maria cristina salimena da silva - UFF
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE<br />
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS<br />
INSTITUTO DE BIOLOGIA<br />
PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA<br />
MARIA CRISTINA SALIMENA DA SILVA<br />
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO DIMORFISMO SEXUAL NA<br />
LESÃO MUSCULAR DE CAMUNDONGO mdx COM<br />
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE<br />
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL<br />
FLUMINENSE VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE<br />
DOUTOR EM NEUROIMUNOLOGIA<br />
Orientador(as):Thereza Quírico-Santos<br />
Jussara Lagrota-Cândido<br />
NITERÓI<br />
2008
MARIA CRISTINA SALIMENA<br />
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO DIMORFISMO SEXUAL NA<br />
LESÃO MUSCULAR DE CAMUNDONGOS mdx COM<br />
Orientadoras<br />
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE<br />
Professora Dr a . Thereza Quírico - Santos<br />
Professora Dr a . Jussara Lagrota - Cândido<br />
ii
Tese submeti<strong>da</strong> à Coordenação do curso de pós-graduação de<br />
Neuroimunologia do Instituto de Biologia <strong>da</strong> Universi<strong>da</strong>de Federal<br />
Fluminense, como parte dos requisitos necessários para obtenção do<br />
grau de Doutor em Neuroimunologia - área de concentração: Patologia<br />
Celular.<br />
Banca Examinadora:<br />
Profª Dra. Thereza Fonseca Quirico dos Santos (orientadora)<br />
Profª Dra. Andréia Alice <strong>da</strong> Silva<br />
Profª Dra. Valéria Coelho<br />
Dr. Vinicius Cota de Almei<strong>da</strong><br />
Profª Dra. Maria de Fátima Pinho (revisora)<br />
Profª Dra. Márcia Cury El-Cheik (suplente)<br />
Profº Dr. Maurício Verícimo<br />
iii
A parte experimental deste trabalho foi executa<strong>da</strong> nos Laboratórios de<br />
Patologia Celular e Imunopatologia do Instituto de Biologia <strong>da</strong><br />
Universi<strong>da</strong>de Federal Fluminense (<strong>UFF</strong>), com suporte financeiro <strong>da</strong><br />
Coordenação de Apoio ao Pessoal de Ensino Superior (CAPES).<br />
iv
S 165 SALIMENA, MARIA CRISTINA<br />
FICHA CATALOGRÁFICA<br />
Estudo <strong>da</strong> influência do dimorfismo sexual na lesão muscular de camundongos<br />
mdx com distrofia muscular de Duchenne/ Maria Cristina Salimena. [s.n.];<br />
Niterói, 2008.<br />
185f.<br />
Tese (Doutorado em Neuroimunologia)<br />
Universi<strong>da</strong>de Federal Fluminense, 2008.<br />
1. Distrofia Muscular 2. Distrofia Muscular de Duchenne 3.Músculo<br />
Esquelético 4.Camundongo I.Título<br />
CDD.591.1852<br />
v
DEDICATÓRIA<br />
À minha família, em especial aos meus pais e ao meu marido, que<br />
pacientemente me incentivava e aju<strong>da</strong>va de forma incondicional e aos meus<br />
filhos, que me alegravam nas horas mais difíceis.<br />
vi
AGRADECIMENTOS<br />
� Às minhas orientadoras Professoras Thereza Quírico e Jussara Lagrota-<br />
Cândido, que alternando momentos de ansie<strong>da</strong>de e puro entusiasmo,<br />
dedicaram-se com afinco à minha formação científica.<br />
� Às amigas Nina e Bartira, pelo apoio e estímulo, compartilhando todos os<br />
momentos difíceis com palavras de incentivo e muito carinho, além <strong>da</strong> aju<strong>da</strong><br />
fantástica no processamento histológico.<br />
� Aos amigos, Douglas e Guilherme, pela disponibili<strong>da</strong>de no dia-a-dia,<br />
aju<strong>da</strong>ndo sempre que eu precisava e prontos para ouvir minhas lamúrias.<br />
� A todos os alunos de iniciação científica, estagiários e bolsistas dos<br />
laboratórios de Patologia Celular e Imunopatologia, sempre muito solidários,<br />
aju<strong>da</strong>ndo-me a superar as dificul<strong>da</strong>des e sempre presentes com palavras<br />
de estímulo.<br />
� Ao Professor Claudio Serfaty e ao aluno Pablo do Laboratório de<br />
Neuroplastici<strong>da</strong>de, pela amizade e incrível aju<strong>da</strong> na digitalização <strong>da</strong>s<br />
imagens, na utilização do microscópio de fluorescência, do criostato e na<br />
produção do ELVAX.<br />
vii
� A minha grande amiga doutora Sônia de Oliveira Couto que possibilitou o<br />
meu afastamento temporário do trabalho, permitindo que tivesse maior<br />
disponibili<strong>da</strong>de de tempo para desenvolver e concluir esta tese.<br />
� Em especial, ao amigo Wagner, que abriu a primeira porta para o renascer<br />
dos meus conhecimentos e ao amigo Heliomar, que concretizou estes<br />
conhecimentos.<br />
� Um sincero agradecimento a todos os colegas do mestrado e doutorado e<br />
professores do curso de pós-graduação em Neuroimunologia, pela<br />
convivência muito agradável e estímulo continuado, através dos quais pude<br />
obter uma nova visão <strong>da</strong> ciência.<br />
� À minha família, que sempre serviu de alicerce para to<strong>da</strong>s as minhas<br />
conquistas.<br />
� A DEUS, que fortaleceu o meu espírito, acalmou minha impaciência e<br />
manteve a minha perseverança.<br />
� Um agradecimento especial à CAPES que viabilizou o desenvolvimento do<br />
trabalho experimental.<br />
viii
EPÍGRAFE<br />
O excesso de luz cega a vista.<br />
O excesso de som ensurdece o ouvido.<br />
A cobiça do impossível destrói a ética.<br />
Por isto, o sábio em sua alma determina a medi<strong>da</strong> para ca<strong>da</strong> coisa.<br />
To<strong>da</strong>s as coisas visíveis lhe são apenas setas que apontam para o invisível.<br />
Lao Tse<br />
ix
ÍNDICE<br />
1.1 Características gerais do músculo esquelético ...................................... 2<br />
1.2 Regeneração do tecido muscular ........................................................... 7<br />
1.3 Metaloproteases e remodelagem muscular .......................................... 10<br />
1.4 Regulação hormonal do músculo esquelético ...................................... 11<br />
