et al
et al
et al
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
ถายลงสูหลอดใหม<br />
(อาจทําซ้ํา<br />
2-3 ครั้ง<br />
ถามีปริมาณตะกอนโปรตีนมาก) เติมโซเดียมอะซิเทต<br />
ความเขมขน 3 โมลาร ปริมาตร 0.1 เทา ของปริมาตรสารละลายที่ดูดได<br />
เติมไอโซโพรพานอล<br />
ปริมาตร 1 เทา ผสมโดยพลิกหลอดไปมาเบาๆ ตั้งไวที่อุณหภูมิหองเปนเวลา<br />
5 นาที แลวปน<br />
เหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 10 นาที เทสารละลายออก แลวลางตะกอนดีเอ็นเอดวย<br />
เอธานอล 70 เปอรเซ็นต ปริมาตร 200 ไมโครลิตร ดูดสารละลายออกใหหมด ทิ้งใหตะกอน<br />
แหง แลวละลายตะกอนดีเอ็นเอในบัฟเฟอร TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)<br />
ปริมาตร 20-50 ไมโครลิตร ตามความเหมาะสม เก็บรักษาไวที่อุณหภูมิ<br />
4 องศาเซลเซียส ถา<br />
ตองการเก็บรักษาเปนระยะเวลานานจะเก็บที่<br />
-20 องศาเซลเซียส<br />
4. วิธีการพื้นฐานที่ใชสําหรับ<br />
E. coli<br />
วิธีการพื้นฐานที่ใชสําหรับ<br />
E. coli ใชวิธีการตาม Sambrook and Russell (2001)<br />
4.1 อาหารและสภาวะที่ใชเลี้ยง<br />
การเลี้ยง<br />
E. coli บนจานอาหารแข็ง จะเขี่ยเชื้อลงบนอาหารแข็ง<br />
Luria-Bertani<br />
(LA; 1l: 10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl, 15 g agar, pH 7.2) แลวบมที่<br />
37<br />
องศาเซลเซียส เปนเวลาขามคืน<br />
การเลี้ยงในอาหารเหลว<br />
จะเติมเชื้อลงในขวดรูปชมพูที่มีอาหารเหลว<br />
อัตราสวน<br />
1: 100 โดยใชอาหารเหลว LB (สูตรเหมือน LA แตไมเติม agar) นําไปเขยา 250 รอบตอนาที<br />
ที่<br />
37 องศาเซลเซียส เปนเวลาขามคืน<br />
เมื่อเลี้ยง<br />
E. coli ที่สามารถตานทานยาปฏิชีวนะ<br />
จะเติมยาปฏิชีวนะที่เหมาะสม<br />
ในความเขมขนดังตารางที่<br />
4<br />
4.2 การสกัดพลาสมิด<br />
ใชวิธี Alk<strong>al</strong>ine lysis with SDS ของ Sambrook and Russell (2001) โดยนํา<br />
เชื้อ<br />
E. coli ที่เลี้ยงในอาหาร<br />
LB เปนเวลาขามคืน ปริมาตร 1.5 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดขนาด<br />
1.5 มิลลิลิตร ปนเหวี่ยงที่<br />
12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาที เพื่อเก็บเซลล<br />
เทอาหารทิ้ง<br />
จากนั้นแขวนลอยตะกอนเซลลใน<br />
Solution I (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl, 10 mM<br />
EDTA, pH 8.0) ที่เย็นจัด<br />
ปริมาตร 100 ไมโครลิตร นําไปแชในน้ําแข็งเปนเวลา<br />
10-15 นาที<br />
27
Change language