(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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세포주는 바람직하게는 무혈청 배양 배지 및/또는 무단백질 배지에서 성장한다. 배지는 인간 또는 동물 유래의
혈청으로부터의 첨가물이 없을 때 본 발명의 문맥에서 무혈청 배지로 지칭된다. 이런 배양에서 성장하는 세포는
천연적으로 단백질 자체를 함유하지만, 무단백질 배지는 단백질, 성장인자, 다른 단백질 첨가물 및 무혈청 단백
질을 배제한 상태에서 세포의 증식이 일어나는 것으로 이해되지만, 바이러스 성장에 필요할 수 있는 트립신 또
는 다른 프로테아제와 같은 단백질을 선택적으로 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 바이러스 복제 동안 바람직하게는 37℃(예컨대 30-36℃, 또는
약 3O℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃) 아래에서 자란다[55].
배양된 세포에서 인플루엔자 바이러스를 번식시키는 방법은 일반적으로 자라날 주의 접종물로 세포의 배양액을
접종하는 단계, 예를 들면, 바이러스 역가 또는 항원 발현에 의해 결정되는 바와 같은, 바이러스 번식에 대하여
원하는 시간 동안 감염된 세포를 배양하는 단계(예컨대 접종 후 24 및 168시간 사이), 및 번식된 바이러스를 수
득하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 더욱 바람직하게는
1:50 내지 1:10의 세포에 대한 바이러스(PFU 또는 TCID50에 의해 측정됨)의 비율로 접종된다. 바이러스는 세포의
부유물에 첨가되거나 세포의 단층막에 적용되고, 바이러스는 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 37℃에서
적어도 60분, 보통 300분 미만, 바람직하게는 90 및 240분 사이 동안 흡수된다. 감염된 세포 배양액(예컨대 단
층막)은 회수된 배양 상청액의 바이러스 함량을 증가시키기 위해 동결-해동 또는 효소적 반응 중 어느 하나에
의해 제거될 수 있다. 회수된 유체는 이후 불활성화되거나 동결 보관된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10,
바람직하게는 0.002 내지 5, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 2의 다중 감염("m.o.i.")으로 감염될 수 있다. 더욱
더 바람직하게는, 세포는 약 0.01의 m.o.i로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60시간 후에 회수될 수
있다. 바람직하게는 세포는 감염 후 34 내지 48시간에 회수된다. 더욱 더 바람직하게는 세포는 감염 후 38 내지
40시간 내에 회수된다. 프로테아제(전형적으로 트립신)는 바이러스 분비를 허용하기 위해 세포 배양 동안 일반
적으로 첨가되며, 프로테아제는 접종 중의 적당한 임의의 단계에서, 예컨대 접종 전, 접종과 동시에 또는 접종
후에 첨가될 수 있다[55]. 일부 구체예에서, 특히 MDCK 세포와 함께, 세포주는 임상시험용 줄기 세포 은행으로
부터 40번의 집단-배가 수준 이상으로 계대배양되지 않았다.
바이러스 접종물 및 바이러스 배양은 바람직하게는 단순 포진 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루
엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 버나
바이러스, 써코바이러스, 및/또는 파보바이러스가 없는 것이 바람직하다(즉 시험을 실시하여 이에 대한 오염에
대하여 음성적인 결과를 받을 것임)[56]. 단순 포진 바이러스의 부재가 특히 바람직하다.
숙주 세포 DNA
바이러스가 세포주에서 자랐을 때, 이후 DNA의 임의의 발암적 활성을 최소화하기 위하여, 최종 백신에서 잔여
세포주 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 실행이다. 따라서 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 숙주 세포
DNA의 자취량이 존재할 수 있다 하더라도, 바람직하게는 투여량 당 잔여 숙주 세포 DNA의 10ng 미만(바람직하게
는 1 ng 미만, 및 더욱 바람직하게는 1OO pg 미만)를 함유한다.
0.25 ㎖ 부피 당