Parte 2 - CusMiBio - Università degli Studi di Milano

Negli individui di origine Boera è frequente una mutazione del gene del recettore LDL consistente in una sostituzione
di una coppia di basi (G C) nell’esone 4 del gene che crea un sito per l’enzima di restrizione DdeI: 5’ C/TNAG 3’
3’ GANT/C 5’
La mutazione causa anche una sostituzione amminoacidica Asp Glu che modifica la maturazione della proteina
recettore e ne riduce la capacità di legare LDL una volta giunta sulla superficie cellulare.
Il probando riferisce che lo zio deceduto si era sottoposto all’analisi del DNA e le analisi in suo possesso confermano
che era portatore della mutazione sopradescritta.
Pr fw
Amplificando con la PCR un segmento di DNA di
DdeI
235 bp che comprende il sito DdeI (posizionato
Esone 4
130 bp dall’estremità 5’), e digerendo il prodotto
Pr rev
della PCR con l’ER DdeI, quale è il numero e la
lunghezza (in bp) delle bande che vi aspettate di
trovare negli individui che hanno ereditato l’allele
235 bp (normale)
mutato (omozigoti o eterozigoti) e in quelli che
non lo hanno (omozigoti normali)
130 + 105 bp (mutato)
Analizzeremo il DNA dei membri della famiglia
disponibili, per individuare chi è portatore della stessa mutazione identificata nello zio deceduto.
Scenario 3. Emofilia A (HEMA) #OMIM 306700
Sei anni fa ha richiesto consulenza genetica una giovane coppia proveniente da un piccolo centro dell’appennino
marchigiano. All’anamnesi sono stati raccolti i seguenti dati: la donna aveva un fratello emofilico, morto a 8 anni in
seguito ad una emorragia intestinale. I suoi genitori non hanno l’emofilia. Il marito è sano. Il loro primo figlio è un
maschio affetto da emofilia A. La domanda della coppia riguardava il rischio di avere altri figli emofilici. La risposta
era stata che ogni figlio maschio aveva 50% di probabilità di essere emofilico e che era quindi consigliabile, in caso di
una successiva gravidanza in cui fosse accertato il sesso maschile del feto, eseguire l’analisi del DNA fetale per fare
diagnosi prenatale di malattia.
Essendo l’emofilia A, come abbiamo già detto (vedi §2.4) una patologia estremamente eterogenea (il catalogo OMIM
riporta 270 varianti alleliche principali), per identificare quale è la mutazione responsabile della malattia in ogni
singolo caso è necessario effettuare delle analisi del DNA estremamente complesse e laboriose che richiedono
laboratori attrezzati. Una via più semplice e tecnicamente meno impegnativa è quella di fare una diagnosi indiretta di
malattia utilizzando un marcatore RFLP associato all’allele malattia (vedi pag. 15). Sono stati identificati alcuni
RFLP associati al gene che codifica il fattore VIII. Come abbiamo già detto (vedi pag. 15), per avere dei risultati
significativi è necessario analizzare il DNA di molti individui all’interno della famiglia per identificare quale RFLP
utilizzare e quale allele del RFLP scelto è associato all’allele malattia all’interno di quella famiglia.
La coppia è ora in attesa di un figlio che ecograficamente è risultato maschio. La donna vuole sottoporsi ad
amniocentesi. Si rimette in contatto con il centro di Milano che consiglia di rivolgersi a un laboratorio del capoluogo
della regione di residenza che non è attrezzato per l’identificazione diretta della mutazione ma è invece
tecnologicamente in grado di eseguire una analisi del DNA per identificare RFLP associati alla malattia.
Sono disponibili i DNA della donna che richiede l’analisi e che è in attesa del quarto figlio, di sua madre, di due suoi
fratelli e di una sua sorella; sono disponibili anche i DNA dei tre bambini della signora: il maschio emofilico e due
figlie femmine nate nel frattempo.
Costruite il pedigree di questa famiglia (rivedere il §2.2). Se non ricordate la modalità di trasmissione ereditaria
dell’emofilia A consultate il catalogo OMIM (§2.3). Verificate il vostro pedigree con quello che trovate a pag.22.
Nella famiglia è risultato significativo il RFLP legato a un sito Hind III all’interno dell’introne 19 del gene. Questa
mutazione è una piccola delezione (del AGAG) che crea un sito Hind III 5'A/A G C T T 3'
3'T T C G A/A 5'
Pr fw
HindIII
Introne 19
Pr rev
717 bp (-)
167 + 550 bp (+)
(+)(+)(+
Nella famiglia l’allele malattia è associato all’allele (-)
del RFLP (= assenza della delezione e quindi del sito).
Quindi l’allele (-) sarà identificato dalla presenza di 1
banda e l’allele (+) sarà identificato dalla presenza di
2 bande.
Amplificando con la PCR un segmento di DNA di
717 bp che comprende il sito HindIII (posizionato 167
bp dall’estremità 5’), e digerendo il prodotto della
PCR con l’ER HindIII, quale è il numero e la lunghezza (in bp) delle bande che vi aspettate di trovare nel DNA dei
soggetti malati della famiglia, dei soggetti portatori, dei soggetti sani
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