1.5 Influência do sistema imune no músculo esquelético .............................. 19<br />
1.6 Interações do tecido muscular e tecido adiposo ...................................... 22<br />
1.7 Receptores de estrogênios – Moduladores e bloqueadores ............... 26<br />
1.8 Distrofia muscular de Duchenne........................................................... 28<br />
1.9 Camundongo mdx - modelo murino <strong>da</strong> DMD ...................................... 31<br />
2.0 OBJETIVOS ......................................................................................... 34<br />
2.1 Objetivo geral ....................................................................................... 34<br />
2.2 Objetivos específicos ............................................................................ 34<br />
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................... 36<br />
3.1 Animais ................................................................................................. 36<br />
3.2 Castração cirúrgica............................................................................... 36<br />
3.3 Análise histológica ................................................................................ 37<br />
3.4 Reação histoquímica <strong>da</strong> miosina-ATPase ............................................ 38<br />
3.5 Reação histoquímica: tecido adiposo ................................................... 39<br />
3.6 Imunohistoquímica ............................................................................... 39<br />
3.7 Zimografia ............................................................................................ 42<br />
3.8 Preparação <strong>da</strong> resina Elvax com tamoxifen ......................................... 43<br />
3.9 Implante de elvax no músculo esquelético ........................................... 44<br />
4.0 RESULTADOS...................................................................................... 46<br />
4.1 Efeito <strong>da</strong> castração no músculo esquelético do mdx ............................ 46<br />
x
4.3 Influência <strong>da</strong> castração no número de mioblastos ativados (NCAM) e de<br />
células-tronco (Sca-1) presentes nos músculos esqueléticos (gastrocnêmio e<br />
solear) do mdx. .............................................................................................. 61<br />
4.4 Efeitos <strong>da</strong> castração cirúrgica na ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s metaloproteases 2 e 9<br />
no músculo esquelético ................................................................................. 70<br />
4.5 Efeito do tratamento com tamoxifen no músculo gastrocnêmio do mdx72<br />
4.6 Análise de mioblastos ativados (NCAM) e células-tronco (Sca-1) no<br />
músculo esquelético do camundongo mdx tratado com tamoxifen ............... 76<br />
4.7 Presença de macrófagos: Mac-1 e F4/80 no gastrocnêmio de mdx<br />
tratados com tamoxifen. ................................................................................ 80<br />
4.8 Efeito <strong>da</strong> castração sobre o número de adipócitos presentes no músculo<br />
gastrocnêmio do mdx .................................................................................... 85<br />
4.9 Efeito do tratamento com e sem tamoxifen no número de adipócitos no<br />
músculo esquelético do mdx ......................................................................... 89<br />
5.0 DISCUSSÃO..........................................................................................93<br />
6.0 CONCLUSÕES ..................................................................................... 99<br />
7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................113<br />
xi
AP-1<br />
BMD<br />
CS<br />
CAMs<br />
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS<br />
Proteína ativadora tipo 1<br />
Distrofia Muscular de Becker<br />
Células satélites<br />
Moléculas de adesão celular<br />
CMD Distrofia Muscular Congênita<br />
DGC Complexo de glicoproteínas associa<strong>da</strong>s à distrofina<br />
DMD Distrofia Muscular de Duchenne<br />
ECM<br />
ER<br />
ERE<br />
Matriz extracelular<br />
Receptor de estrogênio<br />
Elemento de resposta ao estrogênio<br />
FGF Fator de crescimento de fibroblasto<br />
FGF-b Fator de crescimento básico de fibroblastos<br />
GRMD<br />
GH<br />
HGF<br />
HSP70<br />
HLA<br />
Distrofia Muscular em cão <strong>da</strong> raça golden retriever<br />
Hormônio do crescimento<br />
Fator de crescimento do hepatócito<br />
Proteína de choque térmico 70<br />
Complexo principal de histocompatibili<strong>da</strong>de humano<br />
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1<br />
IFN- Interferon-gama<br />
IL<br />
IGF1<br />
LFA-1<br />
Interleucina<br />
Fator de crescimento do tipo 1 semelhante à insulina<br />
Molécula de adesão do tipo 1 associa<strong>da</strong> a função do linfócito<br />
LGDM Distrofia Muscular <strong>da</strong> Cintura e Membros<br />
LIF Fator inibitório de leucemia<br />
LN<br />
MRF<br />
MCP-1<br />
MyHC<br />
MDSC<br />
MMPs<br />
Laminina<br />
Fatores regulatórios miogênicos<br />
Proteína quimioatraente de macrófagos-1<br />
Miosina de cadeia pesa<strong>da</strong><br />
Células-tronco deriva<strong>da</strong>s do músculo<br />
Metaloproteases<br />
xii
NFқB<br />
NO<br />
eNOS<br />
OVX<br />
OOX<br />
PAI-1<br />
SERM<br />
Fator nuclear-κB<br />
Óxido nítrico<br />
Óxido nítrico sintase endotelial<br />
Ovariectomia<br />
Orquiectomia<br />
Inibidor do ativador do plasminogênio<br />
Receptor seletivo de estrogênio<br />
TGF- Fator de transformação de crescimento<br />
TI-CL Colágeno tipo I<br />
TIII-CL Colágeno tipo III<br />
TIV-CL Colágeno tipo IV<br />
TNF- Fator de necrose tumoral-<br />
TN<br />
TIMPs<br />
TG<br />
Tenascina<br />
Inibidores de metaloproteinases<br />
Triglicerídeos<br />
VCAM-1 Molécula de adesão vascular<br />
