโดยใชอุณหภูมิ<br />
anne<strong>al</strong>ing ที่<br />
70 องศาเซลเซียส<br />
พบวาผลิตภัณฑพีซีอารที่ไดมีแถบดีเอ็นเอที่ตองการ<br />
ขนาดประมาณ 1.3 กิโลเบส พรอมกับพบ<br />
แถบดีเอ็นเอที่ไมจําเพาะ<br />
(non-specific) ซึ่งมีขนาดเล็กกวาอยูบางสวน<br />
จึงไดทดลองทําพีซีอาร<br />
โดยเพิ่มอุณหภูมิ<br />
anne<strong>al</strong>ing ใหสูงขึ้นเปน<br />
72 องศาเซลเซียส แตยังคงพบวามีแถบดีเอ็นเอที่ไม<br />
จําเพาะอยู<br />
(ภาพที่<br />
22 ก) ดังนั้นอุณหภูมิ<br />
anne<strong>al</strong>ing ที่<br />
70 องศาเซลเซียส จึงเปนอุณหภูมิที่<br />
เหมาะสมที่สุด<br />
เชนเดียวกับที่มีรายงานใน<br />
Streptomyces sp. A2a-19 (ณัฏฐิกาและอรินทิพย,<br />
2544)<br />
สกัดผลิตภัณฑพีซีอารขนาด 1.3 กิโลเบส จากเจล แลวตัดดวยเอนไซมตัด<br />
จําเพาะ EcoRI และ PstI ซึ่งจะตัดบริเวณปลายของชิ้นดีเอ็นเอตามที่ไดออกแบบตําแหนงตัดของ<br />
เอนไซมไวที่ปลาย<br />
5’ ของไพรเมอร (วิธีการขอ 7.1; ณัฏฐิกาและอรินทิพย, 2544) พบวาชิ้นดี<br />
เอ็นเอขนาด 1.3 กิโลเบส ถูกตัดใหแถบดีเอ็นเอ 2 แถบ มีขนาด 1.1 และ 1.3 กิโลเบส (ภาพที่<br />
22 ข) ซึ่งแสดงวามีตําแหนงตัดของเอนไซม<br />
EcoRI หรือ PstI ในชิ้นดีเอ็นเอ<br />
โดยจะไดกลาวถึงใน<br />
ขอ 2.2 ตอไป<br />
เชื่อมตอชิ้นดีเอ็นเอทั้งขนาด<br />
1.1 และ 1.3 กิโลเบสนั้น<br />
กับพลาสมิด pUC18 ซึ่ง<br />
ตัดดวยเอนไซมเดียวกัน นําไปทรานสฟอรมเขาสู<br />
E. coli JM109 คัดเลือกโคลนโดยการตัดดวย<br />
เอนไซม EcoRI และ PstI พบวาโคลนไดเฉพาะชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
1.1 กิโลเบส เทานั้น<br />
ใหชื่อ<br />
พลาสมิดวา pATT401 (ภาพที่<br />
22 ค)<br />
63
(ก) (ข)<br />
M 1 2<br />
M 1 2 3<br />
1.6 kb<br />
1 kb<br />
(ค)<br />
3 kb<br />
2.5 kb<br />
1.2 kb<br />
1 kb<br />
1.3 kb<br />
1.6 kb<br />
1 kb<br />
M 1 2 3 4 5<br />
2.7 kb<br />
1.1 kb<br />
1.3 kb<br />
1.1 kb<br />
ภาพที่<br />
22 ผลการทําพีซีอารยีนดวยไพรเมอร ATT10 และ ATT11 จาก S. rimosus R7 และ<br />
การตรวจสอบการโคลนชิ้นดีเอ็นเอดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder (ก) ผลการทําพีซีอารชิ้นดีเอ็นเอ<br />
(KS-R7) ที่อุณหภูมิ<br />
anne<strong>al</strong>ing<br />
ที่<br />
แถวที่<br />
1 = 70 องศาเซลเซียส แถวที่<br />
2 = 72 องศาเซลเซียส (ข) การเตรียมชิ้น<br />
ดีเอ็นเอสําหรับการโคลน แถวที่<br />
1 = KS-R7 แถวที่<br />
2 = KS-R7 ที่สกัดจากเจล<br />
แถวที่<br />
3 = KS-R7 ที่สกัดจากเจล/EcoRI/PstI<br />
(ค) การตรวจสอบโคลน<br />
pATT401 แถวที่<br />
1 = KS-R7 ที่สกัดจากเจล/EcoRI/PstI<br />
แถวที่<br />
2 =<br />
pUC18/EcoRI/PstI แถวที่<br />
3 = pUC18 แถวที่<br />
4 = pATT401/EcoRI/PstI<br />
แถวที่<br />
5 = pATT401<br />
64
2.2 การวิเคราะหชิ้นดีเอ็นเอที่ใชเปนโพรบ<br />
นําพลาสมิด pATT401 ไปหาลําดับเบสโดยใชไพรเมอร M13 Forward และ<br />
M13 Reverse ไดลําดับเบสจํานวน 806 และ 825 คูเบส<br />
ตามลําดับ (ภาพที่<br />
23) เมื่อวิเคราะห<br />
แลวพบวาชิ้นดีเอ็นเอในพลาสมิด<br />
pATT401 มีลําดับเบสขนาด 1,050 คูเบส<br />
สามารถแปลรหัส<br />
เปนกรดอะมิโนขนาด 350 กรดอะมิโน (ภาพที่<br />
24) เมื่อนําลําดับกรดอะมิโนที่ไดไป<br />
เปรียบเทียบกับฐานขอมูลโดยใชโปรแกรม BlastP (23 กุมภาพันธ 2547) พบวามีความ<br />
คลายคลึงกับกลุมยีน<br />
Type I PKS ในฐานขอมูลดังตารางที่<br />
6 โดย 4 ลําดับแรกที่มีคาความ<br />
เหมือน (identity) สูงที่สุด<br />
ที่<br />
72-89 เปอรเซ็นต เปนยีน Type I PKS ในกระบวนการ<br />
สังเคราะหสารโพลีคีไทดในกลุมโพลีอีนเชนเดียวกับไรโมซิดิน<br />
ซึ่งไดแก<br />
พิมาริซินจาก S.<br />
nat<strong>al</strong>ensis (Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000), แคนดิซิดิน (candicidin) จาก Streptomyces sp. FR-008<br />
(Chen <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003), นัยสตาตินจาก S. noursei (Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) และแอมโฟเทอริซิน<br />
จาก S. nodusus (Caffrey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001) จากคาความเหมือนนี้แสดงใหเห็นวา<br />
401-KS นาจะ<br />
เปนโดเมนหนึ่ง<br />
ซึ่งอยูในกลุมยีนที่เกี่ยวของกับการสังเคราะหสารโพลีอีนมากกวากลุมยีน<br />
Type I<br />
PKS ชนิดอื่น<br />
นําลําดับกรดอะมิโน (401-KS) ไปทํา multiple <strong>al</strong>ignment และ clustering<br />
โดยใชโปรแกรม Clust<strong>al</strong>W เปรียบเทียบกับลําดับกรดอะมิโนของยีน Type I PKS ในสวน KS<br />
จากฐานขอมูล โดยเลือกโดเมน KS จากโพลีคีไทดชนิดที่<br />
1 กลุมมาโครไลด<br />
ไดแก KS โมดุลที่<br />
1<br />
ของการสังเคราะหทัยโลซิน (tylosin; TYL-KS1; DeHoff <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1996), KS โมดุลที่<br />
2 ของ<br />
การสังเคราะหอีรีโธรมัยซิน (ERY-KS2; Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991) และ KS โมดุลที่<br />
2 ของการ<br />
สังเคราะหอะเวอรเมกทิน (AVE-KS2; Ikeda <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1999) มาเปรียบเทียบกับโดเมน KS จาก<br />
โพลีคีไทดชนิดที่<br />
1 กลุมโพลีอีน<br />
ไดแก KS โมดุลที่<br />
6 ของการสังเคราะหพิมาริซิน (PIM-KS6;<br />
Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000), KS โมดุลที่<br />
9 ของการสังเคราะหนัยสตาติน (NYS-KS9; Brautas<strong>et</strong><br />
<strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) และ KS โมดุลที่<br />
9 ของการสังเคราะหแอมโฟเทอริซิน (AMP-KS9; Caffrey <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 2001) เมื่อวาด<br />
phylogen<strong>et</strong>ic tree ดวยโปรแกรม TreeView (ภาพที่<br />
25) ปรากฏวา KS<br />
ของ S. rimosus R7 ที่ไดจากการพีซีอาร<br />
(401-KS) จัดอยูในกลุม<br />
KS ของสารโพลีอีน แยก<br />
ออกจากกลุม<br />
KS ของสารมาโครไลด เชื่อไดวา<br />
KS ที่ไดจากการพีซีอารนาจะเกี่ยวของกับการ<br />
สังเคราะหสารไรโมซิดิน<br />
ผลจากการทํา <strong>al</strong>ignment ทําใหทราบวาขนาดที่สั้นลงของ<br />
KS ที่โคลนไดใน<br />
พลาสมิด pATT401 เกิดจากการมีตําแหนงตัดของเอนไซม EcoRI ในชวงตนของปลาย 5’ ของ<br />
ยีน KS (ภาพที่<br />
23)<br />
65
ภาพที่<br />
23 ทิศทางการหาลําดับเบสของพลาสมิด pATT401 และทิศทางของยีน KS<br />
(ก)<br />
M13 Reverse primer<br />
825 bp<br />
EcoRI PstI<br />
1.1 kb<br />
KS pATT401<br />
806 bp<br />
M13 Forword primer<br />
EcoRI<br />
1: GAATTCGACGCCTCCTTCTTCGGGATCTCCCCGCGTGAGGCGCTCGCCATG<br />
1: E F D A S F F G I S P R E A L A M<br />
52: GACCCGCAGCAGCGGCTGCTGCTGGAGTCCTCCTGGGAAGCCTTCGAGCGG<br />
18: D P Q Q R L L L E S S W E A F E R<br />
103: GCCGGCATCGACCCGGCGGCGGTCCGGGGCACCCGGACGGGCATGTTCGTC<br />
35: A G I D P A A V R G T R T G M F V<br />
154: GGGGCGATGCCCCAGGAGTACCGGGTGGGCCCGGACGACGACGTCCAGGGC<br />
52: G A M P Q E Y R V G P D D D V Q G<br />
205: TTCGCCTTGACCGGCACCACCACCAGCGTCATCTCGGGCCGCCTCGCCTAC<br />
69: F A L T G T T T S V I S G R L A Y<br />
256: TTCTTCGGGGCCGTGGGCCCGGCGGTCACCATCGACACCGCCTGCTCCTCC<br />
86: F F G A V G P A V T I D T A C S S<br />
307: TCCCTCGTGGCCCTGCACCTGGCCGCCCACTCGCTGCGCCAGGGCGAGTGC<br />
103: S L V A L H L A A H S L R Q G E C<br />
358: TCCCTCGCGCTGGCCGCCGGTGTGACCGTGATGTCCAGCCCCACCACCTTC<br />
120: S L A L A A G V T V M S S P T T F<br />
409: GTGGAGTTCAGCCGCCAGGGCGGCCTCTCCCCGGACGGGCGCTGCCGCTCC<br />
137: V E F S R Q G G L S P D G R C R S<br />
460: TTCGCGGACTCCGCCAACGGCACCGGCTGGGCCGAGGCGGTCGGCGTCCTG<br />
154: F A D S A N G T G W A E A V G V L<br />
511: GTCCTGGAGCGCCTCTCCGAGGCCCGCCGCAACGGGCACGAGATCCTGGGC<br />
171: V L E R L S E A R R N G H E I L G<br />
562: GTCGTACGGGGCTCCGCCGTCAACCAGGACGGCGCCTCCAACGGCCTGACC<br />
188: V V R G S A V N Q D G A S N G L T<br />
613: GCCCCCAACGGCCCCTCCCAGCAGCGGGTCATCGAACAGGCGCTGGTCAGC<br />
205: A P N G P S Q Q R V I E Q A L V S<br />
664: GCGCGGCTCTCGGCCGACGAGGTCGACGCCGTCAAGGGGCACGGCACCGGC<br />
222: A R L S A D E V D A V K G H G T G<br />
ภาพที่<br />
24 ลําดับเบสและลําดับกรดอะมิโนของโดเมน KS จาก S. rimosus R7 ในพลาสมิด<br />
pATT401<br />
(ก) ลําดับเบสขนาด 1,050 คูเบสและการแปลรหัส<br />
(ข) ลําดับกรดอะมิโนขนาด<br />
350 กรดอะมิโน ตีกรอบ=active-site sequence (*)=active site<br />
*<br />
66
(ข)<br />
ภาพที่<br />
24 (ตอ)<br />
715: ACCACCCTCGGCGACCCGGTCGAGGCGCAGGCGCTGCTGGCGACCTACGGT<br />
239: T T L G D P V E A Q A L L A T Y G<br />
766: CAGGGCCGCGACGCCGACAGCCCCCTCCTGCTGGGCTCCGTCAAGTCGAAC<br />
256: Q G R D A D S P L L L G S V K S N<br />
817: CTCGGCCACACCCAGCCGGCGGCCGGCCTGGCCGGTGTCATCAAGATGGTG<br />
273: L G H T Q P A A G L A G V I K M V<br />
868: CTGGCCATGAAGCACGGCCTGCTCCCGCGCACGCTCCATGTGGACGCGCCG<br />
290: L A M K H G L L P R T L H V D A P<br />
919: TCCTCGCACGTCGACTGGACGCAGGGGGCCGTACGCCTGCTCACCGAGCAG<br />
307: S S H V D W T Q G A V R L L T E Q<br />
970: GTCCCCTGGCCGCAGGGTGAACGGCCGCGCCGGGCCGGCGTCTCCTCGTTC<br />
324: V P W P Q G E R P R R A G V S S F<br />
Primer ATT11 PstI<br />
1021: GGGCTCAGCGGCACCAACGCCCACGTGATCCTGCAG<br />
341: G L S G T N A H V I<br />
1 EFDASFFGISPREALAMDPQQRLLLESSWEAFERAGIDPAAVRGTRTGMF<br />
51 VGAMPQEYRVGPDDDVQGFALTGTTTSVISGRLAYFFGAVGPAVTIDTAC<br />
101 SSSLVALHLAAHSLRQGECSLALAAGVTVMSSPTTFVEFSRQGGLSPDGR<br />
151 CRSFADSANGTGWAEAVGVLVLERLSEARRNGHEILGVVRGSAVNQDGAS<br />
201 NGLTAPNGPSQQRVIEQALVSARLSADEVDAVKGHGTGTTLGDPVEAQAL<br />
251 LATYGQGRDADSPLLLGSVKSNLGHTQPAAGLAGVIKMVLAMKHGLLPRT<br />
301 LHVDAPSSHVDWTQGAVRLLTEQVPWPQGERPRRAGVSSFGLSGTNAHVI<br />
ตารางที่<br />
6 ขอมูล 4 ลําดับแรก ที่ไดจากการเปรียบเทียบลําดับกรดอะมิโนของชิ้นดีเอ็นเอใน<br />
พลาสมิด pATT401 กับฐานขอมูลดวยโปรแกรม BlastP<br />
ลําดับที่<br />
เอนไซม เชื้อ<br />
สารที่สังเคราะห<br />
Accession No. เอกสารอางอิง<br />
Identity<br />
(%)<br />
1 PimS2 S. nat<strong>al</strong>ensis Pimaricin CAC20921 Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000 89<br />
2 FscD Streptomyces sp. FR-008/ AAQ82568 Chen <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003 80<br />
FR-008 Candicidin<br />
3 NysI S. noursei Nystatin AAF71766 Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000 72<br />
4 AmphI S. nodosus Amphotericin AAK73501 Caffrey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001 72<br />
67
401-KS<br />
ภาพที่<br />
25 Phylogen<strong>et</strong>ic tree ที่<br />
bootstrap 1,000 ครั้ง<br />
ของโดเมน KS จากพลาสมิด<br />
pATT401 (401-KS) เปรียบเทียบกับ KS ของทัยโลซิน (TYL), อีรีโธรมัยซิน<br />
(ERY), อะเวอรเมกทิน (AVE), พิมาริซิน (PIM), นัยสตาติน (NYS) และแอมโฟ<br />
เทอริซิน (AMP)<br />
ตัวเลขทาย=ลําดับโมดุล<br />
2.3 การตรวจสอบยีน Type I PKS ดวย Southern Blot Hybridization<br />
ตัดโครโมโซมของ S. rimosus R7 ใหสมบูรณดวยเอนไซมตัดจําเพาะ BamHI,<br />
EcoRI, KpnI และ PstI (ภาพที่<br />
26 ก) แลวนําไปทํา Southern blot hybridisation ดวยโพรบของ<br />
ยีน KS จากพลาสมิด pATT401 เมื่อใชอุณหภูมิ<br />
hybridise ที่<br />
65 องศาเซลเซียส ตรวจสอบพบ<br />
แถบดีเอ็นเอขนาดตางๆ กัน ตั้งแตขนาดประมาณ<br />
4 กิโลเบส จนถึงมากกวา 12 กิโลเบส (ภาพที่<br />
26 ข) และเมื่อใชอุณหภูมิ<br />
hybridise ที่<br />
68 องศาเซลเซียส ตรวจสอบพบแถบดีเอ็นเอที่จําเพาะ<br />
มากขึ้น<br />
คือ เมื่อตัดดวย<br />
BamHI ไดขนาดมากกวา 12 กิโลเบส ตัดดวย EcoRI ไดขนาดมากกวา<br />
12 กิโลเบส ตัดดวย KpnI ไดขนาด 4 และมากกวา 12 กิโลเบส และตัดดวย PstI ไดขนาด<br />
มากกวา 12 กิโลเบส (ภาพที่<br />
26 ค)<br />
68
(ก)<br />
12 kb<br />
5 kb<br />
4 kb<br />
3 kb<br />
1.6 kb<br />
1 kb<br />
M 1 2 3 4 5<br />
ภาพที่<br />
26 การทํา Southern blot hybridisation ของโครโมโซมของ S. rimosus R7 ดวยโพรบ<br />
KS จากพลาสมิด pATT401<br />
(ก) อะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส (ข) และ (ค) Southern hybridization เมื่อใช<br />
อุณหภูมิ hybridise ที่<br />
65 และ 68 องศาเซลเซียส ตามลําดับ M=1 kb ladder<br />
แถวที่<br />
1-4 = โครโมโซมที่ตัดดวยเอนไซม<br />
BamHI, EcoRI, KpnI และ PstI<br />
ตามลําดับ แถวที่<br />
5 = KS-R7 จากพีซีอาร<br />
(ข)<br />
(ค)<br />
1.3 kb<br />
M 1 2 3 4 5<br />
M 1 2 3 4 5<br />
>12 kb<br />
4 kb<br />
1.3 kb<br />
4 kb<br />
1.3 kb<br />
69<br />
>12 kb
2.4 การโคลนยีน Type I PKS จาก S. rimosus R7<br />
จากผลการตรวจสอบยีน Type I PKS ในโครโมโซมของ S. rimosus R7 (ภาพที่<br />
26 ข และ ค) จึงเลือกชิ้นดีเอ็นเอที่จะโคลนจํานวน<br />
3 ชิ้น<br />
ไดแก ชิ้นดีเอ็นเอขนาดประมาณ<br />
