et al
et al
et al
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
5.6.4 การติดฉลากดีเอ็นเอที่ใชเปนโพรบ<br />
ใชชุดอุปกรณ Gene Images random prime labeling module<br />
(Amersham Pharmacia Biotech, UK) ทําตามวิธีการในคูมือ<br />
โดยนําดีเอ็นเอที่ใชทําเปนโพรบ<br />
50 นาโนกรัม ในน้ํากลั่นปริมาตร<br />
34 ไมโครลิตร ไปทําใหเสียสภาพในน้ําเดือด<br />
เปนเวลา 5 นาที<br />
แลวแชในน้ําแข็งทันที<br />
เปนเวลา 5 นาที เติม Nucleotide mix 10 ไมโครลิตร Random primer<br />
5 ไมโครลิตร Klenow 1 ไมโครลิตร ในปริมาตรสุดทาย 50 ไมโครลิตร ผสมใหเขากัน แลวบม<br />
ที่<br />
37 องศาเซลเซียส เปนเวลาขามคืน เก็บรักษาในที่มืด<br />
ที่<br />
-20 องศาเซลเซียส กอนนําไปใช<br />
5.6.5 Hybridisation และการตรวจสอบผล<br />
ใชชุดอุปกรณ Gene Images CDP-star d<strong>et</strong>ection module (Amersham<br />
Pharmacia Biotech, UK) โดยบมเมมเบรนใน Hybridisation buffer [5 % Liquid block, 5x<br />
SSC (20x SSC; 3 M sodium chloride, 0.3 M sodium citrate, pH 7.0), 0.1 % SDS, 5 %<br />
(w/v) dextran sulphate หรือ 1.25 % PEG MW=8000] ที่อุณหภูมิ<br />
68 องศาเซลเซียส เปน<br />
เวลา 1-2 ชั่วโมง<br />
จากนั้นเติมดีเอ็นเอโพรบที่ทําใหเสียสภาพแลว<br />
ปริมาตร 5-10 ไมโครลิตร<br />
ขึ้นกับขนาดของเมมเบรน<br />
(ทําโดยนําดีเอ็นเอโพรบปริมาณที่เหมาะสมเติมลงใน<br />
Hybridisation<br />
buffer 500 ไมโครลิตร แลวนําไปทําใหเสียสภาพในน้ําเดือด<br />
เปนเวลา 5 นาที แลวแชในน้ําแข็ง<br />
ทันที เปนเวลา 5 นาที กอนนําไปเติม) บมไวที่อุณหภูมิเดิมเปนเวลาขามคืน<br />
จากนั้นนําเมม<br />
เบรนมาลางดวยสารละลายที่ประกอบดวย<br />
2x SSC และ SDS เขมขน 0.1 เปอรเซ็นต (w/v) ที่<br />
อุณหภูมิหอง เขยา 50 รอบตอนาที เปนเวลา 20 นาที 2 ครั้ง<br />
แลวลางดวย สารละลาย 0.1x<br />
SSC และ SDS เขมขน 0.1 เปอรเซ็นต (w/v) ที่อุณหภูมิ<br />
68 องศาเซลเซียส 15 นาที 2 ครั้ง<br />
โดยเขยาบางเปนครั้งคราว<br />
จากนั้นนําไปลางในสารละลาย<br />
Washing buffer [0.3% Tween 20<br />
ใน Buffer A (10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl pH 9.5)] เปนเวลา 1-5 นาที จึงนําไปบม<br />
ใน Blocking solution (10 % Liquid block ใน buffer A) ที่อุณหภูมิหอง<br />
เขยา 50 รอบตอนาที<br />
เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
แลวนําไปบมใน Antibody solution [anti-fluorescein <strong>al</strong>k<strong>al</strong>ine phosphatase<br />
conjugate 1: 5000 ใน Buffer A ที่มี<br />
0.5 % bovine serum <strong>al</strong>bumin (BSA)] เขยา 50 รอบตอ<br />
นาที เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
แลวนําเมมเบรนไปลางใน Washing buffer โดยเขยา 50 รอบตอนาที<br />
เปนเวลา 10 นาที 3 ครั้ง<br />
จากนั้นนําเมมเบรนวางบนแผนพลาสติก<br />
เติม CDP-star d<strong>et</strong>ection<br />
agent จนทวมแผนเมมเบรน นําพลาสติกอีกแผนปดทับโดยไมใหมีฟองอากาศ ทิ้งไว<br />
5 นาที รีด<br />
ของเหลวสวนเกินออก แลวนําไปทาบกับฟลม Kodak Medic<strong>al</strong> X-ray Film (Kodak, Japan)<br />
ระยะเวลาตามความเหมาะสม นําฟลมไปลางดวยสารละลาย Kodak Developer and Replenisher<br />
33
Change language