Manual de Técnicas.DOC - USP

GUIA-TP 3
Incubam-se 104 espermatozóides/1 ml de soro sanguíneo
(ver mais adiante) a 37 0 C por 3 ou 4 horas em uma placa
de cultura. Cobrir com azeite mineral. Ao cabo desse
tempo pode-se examinar os espermatozóides com o
microscópio de contraste de fases para avaliar a
ativação e reação do acrosoma (ver Barros, 1974).
e) Inseminação artificial
Fêmeas induzidas a ovular ou superovular são
anestesiadas com Avertina, Nembutal ou éter e, através
de uma incisão médio-ventral, injetam-se nos cornos
uterinos 0,2 ml de uma suspensão de espermatozóides (2
epidídimos para 4 cornos uterinos). Em seguida liga-se o
corno uterino cranialmente da entrada da agulha. Sutura-
se o animal e, aos diferentes tempos desejados, obtém-se
os ovos fecundados. Para uma maior segurança (não muita)
convém inseminar umas 12 horas após a injeção de HCG.
f) Preparação do soro sanguíneo 70 o C
Deixa-se coagular sangue humano obtido sem
anticoagulante e depois o submete a centrifugação para a
obtenção do soro. Aquece-se em banho-maria a 70 o C por 1
hora o soro obtido com a centrifugação. Passa-se este
soro coagulado por homogenizador e centrifuga-se
novamente a 15 000 rpm (± 27 000 g) durante 30 minutos.
Obtém-se um sobrenadante fluído que, depois de ser
esterilizado por filtração, pode ser envasado em
alíquotas de 1cc a -40 o C. Uma vez descongelado, o soro
só deve ser usado uma única vez.
g) Fecundação "in vitro"