3.7<br />
กิโลเบส และขนาดมากกวา 12 กิโลเบส ที่ตัดโดยเอนไซม<br />
KpnI และชิ้นดีเอ็นเอขนาดมากกวา<br />
12 กิโลเบส ที่ตัดโดยเอนไซม<br />
PstI โดยนําดีเอ็นเอของ S. rimosus R7 มาตัดดวยเอนไซม<br />
ดังกลาว แลวแยกขนาดดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส ตัดเอาเจลบริเวณที่คาดวามีชิ้นดีเอ็น<br />
เอที่ตองการไปสกัดดีเอ็นเอ<br />
นําดีเอ็นเอที่สกัดไดไปทํา<br />
dot blot hybridisation กับโพรบ KS<br />
จากพลาสมิด pATT401 เพื่อยืนยันวามีชิ้นดีเอ็นเอดังกลาวอยู<br />
จากผลการทดลองแสดงวาการ<br />
สกัดดีเอ็นเอจากเจลไดชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการ<br />
ซึ่งมีขนาดประมาณ<br />
3.7 กิโลเบส ที่ตัดโดยเอนไซม<br />
KpnI และชิ้นดีเอ็นเอขนาดมากกวา<br />
12 กิโลเบส ที่ตัดโดยเอนไซม<br />
PstI (ภาพที่<br />
27 ก และ ข)<br />
(ก)<br />
1 2 3 4<br />
10 kb<br />
4 kb<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
(ข) M 2 3 4 5 6<br />
>12 kb<br />
3.7 kb<br />
ภาพที่<br />
27 การตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอของ<br />
S. rimosus R7 ที่สกัดจากเจล<br />
(ก) dot blot hybridisation ดวยโพรบ KS จากพลาสมิด pATT401 (ข) อะกาโรส<br />
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส M=1 kb ladder 1=pATT401 2 และ 3=ชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
3.7 และมากกวา 12 กิโลเบสจากการตัดดวย KpnI 4=ชิ้นดีเอ็นเอขนาดมากกวา<br />
12 กิโลเบสจากการตัดดวย PstI<br />
70
เมื่อนําชิ้นดีเอ็นเอที่สกัดไดทั้ง<br />
2 ชิ้นไปเชื่อมกับพลาสมิด<br />
pUC18 ที่ตัดดวย<br />
เอนไซมชนิดเดียวกัน แลวทรานสฟอรมเขาสู<br />
E. coli JM109 คัดเลือกโคลนไปทํา colony dot<br />
blot hybridisation ดวยโพรบ KS จากพลาสมิด pATT401 (ภาพที่<br />
28 ก) สุมเลือกโคลนที่<br />
ใหผลเปนบวก จํานวน 28 โคลน ไปตรวจสอบอีกครั้งดวยการทําพีซีอารโดยตรงจากเซลล<br />
โดยใช<br />
ไพรเมอรจําเพาะตอ KS คัดเลือกโคลนที่ใหผลิตภัณทพีซีอารขนาด<br />
1.3 กิโลเบส จํานวน 16<br />
โคลน (ภาพที่<br />
28 ข โคลนที่มีเครื่องหมาย<br />
*) นําไปสกัดพลาสมิดและทํา Southern blot<br />
hybridisation โดยการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ KpnI หรือ PstI ตามความเหมาะสม และ<br />
ตรวจสอบดวยโพรบ KS จากพลาสมิด pATT401 (ภาพที่<br />
29) ผลของ Southern blot แสดงวา<br />
สามารถโคลนยีน Type I PKS ได 2 ชิ้น<br />
ไดแก ชิ้นดีเอ็นเอขนาดประมาณ<br />
3.7 กิโลเบส จากการ<br />
ตัดดวยเอนไซม KpnI ใหชื่อพลาสมิดวา<br />
pATT403 (ภาพที่<br />
29 แถวที่<br />
2) และชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
มากกวา 12 กิโลเบส จากการตัดดวยเอนไซม PstI ใหชื่อ<br />
พลาสมิดวา pATT404 (ภาพที่<br />
29<br />
แถวที่<br />
17) โดยจะเลือกใชพลาสมิด pATT403 ในการศึกษาตอไป<br />
71
(ก)<br />
+ -<br />
(ข)<br />
M 1 2 3 * 4 * * 5 * 6 * 7 * 8 9 10 11 12 13 14 * 15 * 16 * M 17 * 18 * 19 20 * 21 22 23 24 * 25 * 26 * 27 * 28 29 30<br />
ภาพที่<br />
28 การตรวจสอบโคลนของยีน Type I PKS โดย colony dot blot hybridisation<br />
และพีซีอาร<br />
(ก) Colony dot blot hybridisation ดวยโพรบ KS จาก pATT401<br />
และ = โคลนของชิ<br />
1.3 kb<br />
้นดีเอ็นเอขนาด 3.7 กิโลเบสจากการตัดดวยเอนไซม KpnI<br />
และ = โคลนของชิ้นดีเอ็นเอขนาดมากกวา<br />
12 กิโลเบสตัดดวยเอนไซม PstI<br />
และ = โคลนที่คาดวามียีน<br />
Type I PKS<br />
(+) = E. coli (pATT401), (−) = E. coli (pUC18)<br />
(ข) อะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสของผลิตภัณฑพีซีอาร โดยตรงจากเซลลของ E.<br />
coli ดวยไพรเมอร ATT10 และ ATT11 M=1 kb ladder แถวที่<br />
1-13 = โคลน<br />
ของชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
3.7 กิโลเบสจากการตัดดวยเอนไซม KpnI แถวที่<br />
14-28 =<br />
โคลนของชิ้นดีเอ็นเอขนาดมากกวา<br />
12 กิโลเบสจากการตัดดวยเอนไซม PstI แถวที่<br />
29 = ดีเอ็นเอ S. rimosus R7 แถวที่<br />
30 = pUC18 (*) = โคลนที่คาดวามียีน<br />
Type I PKS<br />
72
10 kb<br />
4 kb<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
(ก) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17<br />
(ข)<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17<br />
>12 kb<br />
3.7 kb<br />
2.7 kb<br />
>12 kb<br />
3.7 kb<br />
ภาพที่<br />
29 การตรวจสอบโคลนของยีน Type I PKS ดวย Southern blot hybridisation<br />
(ก) การตัดของเอนไซมตัดจําเพาะของพลาสมิดบนอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
(ข) Southern hybridisation ดวยโพรบ KS จาก pATT401 M=1 kb ladder<br />
แถวที่<br />
1-7=โคลนของชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
3.7 กิโลเบส ตัดดวยเอนไซม KpnI แถวที่<br />
8-17=โคลนของชิ้นดีเอ็นเอขนาดมากกวา<br />
12 กิโลเบส ตัดดวยเอนไซม PstI แถว<br />
ที่<br />
2 = pATT403 แถวที่<br />
17 = pATT404<br />
73
2.5 การวิเคราะหพลาสมิด pATT403 โดยการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
นําพลาสมิด pATT403 ไปตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ 12 ชนิด ไดแก BamHI,<br />
BglII, DraI, EcoRI, EcoRV, KpnI, MluI, NcoI, PstI, SacI, S<strong>al</strong>I และ SphI ซึ่งบางเอนไซมมี<br />
ตําแหนงตัด 1 ตําแหนง บน multiple cloning site ของพลาสมิด pUC18 คือ BamHI, EcoRI,<br />
KpnI, PstI, SacI, S<strong>al</strong>I สวน SphI และ DraI มีตําแหนงตัด 3 ตําแหนง บนพลาสมิด จากการ<br />
แยกขนาดโดยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส แสดงวาเอนไซม BglII, DraI, EcoRI, EcoRV,<br />
MluI, PstI และ SphI ไมมีตําแหนงตัดบนชิ้นดีเอ็นเอ<br />
(ภาพที่<br />
30 แถวที่<br />
3-7, 9 และ 12)<br />
เอนไซม BamHI ใหแถบดีเอ็นเอ 2 แถบ ขนาด 1 และ 5.4 กิโลเบส แสดงวามีตําแหนงตัดบน<br />
ชิ้นดีเอ็นเอ<br />
1 ตําแหนง (ภาพที่<br />
30 แถวที่<br />
2) เอนไซม NcoI ใหแถบดีเอ็นเอ 4 แถบ ขนาด<br />
0.1, 0.5, 1.7 และ 4.1 กิโลเบส แสดงวามีตําแหนงตัดบนชิ้นดีเอ็นเอ<br />
4 ตําแหนง (ภาพที่<br />
30<br />
แถวที่<br />
8) เอนไซม SacI ใหแถบดีเอ็นเอ 3 แถบ ขนาด 0.4, 2.7 และ 3.3 กิโลเบส แสดงวามี<br />
ตําแหนงตัดบนชิ้นดีเอ็นเอ<br />
2 ตําแหนง (ภาพที่<br />
30 แถวที่<br />
10) เอนไซม S<strong>al</strong>I ใหแถบดีเอ็นเอ 5<br />
แถบ ขนาด 0.4, 0.6 (2 แถบ), 1.6 และ 3.0 กิโลเบส แสดงวามีตําแหนงตัดบนชิ้นดีเอ็นเอ<br />
4<br />
ตําแหนง (ภาพที่<br />
30 แถวที่<br />
11)<br />
2.6 การ subclone พลาสมิด pATT403<br />
จากผลการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะของพลาสมิด pATT403 ในขอ 2.5 จึง<br />
เลือกใชเอนไซม NcoI ในการ subclone โดยชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
0.5 และ 1.7 กิโลเบส โคลนเขา<br />
สูพลาสมิด<br />
Litmus28 ที่ตัดดวยเอนไซมเดียวกัน<br />
ใน E. coli JM109 ไดพลาสมิด pATT407<br />
และ pATT406 ตามลําดับ (ตรวจสอบโคลนในภาพที่<br />
31)<br />
นําพลาสมิด pATT406 มาตัดดวยเอนไซม S<strong>al</strong>I ไดชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
0.6 และ<br />
3.9 กิโลเบส เชื่อมชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
3.9 กิโลเบส ซึ่งมีพลาสมิด<br />
Litmus28 อยู<br />
ตอกับตัวเอง ให<br />
ชื่อพลาสมิดวา<br />
pATT418 สวนชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
0.6 กิโลเบส โคลนเขาสูพลาสมิด<br />
pUC18 ให<br />
ชื่อวา<br />
pATT419 (ตรวจสอบโคลนในภาพที่<br />
32)<br />
นําพลาสมิด pATT403 มาตัดดวยเอนไซม KpnI และ NcoI โคลนชิ้นดีเอ็นเอ<br />
ขนาด 0.8 กิโลเบส เขาสูพลาสมิด<br />
Litmus28 ใหชื่อพลาสมิดวา<br />
pATT420 (ตรวจสอบโคลนใน<br />
ภาพที่<br />
33)<br />
74
10 kb<br />
6<br />
4<br />
kb<br />
kb<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
1 kb<br />
0.5 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12<br />
6.4 kb<br />
5.4 kb<br />
4.1 kb<br />
3.3 kb<br />
3.0 kb<br />
2.7 kb<br />
1.7 kb<br />
1.0 kb<br />
0.6 kb<br />
0.5 kb<br />
0.4 kb<br />
0.1 kb<br />
ภาพที่<br />
30 การตัดพลาสมิด pATT403 ดวยเอนไซมตัดจําเพาะ 12 ชนิด<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT403 แถวที่<br />
2=BamHI แถวที่<br />
3=BglII แถวที่<br />
4=<br />
DraI แถวที่<br />
5=EcoRI แถวที่<br />
6=EcoRV แถวที่<br />
7=MluI แถวที่<br />
8=NcoI แถวที่<br />
9=PstI แถวที่<br />
10=SacI แถวที่<br />
11=S<strong>al</strong>I แถวที่<br />
12=SphI<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
1 kb<br />
0.5 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
2.7 kb<br />
1.7 kb<br />
0.5 kb<br />
ภาพที่<br />
31 การตรวจสอบโคลนของพลาสมิด pATT406 และ pATT407 ดวยอะกาโรส<br />
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1= pATT403 แถวที่<br />
2= pATT403/NcoI แถวที่<br />
3= ชิ้น<br />
ดีเอ็นเอขนาด 1.7 กิโลเบส ที่สกัดจากเจล<br />
แถวที่<br />
4= ชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
0.5 กิโลเบส<br />
ที่สกัดจากเจล<br />
แถวที่<br />
5= Litmus28/NcoI/CIAP แถวที่<br />
6= pATT406 แถวที่<br />
7= pATT406/NcoI แถวที่<br />
8= pATT407 แถวที่<br />
9= pATT407/NcoI<br />
75
3 kb<br />
2 kb<br />
1 kb<br />
0.5 kb<br />
ภาพที่<br />
32 การตรวจสอบโคลนของพลาสมิด pATT418 และ pATT419 ดวยอะกาโรส<br />
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1= pATT406 แถวที่<br />
2=pATT406/S<strong>al</strong>I แถวที่<br />
3=ชิ้นดี<br />
เอ็นเอขนาด 0.6 กิโลเบส ที่สกัดจากเจล<br />
แถวที่<br />
4=ชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
3.9 กิโลเบสที่<br />
สกัดจากเจล แถวที่<br />
5=pUC18/S<strong>al</strong>I/CIAP แถวที่<br />
6=pATT418 แถวที่<br />
7=<br />
pATT418/S<strong>al</strong>I แถวที่<br />
8=pATT419 แถวที่<br />
9=pATT419/S<strong>al</strong>I<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
1 kb<br />
0.5 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
2.8 kb<br />
0.8 kb<br />
3.9 kb<br />
2.7 kb<br />
0.6 kb<br />
ภาพที่<br />
33 การตรวจสอบโคลนของพลาสมิด pATT420 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT403 แถวที่<br />
2=pATT403/KpnI/NcoI แถวที่<br />
3=<br />
ชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
0.8 กิโลเบส ที่สกัดจากเจล<br />
แถวที่<br />
4=Litmus28/KpnI/NcoI<br />
แถวที่<br />
5=pATT420 แถวที่<br />
6=pATT420/KpnI/NcoI<br />
76
3. การวิเคราะหลําดับเบสของยีน Type I PKS จาก S. rimosus R7<br />
3.1 การหาลําดับเบสและวิเคราะหลําดับเบสของพลาสมิด pATT403 และ subclone<br />
หาลําดับเบสของพลาสมิด pATT403 โดยใชไพรเมอร M13 Reverse ไดลําดับ<br />
เบสยาว 777 คูเบส<br />
แปลรหัสเปนกรดอะมิโนได 259 กรดอะมิโน เมื่อนําไปเปรียบเทียบกับ<br />
ฐานขอมูล โดยใชโปรแกรม BlastP (24 กุมภาพันธ 2547) พบวามี conserved domain อยู<br />
2<br />
บริเวณ คือ ฟอสโฟแพนทีธีอินที่บริเวณตอนกลาง<br />
และสวน N-termin<strong>al</strong> ของ KS บริเวณปลาย<br />
C-termin<strong>al</strong> ของลําดับกรดอะมิโน และพบวามีความคลายคลึงกับกลุมยีน<br />
Type I PKS ใน<br />
ฐานขอมูล (ตารางที่<br />
7) โดยกลุมยีนที่ใหคาความเหมือนมากจะเกี่ยวของกับการสังเคราะหสารโพ<br />
ลีอีน เชน พิมาริซิน จาก S. nat<strong>al</strong>ensis (Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000) ซึ่งใหคาความเหมือนสูงที่สุด<br />
ที่<br />
68 เปอรเซ็นต แคนดิซิดินจาก Streptomyces sp. FR-008 (Chen <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003) แอมโฟ เท<br />
อริซินจาก S. nodosus (Caffrey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001) และนัยสตาติน จาก S. noursei (Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 2000) และจากการวิเคราะหพบวาบริเวณตอนกลางของลําดับกรดอะมิโนมีความเหมือนกับ<br />
โดเมน ACP และดาน C-termin<strong>al</strong> มีความเหมือนกับสวนตนของโดเมน KS สอดคลองกับ<br />
conserved domain ที่ตรวจสอบพบโดยโปรแกรม<br />
BlastP แสดงวา pATT403 มียีน Type I PKS<br />
จึงทําการหาลําดับเบส โดยใชไพรเมอร M13 Forword และ Reverse สําหรับพลาสมิด<br />
pATT403 และ subclone ตางๆ ดังแสดงในตารางที่<br />
8<br />
ตารางที่<br />
7 ขอมูล 4 ลําดับแรก ที่ไดจากการเปรียบเทียบลําดับกรดอะมิโนของชิ้นดีเอ็นเอใน<br />
พลาสมิด pATT403 ทางดานไพรเมอร M13 Reverse กับฐานขอมูลดวยโปรแกรม<br />
BlastP<br />
่<br />
ลําดับ<br />
ที<br />
เอนไซม เชื้อ<br />
สารที่สังเคราะห<br />
Accession No. เอกสารอางอิง Identity (%)<br />
1 PimS2 S. nat<strong>al</strong>ensis Pimaricin CAC20921 Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000 68<br />
2 FscD Streptomyces sp. FR-008/ AAQ82568 Chen <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003 60<br />
FR-008 Candicidin<br />
