Esquistossomose mansoni humana: Análise do papel da ... - Unifenas

MATERIAL E MÉTODOS
(1300 rpm, 7 min à 4°C) e o sobrenadante desprezado. As amostras eram então
fixadas com 200 µl de solução fixadora (10 g/l de paraformaldeído, 1% de Cacodilato
de Sódio, 6.67 g/l de cloreto de Sódio, pH 7.2). Após um período de 30 min., a 4°C,
as amostras eram transferidas para tubos de 1 ml e os parâmetros fenotípicos das
células presentes em cada amostra determinado, com o auxílio de um citômetro de
fluxo (FACScan Becton Dickinson) .A identificação das populações celulares de
interesse bem como a determinação do valor percentual de populações e
subpopulações celulares e a expressão de moléculas co-estimuladoras e de adesão
nessas populações eram feitas utilizando-se o software cell quest acoplado ao
citômetro.
A figura 1 mostra, de forma esquemática, a sequência de procedimentos
necessários para análise dos dados obtidos por citometria de fluxo. O primeiro passo
consistiu na identificação de linfócitos. Para isso foram utilizados gráficos de
distribuição puntual onde essa população ocupa uma região característica após
ajustes de ganhos de seu tamanho - FSC e granulosidade - SSC (R1, Figura 1A).
Após a seleção da região de interesse, foi analisada a intensidade de fluorescência
apresentada pelas células presentes na região selecionada, utilizando-se gráficos de
distribuição puntual de fluorescência 1 (FL1) versus fluorescência 2 (FL2) (Figura 1B
e C). A fluorescência do tipo 1 representa células marcadas com isotiocianato de
fluoresceína (FITC) e a fluorescência do tipo 2 representa células marcadas com
ficoeritrina (PE). As análises de subpopulações celulares foram realizadas através
de combinações de gráficos puntuais e de histogramas de fluorescência individual
(Figura 1 C, D e E). Os marcadores de superfície celular que apresentavam
distribuição bimodal, permitindo a discriminação de populações positivas e negativas
foram analisados por “dot plot”. A análise era realizada através da determinação do
percentual de células positivas para os marcadores de interesse. No caso de
marcadores de superfície de células com distribuição unimodal, a análise
quantitativa era realizada através da determinação do canal médio de fluorescência
(CMF) em histogramas unidimensionais. Gráficos de distribuição puntual foram
utilizados para obtenção dos valores percentuais de subpopulações celulares dentro
de região de linfócitos (Figuras 1B e C). Os histogramas de fluorescência individual
foram utilizados para seleção de subpopulação linfocitária de interesse, seguida pela
análise da expressão de um outro marcador pela população selecionada. Esta
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