VLA Antígeno de expressão tardia<br />
xiii
RESUMO<br />
Camundongo mdx, o modelo animal <strong>da</strong> distrofia muscular de Duchenne,<br />
desenvolve uma miopatia inflamatória recessiva liga<strong>da</strong> ao cromossoma X,<br />
caracteriza<strong>da</strong> por degeneração <strong>da</strong>s miofibras esqueléticas e substituição por<br />
tecido conjuntivo. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma possível<br />
relação do dimorfismo sexual com o padrão <strong>da</strong> lesão e mu<strong>da</strong>nças no<br />
microambiente do músculo esquelético durante diferentes fases <strong>da</strong> miopatia.<br />
Foram incluídos camundongos machos e fêmeas <strong>da</strong>s linhagens mdx e controle<br />
C57 (não-distrófico) com 4 e 8 semanas de vi<strong>da</strong> pós-natal. Um grupo de<br />
camundongos mdx foi submetido à castração cirúrgica: ovariectomia (OVX) e<br />
orquiectomia (OOX) e outro grupo foi tratado com tamoxifen, droga agonista do<br />
receptor de estrógeno dissolvi<strong>da</strong> em resina ELVAX, implanta<strong>da</strong> no músculo<br />
esquelético direito, tendo o contralateral como controle não tratado. Secções<br />
transversais de músculo gastrocnêmio incluído em parafina foram processa<strong>da</strong>s<br />
para histoquímica e coradsa pelo picrosírius, Giemsa, oil red e imunohistoquímica<br />
para identificação de molécula de adesão NCAM, células<br />
progenitoras (SCA-1) e macrófagos (Mac-1+ e F4-80). Fragmentos congelados<br />
de músculo foram processados para determinação <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s<br />
metaloproteases MMP-2 e MMP-9. A análise histomorfométrica mostrou nos<br />
camundongos mdx machos não operados e OOX, um percentual maior de<br />
mionecrose e menor regeneração do que nas fêmeas controle e OVX, que<br />
exibiram percentual maior de miofibras regenerando (64%, p0.05) e fêmeas (p>0.05),<br />
embora mdx machos apresentassem menor número de adipócitos que as<br />
fêmeas parea<strong>da</strong>s. Camundongos mdx machos e fêmeas, em especial os<br />
castrados (OOX e OVX), apresentaram maior ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP-2 e -9 do que<br />
o grupo controle C57 não-distrófico. Análise intergrupo mostrou ativi<strong>da</strong>de<br />
aumenta<strong>da</strong> <strong>da</strong> MMP-9 no mdx macho OOX e <strong>da</strong> MMP-2 nas fêmeas mdx OVX.<br />
Músculo esquelético de camundongos mdx, machos e fêmeas, tratados com a<br />
droga tamoxifen apresentaram maior número de células musculares íntegras e<br />
redução acentua<strong>da</strong> de macrófagos do que o músculo contralateral. Em<br />
conjunto, os resultados indicam os efeitos benéficos dos hormônios sexuais<br />
femininos endógenos e do modulador do receptor de estrógeno, tamoxifen,<br />
como estratégia de tratamento capaz de minimizar inflamação e mionecrose<br />
(efeito antinflamatório), de funcionar como mantenedores <strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de<br />
estrutural <strong>da</strong>s miofibras esqueléticas (integri<strong>da</strong>de do sarcolema) e de promover<br />
regeneração muscular no camundongo mdx com distrofia de Duchenne.
ABSTRACT<br />
Mdx mouse, the animal model of Duchenne muscular dystrophy, lacks<br />
dystrophin and develops an X- linked recessive inflammatory myopathy<br />
characterized by degeneration of skeletal muscle fibers and replacement by<br />
connective tissue. The present work aimed to establish a possible relation of the<br />
sexual dimorphism with changes in the microenvironment of the skeletal muscle<br />
and lesion pattern at distinct phases of the myopathy. Male and female mdx and<br />
control nondystrophic C57 mice with 4 and 8 weeks of postnatal life. A group of<br />
mdx was submitted to the surgical castration: ovariectomy (OVX) and<br />
orchiectomy (OOX), and another group treated with tamoxifen, an agonist of<br />
estrogen receptor dissolved in ELVAX resin implanted locally in the right<br />
gastrocnemius muscle, with corresponding contralateral used as non-treated<br />
control muscle. Transversal sections of gastrocnemius muscle embedded in<br />
paraffin were processed for histochemistry and stained with syrius red, Giemsa,<br />
oil red, ATPase enzyme and also immunohistochemistry for identification of<br />
adhesion molecule NCAM, progenitor cells (SCA) and macrophages (Mac-1+<br />
and F4-80). Frozen muscle fragments were processed for determination of<br />
metalloprotease MMP-2 and MMP-9 activities. Morphometric analysis showed<br />
higher percentage of mionecrose and lesser regeneration in non-operated and<br />
OOX mdx males than in both groups of females non-operated and OVX, which<br />
presented higher percentage of regenerated fibers. Mdx male and female mice<br />
did not show significant difference in the number of adipocytes in the<br />
gastrocnemius muscle, but mdx male presented less adipocytes than<br />
corresponding mdx females. Comparing to control (C57) nondystrophic mice,<br />
both male and female mdx mice, especially the castrated ones (OOX, OVX),<br />
presented higher MMP-2 and -9 activities. However, mdx intergroup analysis<br />
showed augmented MMP-9 activity in OOX males and of MMP-2 in females<br />
OVX. Comparing with the contralateral muscle, male and female mdx muscles<br />
treated with tamoxifen presented increased numbers of myofibers with<br />
membrane integrity and marked reduction of macrophages than the<br />
contralateral muscle of C57 and mdx mice. Altogether, the results indicate a<br />
beneficial effect of endogenous sexual female hormone and also the estrogen<br />
modulator receptor (tamoxifen) as therapeutic strategy capable of mitigating<br />
inflammation e myonecrosis (antiinflammatory effect), functioning as structural<br />
membrane stabilizer (sarcolemma integrity) and promoting muscle regeneration<br />
in mdx mice with Duchenne dystrophy.
