(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

: 물에서 30 mg/ml BSA 5 ml 를 NP7.5에서 134 mg/ml PGA 1 ml 와 혼합한다. EDCA 50 mg 을 첨가하여 실온에서
반응을 3시간동안 진행시킨다. 반응은 활성화기를 차단하기 위한 1 mM 의 글리신이 포함된 SP7.4에 대해 18
시간동안 4℃에서 투석하였다. 그리고 나서 SP7.4에 대해서만 24시간동안 4℃에서 투석하였다. 최종산물은
PGA-BSA 접합체라고 불린다.
PCMV와 대조군 표본을 합성하고 투석한 뒤, DNI 단백질의 분자 상태를 시험하여 다양한 양의 PGA의 존재 혹은
부존재하에서 글루타르알데히드가 분자 단계에서 정말로 단백질과 크로스링크 되었는지 확인하였다. PCMV와
대조군표본은 SDS (sodium dodecyl sulphate) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)과 항-PA 항혈청을 이용한
웨스턴 블로팅에 의해 모니터링한다. 도 2에서 보듯이 DNI 단백질은 글루타르알데히드의 크로스링크 이전에
84kDa에서 이동한다. PCVMl-PCMV3(레인1-3)은 220kDa 이상의 분자량에서 밴드가 이동함으로써 DNI 단백질이
광범위한 크로스링크를 함을 보여준다. PGA가 없이 홀로 크로스링크되는 DNI 단백질도 높은 분자량을 나타낸
다(레인 5). 반대로, PGA와 혼합하였으나 글루타르알데히드를 처리하지 않은 DNI는 DNI 또는 더 낮은 분자
량의 물질과 함께 이동한다. Vedan(Taiwan)에서 구입한 PGA 표본은 DNI에 대한 활성을 가지는 프로테아제에
의해 오염된 것으로 보인다. 그러나 6번 레인의 Vedan PGA의 샘플은 항-PA 항혈청과 반응하는 오염단백질의
함유량이 낮아 관찰된 밴드는 다양한 반응을 통해 DNI로부터 유래된 생성물임을 보여준다.
뿐만 아니라, 콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모(FLA)가 PCMV에 포함되는 DNI보다 나은 수송단백질인지 여부를
알아보기 위해 PGA 와 하나 이상의 폐구균(pneumococcal) 다당류를 항원으로 사용하였다. 수송단백질의 효과
는 PGA에 작용하는 Ig G 의 양과 다양한 PCMV 및 이들의 단백질에 의한 면역과정을 톨해 얻어지는 다당류의 양
에 의해 측정한다.
PCMV는 아미노기를 이중작용기성 크로스링커를 사용하지 않고 카르복시기에 직접 크로스링크시켜 만들 수
있다. 특히 PCMV는 카보디이마드를 이용하여 아미노기와 수송단백질의 카르복시기를 크로스링크시킴으로써 만
들 수 있다. 이 화학구조는 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 및 글루타민산 측쇄의 카르복시기
간의 펩타이드 결합을 형성한다. 아미노기는 톡소이드로 처리된 포르말린에 대부분 차단되지만 포르말린은 카
르복시기와 전혀 반응하지 않는다. 따라서, 카보디이미드는 글루타르알데히드에 저항할 수 있는 포르말린 톡
소이드를 이용한 PCMV 함성에 유용할 수 있다. 크로스링킹은 SDS-PAGE에 의해 쉽게 탐지된다. 글루타르알데
히드와 같은 크로스링커의 첨가에 따른 고분자량의 단백질“얼룩”의 존재는 크로스 링크가 일어났음을 알려준
다.
표 2
SDS-PAGE에 의해 탐지된 수송단백질의 크로스링크
글루타르알데히드 부존재 존재 존재 존재 존재
캡슐 중합체 -PGA -PGA +PGA +PS6B +PS23F
BSA - + + + +
디프테리아 톡신 - + + n.d. n.d
디프테리아 톡소이드 - - - n.d. n.d
테타누스 톡소이드 - + + n.d. n.d
+표시는 SDS-PAGE에서 크로스 링크가 탐지되었음을 나타내고, -표시는 글루타르알데히드가 없는 대조군에서 단
백질 이동의 변동이 없음을 나타낸다. n.d.는 분석이 행해지지 않아 알 수 없음을 나타낸다.
표 2에 나타난 실험을 위해 200 마이크로리터의 반응을 pH 7.5의 50 mM HEPES(4-(2- hydroxyethyl)-1-
piperazineethane sulfonic acid)에서 수행하고 2시간동안 분위기온도(Ambient Temperature)에서 배양하였다.
반응은 120M의 보로수소화나타륨에 의해 종료되었다. 글루타르알데히드는 64 mM 를 첨가하였고, BSA( bovine
serum albumin) 15mg/ml를 사용하였으며, 디프테리아 톡신,디프테리아 톡소이드 및 테타누스 톡소이드가 약 5
mg/ml 로 사용되었다. PGA는 13.4 mg/ml, 폐 다당류(pneumo PS) 6B 및 23F가 4 mg/ml 첨가되었다.
표 2에서 보는 바와 같이, 포르말린이 처리된 몇몇 단백질(예;디프테리아 톡소이드)은 글루타르알데히드와 잘
크로스링크되지 않으며, 따라서 PCMV 합성을 위해서 다른 크로스링크 화학구조가 필요하다. 테타누스 톡소이
드와 같은 다른 단백질들은 글루타르알데히드와 크로스링크되기는 하나 디프테리아 톡신이나 BSA같은 비변형 단
백질만큼 광범위하게 크로스링크되지는 않는다.
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공개특허 10-2009-0066272