Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009

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QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008
EXPERIÊNCIA N o. 2: TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COM
PLASMÍDEOS CONTENDO GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS.
Fundamento
A técnica de transformação permite a introdução de plasmídeo em uma bactéria e sua
manutenção como um elemento autônomo auto-replicativo. Este plasmídeo pode conferir à bactéria
hospedeira certas propriedades (por exemplo, resistência a drogas) que podem ter valor seletivo no
meio. Várias técnicas são disponíveis para transformar uma bactéria. Na aula prática usaremos o
método do CaCl2. Neste método as bactérias são submetidas a um tratamento num meio hipotônico
contendo cálcio que as torna competentes para a transformação pelo DNA plasmidial. Usaremos o
plasmídeo pBR322 (ver mapa abaixo).
O plasmídio pBR322 é comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de fragmentos de
genes. Além da origem de replicação que permite sua propagação em bactérias (E. coli) o pBR322
apresenta duas marcas genéticas, ou seja, genes que codificam para proteínas que conferem resistência
a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a introdução de pBR322 em E. coli que normalmente
é sensível tanto à ampicilina como à tetraciclina, leva ao aparecimento de bactérias capazes de crescer
em meio (líquido ou sólido) contendo estes antibióticos.
Note que a introdução de genes exógenos no sítio da enzima de restrição Pst I leva à perda da
resistência à ampicilina, uma vez que este sítio está localizado na região ampr. Da mesma forma,
clonagem no sítio da enzima Bam HI leva à perda da resistência a tetraciclina.
Transformação de bactérias que são sensíveis a um antibiótico, em resistentes, será revelada
através de plaqueamento (inoculação) de bactérias em placas de ágar contendo meio LB (meio rico de
Luria Bertani) na ausência e na presença de antibióticos (ampicilina ou tetraciclina).
Procedimento Experimental