1. INTRODUÇÃO<br />
1.1 Características gerais do músculo esquelético<br />
O músculo esquelético estriado ou voluntário é constituído por miofibras,<br />
células cilíndricas de 1 a 300 m de comprimento e 10 a 50 m de diâmetro com<br />
múltiplos núcleos elípticos localizados na periferia do citoplasma. O epimísio é<br />
uma bainha de tecido conjuntivo que envolve o músculo e se estende<br />
internamente formando septos denominados perimísio, que contornam os<br />
fascículos, organizando feixes contendo dezenas de fibras musculares envoltas<br />
individualmente pelo endomísio e com extensa rede vascular e inervação.<br />
No músculo esquelético e cardíaco, os elementos contráteis do<br />
citoesqueleto estão altamente organizados formando padrões característicos<br />
de cruzamento de miosina e actina (ban<strong>da</strong>s clara e escura) alinha<strong>da</strong>s ao longo<br />
do comprimento, <strong>da</strong>ndo uma aparência estria<strong>da</strong> na microscopia ótica. A faixa<br />
escura (ban<strong>da</strong> A) é anisotrópica e a faixa clara é isotrópica (ban<strong>da</strong> I),<br />
apresentando uma faixa mais escura central, a linha Z (Ran<strong>da</strong>ll, 2000). A<br />
estriação <strong>da</strong> miofibrila deve-se à repetição de uni<strong>da</strong>des iguais, os sarcômeros,<br />
constituídos de filamentos de actina e filamentos grossos de miosina dispostos<br />
longitudinalmente. Ca<strong>da</strong> sarcômero é formado pela região <strong>da</strong> miofibrila<br />
compreendi<strong>da</strong> entre duas linhas Z sucessivas e contém uma ban<strong>da</strong> A<br />
separando duas semiban<strong>da</strong>s I (Tortora, 2003). Essa organização é manti<strong>da</strong> por<br />
diversas proteínas, como a desmina, que liga as miofibrilas umas às outras e a<br />
distrofina, que liga os filamentos de actina às proteínas integrais <strong>da</strong> membrana<br />
plasmática (Michele e Campbell, 2003). Para a contração muscular ocorrer, é<br />
necessário que as cabeças <strong>da</strong>s miosinas tracionem os filamentos finos de<br />
2
actina para a direção central, ocasionando o encurtamento do sarcômero<br />
(Maughan, Watson et al., 1983). A contração do músculo esquelético depende<br />
de impulsos nervosos que estimulam a liberação de cálcio estocado pelo<br />
retículo sarcoplasmático. Tropomiosina, uma proteína fibrosa que une os<br />
filamentos de actina, associa-se a um complexo de três polipeptídeos: a<br />
Troponina C (unindo-se com o cálcio), troponina I (inibitório) e a troponina T<br />
(unindo-se com a tropomiosina).<br />
Existem diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas, ca<strong>da</strong> uma<br />
com diferentes isoformas de proteínas e proprie<strong>da</strong>des funcionais. As fibras<br />
musculares lentas (tipo I) são especializa<strong>da</strong>s em contração lenta e as fibras do<br />
tipo II na contração rápi<strong>da</strong>. Um padrão distinto de estimulação elétrica <strong>da</strong><br />
inervação <strong>da</strong> fibra pode regular a expressão de genes e o tamanho <strong>da</strong> fibra<br />
muscular (Carroll, Nicotera et al., 1999). Com base nas características<br />
funcionais e estruturais, as fibras musculares esqueléticas são classifica<strong>da</strong>s<br />
(Tabela I) em três tipos principais: tipo I, IIA e IIB (Brooke e Kaiser, 1970;<br />
Ran<strong>da</strong>ll, 2000).<br />
3
Tipos de fibra Tipo I Tipo IIA Tipo IIB<br />
Tempo de contração Lenta Rápi<strong>da</strong> Muito rápi<strong>da</strong><br />
Tamanho do n. motor Pequeno Grande Muito grande<br />
Resistência à fadiga Alta Intermediária Pequena<br />
Ativi<strong>da</strong>de Aeróbica A. longa duração A. curta duração<br />
Produção de força Lenta Alta Muito alta<br />
Densi<strong>da</strong>de de mitocôndria Alta Alta Pequena<br />
Densi<strong>da</strong>de de capilares Alta Intermediária Pequena<br />
Capaci<strong>da</strong>de oxi<strong>da</strong>tiva Alta Alta Pequena<br />
Capaci<strong>da</strong>de glicolítica Pequena Alta Alta<br />
Estocagem de energia Triglicerídeos CP, Glicogênio CP, Glicogênio<br />
Tabela 1 – Tipos de fibras musculares<br />
Referência: http://www.brianmac.demon.co.uk/muscle.htm<br />
(acessado em 14/01/2008) CP = fosfocreatina<br />
4
A diversi<strong>da</strong>de funcional entre os tipos de fibras musculares dos<br />
mamíferos deve-se à presença de várias isoformas de miosina e somente a um<br />
tipo de actina. A molécula de miosina é um hetero-hexímero formado por duas<br />
cadeias pesa<strong>da</strong>s de miosina e dois pares de cadeias leves, considerados<br />
regulatórios por determinarem a veloci<strong>da</strong>de e a força <strong>da</strong>s fibras musculares. A<br />
miosina de cadeia pesa<strong>da</strong> (MyHC), uma proteína sarcomérica usa<strong>da</strong> como<br />
