AVALIAÃÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA âIN VITROâ - CCS ...

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- 44 -microplacas com 96 orifícios (COSTAR ® 3590, USA) foram preparadas de forma quecada poço tinha ao final um volume de 100 µL (Fig. 5).Figura. 6. Preparação das microplacas e leitura após aplicação da resazurina. Fonte: Própria autora.O sistema de diluição foi controlado pelo volume da solução-mãe utilizada deacordo com a metodologia de Andrews (2001), modificada por Sampaio (2008), deforma que se obteve diferentes concentrações variando de 400µg/mL à 15 µg/mL.Os poços foram preenchidos com o meio de cultura BHI caldo, o inoculo e assoluções dos extratos. Do poço A1 ao A7 utilizou-se a solução Mãe 1 do extrato, deA8 à A12 utilizou-se a solução Mãe 2 e do B1 ao B8, a solução Mãe 3 (ANEXO 1).As linhas C e D corresponderam a duplicata das linhas A e B sendo depois utilizadaspara determinação da CBM.Para o controle positivo realizou-se microdiluições seriadas até o décimo poçoda linha H, iniciando com o digluconato de clorexidina à 2%.Também foram realizados os seguintes controle de esterilidade: do caldo BHI,da cultura, do extrato e da clorexidina.Na seqüência as placas foram seladas com parafilme e incubadas a 37°C porum período de 20hs (ANDREWS, 2001).4.6.4 Leitura das microplacas para determinação da CIMApós o período de incubação bacteriana, 30 µL de resazurina (Sigma ® ,Steiheim, Alemanha) em solução aquosa na concentração de 0,5% foram acrescidosnos poços de A1 à A12; B1 à B8; G1 à G10 e H1 à H5 e re-incubadas em estufabacteriológica a 37°C por mais duas horas. Tal substância é um indicador de óxido-
- 45 -redução, utilizado para revelar alteração de pH no meio determinado pelocrescimento bacteriano (MONTEJANO et al., 2005).Este sistema revelador permite a leitura das microplacas em pouco tempo. Ospoços que adquirem uma coloração rosada indicam a reação química de óxidoreduçãoda resazurina em resorfurina sendo interpretada como presença de célulasviáveis, enquanto que nos poços onde não há mudança na coloração do coranteinterpreta-se como ausência de células viáveis, indicando inibição do crescimentocelular pelo extrato. A CIM (Concentração inibitória mínima) corresponde ao últimopoço azul da linha no sentido esquerda - direita.
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