et al
et al
et al
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
8. การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมสําหรับการเกิดคอนจูเกชันตางสกุลระหวาง<br />
S. rimosus R7<br />
และ E. coli ET12567 (pUZ8002)<br />
ศึกษาปจจัยตางๆ ที่เกี่ยวของกับประสิทธิภาพของการสงถายพลาสมิด<br />
ในการเกิดคอนจู<br />
เกชันตางสกุลระหวาง S. rimosus R7 และ E. coli ET12567 (pUZ8002) ซึ่งไดดัดแปลง<br />
วิธีการมาจาก Mazodier <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1989) โดยใชพลาสมิด pIJ8600 (ภาพที่<br />
6; Sun <strong>et</strong> <strong>al</strong>.,<br />
1999) และ pSET152 (ภาพที่<br />
7; Bierman <strong>et</strong> <strong>al</strong>., 1992) ซึ่งเปน<br />
mobilisable plasmid ที่มี<br />
attP เมื่อเกิดการสงถายโดยอาศัย<br />
tra บน pUZ8002 ใน E. coli ทําใหสามารถตรวจสอบไดจาก<br />
การแทรกตัวของพลาสมิดเขาไปในโครโมโซมบริเวณ attB<br />
8.1 การศึกษาหาอุณหภูมิและเวลาที่เหมาะสมในการกระตุนการงอกของสปอร<br />
ในการกระตุนการงอกของสปอรใชขั้นตอนตาม<br />
Kieser <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (2000) โดยเก็บ<br />
สปอรของ S. rimosus R7 ที่เลี้ยงบนอาหาร<br />
MS ที่อุณหภูมิ<br />
30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3-5<br />
วัน ปรับใหสปอรมีความเขมขนเปน 10 2 -10 3 สปอรตอมิลลิลิตร ในอาหาร 2x YT (1l: 16<br />
g tryptone, 10 g yeast extract, 5 g NaCl 5 g) แลวนําสปอรไปกระตุนการงอก<br />
โดยทดสอบ<br />
อุณหภูมิที่เหมาะสมในเวลาบม<br />
10 นาที ที่อุณหภูมิ<br />
30, 35, 40, 45, 50, 55 และ 60<br />
องศาเซลเซียส เมื่อตองการทดสอบระยะเวลาที่เหมาะสม<br />
จะใชเวลาบม 0, 5, 10, 15 และ<br />
20 นาที ที่อุณหภูมิ<br />
40 และ 45 องศาเซลเซียส จากนั้นทิ้งใหสปอรเย็นลงโดยแชในอางน้ําที่<br />
อุณหภูมิหอง แลวนําไปปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที แขวนลอยตะกอน<br />
ใน 2x YT ปริมาตร 100 ไมโครลิตร แลวนําไปเกลี่ยบนอาหารแข็ง<br />
MS ที่มี<br />
MgCl2 10 มิลลิโม<br />
ลาร บมไวที่<br />
30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3 วัน บันทึกจํานวนโคโลนีที่เจริญบนอาหาร<br />
8.2 การเตรียม E. coli ET12567 (pUZ8002/pIJ8600)<br />
สกัดพลาสมิด pIJ8600 จาก E. coli S17-1 ตามวิธีการในขอ 4.2 แลวนําไป<br />
ทําทรานสฟอรเมชัน ตามวิธีการในขอ 4.5 เขาสู<br />
E. coli ET12567 (pUZ8002) คัดเลือก<br />
โคลน ในอาหาร LB ที่มี<br />
อะพรามัยซิน (คัดเลือก pIJ8600) คานามัยซิน (คัดเลือก Tn9 ที่ทําให<br />
E. coli มีจีโนไทปเปน dam - ) และคลอแรมฟนิคอล (คัดเลือก pUZ8002) ความเขมขนตาม<br />
ตารางที่<br />
4 นําโคลนที่ไดไปตรวจสอบ<br />
โดยสกัดพลาสมิด แลวตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
BamHI นําไปแยกขนาดโดยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส<br />
39
Change language