marcador de diferenciação muscular (Fulton e Alftine, 1997), tem várias<br />
isoformas. Esta característica permite classificar as fibras musculares em até 7<br />
tipos diferentes (Weiss e Leinwand, 1996; Scott, Stevens et al., 2001), sendo<br />
quatro delas no músculo esquelético do adulto. A MyHC I, presente nas fibras<br />
musculares vermelhas de contração lenta, possui metabolismo mais oxi<strong>da</strong>tivo<br />
pelo maior conteúdo de mitocôndrias e grande resistência à fadiga. Nas fibras<br />
musculares brancas de contração rápi<strong>da</strong> e menor resistência à fadiga<br />
predominam as do tipo IIB (rápi<strong>da</strong> glicolítica), IID/X (rápi<strong>da</strong> intermediária) e IIA<br />
(rápi<strong>da</strong> oxi<strong>da</strong>tiva) (Reiser, Moss et al., 1985; Schiaffino e Reggiani, 1996),<br />
to<strong>da</strong>s ricas em MyHC II. As fibras do tipo IIC são considera<strong>da</strong>s não<br />
diferencia<strong>da</strong>s (Brooke e Kaiser, 1970). A isoforma MyHC IIB aparece<br />
progressivamente no desenvolvimento do músculo esquelético e é a isoforma<br />
que predomina (70%) no animal adulto, chegando acima de 90% nos músculos<br />
gastrocnêmio e quadríceps (Jansen, Win<strong>da</strong>u et al., 1996). As isoformas IID/X e<br />
IIA são principalmente expressas no diafragma, enquanto a isoforma do tipo I,<br />
nos músculos posturais e solear, porém, dependendo do estímulo, pode<br />
ocorrer mu<strong>da</strong>nça no tipo de fibra.<br />
A composição <strong>da</strong> fibra muscular é influencia<strong>da</strong> por fatores hormonais e<br />
do microambiente (Ianuzzo, Patel et al., 1977; Nwoye e Mommaerts, 1981;<br />
5
Pette e Staron, 1997). Em resposta a um estímulo, há transição na expressão<br />
<strong>da</strong> isoforma seguindo o padrão IIB IID/X IIA I. Existem também as fibras<br />
híbri<strong>da</strong>s, coexpressando IIB e IID/X, IID/X e IIA e I e IIA representando talvez<br />
estágios de conversão <strong>da</strong> fibra (Staron e Pette, 1993). A inativi<strong>da</strong>de do músculo<br />
ocasiona uma mu<strong>da</strong>nça no tamanho e na expressão do tipo de fibra, seguindo<br />
obrigatoriamente I IIA IID/X IIB e o sentido oposto com um aumento <strong>da</strong><br />
ativi<strong>da</strong>de e sobrecarga funcional (Booth e Criswell, 1997). A denervação causa<br />
atrofia e mu<strong>da</strong>nça do tipo de fibra lenta para rápi<strong>da</strong> (Sieck, 1994).<br />
6
1.2 Regeneração do tecido muscular<br />
No músculo esquelético, a formação de novos mionúcleos para<br />
crescimento e reparo <strong>da</strong> fibra depende <strong>da</strong> disponibili<strong>da</strong>de de uma população de<br />
células precursoras mononucleares chama<strong>da</strong>s células satélites (CS). Essas<br />
células estão localiza<strong>da</strong>s internamente entre a lâmina basal e o sarcolema <strong>da</strong>s<br />
fibras musculares. Durante o desenvolvimento, muitas células satélites estão<br />
se dividindo e contribuindo com mionúcleos para o crescimento <strong>da</strong> miofibra. No<br />
músculo maduro, as células satélites estão quiescentes, mas podem ser<br />
ativa<strong>da</strong>s em resposta injúria (Mouly, Aamiri et al., 2005), sendo identifica<strong>da</strong>s<br />
pela expressão dos marcadores: NCAM , M-Caderina e Pax 7. Estas células<br />
contribuem para a reposição de mioblastos, osteoblastos, adipócitos e<br />
condrócitos (Asakura, Komaki et al., 2001). As células satélites estão presentes<br />
em todos os tipos de fibras musculares, embora com distribuição desigual. A<br />
porcentagem de CS no músculo solear (contração lenta) do adulto é duas<br />
vezes mais alta do que nos músculos de contração rápi<strong>da</strong> (ex: tibial anterior e<br />
extensor longo dos dedos). A população de células satélites varia também com<br />
a i<strong>da</strong>de: ao nascimento, representam uma população de 30%, reduzindo-se de<br />
forma acentua<strong>da</strong> (menor que 5%) dois meses após o parto, porém mais<br />
lentamente na vi<strong>da</strong> adulta (Bischoff e Heintz, 1994).<br />
Após injúria muscular, ocorre ativação <strong>da</strong>s células mononucleares<br />
inflamatórias e <strong>da</strong>s células com potencial miogênico. Os neutrófilos são as<br />
principais células inflamatórias que migram rapi<strong>da</strong>mente para o tecido após<br />
injúria, enquanto macrófagos representam os maiores responsáveis pela<br />
7
fagocitose de debris celulares e pela ativação de células miogênicas 48 horas<br />
após a lesão. As miofibras regenera<strong>da</strong>s apresentam nucleação central,<br />
geralmente são basofílicas, refletindo alta síntese protéica e expressam<br />
isoformas de MyHC embrionárias e de desenvolvimento.<br />