3 AmphI S. nodosus Amphotericin AAK73501 Caffrey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001 54<br />
4 NysI S. noursei Nystatin AAF71766 Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000 54<br />
77
ตารางที่<br />
8 การหาลําดับเบสของพลาสมิด pATT403 และ subclone<br />
พลาสมิด ไพรเมอร ความยาวของลําดับเบส (คูเบส)<br />
กรดอะมิโน<br />
pATT403<br />
M13 Forword<br />
M13 Reverse<br />
653<br />
777<br />
217<br />
259<br />
pATT406<br />
M13 Forword<br />
M13 Reverse<br />
706<br />
744<br />
234<br />
247<br />
pATT407 M13 Forword 444 147<br />
pATT418 M13 Forword 322 104<br />
pATT419 M13 Forword 621 207<br />
pATT420 M13 Reverse 550 182<br />
3.2 การสรางแผนที่ยีนของพลาสมิด<br />
pATT403<br />
ผลจากการวิเคราะหตําแหนงตัดของเอนไซมตัดจําเพาะของชิ้นดีเอ็นเอในขอ<br />
2.5 รวมกับการวิเคราะหตําแหนงตัดจดจําของเอนไซมตัดจําเพาะในลําดับเบส และการวิเคราะห<br />
ตําแหนงยีนบนลําดับอะมิโนในขอ 3.1 สามารถนําไปสรางแผนที่การตัดของเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
และนําไปเปนแนวทางในการเชื่อมตอลําดับเบสจากพลาสมิดตางๆ<br />
เขาดวยกัน ทําใหสามารถ<br />
สรางแผนที่ยีนของชิ้นดีเอ็นเอในพลาสมิด<br />
pATT403 ไดดังภาพที่<br />
34<br />
จากการเชื่อมตอลําดับเบสทั้งหมดเขาดวยกัน<br />
ทําใหไดลําดับเบสของชิ้นดีเอ็นเอ<br />
บนพลาสมิด pATT403 ซึ่งที่มีความยาวทั้งหมด<br />
3,692 คูเบส<br />
มีปริมาณ G+C เปน 75.2%<br />
แปลรหัสเปนกรดอะมิโนไดยาว 1,231 กรดอะมิโน (ภาพที่<br />
35) พบวาลําดับกรดอะมิโน<br />
ประกอบไปดวย 3 โดเมน คือ โดเมน ACP (กรดอะมิโนที่<br />
71-142) โดเมน KS (กรดอะมิโนที่<br />
165-579) และโดเมน AT (กรดอะมิโนที่<br />
691-1007) โดยทั้ง<br />
3 โดเมน มีลําดับกรดอะมิโน<br />
ครอบคลุมครบทั้งโดเมน<br />
78
ACP KS AT<br />
ภาพที่<br />
34 แผนที่ยีนของโคลน<br />
pATT403 ขนาด 3.7 กิโลเบส<br />
ลูกศรโปรงแสดงทิศทางของยีน Type I PKS (โดเมน ACP, KS, AT)<br />
ลูกศรเล็กแสดงทิศทางการหาลําดับเบส<br />
K=KpnI, S=S<strong>al</strong>I, Sc=SacI, N=NcoI และ B=BamHI<br />
79
1: GGTACCGACGCGGCCTCGGTGACGGTCGCCGACGTACGGTGGGACCGGTTC<br />
1: G T D A A S V T V A D V R W D R F<br />
52: GCGCCGGCCTTCACCCGCAACCGGCGCGGCGCCCTGTTCACCGACCTGCCC<br />
18: A P A F T R N R R G A L F T D L P<br />
103: GAGGCCAGGGCCGCACTCGCGGAACCCGGGAACGCCGGGCAGGGCACCGCG<br />
35: E A R A A L A E P G N A G Q G T A<br />
154: ACCGGACTCGGGGCCCGGCTCGCCGGCCGACCGGCCGCCGAGCAGACCGAG<br />
52: T G L G A R L A G R P A A E Q T E<br />
205: GCGCTGCTGACCCTGATCCGCGGCGAGGTGGCCACGGTGCTCGGCTTCGCC<br />
69: A L L T L I R G E V A T V L G F A<br />
*<br />
KpnI1 pATT403r<br />
Acyl carrier protein (ACP)<br />
256: GACGCCGACGCCGTCCCGTCCGGACCCGCCTTCAAGGACCTCGGCTTCGAC<br />
86: D A D A V P S G P A F K D L G F D<br />
S<strong>al</strong>I2<br />
307: TCGCTGACCGCCGTCGACCTGCGCAACCAGCTCGCCACGGCGACCGGCCTG<br />
103: S L T A V D L R N Q L A T A T G L<br />
358: TCCCTGCCCGCCACCCTCGTCTTCGACTACCCGACGGCGGAGGCGCTGGCC<br />
120: S L P A T L V F D Y P T A E A L A<br />
S<strong>al</strong>I6<br />
SacI3<br />
409: GGGCACCTGCGGACCGAGCTCTTCGGCGAGGACGGCGACGCGCTGCCCGCC<br />
137: G H L R T E L F G E D G D A L P A<br />
460: GTCGGAGCGGTACGGGCGCGGGGCGCGGCCGACGACCCGGTCGTCATCGTC<br />
154: V G A V R A R G A A D D P V V I V<br />
511: GGCATGAGCTGCCGCTACCCGGGCGGGGTCCGCTCGCCCGAGGACCTGTGG<br />
171: G M S C R Y P G G V R S P E D L W<br />
NcoI4 pATT406f<br />
562: CAGCTGGCCATGGGCGAGGTGGACGCCATCGGCGGCTTCCCCGTGGACCGT<br />
188: Q L A M G E V D A I G G F P V D R<br />
613: GGCTGGGACCTGGAGACGCTGCTGAACGGCGACCGGGACGGCCGCGGCCGG<br />
205: G W D L E T L L N G D R D G R G R<br />
664: ACCGCCGTCCGCGAAGGCGGCTTCCTCTACGACGTGGCCGACTTCGACCCG<br />
222: T A V R E G G F L Y D V A D F D P<br />
715: GGGTTCTTCGGGATCGCGCCGCGCGAGGCCATGGTGATGGACCCGCAGCAG<br />
239: G F F G I A P R E A M V M D P Q Q<br />
766: CGCATCCTGCTGGAAGCATCCTGGGAGGCGCTGGAGCGGGCGGGCATCGAC<br />
256: R I L L E A S W E A L E R A G I D<br />
817: CCGGCCGGGCTGCGCGGCGGTGACACCGGCGTGTTCATCGGCGGCGGCTCG<br />
273: P A G L R G G D T G V F I G G G S<br />
868: GGCGACTACCGGCCCGAGGCGGGCCAGCTGGGCCACGCCCAGACCGCGCAG<br />
290: G D Y R P E A G Q L G H A Q T A Q<br />
919: TCGGCCAGCCTGCTGTCCGGCCGGGTGGCCTACCACTTCGGCCTGGAAGGC<br />
307: S A S L L S G R V A Y H F G L E G<br />
971: CCGACCGTCAGCGTCGACACGGCCTGCTCGTCGTCCCTGGTGGCGCTCCAC<br />
324: P T V S V D T A C S S S L V A L H<br />
ภาพที่<br />
35 ลําดับเบสและลําดับกรดอะมิโนของโคลน pATT403<br />
ประกอบดวยยีน Type I PKS ของ S. rimosus R7 จํานวน 3 โดเมน (ACP, KS,<br />
AT) กรดอะมิโนตัวหนา=โดเมน อักษรตัวหนาและขีดเสนใต=ตําแหนงตัดของ<br />
เอนไซมตัดจําเพาะ ตีกรอบ=active-site sequence (*)=active site ลูกศรแสดง<br />
ทิศทางการหาลําดับเบส<br />
*<br />
NcoI5<br />
K<strong>et</strong>o-acyl synthase (KS)<br />
80
ภาพที่<br />
35 (ตอ)<br />
1021: CTGGCCGCCCAGGCGCTGCGCAACGGCGAGTGCTCCGTCGCGCTCACCGGC<br />
341: L A A Q A L R N G E C S V A L T G<br />
1072: GGTGTGACGGTGATGTCCAGCCCGGTGAACTTCGTCGAGTTCGGCGAGATG<br />
358: G V T V M S S P V N F V E F G E M<br />
1123: GGCGCCCTCGCGCCCGACGGCCGCTGCCGGGCCTTCGCCGACTCCGCGAGC<br />
375: G A L A P D G R C R A F A D S A S<br />
1174: GGCACCGGCTGGTCCGAGGGTGTGGGCGTCCTCGTACTGGAGCGCCTCTCG<br />
392: G T G W S E G V G V L V L E R L S<br />
1225: GACGCCCGCCGCAACGGCCACGAGATCCTGGCCGTACTGCGCGGCTCGGCG<br />
409: D A R R N G H E I L A V L R G S A<br />
1276: ATCAACCAGGACGGCGCCAGCAACGGCATCACCGCGCCCAACGGCCCCTCG<br />
426: I N Q D G A S N G I T A P N G P S<br />
1327: CAGCGCCGTGTCATCCGCCGGGCCCTGGCCGACGCCGGGCTTGCGCCGGGC<br />
443: Q R R V I R R A L A D A G L A P G<br />
1378: GACGTGGACGCGGTGGAGGCGCACGGCACCGGCACCACCCTGGGCGACCCC<br />
460: D V D A V E A H G T G T T L G D P<br />
1429: ATCGAGGCGCAGGCGCTGCTGGCCACGTACGGGCAGGAGCGTGAACTGCCG<br />
477: I E A Q A L L A T Y G Q E R E L P<br />
1480: CTGTACCTCGGGTCGTTGAAGTCCAACATCGGCCACACCCAGGCCGCCGCC<br />
494: L Y L G S L K S N I G H T Q A A A<br />
1531: GGTGTTGCCGGCGTGATCAAGATGGTGCAGGCCATGCGGCACGGCGTGCTG<br />
511: G V A G V I K M V Q A M R H G V L<br />
pATT419f S<strong>al</strong>I7 pATT418f<br />
1582: CCCAGGACCCTGCACGTCGACGCGCCGTCGGCGCACGTGGACTGGGACTCC<br />
528: P R T L H V D A P S A H V D W D S<br />
1633: GGCGCCGTCGAGCTGCTGACGGAGGCGGCCGACTGGCCGCGTACGGACCAC<br />
545: G A V E L L T E A A D W P R T D H<br />
1684: CCCCGGCGCGCCGGCATCTCGGCCTTCGGCGCCAGCGGCACCAACTCCCAC<br />
562: P R R A G I S A F G A S G T N S H<br />
1735: GTGATCATCGAGCAGTTCGAGCAGCCCGAACCGGCGGTCACCACCGAACCG<br />
579: V I I E Q F E Q P E P A V T T E P<br />
1786: GTGGAGGCCCACGGCCCGCTGCCGGTGCCCGTGTCGGCCGCCGCGCCGCAG<br />
596: V E A H G P L P V P V S A A A P Q<br />
1837: GCACTGCGGGCCCAGGCCCGGCAGCTGCACTCCTACGTGACCGCCCGGCCC<br />
613: A L R A Q A R Q L H S Y V T A R P<br />
1888: GGACTCGGCACCGCCGACCTGGCCCGCGCGCTGGCCACCACCCGCTCGGTC<br />
630: G L G T A D L A R A L A T T R S V<br />
1939: TTCACCCACCGCGCCGCCGTCCTCGCGGGCGACCGCGACCGACTGCTGGCC<br />
647: F T H R A A V L A G D R D R L L A<br />
1990: GGCCTGGCCGCGCTCGCCGACGGCCGCACCGCACCCCAGGTCGTACAGGGT<br />
664: G L A A L A D G R T A P Q V V Q G<br />
2041: GAGGCGGCGGCCCGCCGCGGCAAGCTCGCGGTGCTGTTCTCCGGCCAGGGC<br />
681: E A A A R R G K L A V L F S G Q G<br />
Acyl transferase (AT)<br />
2092: ACCCAGCGCCTGGGCATGGGACGGGAGCTGTACGCCCGCTTCCCGGCGTTC<br />
698: T Q R L G M G R E L Y A R F P A F<br />
2143: GCCGCGGCCTTCGACGCGGTGACCGCGCACCTGGACACCGAACTGGACCGC<br />
715: A A A F D A V T A H L D T E L D R<br />
81
ภาพที่<br />
35 (ตอ)<br />
2194: CCCCTGCGGGACGTGCTGTCCGAGGACGCGGAGCGGCTGAACGAGACCGGC<br />
732: P L R D V L S E D A E R L N E T G<br />
2245: TACACCCAGCCCGCGCTGTTCGCCATCGAGGTGGCGCTGTTCCGCCTGGTG<br />
749: Y T Q P A L F A I E V A L F R L V<br />
2296: GAGTCCTGGGGTATCCGCCCGGACTTCGCCGCCGGGCACTCGATCGGCGAG<br />
766: E S W G I R P D F A A G H S I G E<br />
2347: ATCGCGGCCGCGCACGTGGCCGGGGTCTTCTCCCTGGAGGACGCCTGCAAG<br />
783: I A A A H V A G V F S L E D A C K<br />
2398: GTCGTGGCCGCGCGGGCCCGGCTGATGAACGCCCTGCCGTCCGGCGGCGCC<br />
800: V V A A R A R L M N A L P S G G A<br />
2449: ATGGTCGCCGTCCAGGCCACCGAGGAGGAGGTGACGGCCCTGCTGACCGCG<br />
817: M V A V Q A T E E E V T A L L T A<br />
2500: GGAGTGTCGATCGCCGCGGTCAACGGGCCGCGGTCGGTGGTCCTCTCCGGC<br />
834: G V S I A A V N G P R S V V L S G<br />
2551: GACGAGGGCGCCGTCCTGGACATCGCGGACAAACTCACCGCCGACGGGCGC<br />
851: D E G A V L D I A D K L T A D G R<br />
2602: AAGACTAGGCGTTTGCGGGTCAGCCATGCATTTCACTCACTGCACATGGAC<br />
868: K T R R L R V S H A F H S L H M D<br />
2653: GCCATCCTCGACGACTTCCGGCGGGTCACCCGCAGCGTGGACTACCACGCC<br />
885: A I L D D F R R V T R S V D Y H A<br />
2704: CCGCGGATCCCGCTGGTGTCCAACGTCACCGGCGAGGCGGCCACCGAGGAG<br />
902: P R I P L V S N V T G E A A T E E<br />
2755: CAGGTGTGCTCCCCGGACTACTGGGTGCGCCACGTCCGCGAGGCCGTCCGC<br />
919: Q V C S P D Y W V R H V R E A V R<br />
2806: TTCGGCGACGGCATCCGCACCCTCGCCGAGAGCGGCGTGACCGCCTTCCTG<br />
936: F G D G I R T L A E S G V T A F L<br />
SacI10<br />
pATT407f<br />
BamHI9<br />
2857: GAGCTCGGCCCCGACGGCGGGCTGTGCGCCATGGCCCAGGACACCCTGGAC<br />
953: E L G P D G G L C A M A Q D T L D<br />
2908: GCCCTGGCGTCGCGGGCCCTGGCCGTACCGGTCCTGCGCAAGGACCGCGGC<br />
970: A L A S R A L A V P V L R K D R G<br />
2959: GAGCAGGAATCCGCGGTCACCGCCCTCGCCCGGCTGTACGCCGACGGAGCG<br />
987: E Q E S A V T A L A R L Y A D G A<br />
3010: GCCCCGGACTGGGACGCCCTGCTCGCCGGGACGGCCACCGGGCCCCGCCGC<br />
1004: A P D W D A L L A G T A T G P R R<br />
3061: AACGACCTGCCCACCTACCCCTTCCAGCGCCAGCGCTACTGGCCCGCCACC<br />
1021: N D L P T Y P F Q R Q R Y W P A T<br />
3112: CTGCCGGGCGACGCTTCCGCAGCGCCGGAGGGCGCGGACGACGGCTTCTGG<br />
1038: L P G D A S A A P E G A D D G F W<br />
3163: ACGGCGGTGCGCGAGGCCGACTTCGCCTCGCTGGAGACGACGCTGAACGTC<br />
1055: T A V R E A D F A S L E T T L N V<br />
3214: GACGGCGAAGCGCTGGCCAAGGTGCTCCCCGCCCTCGCCGACTGGCGCCGC<br />
1072: D G E A L A K V L P A L A D W R R<br />
S<strong>al</strong>I13<br />
NcoI11<br />
3265: CGGCGCGGCGAGGAGAACACCGTCGACGGCTGGCGGCAGCAGATCACCTGG<br />
1089: R R G E E N T V D G W R Q Q I T W<br />
*<br />
pATT406f NcoI8<br />
S<strong>al</strong>I12<br />
82
ภาพที่<br />
35 (ตอ)<br />
3316: CAGCCGCTGAGTCCGCAGCCCGCCCGCACCCCGGCAGGCACCTGGCTCGCC<br />
1106: Q P L S P Q P A R T P A G T W L A<br />
3367: GTGCTCCCGGCCGGACACGCCGACGACCCCTGGGCCGCCGACGCCGTCACC<br />
1123: V L P A G H A D D P W A A D A V T<br />
3418: GCGCTGGGACCGGACACCGTACGCCTGGAAGTGGCGGACCCCGACCGAGCG<br />
1140: A L G P D T V R L E V A D P D R A<br />
3469: GCGCTCGCCGAACGGCTGCGCGCACTGGCCGCCGACGGGTTCGCGTTCACC<br />
1157: A L A E R L R A L A A D G F A F T<br />
3520: GGAGTGGTGTCCCTGCTGGCCCTCGCCACCACGCCCGCGCCCGGCGCGGAC<br />
1174: G V V S L L A L A T T P A P G A D<br />
3571: GCCCCCGAGGCACTGGCCCTGACCACCGCCCTGATCCAGGCGCTCGGCGAC<br />
1191: A P E A L A L T T A L I Q A L G D<br />
3622: GCGGACCTCGCCGCACCCCTGTGGTGCGTCACCCGCGGCGCGGTCGCCGCC<br />
1208: A D L A A P L W C V T R G A V A A<br />
pATT403f KpnI14<br />
3673: GCGCCCTCCGAGCCGGTACC<br />
1225: A P S E P V P<br />
3.3 การวิเคราะหโดเมนของยีน Type I PKS ที่โคลนได<br />
3.3.1 โดเมน ACP<br />
โดเมน ACP มีความยาว 72 กรดอะมิโน (ภาพที่<br />
35; นิวคลีโอไทดที่<br />
211-426; กรดอะมิโนที่<br />
71-142) จากการทํา multiple <strong>al</strong>ignment เปรียบเทียบกับโดเมน<br />
ACP อื่นที่มีรายงานในฐานขอมูล<br />
จํานวน 179 โดเมน (ตารางที่<br />
9) พบวา ACP ทุกโดเมนมี<br />
ความสัมพันธใกลชิดกัน ไมแบงเปนกลุมยอยที่ชัดเจน<br />
(ไมแสดงผล) ตรวจสอบพบลําดับกรดอะ<br />
มิโน LGFDS (ภาพที ่ 35; กรดอะมิโนที่<br />
99-103) ซึ่งเปน<br />
active-site sequence ของบริเวณ<br />
เขาจับของฟอสโฟแพนทีธีอิน ตรงกันกับ motif คือ LGxDS โดยมี S (serine) เปน active site<br />
(Donadio and Katz, 1992) ดังภาพที่<br />
36<br />
3.3.2 โดเมน KS<br />
โดเมน KS ที่โคลนไดมีทั้งหมด<br />
2 โดเมน โดเมนแรกมาจากการพีซี<br />
