Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009

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QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008
O ideal seria fazermos a experiência em condições estéreis, para evitar contaminação. Como isto não
será possível, manipule convenientemente o material estéril fornecido. NÃO ABRA AS PLACAS DE
ÁGAR ATÉ O MOMENTO DE USO.
As bactérias competentes para transformação foram preparadas a partir de uma cultura em fase
exponencial do crescimento e através de sucessivas lavagens do precipitado de bactérias com uma
solução de CaCl2 e mantidas congelads a -80 o C.
1. Inocular 5 ml de meio LB líquido com uma colônia de bactérias HB101 (E. coli) e incubar à 37°C
até o dia seguinte sob forte agitação (200-250 rpm).
2. Diluir a pré-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar à 37°C sob agitação até OD600nm =0,3 (fase
logarítmica de crescimento).
3. Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactérias por centrifugação (4000 rpm, 5min).
Ressuspender o sedimento de bactérias em 10 ml de tampão acetato de sódio (frio) 20 mM pH 6,5
contendo CaCl2 0,1M. Incubar no gelo por 20 minutos.
4. Coletar as bactérias (4000 rpm, 5 min) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampão (frio).
5. Após pelo menos 30 min no gelo estas BACTÉRIAS COMPETENTES podem ser transformadas.
6. Para transformar, distribuir 0,1 mL/tubo da suspensão de bactérias competentes para cada um de 2
tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 µg DNA de pBR322 em 10 µl de tampão 10 mM Tris pH
7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo será usado como controle (bactéria apenas).
7. Incubar em gelo por 15 min antes de dar o choque térmico (42°C por exatamente 90 segundos).
Transferir os tubos novamente para o gelo por 2 min.
8. Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37°C sem agitação, em banho-maria, por uma hora.
9. Transferir 25µl ou 250µl da suspensão para placas de ágar LB e LB-A (LB contendo ampicilina ou
carbenicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactérias com o auxílio
de uma alça de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na própria tampa da placa de Petri.
10. Incubar as placas por __ h e contar as colônias formadas.
Número de colônias/ placa Placa LB Placa LB-A
#1 Bactérias controle 25µL
#2 Bactérias controle 250µL
#3 Bactérias transformadas 25µL
#4 Bactérias transformadas 250µL