Membros <strong>da</strong> família de fatores regulatórios miogênicos (MRF) possuem<br />
um papel central na miogênese do músculo esquelético (Muntoni, Brown et al.,<br />
2002; Chen e Goldhamer, 2003; Charge e Rudnicki, 2004) e pertencem à<br />
superfamília de fatores de transcrição bHLH (basic helix-loop-helix) (Charge e<br />
Rudnicki, 2004). Os MRFs primários, MyoD e Myf5, são necessários para a<br />
ativação <strong>da</strong>s células satélites, enquanto os MRFs secundários, miogenina e<br />
MRF-4, são essenciais para a diferenciação terminal dos miotubos. A<br />
expressão dos MRFs é modula<strong>da</strong> por fatores presentes no microambiente <strong>da</strong><br />
lesão muscular (Charge e Rudnicki, 2004), como: o fator de crescimento do<br />
hepatócito (HGF), o fator inibitório de leucemia (LIF),interleucina-6 (IL-6) e<br />
interleucina -1 (Cantini e Carraro, 1995; Bisschop, Gayan-Ramirez et al., 1997;<br />
Floss, Arnold et al., 1997; Jiang e Hiscox, 1997; Austin, Bower et al., 2000). O<br />
fator de crescimento de fibroblastos (FGF) aumenta a proliferação de células<br />
satélites, a diferenciação e a fusão com o crescimento de miotubos (Dodson,<br />
Allen et al., 1985; Florini, Ewton e Magri, 1991; Delany, Pash et al., 1994;<br />
Fryburg, Jahn et al., 1995; Goldspink, Cox et al., 1995). O fator de crescimento<br />
transformador beta (TGFβ) age como um fator regulatório <strong>da</strong> proliferação e<br />
diferenciação de mioblastos (Charge e Rudnicki, 2004).<br />
Células-tronco deriva<strong>da</strong>s do músculo (MDSC) são caracteriza<strong>da</strong>s pela<br />
expressão de marcadores celulares e pela capaci<strong>da</strong>de de diferenciação<br />
miogênica. MDSCs apresentando os fenótipos de superfície Sca-1+CD45+ e<br />
8
Sca-1+CD45- estão localiza<strong>da</strong>s entre as fibras musculares principalmente<br />
associa<strong>da</strong>s a vasos sangüíneos (Asakura, 2003). MDSCs CD45+ isola<strong>da</strong>s de<br />
músculo normal apresentam potencial miogênico muito limitado in vitro e in<br />
vivo, mas possuem alto potencial hematopoiético. Em contraste, células<br />
MDSCs CD45- se diferenciam prontamente em linhagens miogênicas in vivo e<br />
in vitro (Mckinney-Freeman, Jackson et al., 2002). Alguns estudos mostram que<br />
MDSCs CD45+ também são capazes de originar células miogênicas em alguns<br />
modelos experimentais de lesão muscular, mas não está esclareci<strong>da</strong> a exata<br />
contribuição <strong>da</strong>s diferentes populações de progenitores durante a regeneração<br />
do tecido muscular (Peng e Huard, 2004). Apesar de as células-tronco<br />
hematopoiéticas circularem e migrarem para diferentes tecidos, existe<br />
evidência indicando que as células-tronco residentes são as responsáveis pela<br />
regeneração e reparo do tecido muscular (Peng e Huard, 2004).<br />
9
1.3 Metaloproteases e remodelagem muscular<br />
A matriz extracelular (ECM) é forma<strong>da</strong> por uma rede complexa de<br />
macromoléculas constituí<strong>da</strong>s de polissacarídeos e proteínas estruturais. ECM é<br />
uma estrutura dinâmica que regula o comportamento celular através de<br />
interações com fatores de crescimento, determinando a ativação de vias<br />
clássicas de transdução de sinais que induzem a proliferação, regulam a<br />
expressão gênica, influenciam na migração e posicionamento no<br />
microambiente (Alberts e Ronca, 1997).<br />
A remodelagem <strong>da</strong> ECM é media<strong>da</strong> por proteases, em especial as<br />
metaloproteases (MMPs), uma família de endopepti<strong>da</strong>ses dependentes de<br />
zinco (Kieseier, Schneider et al., 2001) e classifica<strong>da</strong>s de acordo com a<br />
especifici<strong>da</strong>de do substrato (colagenases, gelatinases, estromelisinas,<br />
matrilisinas e tipo membranar). Estas enzimas possuem características comuns<br />
incluindo o modo de ativação, a seqüência de aminoácidos conserva<strong>da</strong> no sítio<br />
ativo de ligação ao metal e inibição por inibidores específicos conhecidos como<br />
inibidores de metaloproteinases (TIMPs). A maioria <strong>da</strong>s MMPs é secreta<strong>da</strong><br />
como zimogênio e sua ativação é caracteriza<strong>da</strong> pela per<strong>da</strong> de<br />
aproxima<strong>da</strong>mente 10-kDa no seu peso molecular (Kherif, Lafuma et al., 1999).<br />
A remodelagem <strong>da</strong> ECM durante a regeneração e degeneração<br />
muscular sugere uma alta regulação <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de lítica <strong>da</strong> matriz durante a<br />
regeneração do músculo, inclusive mioblastos secretam MMP-2 de forma<br />
constitutiva (Kherif, Lafuma et al., 1999). MMP-2 está envolvi<strong>da</strong> na regulação<br />
<strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de e composição <strong>da</strong> ECM no músculo esquelético, regulando a<br />
proliferação, diferenciação de mioblastos e reparo <strong>da</strong> miofibra após a injúria (El<br />
10
Fahime, Torrente et al., 2000; Wiendl, Hohlfeld et al., 2005). O tratamento<br />
prévio de mioblastos com concanavalina A, um mitógeno indutor de MMP,<br />
aumenta a migração de mioblastos injetados por via intramuscular (El Fahime,<br />
Torrente et al., 2000). Após injúria muscular, a forma ativa de MMP-2<br />
associa<strong>da</strong> com a regeneração deste tecido está transitoriamente aumenta<strong>da</strong><br />
dentro de 24 horas. A MMP-9 é produzi<strong>da</strong> por várias células (ex: neutrófilos,<br />
macrófagos, linfócitos, mastócitos) e permanece ativa por vários dias (Kherif,<br />
Lafuma et al., 1999). Durante a remodelagem muscular, algumas proteínas <strong>da</strong><br />
ECM promovem sinais estimulatórios ou inibitórios para a migração de células.<br />
A integrina 7 1 influencia a motili<strong>da</strong>de de mioblastos ao longo <strong>da</strong> membrana<br />
basal rica em laminina (LN) durante a regeneração muscular (El Fahime,<br />
Torrente et al., 2000).<br />
1.4 Regulação hormonal do músculo esquelético<br />
Existe uma contínua renovação de proteínas, síntese e per<strong>da</strong>, que<br />
mantém a integri<strong>da</strong>de funcional e a quali<strong>da</strong>de do músculo esquelético.<br />
Importantes reguladores deste processo são os hormônios como o do<br />
crescimento (GH) e os sexuais (testosterona), que estimulam o crescimento<br />
muscular, principalmente pelos aumento <strong>da</strong> síntese protéica, pelos hormônios<br />
que diminuem a per<strong>da</strong> de proteínas (ex: insulina) e pelos hormônios do<br />
estresse, que aumentam o catabolismo muscular (glucagon, glicocorticóides e<br />
catecolaminas). Os hormônios tireoidianos são também essenciais durante o<br />
crescimento muscular, mas o excesso e ou deficiência causam destruição do<br />
músculo. Estudos recentes mostraram que MDSCs origina<strong>da</strong>s de<br />
camundongos fêmeas apresentam maior capaci<strong>da</strong>de regenerativa compara<strong>da</strong>s<br />
11
com os machos, respondendo a baixos níveis de estresse oxi<strong>da</strong>tivo e com<br />
grande proliferação (Deasy, Lu et al., 2007). Compreender os mecanismos que<br />
levam à regulação <strong>da</strong> síntese e per<strong>da</strong> de proteínas no metabolismo muscular é<br />
essencial para eluci<strong>da</strong>r os mecanismos de destruição muscular. A per<strong>da</strong> ou<br />
ganho de proteínas musculares é determina<strong>da</strong> pelo balanço entre síntese e<br />
degra<strong>da</strong>ção de proteínas. As taxas de renovação muscular são afeta<strong>da</strong>s por<br />
muitas condições fisiológicas, como alimentação (Rennie, Edwards et al.,<br />
1982), jejum (Cheng, Pacy et al., 1987), i<strong>da</strong>de (Welle, Thornton et al., 1993;<br />
Yarasheski, Zachwieja et al., 1993) e também doenças (Rennie, 1985). Os<br />
hormônios são os maiores reguladores de renovação de proteínas nestas<br />
condições. Muitas endocrinopatias são caracteriza<strong>da</strong>s por destruição muscular<br />
e per<strong>da</strong> <strong>da</strong> função (Ruff e Weissmann, 1988).<br />
Muitos estudos têm mostrado os efeitos <strong>da</strong> insulina sobre o metabolismo<br />
protéico do músculo. Estes estudos mostram o efeito anabólico <strong>da</strong> insulina<br />
sobre o músculo, estimulando a captação de aminoácidos, síntese de proteína<br />
e inibição <strong>da</strong> quebra de proteínas (Florini, 1987; Kettelhut, Wing et al., 1988;<br />
Sugden e Fuller, 1991; Garlick, Essen et al., 1992; Wright e Sutherland, 2008).<br />
O efeito anabólico <strong>da</strong> insulina é evidente, uma vez que pacientes diabéticos,<br />
deficientes de insulina, têm grande destruição muscular e isto é revertido com o<br />
tratamento de insulina. Outros estudos sugerem que a redução induzi<strong>da</strong> pela<br />
insulina na quebra <strong>da</strong> proteína muscular ocorre principalmente nas proteínas<br />
não miofibrilares (Arfvidsson, Zachrisson et al., 1991; Moller-Loswick,<br />
Zachrisson et al., 1994).<br />
O efeito anabólico do hormônio do crescimento (GH) em crianças e<br />
adultos deficientes GH é bem estabelecido (Collipp, Thomas et al., 1973;<br />
12
Jorgensen, Pedersen et al., 1989; Cuneo, Salomon et al., 1991; Smith, Barua et<br />
al., 1992; Jorgensen, Moller et al., 1994). Nos idosos, que apresentam<br />
diminuição <strong>da</strong> secreção GH, a suplementação GH determina o aumento <strong>da</strong><br />
massa muscular. Estudos em animais têm mostrado que GH aumenta as taxas<br />
de síntese de proteínas e diminui a quebra de proteínas no tecido muscular<br />
