et al
et al
et al
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
4.4 การเตรียมคอมพิเทนตเซลล (Comp<strong>et</strong>ent Cell) ของ E. coli<br />
ทําตามวิธีของ Chung <strong>et</strong> <strong>al</strong>. (1989) โดยนําเชื้อที่เลี้ยงขามคืนในอาหาร<br />
LB<br />
ปริมาตร 500 ไมโครลิตร ลงเลี้ยงในอาหาร<br />
LB ปริมาตร 50 มิลลิลิตร ในขวดรูปชมพูขนาด<br />
250 มิลลิลิตร เขยา 250 รอบตอนาที ที่<br />
37 องศาเซลเซียส จนมีคาดูดแสงที่ความยาวคลื่น<br />
600<br />
นาโนเมตร (OD600) เปน 0.3-0.4 (ประมาณ 2-3 ชั่วโมง)<br />
ถายใสหลอดขนาด 50 มิลลิลิตร<br />
แลวแชน้ําแข็งเปนเวลา<br />
15 นาที จึงนําไปปนเหวี่ยงเก็บเซลล<br />
ที่<br />
4,000 รอบตอนาที อุณหภูมิ 4<br />
องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 นาที เทอาหารทิ้ง<br />
แลวเติม Transformation and storage solution<br />
[TSS; 10 % (w/v) poly<strong>et</strong>hylene glycol (PEG) MW=8000, 5 % dim<strong>et</strong>hylsulphoxide<br />
(DMSO), 50 mM MgCl2, in LB, pH 6.5) ที่เย็นจัด<br />
ปริมาตร 5 มิลลิลิตร แขวนลอยเซลล<br />
ในสารละลาย นําไปปนเหวี่ยงเก็บเซลล<br />
แลวแขวนลอยเซลลใน TSS ปริมาตร 3 มิลลิลิตร<br />
แบงเก็บในหลอดขนาด 1.5 มิลลิลิตร ที่เย็น<br />
หลอดละ 100 ไมโครลิตร แชหลอดทิ้งไวในน้ําแข็ง<br />
เปนเวลา 10 นาที ถายังไมนําไปใชใหเก็บรักษาไวที่<br />
-80 องศาเซลเซียส<br />
4.5 การทรานสฟอรเมชัน (Transformation)<br />
ใชวิธี heat-shock (Sambrook and Russell, 2001) โดยนําคอมพิเทนตเซลล<br />
100 ไมโครลิตร แลวเติมพลาสมิด 1-10 ไมโครลิตร ใชปเปตตผสมเบาๆ ทิ้งไวในน้ําแข็งอีก<br />
20 นาที จึงนําไปบมที่อุณหภูมิ<br />
42 องศาเซลเซียส เปนเวลา 90 วินาที แลวนํากลับไปแชใน<br />
น้ําแข็งทันที<br />
เปนเวลา 5 นาที เติมอาหาร LB ปริมาตร 900 ไมโครลิตร แลวบมที่<br />
37 องศา<br />
เซลเซียส เขยา 250 รอบตอนาที เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
จึงแบงเซลล 100 ไมโครลิตร ไปเกลี่ยลง<br />
อาหาร LA ซึ่งมียาปฏิชีวะนะตามความเหมาะสมเพื่อคัดเลือก<br />
โดยใชความเขมขนของยาปฏิชีวนะ<br />
ตามตารางที่<br />
4 กรณีที่คัดเลือกโดยการทํางานของยีน<br />
lacZ จะเกลี่ยทับอาหารแข็งไวกอนดวย<br />
X-g<strong>al</strong> (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-g<strong>al</strong>actoside) เขมขน 20 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร<br />
ใน dim<strong>et</strong>hylformamide ปริมาตร 40 ไมโครลิตร และ IPTG (isopropylthio-β-D-g<strong>al</strong>actoside)<br />
เขมขน 200 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ปริมาตร 4 ไมโครลิตร จากนั้นบมจานอาหารที่เกลี่ยดวย<br />
เซลลแลวที่<br />
37 องศาเซลเซียส เปนเวลาขามคืน คัดเลือกโคโลนีที่เจริญ<br />
ไปตรวจสอบการ<br />
ไดรับพลาสมิดตอไป<br />
29
Change language