อาร (401-KS) เพื่อนําไปใชเปนโพรบตรวจสอบกลุมยีน<br />
Type I PKS มีความยาว 1,050 คูเบส<br />
แปลรหัสไดยาว 350 กรดอะมิโน (ภาพที่<br />
24 ก) อีกโดเมนหนึ่งเปนชิ้นดีเอ็นเอที่โคลนไดจาก<br />
โครโมโซม บน pATT403 (403-KS) มีความยาว 1,245 คูเบส<br />
แปลรหัสไดยาว 415 กรดอะ<br />
มิโน (ภาพที่<br />
35; นิวคลีโอไทดที่<br />
493-1737; กรดอะมิโนที่<br />
165-579) พบวา 401-KS ที่ได<br />
83
ตารางที่<br />
9 กลุมยีน<br />
Type I PKS ที่นํามาใชในการทํา<br />
multiple <strong>al</strong>ignment และ phylogen<strong>et</strong>ic tree<br />
สาร<br />
Erythromycin<br />
Meg<strong>al</strong>omycin<br />
Olendomycin<br />
Pikromycin<br />
Niddamycin<br />
Tylosin<br />
FKB520<br />
Rifamycin<br />
Spinosad<br />
Avermectin<br />
Pimaricin<br />
Rapamycin<br />
Amphotericin<br />
Nystatin<br />
Candicidin/FR008<br />
ตัวยอ<br />
ERY<br />
MEG<br />
OLE<br />
PIK<br />
NID<br />
TYL<br />
FKB<br />
RIF<br />
SPN<br />
AVE<br />
PIM<br />
RAP<br />
AMP<br />
NYS<br />
FSC<br />
จํานวน<br />
โมดุล<br />
6<br />
6<br />
6<br />
6<br />
7<br />
7<br />
10<br />
10<br />
10<br />
12<br />
13<br />
14<br />
18<br />
18<br />
21<br />
KS<br />
6<br />
6<br />
7<br />
7<br />
8<br />
8<br />
10<br />
10<br />
10<br />
12<br />
13<br />
14<br />
19<br />
19<br />
21<br />
จํานวนโดเมน<br />
AT<br />
7<br />
7<br />
7<br />
7<br />
8<br />
8<br />
10<br />
10<br />
11<br />
13<br />
13<br />
14<br />
19<br />
19<br />
21<br />
ACP<br />
7<br />
7<br />
7<br />
7<br />
8<br />
8<br />
11<br />
11<br />
11<br />
13<br />
14<br />
15<br />
19<br />
19<br />
22<br />
เชื้อที่ผลิต<br />
Saccharopolyspora erythraea<br />
Micromonospora meg<strong>al</strong>omicea<br />
Streptomyces antibioticus<br />
Streptomyces venezuelae<br />
Streptomyces caelestis<br />
Streptomyces fradiae<br />
Streptomyces hygroscopicus<br />
Amycolatopsis mediterranei<br />
Saccharopolyspora spinosa<br />
Streptomyces avermitilis<br />
Streptomyces nat<strong>al</strong>ensis<br />
Streptomyces hygroscopicus<br />
Streptomyces nodosus<br />
Streptomyces noursei<br />
Streptomyces sp. FR-008<br />
Accession<br />
Q03131-3<br />
AAG13917–9<br />
Q07017,<br />
AAF82408-9<br />
AAC69329-32<br />
AAC46024-8<br />
AAB66504-8<br />
AAF86392-3, 6<br />
AAC01710-4<br />
AAG23262-6<br />
BAA84474-5, 8-9<br />
CAC20919-21, 30-1<br />
CAA60459-60, 62<br />
AAK73501-3,12-4<br />
AAF71766-8, 74-6<br />
AAQ82561, 4-8<br />
เอกสารอางอิง<br />
Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991<br />
Volchegursky <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
Swan <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1994;<br />
Shah <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
Xue <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1998<br />
Kakavas <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997<br />
DeHoff <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1996<br />
Wu <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
August <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1998<br />
W<strong>al</strong>dron <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001<br />
Ikeda <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1999<br />
Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
Schwecke <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1995<br />
Caffrey <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2001<br />
Brautas<strong>et</strong> <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
Chen <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003<br />
84
ขาดหายไปในสวน N-termin<strong>al</strong> ของโดเมน ประมาณ 70 กรดอะมิโน สวน 403-KS ที่ได<br />
ครอบคลุมทั้งโดเมน<br />
KS<br />
นอกจากนั้นพบวา<br />
ทั้ง<br />
2 โดเมนมีลําดับกรดอะมิโนของ active site<br />
motif สําหรับการเกิดพันธะไธโอเอสเทอร คือ GPxxxxxTACSS ซึ่งมี<br />
C (Cystein) เปน active<br />
site (Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991; Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1996) โดยใน 401-KS มีลําดับเปน<br />
GPAVTIDTACSS (ภาพที่<br />
24; กรดอะมิโนที่<br />
91-102) และ 403-KS มีลําดับเปน<br />
GPTVSVDTACSS (ภาพที่<br />
35; กรดอะมิโนที่<br />
323-334) ดังภาพที่<br />
37<br />
PIM-ACP5 LGAVRSQIAGVLGHAEATEIDQDRAFLDLGFDSLTAVELRNRLGAVTGIRLPATLLFDYP 60<br />
FSC-ACP7 LDLVRGQIAVVLGHSGAQTVNPHRAFQDLGFDSLTAVELRNRLGKVTGLRLPATVVFDYP 60<br />
AMP-ACP8 LTLVRGQAATVLGHRDGSAIGRERQFQELGFDSLTAVEFRNRLNTATGLRLPATLLFDYP 60<br />
OLE-ACP3 VSLVQSEVAAVLGHSSTDAVQPQRAFREIGFDSLTAVQLRNRLTATTGMRLPTTLVFDYP 60<br />
RAP-ACP13 LELVL-ERRSVLGHSSADAIATDTSFKDLGMDSLTAIELRNRLVAETGLQLPATMVFDYP 59<br />
ERY-ACP2 VRLVRTSTATVLGHDDPKAVRATTPFKELGFDSLAAVRLRNLLNAATGLRLPSTLVFDHP 60<br />
RIF-ACP6 VDLVRGQVAVVLGYDGPEAVRPDTAFKDTGFDSLTSVELRNRLREATGLKLPATLVFDYP 60<br />
NID-ACP3 LELVRTEVAAVLGHGDPGAVGAERSFKDAGFDSLTAVDLRNRLNARTGLRLPATLVFDHP 60<br />
TYL-ACP3 TGFVRAQVAAVLGHPTSDTIDVRRSFKEAGFDSLTAVELRNRLRAATGLKLPATLVFDHP 60<br />
FKB-ACP1 LAIVCAATAAVLGHADASEITPTTAFKDLGIDSLSGVRLRNSLAETTGVRLSATAVFDHP 60<br />
SPN-ACP9 LGVVREHAAAVLGYSSAADVGVERAFRDLGFDSLSGVELRNRLAGVLGVRLPATAVFDYP 60<br />
MEG-ACP4 AELVRSHAAAVAGYDSADQLPERKAFKDLGFDSLAAVELRNRLGVTTGVRLPSTLVFDHP 60<br />
PIK-ACP1 LGLVRAQAAAVLRMRSPEDVAADRAFKDIGFDSLAGVELRNRLTRATGLQLPATLVFDHP 60<br />
403-ACP LTLIRGEVATVLGFADADAVPSGPAFKDLGFDSLTAVDLRNQLATATGLSLPATLVFDYP 60<br />
NYS-ACP12 LDLLRTQVAAVLGHADPRTVEDDHAFRDLGFDSLTILELRNALNAATGLSLPATLVYDLP 60<br />
AVE-ACP5 LGLIRTGICTVLGLRNPEGIEDQRAFRDLGFDSLTSAQFSKELAKETGLPLPPSLVFDYP 60<br />
motif LGxDS<br />
ภาพที่<br />
36 Multiple <strong>al</strong>ignment ของโดเมน ACP ในบริเวณ active site<br />
บรรทัดลางแสดง active site motif<br />
AVE-KS1 VEGHILTGTTGSVLSGRIAYSFGLEGPAITVDTGCSA 179<br />
OLE-KS1 SGGYVLTGNTASVASGRIAYSLGLEGPAVTVDTACSS 164<br />
NID-KS2 YGGHLLTGTLASVMSGRVAYTLGLQGPALTVDTACSS 175<br />
FKB-KS6 LDGFGSIGMQPSVLTGRISYFYGLQGPAFTVDTACSS 163<br />
RAP-KS10 LGGFGTTAGAASVLSGRVSYFFGLEGPAFTVDTACSS 170<br />
403-KS QLGHAQTAQSASLLSGRVAYHFGLEGPTVSVDTACSS 170<br />
NYS-KS14 EAGQWQTAQSASLLSGRLAYTFGIQGPTVSVDTACSS 167<br />
401-KS VQGFALTGTTTSVISGRLAYFFGAVGPAVTIDTACSS 102<br />
PIM-KS6 VQGFALTGTTTSVISGRLAYFFGAVGPAVTVDTACSS 163<br />
AMP-KS9 AEGFQLTGNTGSVLSGRISYTFGTVGPAVTVDTACSS 164<br />
SPN-KS9 FEGYLGNGSAGGVFSGRVAYSFGFEGPAVTVDTACSS 176<br />
FSC-KS8 YEGYRGNGSAGSIASGRVSYTFGFEGPAVTVDTACSS 173<br />
PIK-KS4 LEGYVGTGNAASIMSGRVSYTLGLEGPAVTVDTACSS 175<br />
TYL-KS5 FDGYLGTGNSASVMSGRLSYVFGLEGPAVTVDTACSA 175<br />
RIF-KS5 LEGFVTTATAGSVASGRVSYTFGFEGPAVTVDTACSS 175<br />
ERY-KS4 VDGYQGLGNSASVLSGRIAYTFGWEGPALTVDTACSS 175<br />
MEG-KS3 AEGYSVTGVAPAVASGRISYALGLEGPSISVDTACSS 174<br />
motif GPxxxxxTACSS<br />
ภาพที<br />
่ 37 Multiple <strong>al</strong>ignment ของโดเมน KS ในบริเวณ active site<br />
บรรทัดลางแสดง active site motif<br />
85
เมื่อนําไปทํา<br />
multiple <strong>al</strong>ignment รวมกับโดเมน KS ทั้ง<br />
170 โดเมน<br />
ของกลุมยีน<br />
Type I PKS (ตารางที่<br />
9) ทํา clustering แลววาด phylogen<strong>et</strong>ic tree พบวาโดเมน<br />
KS แบงกลุมยอยออกตามชนิดของสารที่ผลิต<br />
และตามขนาดโมเลกุลของสารที่ใกลเคียงกัน<br />
จึง<br />
เลือก KS บางโดเมน มาทํา multiple <strong>al</strong>ignment และ clustering พบวา phylogen<strong>et</strong>ic tree ที่ได<br />
(ภาพที่<br />
38) แสดงการแบงแยกออกจากกันของโดเมน KS เปน 2 กลุมที่ชัดเจน<br />
คือกลุมของมา<br />
โครไลดซึ่งมีโครงสรางเปนวงแลคโตนขนาด<br />
12- ถึง 24-member (มียีน Type I PKS 6-12<br />
โมดุล) กับ กลุมโพลีอีนซึ่งมีโครงสรางเปนวงแหวนแลคโตนขนาดมากกวา<br />
26-member (มียีน<br />
Type I PKS มากกวา 12 โมดุล) แสดงวาโดเมน KS อาจใชระบุขนาดของโครงสรางของวงแลค<br />
โตนได<br />
เมื่อพิจารณาโดเมน<br />
KS ในกลุมโพลีอีน<br />
พบวามีการแบงกลุมยอย<br />
ตามลําดับโมดุล ซึ่งจากการเปรียบเทียบรูปแบบการจัดเรียงตัวของกลุมยีน<br />
Type I PKS ของสาร<br />
โพลีอีน ไดแก นัยสตาติน (NYS), แอมโฟเทอริซิน (AMP), แคนดิซิดิน (FSC) และ พิมาริซิน<br />
(PIM) ดังภาพที่<br />
39 แสดงใหเห็นวา การแบงกลุมยอยตามลําดับโมดุลนี้เกิดอยางเห็นไดชัด<br />
เฉพาะใน ORF ที่<br />
4 ของ NYS, AMP และ FSC และ ORF ที่<br />
3 ของ PIM โดย ORF นี้<br />
เกี่ยวของกับการสังเคราะหสวน<br />
exocyclic carboxyl group และ hemik<strong>et</strong><strong>al</strong> ring ของสารโพลีอี<br />
นทุกชนิด (ภาพที่<br />
40) (Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2003) ตัวอยางกลุมยอย<br />
ไดแก กลุมยอยของ<br />
AMP-<br />
KS12, NYS-KS12, FSC-KS14 และ PIM-KS9 เปนตน (ภาพที่<br />
38) นอกจากนั้นยั้งพบวา<br />
403-KS แบงกลุมยอยไปอยูรวมกับ<br />
AMP-KS14, NYS-KS14, FSC-KS16 และ PIM-<br />
KS11 ซึ่งเปน<br />
KS ในโมดุลสุดทายของ ORF และ 401-KS แบงกลุมยอยไปอยูรวมกับ<br />
AMP-<br />
KS9, NYS-KS9, FSC-KS11 และ PIM-KS6 ซึ่งเปน<br />
KS โมดุลแรกของ ORF คาดวา 403-<br />
KS และ 401-KS นาจะเกี่ยวของกับการสังเคราะหโครงสรางสวน<br />
exocyclic carboxyl group<br />
และ hemik<strong>et</strong><strong>al</strong> ring ของไรโมซิดิน จากการวิเคราะหนี้ยังแสดงใหเห็นวา<br />
403-KS และ 401-<br />
KS เปน KS ตางโดเมนกันและอยูคนละโมดุล<br />
86
403-KS<br />
401-KS<br />
Macrolide<br />
Polyene<br />
ภาพที่<br />
38 Phylogen<strong>et</strong>ic tree ที่คา<br />
bootstrap 1,000 ครั้ง<br />
ของโดเมน KS ของ S. rimosus R7<br />
ที่ใชเปนโพรบ<br />
(401-KS) และที่โคลนได<br />
(403-KS) เปรียบเทียบกับ KS ของสาร<br />
มาโครไลดและโพลีอีน<br />
กรอบเสนประ=กลุมยอยของ<br />
KS ตัวเลขขางทาย KS=ลําดับโมดุล<br />
87
NYS<br />
AMP<br />
FSC<br />
PIM<br />
L 1 3 9 15 18<br />
L 1 3 9 15 18<br />
L 2 5 11 17 21<br />
L 2 6 12 13<br />
Loading Minim<strong>al</strong> PKS + DH + KR<br />
Minim<strong>al</strong> PKS Minim<strong>al</strong> PKS + DH + ER + KR<br />
Minim<strong>al</strong> PKS + KR TE<br />
M<strong>et</strong>hylm<strong>al</strong>onyl-specific module<br />
ภาพที่<br />
39 การจัดเรียงตัวของกลุมยีน<br />
Type I PKS ของสารกลุมโพลีอีน<br />
NYS=นัยสตาติน AMP=แอมโฟเทอริซิน FSC=แคนดิซิดิน<br />
PIM=พิมาริซิน L=Loading domain และ ตัวเลข=ลําดับโมดุล<br />
HO<br />
C<br />
H 3<br />
C<br />
H 3<br />
1<br />
O<br />
CH 3<br />
3<br />
18<br />
O<br />
OH OH OH<br />
OH O<br />
OH NH2 O OH<br />
O<br />
ภาพที่<br />
40 โครงสรางของนัยสตาติน<br />
วงกลม=ตําแหนง exocyclic carboxyl group และ hemik<strong>et</strong><strong>al</strong> ring<br />
ตัวเลข=ลําดับโมดุล<br />
15<br />
OH<br />
9<br />
OH<br />
OH<br />
COOH<br />
CH 3<br />
88
3.3.3 การวิเคราะหโดเมน AT<br />
โดเมน AT ที่โคลนได<br />
(403-AT) มีความยาว 317 กรดอะมิโน (ภาพ<br />
ที่<br />
35; นิวคลีโอไทดที่<br />
2071-3021; กรดอะมิโนที่<br />
691-1007) จากการทํา multiple<br />
<strong>al</strong>ignment เปรียบเทียบกับโดเมน AT อื่นที่มีรายงานในฐานขอมูล<br />
(ตารางที่<br />
9) จํานวน 174<br />
โดเมน พบ active site motif คือ GHSxG ซึ่งมี<br />
S (serine) เปน active site (Donadio <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1991; Aparicio <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1996) มีลําดับเปน GHSIG (กรดอะมิโนที่<br />
777-781) เมื่อคัดเลือก<br />
โดเมน AT ทั้งที่จําเพาะตอ<br />
มาโลนิล-โคเอ (mAT) และ AT ที่จําเพาะตอเมธิลมาโลนิล-โคเอ<br />
(mmAT) บางสวนไปทํา clustering พบวา phylogen<strong>et</strong>ic tree ที่ได<br />
(ภาพที่<br />
41) มีการแบงกลุม<br />
เปนกลุม<br />
mAT และ mmAT โดย 403-AT จับกลุมอยูในกลุม<br />
mAT และจากลําดับกรดอะมิโน<br />
ตรวจพบวามีบริเวณของ specificity motif ของ mAT คือ xTxxtQPALFAxevALxrLxxxwGxxP<br />
xxvxGHS (Thamchaipen<strong>et</strong> and Chotewutmontri, 2002) โดยมีลําดับเปน ETGYTQPALFAIE<br />
VALFRLVESWGIRPDFAAGHS (ภาพที่<br />
42) สนับสนุนวา 403-AT เปน AT ที่จําเพาะ<br />
ตอมาโลนิล-โคเอ นอกจากนั้นยังพบวา<br />
403-AT อยูในกลุมยอยของ<br />
AMP-AT14, NYS-<br />
AT14, FSC-AT16 และ PIM-AT11 ซึ่งใหความสัมพันธเชนเดียวกันกับ<br />
