Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009

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Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

EXPERIÊNCIA N o. 2: TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COM

PLASMÍDEOS CONTENDO GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS.

Fundamento

A técnica de transformação permite a introdução de plasmídeo em uma bactéria e sua

manutenção como um elemento autônomo auto-replicativo. Este plasmídeo pode conferir à bactéria

hospedeira certas propriedades (por exemplo, resistência a drogas) que podem ter valor seletivo no

meio. Várias técnicas são disponíveis para transformar uma bactéria. Na aula prática usaremos o

método do CaCl2. Neste método as bactérias são submetidas a um tratamento num meio hipotônico

contendo cálcio que as torna competentes para a transformação pelo DNA plasmidial. Usaremos o

plasmídeo pBR322 (ver mapa abaixo).

O plasmídio pBR322 é comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de fragmentos de

genes. Além da origem de replicação que permite sua propagação em bactérias (E. coli) o pBR322

apresenta duas marcas genéticas, ou seja, genes que codificam para proteínas que conferem resistência

a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a introdução de pBR322 em E. coli que normalmente

é sensível tanto à ampicilina como à tetraciclina, leva ao aparecimento de bactérias capazes de crescer

em meio (líquido ou sólido) contendo estes antibióticos.

Note que a introdução de genes exógenos no sítio da enzima de restrição Pst I leva à perda da

resistência à ampicilina, uma vez que este sítio está localizado na região ampr. Da mesma forma,

clonagem no sítio da enzima Bam HI leva à perda da resistência a tetraciclina.

Transformação de bactérias que são sensíveis a um antibiótico, em resistentes, será revelada

através de plaqueamento (inoculação) de bactérias em placas de ágar contendo meio LB (meio rico de

Luria Bertani) na ausência e na presença de antibióticos (ampicilina ou tetraciclina).

Procedimento Experimental

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