Esquistossomose mansoni humana: Análise do papel da ... - Unifenas

MATERIAL E MÉTODOS
(10 min, 400 X g, 4°C). As células eram lavadas por mais duas vezes utilizando-se
cerca de 30 ml de MEM. Ao final, as células eram ressuspendidas em 2 ml de meio
de cultura RPMI-1640 (GIBCO). Uma alíquota da suspensão de células era diluída
(1:20) em solução de Turck's, e o número de células determinado através de
contagem em câmara de Newbauer, com o auxílio de um microscópio ótico. A
concentração de células era ajustada para uma suspensão contendo 10 X 10 6
células/ml de RPMI-1640. Toda manipulação das células era realizada em
condições estéreis, em capela de fluxo laminar (BBL-Biological Cabinet, model
60474).
4.4 - ENSAIO DE GRANULOMA IN VITRO
4.4.1 - LIGAÇÃO DO SEA ÀS ESFERAS DE POLIACRILAMIDA
Para ligação do antígeno de SEA, esferas de poliacrilamida (Bio-gel P-4,
200-400 mesh, BIORAD cat n o 150-0450), eram acondicionadas em frasco de vidro
siliconizado, e esterilizados por autoclavação. Posteriormente as esferas eram
hidratadas em 1000 ml de água destilada, por 48 horas, à temperatura ambiente.
Após a lavagem em tampão carbonato/bicarbonato 0.5 M, 200 mg de esferas de
poliacrilamida eram incubadas, por 4 horas, em banho-maria a 63 o C, sob agitação
lenta e contínua em tampão carbonato/bicarbonato 0.5 M. Esta operação era
repetida novamente, seguida da adição de 20 mg de SEA (Ver item II, M&M), na
presença de 100 mg de EDAC (1- etil-3(3-dimetilaminopropil) carbodimida-HCL),
(BIORAD) em 100 ml de água destilada acidificada, pH 5.5 - 6.0. O frasco era
incubado por 18 horas, a 4 o C, sob agitação lenta e contínua. Após esse período, as
esferas eram lavadas e estocadas em PBS contendo 0.1% de azida sódica até o
momento do uso, quando então eram lavadas, por três vezes em RPMI-1640.
Desse modo, obtinha-se esferas de poliacrilamida ligadas ao antígeno solúvel de
ovo (PB-SEA). Em paralelo, as esferas de poliacrilamida para controle (PB) eram
submetidas aos mesmos reagentes e incubações descritos acima, apenas na
ausência de antígeno. Todo o procedimento era realizado em condições estéreis.
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