403-KS ซึ่งอยูใน<br />
โมดุลเดียวกัน ดังที่ไดกลาวไปกอนหนานี้<br />
89
403-AT<br />
ภาพที่<br />
41 Phylogen<strong>et</strong>ic tree ที่คา<br />
bootstrap 1,000 ครั้ง<br />
ของโดเมน AT ของ S. rimosus R7<br />
(403-AT) เปรียบเทียบกับ AT ของสารโพลีคีไทด<br />
กรอบเสนประ=กลุมยอยของ<br />
AT mAT=m<strong>al</strong>onate specific AT<br />
mmAT = m<strong>et</strong>hylm<strong>al</strong>onate specific AT<br />
403-AT EDAERLNETGYTQPALFAIEVALFRLVESWGIRPDFAAGHSIGEIAAAHVAGVFS 103<br />
AMP-AT3 SDAELLNETGWTQPALFAVEVALYRLVSSLGVTPDYVGGHSIGEIAAAHVAGVLS 104<br />
NYS-AT4 EDAQLVDRTGYTQPALFAIEVALFRLLEAWGITPDFVAGHSIGEIAAAHVAGVLS 104<br />
PIM-AT6 PEAALLDQTGYAQPALFAIEVALYRLAESFGITPDFLAGHSIGEIAAAHVAGVFT 108<br />
FSC-AT11 EEAALLDRTEYAQPALFALEVALYRLVESWGVTPDHLTGHSVGEIAAAHVAGVFT 108<br />
PIK-AT2 AEAALLDETRYTQCALFALEVALFRLVESWGMRPAALLGHSVGEIAAAHVAGVFS 108<br />
TYL-AT7 PEAALLDRTEYTQPALFAVEVALHRLLEHWGMRPDLLLGHSVGELAAAHVAGVLD 108<br />
RAP-AT5 VPDLEVNETGYAQPALFALQVALFGLLESWGVRPDAVVGHSVGELAAGYVSGLWS 91<br />
RIF-AT9 AETGLLNQTVFTQAGLFAVESALFRLAESWGVRPDVVLGHSIGEITAAYAAGVFS 111<br />
SPN-AT4 SDAQLLDQTLWAQSGLFALQAGLLGLLGSWGVRPDVVMGHSVGELAAAFAAGVLS 106<br />
FKB-AT10 EHGALAHDTLYAQAGLFTLEVALLRLLEHWGVRPDVLVGHSVGEVTAAYAAGVLT 104<br />
NID-AT1 DQPDLLDRTEYTQPALFALQTALYRTLTARGTQAHLVLGHSVGEITAAHIAGVLD 105<br />
motif xTxxtQPALFAxevALxrLxxxwGxxPxxvxGHS<br />
mmAT<br />
mAT<br />
ภาพที่<br />
42 Multiple <strong>al</strong>ignment ของโดเมน AT ที่จําเพาะตอมาโลนิล-โคเอในบริเวณ<br />
active site<br />
บรรทัดลางแสดง specificity motif ของ m<strong>al</strong>onate specific AT<br />
90
4. การทํายีนดิสรัปชันดวยชิ้นดีเอ็นเอที่โคลนได<br />
4.1 การเตรียมพลาสมิดสําหรับทํายีนดิสรัปชัน<br />
พลาสมิดที่ใชในการทํายีนดิสรัปชัน<br />
ไดมาจากการแทรกชิ้นยีนที่โคลนไดเขาไป<br />
ใน mobilisable plasmid ซึ่งไมสามารถเพิ่มจํานวนไดใน<br />
Streptomyces ไดแก pSET151 และ<br />
pKC1132<br />
4.1.1 พลาสมิดสายผสมที่มาจาก<br />
pSET151<br />
ก. พลาสมิด pATT402<br />
พลาสมิด pATT402 ไดจากการนําชิ้นดีเอ็นเอ<br />
401-KS ขนาด<br />
1.1 กิโลเบส ที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
EcoRI และ PstI แลวโคลนเขาไปในพลาสมิด<br />
pSET151 ทรานสฟอรม พลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109 และตรวจสอบโคลนโดยการ<br />
ตัดดวยเอนไซม แลวจึงนําเขาสู<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) (ภาพที่<br />
43) เขียนแผนที่<br />
พลาสมิดไดดังภาพที่<br />
44 ก<br />
ข. พลาสมิด pATT405<br />
พลาสมิด pATT405 ไดจากการนําชิ้นดีเอ็นเอ<br />
403-PKS<br />
ขนาด 3.7 กิโลเบส ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
EcoRI และ PstI โคลนเขาไปใน พลาสมิด pSET151<br />
ทรานสฟอรมพลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109 และตรวจสอบโคลนโดยการตัดดวย<br />
เอนไซม แลวจึงนําเขาสู<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) (ภาพที่<br />
45) เขียนแผนที่พลาสมิดได<br />
ดังภาพที่<br />
44 ข<br />
ค. พลาสมิด pATT408<br />
พลาสมิด pATT408 ไดจากการนําชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
1.7 กิโล<br />
เบส จากพลาสมิด pATT406 ซึ่งตัดดวยเอนไซม<br />
EcoRI และ XbaI โคลนเขาสูพลาสมิด<br />
pSET151 ทรานสฟอรมพลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109 และตรวจสอบโคลนโดยการตัด<br />
ดวยเอนไซม แลวจึงนําเขาสู<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) (ภาพที่<br />
46) เขียนแผนที่พลาสมิด<br />
ไดดังภาพที่<br />
44 ค<br />
91
ภาพที่<br />
43 การตรวจสอบพลาสมิด pATT402 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT401/EcoRI/PstI แถวที่<br />
2=1.1 kb ที่สกัดจาก<br />
เจล แถวที่<br />
3=pSET151/EcoRI/PstI แถวที่<br />
4=pATT402 แถวที่<br />
5=<br />
pATT402/EcoRI/PstI และแถวที่<br />
6=pUZ8002+pATT402 ที่สกัดจาก<br />
E. coli<br />
ET12567/EcoRI/PstI<br />
(ก)<br />
6 kb<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
1 kb<br />
0.5 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
6.2 kb<br />
2.7 kb<br />
1.1 kb<br />
ภาพที่<br />
44 แผนที่ของพลาสมิดสายผสมซึ่งใชในการทํายีนดิสรัปชันที่มาจาก<br />
pSET151<br />
(ก) pATT402 (ข) pATT405 (ค) pATT408<br />
92
ภาพที่<br />
44 (ตอ)<br />
(ข)<br />
(ค)<br />
93
6 kb<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
M 1 2 3 4 5<br />
6.2 kb<br />
3.8 kb<br />
2.7 kb<br />
ภาพที่<br />
45 การตรวจสอบพลาสมิด pATT405 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT403/EcoRI/PstI แถวที่<br />
2=3.7 kb ที่สกัดจาก<br />
เจล แถวที่<br />
3=pSET151/EcoRI/PstI แถวที่<br />
4=pATT405/EcoRI/PstI และแถว<br />
ที่<br />
5=pUZ8002+pATT405 ที่สกัดจาก<br />
E. coli ET12567/EcoRI/PstI<br />
2 kb<br />
3 kb<br />
6 kb<br />
1 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
6.2 kb<br />
2.7 kb<br />
1.7 kb<br />
ภาพที่<br />
46 การตรวจสอบพลาสมิด pATT408 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT406/EcoRI/XbaI แถวที่<br />
2=1.7 kb ที่สกัดจาก<br />
เจล แถวที่<br />
3=pSET151/EcoRI/XbaI แถวที่<br />
4=pATT408 แถวที่<br />
5=<br />
pATT408/EcoRI/XbaI และแถวที่<br />
6=pUZ8002+pATT408 ที่สกัดจาก<br />
E. coli<br />
ET12567/EcoRI/XbaI<br />
94
4.1.2 พลาสมิดสายผสมที่มาจาก<br />
pKC1132<br />
จากการหาประสิทธิภาพคอนจูเกชันของเชื้อ<br />
S. rimosus R7 ในผลการ<br />
ทดลองขอ 1.3 ทําใหทราบวา S. rimosus R7 ตานทานตอยาอะพรามัยซิน ไมสามารถใชยานี้ใน<br />
การคัดเลือกได การสรางพลาสมิดสายผสมเพื่อทํายีนดิสรัปชันโดยใช<br />
pKC1132 นี้<br />
จึงจะโคลน<br />
ยีนตานไธโอเสตรปทอน (tsr) ใสเขาไปดวย เนื่องจาก<br />
pKC1132 มียีนตานอะพรามัยซินเทานั้น<br />
ชิ้นยีน<br />
tsr ตัดจากพลาสมิด pIJ8671 (ภาพที่<br />
47) ดวยเอนไซมตัด<br />
จําเพาะ EcoRI ไดขนาด 2.0 กิโลเบส แลวโคลนเขาไปในพลาสมิด pUC18 ทรานสฟอรม<br />
พลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109 ไดโคลนที่มีทิศทางของยีน<br />
tsr สวนทางกับยีนตานแอมพิ<br />
ซิลลิน ใหชื่อวาพลาสมิด<br />
pATT412 (ตรวจสอบโคลนดังภาพที่<br />
48) จากนั้นตัดยีน<br />
tsr ขนาด<br />
1.3 กิโลเบส จากพลาสมิด pATT412 ดวยเอนไซมตัดจําเพาะ KpnI แลวโคลนเขาไปใน<br />
พลาสมิด pUC18 ทรานสฟอรมพลาสมิดสายผสมเขาสู E. coli JM109 ไดโคลนที่มีทิศทางของ<br />
ยีน tsr สวนทางกับยีนตานแอมพิซิลลิน ใหชื่อวาพลาสมิด<br />
pATT413 (ตรวจสอบโคลนดังภาพที่<br />
49) โดยพลาสมิดนี้จะมีตําแหนงตัดของ<br />
EcoRI อยูทั้ง<br />
2 ขางของยีน tsr ขนาด 1.3 กิโลเบส<br />
ภาพที่<br />
47 พลาสมิด pIJ8671 ที่นํายีนตานยาปฏิชีวนะไธโอสเตรปทอนมาใช<br />
สวนประกอบสําคัญ คือ oriT (จากพลาสมิด RK2) และยีนตานยาปฏิชีวนะไธ<br />
โอสเตรปทอน (tsr) และอะพรามัยซิน [acc(3)IV]<br />
ที่มา:<br />
Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2000<br />
95
ภาพที่<br />
48 การตรวจสอบพลาสมิด pATT412 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pIJ8671/EcoRI แถวที่<br />
2=2.0 kb ที่สกัดจากเจล<br />
แถว<br />
ที่<br />
3=pUC18/EcoRI แถวที่<br />
4=pATT412 แถวที่<br />
5=pATT412/EcoRI แถวที่<br />
6=pATT412/HindII/PvuII<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
1 kb<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
1 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
2.7 kb<br />
2.0 kb<br />
2.7 kb<br />
1.3 kb<br />
ภาพที่<br />
49 การตรวจสอบพลาสมิด pATT413 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT412/KpnI แถวที่<br />
2=1.3 kb ที่สกัดจากเจล<br />
แถว<br />
ที่<br />
3=pUC18/KpnI แถวที่<br />
4=pATT413 แถวที่<br />
5=pATT413/KpnI แถวที่<br />
6=pATT413/EcoRI<br />
96
ก. พลาสมิด pATT414 และ pATT416<br />
ตัดชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
1.1 กิโลเบส จากพลาสมิด pATT401<br />
ดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI และ PstI แลวโคลนเขาไปในพลาสมิด pKC1132 ที่ตัดดวย<br />
เอนไซมชนิดเดียวกัน ทรานสฟอรม พลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109 ใหชื่อวาพลาสมิด<br />
pATT410 (ตรวจสอบโคลนดังภาพที่<br />
50) จากนั้นตัดยีนตานไธโอสเตรปทอนขนาด<br />
1.3 กิโล<br />
เบส จากพลาสมิด pATT413 โดยการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI แลวเชื่อมเขาไปใน<br />
พลาสมิด pATT410 ที่ตัดดวยเอนไซมเดียวกัน<br />
ทรานสฟอรมพลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli<br />
JM109 คัดเลือกโคลนที่ยีนตานไธโอสเตรปทอนมีทิศทางเดียวกับยีน<br />
PKS ใหชื่อวา<br />
pATT414<br />
และเมื่อยีนมีทิศทางตรงกันขาม<br />
ใหชื่อวา<br />
pATT416 (ตรวจสอบโคลนดังภาพที่<br />
51) เขียนแผน<br />
ที่พลาสมิดทั้ง<br />
2 ไดดังภาพที่<br />
52 ก และ ข นําพลาสมิดทั้งสองเขาสู<br />
E. coli ET12567<br />
(pUZ8002)<br />
ข. พลาสมิด pATT415 และ pATT417<br />
ตัดชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
1.7 กิโลเบส จากพลาสมิด pATT406<br />
ดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI และ XbaI แลวโคลนเขาไปในพลาสมิด pKC1132 ที่ตัดดวย<br />
เอนไซมชนิดเดียวกัน ทรานสฟอรม พลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109 ใหชื่อวา<br />
pATT411<br />
(ตรวจสอบโคลนดังภาพที่<br />
53) จากนั้นตัดยีนตานทานไธโอสเตรปทอนขนาด<br />
1.3 กิโลเบส<br />
จากพลาสมิด pATT413 โดยการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI แลวเชื ่อมเขาไปในพลาสมิด<br />
pATT411 ที่ตัดดวยเอนไซมเดียวกัน<br />
ทรานสฟอรมพลาสมิดสายผสมเขาสู<br />
E. coli JM109<br />
คัดเลือกโคลนที่ยีนตานทานไธโอสเตรปทอนมีทิศทางเดียวกับยีน<br />
PKS ใหชื่อวา<br />
pATT415 และ<br />
เมื่อยีนมีทิศทางตรงกันขาม<br />
ใหชื่อวา<br />
pATT417 (ตรวจสอบโคลนดังภาพที่<br />
54) เขียนแผนที่<br />
พลาสมิดทั้ง<br />
2 ไดดังภาพที่<br />
52 ค และ ง นําพลาสมิดทั้งสองเขาสู<br />
E. coli ET12567<br />
(pUZ8002)<br />
97
3 kb<br />
1 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
3.4 kb<br />
1.1 kb<br />
ภาพที่<br />
50 การตรวจสอบพลาสมิด pATT410 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT401/EcoRI/PstI แถวที่<br />
2=1.1 kb ที่สกัดจาก<br />
เจล แถวที่<br />
3=pKC1132/EcoRI/PstI แถวที่<br />
4=pATT410 แถวที่<br />
5=<br />
pATT410/EcoRI/PstI<br />
5 kb<br />
4 kb<br />
3 kb<br />
2 kb<br />
1 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
4.5 kb<br />
1.9 kb<br />
1.5 kb<br />
1.3 kb<br />
ภาพที่<br />
51 การตรวจสอบพลาสมิด pATT414 และ pATT416 ดวยอะกาโรส<br />
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT413/EcoRI แถวที่<br />
2=1.3 kb ที่สกัดจากเจล<br />
แถว<br />
ที่<br />
3=pATT410/EcoRI แถวที่<br />
4=pATT414 แถวที่<br />
5=pATT414/EcoRI แถวที่<br />
6=pATT414/HindII/PvuII แถวที่<br />
7=pATT416 แถวที่<br />
8=pATT416/EcoRI<br />
แถวที่<br />
9=pATT416/HindII/PvuII<br />
98
(ก)<br />
(ค)<br />
ภาพที่<br />
52 แผนที่ของพลาสมิดสายผสมซึ่งใชในการทํายีนดิสรัปชันที่มาจาก<br />
pKC1132<br />
(ก) pATT414 (ข) pATT416 (ค) pATT415 (ง) pATT417<br />
(ข)<br />
(ง)<br />
99
3 kb<br />
2 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
3.4 kb<br />
1.7 kb<br />
ภาพที่<br />
53 การตรวจสอบพลาสมิด pATT411 ดวยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT406/EcoRI/XbaI แถวที่<br />
2=1.7 kb ที่สกัดจาก<br />
เจล แถวที่<br />
3=pKC1132/EcoRI/XbaI แถวที่<br />
4=pATT411 แถวที่<br />
5=<br />
pATT411/EcoRI/XbaI<br />
5 kb<br />
4 kb<br />
1 kb<br />
0.5 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
5.1 kb<br />
1.3 kb<br />
1.0 kb<br />
0.7 kb<br />
100<br />
ภาพที่<br />
54 การตรวจสอบพลาสมิด pATT415 และ pATT417 ดวยอะกาโรส<br />
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
M=1 kb ladder แถวที่<br />
1=pATT413/EcoRI แถวที่<br />
2=1.3 kb ที่สกัดจากเจล<br />
แถว<br />
ที่<br />
3=pATT411/EcoRI แถวที่<br />
4=pATT415 แถวที่<br />
5=pATT415/EcoRI แถวที่<br />
6=pATT415/HindII/PvuII แถวที่<br />
7=pATT417 แถวที่<br />
8=pATT417/EcoRI<br />
แถวที่<br />
9=pATT417/HindII/PvuII
4.2 การตรวจสอบสายพันธุกลายจากการทํายีนดิสรัปชันโดย<br />
Hybridisation<br />
4.2.1 พลาสมิด pATT402, pATT405 และ pATT408<br />
จากการทําคอนจูเกชันและคัดเลือกเอกซคอนจูแกนตของทั้งพลาสมิด<br />
pATT402, pATT405 และ pATT408 (ภาพที่<br />
46) หลายการทดลอง พบวาไมสามารถ<br />
คัดเลือกเอกซคอนจูแกนตที่ไดรับพลาสมิดเหลานี้<br />
ทั้งนี้อาจจะเนื่องมาจากขนาดของพลาสมิดซึ่ง<br />
มีขนาดใหญ โดยพลาสมิด pATT402, pATT405 และ pATT408 มีขนาดเปน 7.3, 10.0<br />
และ 7.9 กิโลเบส ตามลําดับ ทําใหความสามารถในการสงถายพลาสมิดลดลง เชนเดียวกับที่มี<br />
รายงานการสงถายพลาสมิดเขาสู<br />
S. coelicolor และ S. lividans กอนหนานี้<br />
(Fl<strong>et</strong>t <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1997) สําหรับในการใชพลาสมิด pIJ8600 ซึ่งมีขนาด<br />
8.1 กิโลเบส เพื่อศึกษาการเกิดคอนจูเก<br />
ชันนั้น<br />
ถึงแมวาพลาสมิดจะมีขนาดใหญและสงถายไดนอย แตเมื่อเกิดการสงถายไปแลวจะเกิด<br />
การแทรกตัวแบบ site-specific recombination ของ attB และ attP โดยอาศัยเอนไซม integrase<br />
จากยีน int ของฝาจ φC31 ไดอยางมีประสิทธิภาพ โดยจากการศึกษาคอนจูเกชันระหวาง S.<br />
coelicolor และ S. lividans กับ E. coli ET12567 (pUB307) แสดงวาประสิทธิภาพของ sitespecific<br />
recombination สูงกวาโฮโมโลกัสรีคอมบิเนชัน เปน 10 3 และ 10 6 เทา เมื่อชิ้นดีเอ็นเอที่<br />
ใชในการเกิดโฮโมโลกัสรีคอมบิเนชันมีขนาดเปน 5.8 และ 2.1 กิโลเบส ตามลําดับ (Fl<strong>et</strong>t <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1997) จึงสามารถคัดเลือกเอกซคอนจูแกนตที่ไดรับพลาสมิด<br />
pIJ8600 ได ตางจากพลาสมิด<br />
pATT402, pATT405 และ pATT408 ซึ่งตองอาศัยการแทรกตัวแบบโฮโมโลกัสรีคอมบิเนชัน<br />
4.2.2 พลาสมิด pATT414, pATT415, pATT416 และ pATT417<br />
เมื่อนําไปทําคอนจูเกชันแลวคัดเลือกเอกซคอนจูแกนตบนอาหารแข็งที่<br />
มีไธโอสเตรปทอน พบวามีเชื้อที่สามารถเจริญได<br />
จึงไดนําไปเขี่ยเปนโคโลนีเดี่ยวบนอาหารแข็ง<br />
MS ที่มีไธโอสเตรปทอน<br />
3 รอบ จากนั้นจึงนําไปเลี้ยงในอาหารเหลว<br />
TSB ที่มีไธโอสเตรปทอน<br />
เพื่อสกัดดีเอ็นเอ<br />
แตเมื่อตรวจสอบโดยการทํา<br />
dot blot hybridisation โดยใช โพรบขนาด 1.4<br />
กิโลเบส ที่มียีน<br />
oriT จากการตัดพลาสมิด pKC1132 ดวยเอนไซม SacI และ HindIII พบวา<br />
ทั้งหมดใหผลเปนลบ<br />
(ภาพที่<br />
55) แสดงวาเชื้อที่เจริญไดบนอาหารแข็งไมใช<br />
เอกซคอนจูแกนต<br />
ดังนั้น<br />
ถึงแมวาจะทํายีนดิสรัปชันโดยสงถายพลาสมิด pATT414 และ<br />
pATT416 (ขนาด 5.8 กิโลเบส) และ pATT415 และ pATT417 (ขนาด 6.4 กิโลเบส) ที่มี<br />
ขนาดเล็กลงกวา pATT402, pATT405 และ pATT408 และยังมีขนาดเล็กกวาพลาสมิดที่ใช<br />
ทดสอบการคอนจูเกชัน คือ pIJ8600 แลวก็ตาม ก็ไมสามารถทําใหเกิดยีนดิสรัปชันไดใน S.<br />
rimosus R7<br />
101
+ -<br />
<br />
ภาพที่<br />
55 การตรวจสอบเอกซคอนจูแกนตของ S. rimosus R7 ที่ไดรับการสงถายพลาสมิด<br />
102<br />
pATT414 และ pATT415 ดวย dot blot hybridisation<br />
(-) = S. rimosus R7, (+) = pKC1132, = เอกซคอนจูแกนตของ pATT416,<br />
= เอกซคอนจูแกนตของ pATT415<br />
คาดวาการที่ไมสามารถพบสายพันธุกลาย<br />
จากการเกิดโฮโมโลกัสรีคอมบิเนชัน<br />
ได นาจะเกิดขึ้นเนื่องจากความถี่ของโฮโมโลกัสรีคอมบิเนชันมีคาต่ํามาก<br />
โดยอาจจะตองเพิ่ม<br />
ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอที่ใชในการเกิดรีคอมบิเนชันใหมีขนาดใหญขึ้น<br />
เพื่อเพิ่มความถี่ใหสูงขึ้น<br />
และอาจตองเปลี่ยนไปใชพลาสมิดรูปแบบอื่น<br />
เชน พลาสมิดแบบ temperature-sensitive<br />
replicon ของ Streptomyces เชน pGM160 (Muth <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1989) และ pKC1139 (Bierman <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 1992) ซึ ่งจะสามารถควบคุมการเพิ่มจํานวนของพลาสมิดไดดวยอุณหภูมิ<br />
โดยที่อุณหภูมิ<br />
30 องศาเซลเซียส จะสามารถตรวจสอบการสงถายพลาสมิดจากการคอนจูเกชันไดในขั้นตน<br />
(พลาสมิดเพิ่มจํานวนได)<br />
และสามารถบังคับใหเกิดรีคอมบิเนชัน โดยการเปลี่ยนอุณหภูมิให<br />
สูงขึ้นมากกวา<br />
34 องศาเซลเซียส ทําใหพลาสมิดเพิ่มจํานวนไมได<br />
จากการที่สามารถสงถายพลาสมิด<br />
pIJ8600 เขาไปใน S. rimosus R7 ได แสดง<br />
วาระบบการทําลายดีเอ็นเอแปลกปลอม (restriction-modification system) ใน S. rimosus R7<br />
ไมมีผลในการทําลายพลาสมิดที่ซึ่งสงเขา<br />
และวิธีการที่ใชในการทําคอนจูเกชันนั้นมีหลายขั้นตอน<br />
ที่ชวยลดการทําลายพลาสมิดที่สงถายไปได<br />
ไดแก การใช E. coli ET12567 เปนผูให<br />
ซึ่งขาด<br />
สมบัติการเติมหมูเมธิลบนดีเอ็นเอ<br />
(Kwak <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 2002) รวมทั้งระบบการสงถายพลาสมิดใน<br />
การเกิดคอนจูเกชันนั้น<br />
พลาสมิดจะอยูในรูปดีเอ็นเอสายเดี่ยว<br />
ซึ่งไมถูกตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
(Hillemann <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1991; Fl<strong>et</strong>t <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1997) โดยพบวาสายพันธุที่มีการทําลายดีเอ็นเอ<br />
แปลกปลอมไดดี เชน S. <strong>al</strong>bus G (Voeykova <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1998), S. coelicolor (Fl<strong>et</strong>t <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1997), S. fradiae (Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992) และ Saccharopolyspora spinosa (Matsushima <strong>et</strong><br />
<strong>al</strong>., 1994) เปนตน สามารถสงถานพลาสมิดโดยการทําคอนจูเกชันกับ E. coli ได ดังนั้นคอนจู<br />
เกชันนาจะเปนวิธีการที่สามารถหลีกเลี่ยงระบบการทําลายดีเอ็นเอแปลกปลอมได
สรุป<br />
103<br />
การศึกษาการสงถายพลาสมิดเขาสู<br />
S. rimosus R7 โดยอาศัยการเกิดคอนจูเกชันตางสกุล<br />
กับ E. coli ET12567 (pUZ8002) เพื่อนําไปใชสรางสายพันธุกลายและศึกษาหนาที่ของยีน<br />
Type I PKS พบวาสภาวะที่เหมาะสม<br />
คือ กระตุนสปอรของ<br />
S. rimosus R7 ที่<br />
40 องศา<br />
เซลเซียส เปนเวลา 10 นาที กอนผสมกับ E. coli โดยสามารถสงถายพลาสมิด pIJ8600 เขาสู<br />
S. rimosus R7 ไดที่ความถี่อยูในชวง<br />
10 -7 -10 -4 เอกซคอนจูแกนตตอผูรับ<br />
โดยใหความถี่สูงสุด<br />
ที่<br />
1.91 x 10 -4 เอกซคอนจูแกนตตอผูรับ<br />
เมื่อทําคอนจูเกชันบนอาหารแข็ง<br />
MS ที่มี<br />
MgCl2 เขมขน 10 มิลลิโมลาร พบวาเอกซคอนจูแกนตมีลักษณะสัณฐานวิทยาและสมบัติในการสรางสาร<br />
ตานเชื้อราไดเทียบเทา<br />
wild type ทุกประการ โดยที่การแทรกตัวของ<br />
pIJ8600 เขาไปใน<br />
โครโมโซมจะเกิดขึ้นที่ตําแหนงเดียวกัน<br />
เมื่อสกัดสารไรโมซิดินในอาหาร<br />
Waksman broth พบวา<br />
สารสกัดที่ไดจากเสนใยใหปริมาณไรโมซิดินสูงกวาจากน้ําเลี้ยงเชื้อประมาณ<br />
10 เทา โดยเมื่อแยก<br />
TLC ดวยแผน Silica gel 60 F254 ตัวพาที่เหมาะสม<br />
คือ n-butanol:ac<strong>et</strong>ic acid:H2O (4:1:5)<br />
เมื่อนําสารสกัดมาวัดคาการดูดแสงดวยสเปกโทรเมทรี<br />
พบวาได λmax ของสารไรโมซิดินที่<br />
278.0, 289.6, 303.2 และ 317.6 นาโนเมตร<br />
การโคลนยีน Type I PKS จาก S. rimosus R7 โดยการทําพีซีอารดวยไพรเมอรจําเพาะ<br />
ตอโดเมน KS ใหยีนขนาด 1.1 กิโลเบส จัดอยูในกลุมเดียวกับ<br />
KS ของ Type I PKS ใน<br />
กระบวนการสังเคราะหสารโพลีคีไทดกลุมโพลีอีน<br />
เมื่อใชชิ้น<br />
KS นี้เปนโพรบ<br />
สามารถโคลนชิ้นดี<br />
เอ็นเอ ขนาด 3.7 และ 18 กิโลเบส จากโครโมโซมของ S. rimosus R7 ได ซึ่งชิ้นดีเอ็นเอขนาด<br />
3.7 กิโลเบส นี้ประกอบไปดวยยีน<br />
Type I PKS ในสวนของโดเมน ACP, KS และ AT โดย<br />
สามารถตรวจพบบริเวณ active site การทํา phylogen<strong>et</strong>ic tree แสดงใหเห็นวาโดเมน AT จัดอยู<br />
ในกลุมที่มีความจําเพาะตอมาโลนิล-โคเอ<br />
ขณะที่โดเมน<br />
KS และ AT เกี่ยวของกับกระบวนการ<br />
สังเคราะหสวน exocyclic carboxyl group และ hemik<strong>et</strong><strong>al</strong> ring ซึ่งเปนโครงสรางสําคัญสวนหนึ่ง<br />
ของโพลีอีน<br />
นํายีน KS ที่ไดจากพีซีอาร<br />
และบางสวนของ Type I PKS จากโครโมโซมของ S. rimosus<br />
R7 ไปศึกษาหนาที่โดยการทํายีนดิสรัปชัน<br />
อาศัยดีเอ็นเอพาหะ คือ pSET151 และ pKC1132<br />
พบวาไมสามารถไดสายพันธุกลาย<br />
คาดวานาจะเกิดจากความถี่ในการเกิดโฮโมโลกัสรีคอมบิเนชัน<br />
ใน S. rimosus R7 มีคาต่ํามาก
เอกสารและสิ่งอางอิง<br />
ณัฏฐิกา พูลสวัสดิ์<br />
และ อรินทิพย ธรรมชัยพิเนต. 2544. การโคลนยีนคีโตซินเทสซึ่งเกี่ยวของ<br />
กับการสังเคราะหโพลีคีไทดชนิดที่<br />
1 จาก Streptomyces sp. A2a-19, น. 119-122.<br />
ใน รายงานการประชุมทางวิชาการของสมาคมพันธุศาสตรแหงประเทศไทย ครั้งที่<br />
12. ภาควิชาพันธุศาสตร, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.<br />
Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers and D.J. Lipman. 1990. Basic loc<strong>al</strong><br />
<strong>al</strong>ignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.<br />
Andriole, V.T. 2000. Current and future antifung<strong>al</strong> therapy: new targ<strong>et</strong> for antifung<strong>al</strong><br />
therapy. Int. J. Antimicrob. Agents 16: 317-321.<br />
Aparicio, J.F., A.J. Colina, E. Ceb<strong>al</strong>los and J.F. Martin. 1999. The biosynth<strong>et</strong>ic gene<br />
cluster for the 26-membered ring polyene macrolide pimaricin. J. Biol. Chem.<br />
274: 10133-10139.<br />
, I. Molnar, T. Schwecke, A. Konig, S.F. Haydock, L.E. Khaw, J. Staunton and<br />
P.F. Leadlay. 1996. Organization of the biosynth<strong>et</strong>ic gene cluster for rapamycin<br />
in Streptomyces hygroscopicus: an<strong>al</strong>ysis of the enzymatic domains in the modular<br />
polyk<strong>et</strong>ide synthase. Gene 169: 9-16.<br />
, P. Caffrey P., J.A. Gil and S.B. Zotchev. 2003. Polyene antibiotic biosynthesis<br />
gene clusters. Appl. Microbiol. Bitechnol. 61: 179-188.<br />
, R. Fouces, M.V. Mendes, N. Olivera and J.F. Martin. 2000. A complex<br />
multienzyme system encoded by five polyk<strong>et</strong>ide synthase genes is involved in the<br />
biosynthesis of the 26-membered polyene macrolide pimaricin in Streptomyces<br />
nat<strong>al</strong>ensis. Chem. Biol. 7: 895-905.<br />
104
August, P.R., L. Tang, Y.J. Yoon, S. Ning, R. Muller, T.W. Yu, M. Taylor, D.<br />
Hoffmann, C.G. Kim, X. Zhang, C.R. Hutchinson CR and H.G. Floss. 1998.<br />
Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular<br />
an<strong>al</strong>ysis of the rif biosynth<strong>et</strong>ic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S699.<br />
Chem. Biol. 5: 69-79.<br />
B<strong>al</strong>tz, R.H. 1998. Gen<strong>et</strong>ic manipulation of antibiotic producing Streptomyces. Trends<br />
Microbiol. 6: 76-83.<br />
Bangera, M.G. and L.S. Thomashow. 1999. Identification and characterization of a gene<br />
cluster for synthesis of the polyk<strong>et</strong>ide antibiotic 2,4-diac<strong>et</strong>ylphloroglucinol from<br />
Pseudomonas fluorescens Q2-87. J. Bacteriol. 181: 3155-3163.<br />
Bevitt, D.J., J. Cortes, S.F. Haydock and P. Leadlay. 1992. 6-Deoxyerythronolide-B<br />
synthase 2 from Saccharopolyspora erythraea: cloning of the structur<strong>al</strong> gene,<br />
sequence an<strong>al</strong>ysis and inferred domain structure of the multifunction<strong>al</strong> enzyme.<br />
Eur. J. Biochem. 204: 39-49.<br />
Bibb, M.J., S. Biro, H. Motamedi, J.F. Collins and C.R. Hutchinson. 1989. An<strong>al</strong>ysis of<br />
the nucleotide sequence of the Streptomyces glaucescens tcmI genes provides key<br />
information about the enzymology of polyk<strong>et</strong>ide antibiotic biosynthesis. EMBO J.<br />
8: 2727-2736.<br />
, J.M. Ward and D.A. Hopwood. 1978. Transformation of plasmid DNA into<br />
Streptomyces at high frequency. Nature 274: 398-400.<br />
Bierman, M., R. Logan, K. Obrien, E.T. Seno, R.N. Rao and B.E. Schoner. 1992.<br />
Plasmid cloning vectors for the conjug<strong>al</strong> transfer of DNA from Escherichia coli to<br />
Streptomyces spp. Gene 116: 43-39.<br />
Birch, A.J. 1967. Biosynthesis of polyk<strong>et</strong>ides and related compounds. Science 156:<br />
202-206.<br />
105
Brautas<strong>et</strong>, T., O.N. Sekurova, H. Sl<strong>et</strong>ta, T.E. Ellingsen, A.R. StrLm, S. V<strong>al</strong>la and S.B.<br />
Zotchev. 2000. Biosynthesis of the polyene antifung<strong>al</strong> antibiotic nystatin in<br />
Streptomyces noursei ATCC 11455: an<strong>al</strong>ysis of the gene cluster and deduction of<br />
the biosynth<strong>et</strong>ic pathway. Chem. Biol. 7: 395-403.<br />
Brewer, G.A. and T.B. Platt. 1967. Antibiotics, pp. 460-633. In F.D. Snell and C.L.<br />
Hilton, eds. Encyclopedia of Industri<strong>al</strong> Chemic<strong>al</strong> An<strong>al</strong>ysis. Vol 5. John Wiley and<br />
Sons, Inc., New York. 677 p.<br />
Butler, M.J., E.J. Friend, I.S. Hunter, F.S. Kaczmarek, D.A. Sugden and M. Warren.<br />
1989. Molecular cloning of resistance genes and architecture of a linked gene<br />
cluster involved in biosynthesis of oxyt<strong>et</strong>racycline by Streptomyces rimosus. Mol.<br />
Gen. Gen<strong>et</strong>. 215: 231-238.<br />
Caffrey, P., S. Lynch, E. Flood, S. Finnan and M. Oliynyk. 2001. Amphotericin<br />
biosynthesis in Streptomyces nodosus: deductions from an<strong>al</strong>ysis of polyk<strong>et</strong>ide<br />
synthase and lated genes. Chem. Biol. 8: 713-723.<br />
Campelo, A.B. and J.A. Gil. 2002. The candicidin gene cluster from Streptomyces<br />
griseus IMRU 3570. Microbiol. 148: 51-59.<br />
Carreras, C.W., R. Pieper and C. Khosla. 1997. The chemistry and biology of fatty acid,<br />
polyk<strong>et</strong>ide, and nonribosom<strong>al</strong> peptide biosynthesis. Top. Curr. Chem. 188: 85-<br />
126.<br />
Chen, S., X. Huang, X. Zhou, L. Bai, J. He K.J. Jeong, S.Y. Lee and Z. Deng. 2003.<br />
Organization<strong>al</strong> and mutation<strong>al</strong> an<strong>al</strong>ysis of a compl<strong>et</strong>e FR-008/candicidin gene<br />
cluster encoding a structur<strong>al</strong>ly related polyene complex. Chem. Biol. 10: 1065-<br />
1076.<br />
Chung, C.T., S.L. Niemela and R.H. Miller. 1989. One-step preparation of comp<strong>et</strong>ent<br />
Escherichia coli: transformation and storage of bacteri<strong>al</strong> cells in the same solution.<br />
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2172-2175.<br />
106
Combes, P., R. Till, S. Bee and M.C.M. Smith. 2002. The Streptomyces genome<br />
contains multiple pseudo-attB sites for the φC31-encoded site specific<br />
recombination system. J. Bacteriol. 184: 5746-5752.<br />
Cope, C., E.P. Burrows, M.E. Derieg, S. Moon and W.-D. Wirth. 1965. Rimocidin I:<br />
carbon skel<strong>et</strong>on, parti<strong>al</strong> structure and absolute configuration at C-27. J. Am.<br />
Chem. Soc. 87: 5452-5460.<br />
Cortes, J., S.F. Haydock, G.A. Roberts, D.J. Bevitt and P. Leadlay. 1990. An unusu<strong>al</strong>ly<br />
large multifunction<strong>al</strong> polypeptide in the erythromycin-producing polyk<strong>et</strong>ide<br />
synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature 348:176-178.<br />
Crawford, D.L. 1988. Biodegradation of agricultur<strong>al</strong> and urban wastes, pp. 433-459.<br />
In M. Goodfellow, S.T. Williams and M. Mordarski, eds. Actinomyc<strong>et</strong>es in<br />
Biotechnology. Academic Press, San Diego. 501 p.<br />
Cross, T. and L.J. Al-Diwany. 1981. Streptomyc<strong>et</strong>es with substrate mycelium spores:<br />
the genus Elytrosporangium. Zentr<strong>al</strong>lbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. I Abt. Suppl.<br />
11: 59-65.<br />
Davisson, J.D., F.W. Tanner, Jr., A.C. Finlay and I.A. Solomons. 1951. Rimocidin, a<br />
new antibiotic. Antibiot. Chemother. 1: 289-290.<br />
DeHoff, B.S., K.L. Sutton and P.R Jr. Rosteck. 1996. Sequence of Streptomyces fradiae<br />
tylactone synthase gene tylG. (Unpublished).<br />
Dinya, Z.M. and F.J. Sztaricskai. 1986. Ultraviol<strong>et</strong> and light absorption spectrom<strong>et</strong>ry. In<br />
A. Asz<strong>al</strong>os, ed. Modern An<strong>al</strong>ysis of Antibiotics. Marcel Dekker, Inc., New York.<br />
535 p.<br />
107
Donadio, S., J.B. McAlpine, P.J. Sheldon, M. Jackson and L. Katz. 1993. An<br />
erythromycin an<strong>al</strong>og produced by reprogramming of polyk<strong>et</strong>ide synthesis. Proc.<br />
Natl. Acad. Sci. USA 99: 7119-7123.<br />
108<br />
and L. Katz. 1992. Organization of the enzymatic domains in the multifunction<strong>al</strong><br />
polyk<strong>et</strong>ide synthase involved in erythromycin formation in Saccharopolyspora<br />
erythraea. Gene 111: 51-60.<br />
, S., M.J. Staver, J.B. McAlpine, S.J. Swanson and L. Katz. 1991. Modular<br />
organization of genes required for complex polyk<strong>et</strong>ide biosynthesis. Science 252:<br />
675-679.<br />
Ebben, M.H. and D.M. Spencer. 1978. The use of antagonistic organisms for control of<br />
black root rot of cucumber, Phomopsis sclerotioides. Annu. Appl. Biol. 89:103-<br />
106.<br />
Evans, P.D., S.N. Cook, R.D. Riggs and C.J. Noren. 1995. LITMUS: multipurpose<br />
cloning vectors with a novel system for bidirection<strong>al</strong> in vitro transcription.<br />
Biotechniques. 19: 130-135.<br />
F<strong>al</strong>kowski, L., J. Zielinski, J. Golik, E. Bylec and E. Borowski. 1978. The structure of<br />
rimocidin: mass spectrom<strong>et</strong>ric an<strong>al</strong>ysis of derivatives of the antibiotic. J. Antibiot.<br />
31: 742-749.<br />
Fernandez-Moreno, M.A., E. Martinez, L. Boto, D.A. Hopwood and F. M<strong>al</strong>partida.<br />
1992. Nucleotide sequence and deduced functions of a s<strong>et</strong> of cotranscribed genes<br />
of Streptomyces coelicolor A3(2) including the polyk<strong>et</strong>ide synthase for the<br />
antibiotic actinorhodin. J. Biol. Chem. 267: 19278-19290.<br />
Fischer, G., B. Decaris and P. Leblond. 1997. Occurrence of del<strong>et</strong>ions, associated with<br />
gen<strong>et</strong>ic instability in Streptomyces ambofaciens, is independent of the linearity of<br />
the chromosom<strong>al</strong> DNA. J. Bacteriol. 179: 4553-4558
Fl<strong>et</strong>t, F., V. Mersinias and C.P. Smith. 1997. High efficiency intergeneric conjug<strong>al</strong><br />
transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to m<strong>et</strong>hyl DNA-restricting<br />
streptomyc<strong>et</strong>es. FEMS Microbiol. L<strong>et</strong>t. 155: 223-229.<br />
109<br />
Fouces, R., M. Rodriguez, E. Mellado, B. Diez and J.L. Barredo. 2000. Conjugation and<br />
transformation of Streptomyces species by tylosin resistance. FEMS Microbiol.<br />
L<strong>et</strong>t. 186: 319-325.<br />
Funa, N., Y. Ohnishi, I. Fujii, M. Shibuya, Y. Ebizuka and S. Horinouchi. 1999. A new<br />
pathway for polyk<strong>et</strong>ide synthesis in microorganisms. Nature 400: 897-899.<br />
Gokh<strong>al</strong>e, R.S., D. Hunziker, D.E. Cane and C. Khosla. 1999. Mechanism and specificity<br />
of the termin<strong>al</strong> thioesterase domain from the erythromycin polyk<strong>et</strong>ide synthase.<br />
Chem. Biol. 6: 117-125.<br />
Goodfellow, M. 1989. Supergeneric classification of actinomyc<strong>et</strong>es, pp. 2333-2339. In<br />
S.T. Williams, ed. Bergey’s Manu<strong>al</strong> of Systematic Bacteriology. Vol. 4. Williams<br />
and Wilkins, B<strong>al</strong>timore. 349 p.<br />
Hillemann, D., A. Puhler and W. Wohlleben. 1991. Gene disruption and gene<br />
replacement in the Streptomyces via single stranded DNA transformation of<br />
integration vectors. Nucleic Acids Res. 19: 727-731.<br />
Hobbs, G., C.M. Frazer, D.C.J. Gardner, J.A. Cullum and S.G. Oliver. 1989. Dispersed<br />
growth of Streptomyces in liquid culture. Appl. Microbiol. Biotechnol. 31: 272-<br />
277.<br />
Hopwood, D.A., M.J. Bibb, K.F. Chapter, T. Kieser, C.T. Bruton, H.M. Kieser, D.J.<br />
Lydiate, C.P. Smith, J.M. Ward and H. Schrempf. 1985. Gen<strong>et</strong>ic Manipulation<br />
of Streptomyces: a Laboratory Manu<strong>al</strong>. The John Innes Foundation, Norwich.<br />
356 p.
and D.H. Sherman. 1990. Molecular gen<strong>et</strong>ics of polyk<strong>et</strong>ides and its comparison<br />
to fatty acid biosynthesis. Annu. Rev. Gen<strong>et</strong>. 24: 37-66.<br />
Horton, H.R., L.A. Moran, R.S. Ochs, J.D. Rawn and K.G. Scrimgeour. 2002.<br />
Principles of Biochemistry. 3 rd ed. Prentice H<strong>al</strong>l, New Jersey. 862 p.<br />
Hosoya, S., N. Komatsu, M. Soeda and Y. Sonoda. 1952. Trichomycin, a new antibiotic<br />
produced by Streptomyces hachijoensis with trichomonadicid<strong>al</strong> and antifung<strong>al</strong><br />
activity. Jap. J. Exp. Med. 22: 505-509.<br />
Hutchinson, C.R. and I. Fujii. 1995. Polyk<strong>et</strong>ide synthase gene manipulation: a structurefunction<br />
approach in engineering novel antibiotics. Annu. Rev. Microbiol. 49:<br />
201-238.<br />
Ikeda, H., T. Nonomiya, M. Usami, T. Ohta and S. Omura. 1999. Organization of the<br />
biosynth<strong>et</strong>ic gene cluster for the polyk<strong>et</strong>ide anthelmintic macrolide avermectin in<br />
Streptomyces avermitilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9509-9514.<br />
Kakavas, S.J., L. Katz and D. Stassi. 1997. Identification and characterization of the<br />
niddamycin polyk<strong>et</strong>ide synthase genes from Streptomyces caelestis. J. Bacteriol.<br />
179: 7515-7522.<br />
Kao, C.M., L. Katz and C. Khosla. 1994. Engineered biosynthesis of a compl<strong>et</strong>e<br />
macrolactone in a h<strong>et</strong>erologous host. Science 265: 509-512.<br />
Khosla, C. and R.J. Zawada. 1996. Generation of polyk<strong>et</strong>ide libraries via combinatori<strong>al</strong><br />
biosynthesis. Trends Biotechnol. 14: 335-341.<br />
Kieser, T., M.J. Bibb, M.J. Buttner, K.F. Chater and D.A. Hopwood. 2000. Practic<strong>al</strong><br />
Streptomyces Gen<strong>et</strong>ics. The John Innes Foundation, Norwich. 613 p.<br />
110
Kitani, S., K., M.J. Bibb, T. Nihira and Y. Yamada. 2000. Conjug<strong>al</strong> transfer of plasmid<br />
DNA from Escherichia coli to Streptomyces lavendulae FRI-5. J. Microbiol.<br />
Biotechnol. 10: 535-538.<br />
Kuhstoss, S., M.A. Richardson and R.N. Rao. 1991. Plasmid cloning vector that<br />
integrate site-specific<strong>al</strong>ly in Streptomyces spp. Gene 97: 143-146.<br />
Kwak, J., H. Jiang and K.E. Kendrick. 2002. Transformation using in vivo and in vitro<br />
m<strong>et</strong>hylation in Strptomyces griseus. FEMS Microbiol. L<strong>et</strong>t. 209: 243-248.<br />
Lacey, J. 1988. Actinomyc<strong>et</strong>es as biod<strong>et</strong>eriogens and pollutants of the environment, pp.<br />
359-432. In M. Goodfellow, S.T. Williams and M. Mordarski, eds.<br />
Actinomyc<strong>et</strong>es in Biotechnology. Academic Press, San Diego. 501 p.<br />
Lau, J., D.E. Cane and C. Khosla. 2000. Substrate specificity of the loading didomain of<br />
the erythromycin polyk<strong>et</strong>ide synthase. Biochem. 39: 10514-10520.<br />
Lechev<strong>al</strong>ier, M. 1988. Actinomyc<strong>et</strong>es in agriculture and forestry, pp. 327-358. In M.<br />
Goodfellow, S.T. Williams and M. Mordarski, eds. Actinomyc<strong>et</strong>es in<br />
Biotechnology. Academic Press, San Diego. 501 p.<br />
111<br />
Lin, Y.-S., H.M. Kieser, D.A. Hopwood and C.W. Chen. 1993. The chromosom<strong>al</strong> DNA<br />
of Streptomyces lividans 66 is linear. Mol. Microbiol. 10: 923-933.<br />
Lomovskaya, N., L. Fonstein, X. Ruan, D. Stassi, L. Katz and C.R. Hutchinson. 1997.<br />
Gene disruption and replacement in the rapamycin-producing Streptomyces<br />
hygroscopicus strain ATCC 29253. Microbiol. 143: 875-883.<br />
Lopez-Cabrera, M., J.A. Perez-Gonz<strong>al</strong>ez, P. Heinzel, W. Piepersberg and A. Jimenez.<br />
1989. Isolation and nucleotide sequencing of an aminocyclitol ac<strong>et</strong>yltransferase<br />
gene from Streptomyces rimosus forma paromomycinus. J. Bacteriol. 171: 321-<br />
328.
MacNeil, D.J. 1988. Characterization of a unique m<strong>et</strong>hyl-specific restriction system in<br />
Streptomyces avermitilis. J. Bacteriol. 170: 5607-5612.<br />
MacNeil, D.J., K.M. Gewain, C.L. Ruby, G. Dezeny, P.H. Gibbons and T. MacNeil.<br />
1992. An<strong>al</strong>ysis of Streptomyces avermitilis genes required for avermectin<br />
biosynthesis utilizing a novel integration vector. Gene 111: 61-68.<br />
Mazodier, P., R. P<strong>et</strong>ter and C. Thompson. 1989. Intergeneric conjugation b<strong>et</strong>ween<br />
Escherichia coli and Streptomyces species. J. Bacteriol. 171: 3583-3585.<br />
Matsushima, P. and R.H. B<strong>al</strong>tz. 1985. Efficient plasmid transformation of Streptomyces<br />
ambofaciens and Streptomyces fradiae protoplasts. J. Bacteriol. 163: 180-185.<br />
and . 1996. A gene cloning system for Streptomyces toyocaensis.<br />
Microbiol. 142: 261-267.<br />
, M.C. Broughton, J.R. Turner JR and R.H. B<strong>al</strong>tz. 1994. Conjug<strong>al</strong> transfer of<br />
cosmid DNA from Escherichia coli to Saccharopolyspora spinosa: effects of<br />
chromosom<strong>al</strong> insertions on macrolide A83543 production. Gene 146:39-45.<br />
McDaniel, R., A. Thamchaipen<strong>et</strong>, C. Gustafsson, H. Fu, M. B<strong>et</strong>lach, M. B<strong>et</strong>lach and G.<br />
Ashley. 1999. Multiple gen<strong>et</strong>ic modification of the erythromycin polyk<strong>et</strong>ide<br />
synthase to produce a library of novel “unnatur<strong>al</strong>” natur<strong>al</strong> products. Proc. Natl.<br />
Acad. Sci. USA 96: 1846-1851.<br />
, S. Ebert-Khosla, H. Fu, D.A. Hopwood and C. Khosla. 1994. Engineered<br />
biosynthesis of novel polyk<strong>et</strong>ides: influence of a downstream enzyme on the<br />
cat<strong>al</strong>ytic specificity of a minim<strong>al</strong> aromatic polyk<strong>et</strong>ide synthase. Proc. Natl. Acad.<br />
Sci. USA 91: 11542-11546.<br />
112
McGinnis, M.R. and M.G. Rin<strong>al</strong>di. 1996. Antifung<strong>al</strong> drugs: mechanisms of action, drug<br />
resistance, susceptibility testing, and assays of activity in biologic fluids, pp. 176-<br />
184. In V. Lorian, ed. Antibiotics in Laboratory Medicine. 4 th ed. Williams and<br />
Wilkins, B<strong>al</strong>timore. 1238 p.<br />
Mendes, M.V., E. Recio, R. Fouces, R. Luiten, J.F. Martin and J.F. Aparicio. 2001.<br />
Engineered biosynthesis of novel polyenes: a pimaricin derivative produced by<br />
targ<strong>et</strong>ed gene disruption in Streptomyces nat<strong>al</strong>ensis. Chem. Biol. 8:635-644.<br />
Miyashita, K., T. Fujii and Y. Sawada. 1991. Molecular cloning and characterization of<br />
chitinase genes from Streptomyces lividans 66. J. Gen. Microbiol. 137: 2065-<br />
2072.<br />
Moore, B.S. and J.N. Hopke. 2001. Discovery of a new bacteri<strong>al</strong> polyk<strong>et</strong>ide biosynth<strong>et</strong>ic<br />
pathway. ChemBioChem. 2: 35-38.<br />
Muth, G., B. Nussbaumer, W. Wohlleben and A. Puhler. 1989. A vector system with<br />
temperature-sensitive replication for gene disruption and mutation<strong>al</strong> cloning in<br />
streptomyc<strong>et</strong>es. Mol. Gen. Gen<strong>et</strong>. 219: 341-348.<br />
Nikodinovic, J., K.D. Barrow and J.-A. Chuck. 2003. High frequency transformation of<br />
the amphotericin-producing bacterium Streptomyces nodosus. J. Microbiol.<br />
M<strong>et</strong>hods 55: 273-277.<br />
Norrander, J., T. Kempe and J. Messing. 1983. Construction of improved M13 vectors<br />
using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene 26: 101-106.<br />
Okuda S. and Y. Tanaka. 1992. Fungicides and antibacteri<strong>al</strong> agents, pp. 213-223. In<br />
S. Omura, ed. The Search for Bioactive Compounds from Microorganisms.<br />
Springer-Verlag, New York. 352 p.<br />
113
Oliynyk, M., C.B. Stark, A. Bhatt, M.A. Jones, Z.A. Hughes-Thomas, C. Wilkinson, Z.<br />
Oliynyk, Y. Demydchuk, J. Staunton and P.F. Leadlay. 2003. An<strong>al</strong>ysis of the<br />
biosynth<strong>et</strong>ic gene cluster for the poly<strong>et</strong>her antibiotic monensin in Streptomyces<br />
cinnamonensis and evidence for the role of monB and monC genes in oxidative<br />
cyclization. Mol. Microbiol. 49: 1179-1190.<br />
Omura, S., H. Ikeda, J. Ishikawa, A. Hanamoto, C. Takahashi, M. Shinose, Y. Takahashi,<br />
H. Horikawa, H. Nakazawa, T. Osonoe, H. Kikuchi, T. Shiba, Y. Sakaki and M.<br />
Hattori. 2001. Genome sequence of an industri<strong>al</strong> microorganism Streptomyces<br />
avermitilis: deducing the ability of producing secondary m<strong>et</strong>abolites. Proc. Natl.<br />
Acad. Sci. USA 98: 12215-12220.<br />
Page, R.D.M. 1996. TREEVIEW: an application to display phylogen<strong>et</strong>ic trees on<br />
person<strong>al</strong> computers. Comput. Appl. Biosci. 12: 357-358.<br />
Pandey, R.C., E.C. Guenther, A.A. Asz<strong>al</strong>os and J. Brajtburg. 1982. Physicochemic<strong>al</strong> and<br />
biologic<strong>al</strong> comparison of polyene macrolide antibiotics fungichromin, lagosin and<br />
cogomycin. J. Antibiot. 35: 988-996.<br />
and K.L. Rinehart, Jr. 1977. Polyene antibiotic VIII: the structure of rimocidin.<br />
J. Antibiot. 30:146-162.<br />
Pandza, K., G. Pf<strong>al</strong>zer, J. Cullum and D. Hranueli. 1997. Physic<strong>al</strong> mapping shows that<br />
the unstable oxyt<strong>et</strong>racycline gene cluster of Streptomyces rimosus lies close to one<br />
end of the linear chromosome. Microbiol. 143: 1493-1501.<br />
Paranthaman, S. and K. Dharm<strong>al</strong>ingam. 2003. Intergeneric conjugation in Streptomyces<br />
peuc<strong>et</strong>ius and Streptomyces sp. strain C5: chromosom<strong>al</strong> integration and expression<br />
of recombinant plasmids carrying the chiC gene. Appl. Environ. Microbiol. 69:<br />
84-91.<br />
114
Peczynska-Czoch, W. and M. Mordarski. 1988. Actinomyc<strong>et</strong>e enzymes, pp. 219-283.<br />
In M. Goodfellow, S.T. Williams and M. Mordarski, eds. Actinomyc<strong>et</strong>es in<br />
Biotechnology. Academic Press, San Diego. 501 p.<br />
Perada, A., R.G. Summers, D.L. Stassi, X. Ruan and L. Katz. 1998. The loading<br />
domain of the erythromycin polyk<strong>et</strong>ide synthase is not essenti<strong>al</strong> for erythromycin<br />
biosynthesis in Saccharopolyspora erythraea. Microbiol. 144: 543-553.<br />
Perez-Gonz<strong>al</strong>ez, J.A., M. Lopez-Cabrera, J.M. Pardo and A. Jimenez. 1989.<br />
Biochemic<strong>al</strong> characterization of two cloned resistance d<strong>et</strong>erminants encoding a<br />
paromomycin ac<strong>et</strong>yltransferase and a paromomycin phosphotransferase from<br />
Streptomyces rimosus forma paromomycinus. J. Bacteriol. 171: 329-334.<br />
Pigac, J. and H. Schrempf. 1995. A simple and rapid m<strong>et</strong>hod of transformation of<br />
Streptomyces rimosus R6 and other streptomyc<strong>et</strong>es by electroporation. Appl.<br />
Environ. Microbiol. 61: 352-356.<br />
Pir<strong>et</strong>, J.M. and A.L. Demain. 1988. Actinomyc<strong>et</strong>es in biotechnology: an overview, pp.<br />
461-482. In M. Goodfellow, S.T. Williams and M. Mordarski, eds.<br />
Actinomyc<strong>et</strong>es in Biotechnology. Academic Press, San Diego. 501 p.<br />
Redenbach, M., H.M. Kieser, D. Denapaite, A. Eichner, J. Cullum, H. Kinashi and D.A.<br />
Hopwood. 1996. A s<strong>et</strong> of ordered cosmids and a d<strong>et</strong>ailed gen<strong>et</strong>ic and physic<strong>al</strong><br />
map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. Mol. Microbiol.<br />
21: 77-96.<br />
Reeves, C.D., S. Murli, G.W. Ashley, M. Piagentini, C.R. Hutchinson and R. McDaniel.<br />
2001. Alteration of the substrate specificity of a modular polyk<strong>et</strong>ide synthase<br />
acyltransferase domain through site-specific mutations. Biochem. 40: 15464-<br />
15470.<br />
115
Reid, R., M. Piagentini, E. Rodriguez, G.Ashley, N. Viswanathan, J. Corney, D.V. Santi,<br />
C.R. Hutchinson and R. McDaniel. 2003. A model of structure and cat<strong>al</strong>ysis for<br />
k<strong>et</strong>oreductase domains in modular polyk<strong>et</strong>ide synthase. Biochem. 42: 72-79.<br />
Rodicio, M.R, and K.F. Chater. 1988. The S<strong>al</strong>I (S<strong>al</strong>GI) restriction-modification system<br />
of Streptomyces <strong>al</strong>bus G. Gene 74:39-42.<br />
Rodriguez, E. and R. McDaniel. 2001. Combinatori<strong>al</strong> biosynthesis of antimicrobi<strong>al</strong>s and<br />
other natur<strong>al</strong> products. Curr. Opin. Microbiol. 4: 526-534.<br />
Sambrook, J. and D.W. Russell. 2001. Molecular Cloning: a Laboratory Manu<strong>al</strong>. 3 nd<br />
ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.<br />
Sanchez, J., C. Barbes, A. Hernandez, C.R. de los Reyes Gavilan and C. Hardisson.<br />
1985. Restriction-modification systems in Streptomyces antibioticus. Can. J.<br />
Microbiol. 31: 942-946.<br />
Schwecke, T., J.F. Aparicio, I. Molnar, A. Konig, L.E. Khaw, S.F. Haydock, M. Oliynyk,<br />
P. Caffrey, J. Cortes, J.B. Lester, G.A. Bohm, J. Staunton and P. Leadlay. 1995.<br />
The biosynth<strong>et</strong>ic gene cluster for the polyk<strong>et</strong>ide immunosuppressant rapamycin.<br />
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7839-7843.<br />
Shah, S., Q. Xue, L. Tang, J.R. Carney, M. B<strong>et</strong>lach and R. McDaniel. 2000. Cloning,<br />
characterization and h<strong>et</strong>erologous expression of a polyk<strong>et</strong>ide synthase and P-450<br />
oxidase involved in the biosynthesis of the antibiotic oleandomycin. J. Antibiot.<br />
53: 502-508.<br />
Shen, B. and C.R. Hutchinson. 1993. Enzymatic synthesis of a bacteri<strong>al</strong> polyk<strong>et</strong>ide from<br />
ac<strong>et</strong>yl and m<strong>al</strong>onyl CoA by a type II polyk<strong>et</strong>ide synthase. Science 262: 1535-<br />
1540.<br />
Shirling, E.B. and D. Gottlieb. 1966. M<strong>et</strong>hods for characterization of Streptomyces<br />
species. Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 3313-3340.<br />
116
Sia, L.A., D.M. Kuehner and D.H. Figurski. 1996. Mechanism of r<strong>et</strong>rotransfer in<br />
conjugation: prior transfer of the conjugative plasmid is required. J. Bacteriol.<br />
178: 1457–1464.<br />
Siddiqui, Z.A. and I. Mahmood. 1999. Role of bacteria in the management of plant<br />
parasitic nematodes: a review. Bioresource Tech. 69: 167-179.<br />
Smith, W.C., L. Xiang and B. Shen. 2000. Gen<strong>et</strong>ic loc<strong>al</strong>ization and molecular<br />
characterization of the nonS gene required for macrot<strong>et</strong>rolide biosynthesis in<br />
Streptomyces griseus DSM40695. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1809-<br />
1817.<br />
117<br />
Snyder, L. and W. Champness. 1997. Molecular Gen<strong>et</strong>ics of Bacteria. American Soci<strong>et</strong>y<br />
for Microbiology Press, Washington. 504 p.<br />
Southern, T.G. 1975. D<strong>et</strong>ection of specific sequences among DNA fragments separated<br />
by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-507.<br />
Sun, J., G.H. Kelemen, J.M. Fernandez-Ab<strong>al</strong>os and M.J. Bibb. 1999. Green fluorescent<br />
protein as a reporter for spati<strong>al</strong> and tempor<strong>al</strong> gene expression in Streptomyces<br />
coelicolor A3(2). Microbiol. 145: 2221-2227.<br />
Sun, Y., X. Zhou, H. Dong, G. Tu, M. Wang, B. Wang and Z. Deng. 2003. A compl<strong>et</strong>e<br />
gene cluster from Streptomyces nanchangensis NS3226 encoding biosynthesis of<br />
the poly<strong>et</strong>her ionophore nanchangmycin. Chem Biol. 10: 431-441.<br />
Swan, D.G., A.M. Rodriguez, C. Vilches, C. Mendez and J.A. S<strong>al</strong>as. 1994.<br />
Characterisation of a Streptomyces antibioticus gene encoding a type I polyk<strong>et</strong>ide<br />
synthase which has an unusu<strong>al</strong> coding sequence. Mol. Gen. Gen<strong>et</strong>. 242: 358-<br />
362.
Tanaka, Y. 1992. Antifung<strong>al</strong> agents, pp. 30-44. In S. Omura, ed. The Search for<br />
Bioactive Compounds from Microorganisms. Springer-Verlag, New York. 352 p.<br />
Thompson, J.D., D.G. Higgins and T.J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the<br />
sensitivity of progressive multiple sequence <strong>al</strong>ignment through sequence weighting,<br />
position-specific gap pen<strong>al</strong>ties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:<br />
4673-4680.<br />
Thorpe, H.M., S.E. Wilson and M.C.M. Smith. 2000. Control of direction<strong>al</strong>ity in the<br />
site-specific recombination system of the Streptomyces phage φC31. Mol.<br />
Microbiol. 38: 232-241.<br />
Voeykova, T. L. Emelyanova, T. Vyacheslav and N. Mkrtumyan. 1998. Transfer of<br />
plasmid pTO1 from Escherichia coli to various representatives of the order<br />
Actinomyc<strong>et</strong><strong>al</strong>es by intergenic conjugation. FEMS Microbiol. L<strong>et</strong>t. 162: 47-52.<br />
Volchegursky, Y., Z. Hu, L. Katz and R. McDaniel. 2000. Biosynthesis of the antiparasitic<br />
agent meg<strong>al</strong>omicin: transformation of erythromycin to meg<strong>al</strong>omicin in<br />
Saccharopolyspora erythraea. Mol. Microbiol. 37: 752-762.<br />
Volpon, L. and J.-M. Lancelin. 2002. Solution NMR structure of five representative<br />
glycosylated polyene macrolide antibiotics with a sterol-dependent antifung<strong>al</strong><br />
activity. Eur. J. Biochem. 269: 4533-4541.<br />
W<strong>al</strong>dron, C., P. Matsushima, P.R. Rosteck Jr., M.C. Broughton, J. Turner, K. Madduri,<br />
K.P. Crawford, D.J. Merlo and R.H. B<strong>al</strong>tz. 2001. Cloning and an<strong>al</strong>ysis of the<br />
spinosad biosynth<strong>et</strong>ic gene cluster of Saccharopolyspora spinosa. Chem. Biol. 8:<br />
487-499.<br />
Ward, J.M., G.R. Janssen, T. Kieser and M.J. Bibb. 1986. Construction and<br />
characterisation of a series of multi-copy promoter-probe plasmid vectors for<br />
Streptomyces using the aminoglycoside phosphotransferase gene from Tn5 as<br />
indicator. Mol. Gen. Gen<strong>et</strong>. 203: 468-478.<br />
118
Warnock, D.W. 1997. Chapter 36: antifung<strong>al</strong> agents, pp. 485-498. In F. O’Grady,<br />
H.P. Lambert, R.G. Finch and D. Greenwood, eds. Antibiotic and Chemotherapy:<br />
Anti-infective Agent and Their Use in Therapy. 7 th ed. Churchill Livingstone,<br />
New York. 957 P.<br />
119<br />
Williams, S.T., M. Goodfellow and G. Alderson. 1989. Genus Streptomyces, pp. 2452-<br />
2492. In S.T. Williams, ed. Bergey’s Manu<strong>al</strong> of Systematic Bacteriology. Vol. 4.<br />
Williams and Wilkins, B<strong>al</strong>timore. 349 p.<br />
Wu, K., L. Chung, W.P. Revill, L. Katz and C.D. Reeves. 2000. The FK520 gene<br />
cluster of Streptomyces hygroscopicus var. ascomyc<strong>et</strong>icus (ATCC 14891) contains<br />
genes for biosynthesis of unusu<strong>al</strong> polyk<strong>et</strong>ide extender units. Gene 251: 81-90.<br />
Wu, N., D.E. Cane and C. Khosla. 2002. Quantitative an<strong>al</strong>ysis of the relative<br />
contributions of donor acyl carrier proteins, acceptor k<strong>et</strong>osynthases, and linker<br />
regions to intermodular transfer of intermediates in hybrid polyk<strong>et</strong>ide synthases.<br />
Biochem. 41: 5056-5066.<br />
Xiang, L. and B.S. Moore. 2002. Inactivation, complementation, and h<strong>et</strong>erologous<br />
expression of encP, a novel bacteri<strong>al</strong> phenyl<strong>al</strong>anine ammoni<strong>al</strong>yase gene. J. Biol.<br />
Chem. 277: 32505-32509.<br />
Xiao, K., L.L. Kinkel and D.A. Samac. 2002. Biologic<strong>al</strong> control of Phytophthora root<br />
rots on <strong>al</strong>f<strong>al</strong>fa and soybean with Streptomyces. Biol. Control 23: 285-295.<br />
Xue, Y., L. Zhao, H.W. Liu and D.H. Sherman. 1998. A gene cluster for macrolide<br />
antibiotic biosynthesis in Streptomyces venezuelae: architecture of m<strong>et</strong>abolic<br />
diversity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 12111-12116.<br />
Yanisch-Perron, C., J. Vieira and J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning<br />
vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19<br />
vectors. Gene 33: 103-119.
ประวัติการศึกษา<br />
่<br />
ชื่อ<br />
นายประกิตชัย โชติวุฒิมนตรี<br />
เกิดวันที<br />
7 มิถุนายน 2523<br />
สถานที่เกิด<br />
อําเภอเมือง จังหวัดนนทบุรี<br />
ประวัติการศึกษา<br />
ผลงานทางวิชาการ<br />
วท.บ. (ชีววิทยา) พันธุศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร (2544)<br />
120<br />
ประกิตชัย โชติวุฒิมนตรี และ อรินทิพย ธรรมชัยพิเนต. 2546. การคอนจูเกชันตางจีนัส<br />
ระหวาง Escherichia coli และ Streptomyces rimosus R7, น. 385-388. ใน รายงาน<br />
การสัมมนาวิชาการพันธุศาสตร ครั้งที่<br />
13. มหาวิทยาลัยนเรศวร, พิษณุโลก.<br />
Chotewutmontri, P. and A. Thamchaipen<strong>et</strong>. 2002. Cloning of type I polyk<strong>et</strong>ide synthase<br />
gene from Streptomyces rimosus R7, an anti-fung<strong>al</strong> producer, P-EP03. In<br />
Proceedings of the 14 th Annu<strong>al</strong> Me<strong>et</strong>ing of the Thai Soci<strong>et</strong>y for Biotechnology.<br />
Thamchaipen<strong>et</strong>, A. and P. Chotewutmontri. 2002. Phylogen<strong>et</strong>ic an<strong>al</strong>ysis of KS, AT and<br />
ACP domains of TypeI polyk<strong>et</strong>ide synthase genes from actinomyc<strong>et</strong>es, P-BMicro-<br />
04. In Proceedings of the Internation<strong>al</strong> Conference on Bioinformatics 2002.<br />
Thamchaipen<strong>et</strong>, A., P. Chotwutmontri, N. Pulsawat, N. Peric and I.S. Hunter. 2003.<br />
Insertion<strong>al</strong> inactivation of a putative acyl CoA-ligase gene from oxyt<strong>et</strong>racycline<br />
gene cluster of Streptomyces rimosus, pp 104-107. In Proceeding of the 13 th<br />
Annu<strong>al</strong> Me<strong>et</strong>ing of the Thai Soci<strong>et</strong>y for Gen<strong>et</strong>ics.
Change language