(Florini, 1987; Kettelhut, Wing et al., 1988; Sugden e Fuller, 1991; Ewton, Roof<br />
et al., 1994; Fryburg, Jahn et al., 1995; Di Iorio, Abate et al., 2006).<br />
A infusão de IGF-1 no músculo esquelético de humanos mostrou um<br />
aumento no metabolismo de proteínas, com um aumento na síntese protéica<br />
(Elahi, Mcaloon-Dyke et al., 1993). O efeito estimulatório de IGF-1 sobre a<br />
síntese de proteínas no músculo pode ser atenuado inibindo-se o concomitante<br />
aumento no fluxo de sangue pelo inibidor do óxido nítrico. Isto indica que o<br />
efeito de IGF-1 sobre a síntese de proteína no músculo esquelético depende,<br />
em parte, <strong>da</strong> produção do óxido nítrico (Fryburg, 1996). A ação metabólica do<br />
GH pode, em parte ou inteiramente, ser secundária à produção de IGF-1.<br />
Assim, o hormônio do crescimento pode atuar diretamente ou indiretamente via<br />
IGF-1, dependendo <strong>da</strong> ação metabólica e do tecido (Yarasheski, 1994; Pash,<br />
Delany et al., 1995).<br />
Muito pouco é conhecido sobre a interação de vários hormônios e<br />
fatores de crescimento e possíveis efeitos aditivos. Quando os hormônios GH e<br />
insulina foram administrados simultaneamente aumentaram a síntese de<br />
proteínas e não alteram o catabolismo de proteínas (Gore, Honeycutt et al.,<br />
1991; Fryburg, Louard et al., 1992). Em pacientes com distrofia miotônica, a<br />
suplementação com GH exerce efeito positivo sobre a potência muscular,<br />
indicando possível efeito benéfico sobre o metabolismo de proteínas<br />
13
(Vlachopapadopoulou, Zachwieja et al., 1995). Ambos, GH e IGF-1, têm efeitos<br />
sobre a síntese de proteínas quando administrados diretamente, embora estes<br />
efeitos não sejam observados quando administrados sistemicamente. IGF-1<br />
também pode causar hipoglicemia, o que limita a administração sistêmica,<br />
porém o efeito pode ser contornado com a administração simultânea com GH.<br />
A ação metabólica e interação destes hormônios não são ain<strong>da</strong> inteiramente<br />
conheci<strong>da</strong>s e mais estudos são necessários, especialmente em relação à<br />
distrofia muscular.<br />
Os efeitos anabólicos <strong>da</strong> testosterona sobre o músculo esquelético são<br />
bem conhecidos (Mooradian, Morley et al., 1987). A testosterona e derivados<br />
estruturais induzem acréscimo de massa muscular e síntese de proteína em<br />
indivíduos jovens e idosos (Ferrando, Sheffield-Moore et al., 2002). Esteróides<br />
anabólicos são utilizados para melhorar o ganho de massa muscular após<br />
treinamento físico. Dose suprafisiológica de testosterona, especialmente em<br />
combinação com treinamento de potência, aumenta a massa e potência<br />
muscular em homens saudáveis (Bhasin, Storer et al., 1996). A administração<br />
de testosterona aumenta os níveis de IGF-1 em homens normais, sugerindo<br />
que os efeitos deste hormônio podem ser via IGF-1 (Hobbs, Plymate et al.,<br />
1993; Harridge, 2007). Embora seja conhecido que esteróides aumentam a<br />
massa muscular, muito pouco se sabe sobre os efeitos nos processos<br />
diretamente envolvidos no remodelamento muscular, tal como inflamação. A<br />
testosterona e seus análogos modulam a ativi<strong>da</strong>de de macrófagos (Brain,<br />
Benton et al., 1976; Keller, Ershler et al., 1996). Citocinas e outras proteínas<br />
secreta<strong>da</strong>s por macrófagos podem regular a proliferação de células satélites<br />
(Merly, Lescaudron et al., 1999). Existem evidências de que a testosterona é<br />
14
crítica tanto no início como na resolução <strong>da</strong> resposta inflamatória muscular,<br />
contribuindo para o sucesso do crescimento e regeneração (Bondesen, Mills et<br />
al., 2004). A testosterona aumenta a expressão de molécula de adesão e isto<br />
também pode ser um regulador positivo <strong>da</strong>s células satélites (Zhang, Wang et<br />
al., 2002).<br />
Níveis séricos de testosterona e androgênios adrenais declinam com a<br />
i<strong>da</strong>de em machos (Rennie e Millward, 1983; Rennie, Smith et al., 1994). Em<br />
mulheres idosas, os níveis de testosterona também estão diminuídos,<br />
particularmente após a menopausa. Dados epidemiológicos sugerem a<br />
existência de uma relação entre níveis reduzidos de testosterona e declínio na<br />
massa, potência e força do músculo (Rodier, Richard et al., 1984; Robert,<br />
Beaufrere et al., 1985; Bach, Salemi et al., 1995). A reposição de testosterona<br />
resulta no aumento <strong>da</strong> massa e força muscular em populações de homens<br />
idosos hipogono<strong>da</strong>is (Ruff e Weissmann, 1988; Salomon, Cuneo et al., 1989;<br />
Sakurai, Aarsland et al., 1995). Outro mecanismo pelo qual a testosterona<br />
aumenta a massa muscular tem sido mostrado através do aumento do número<br />
de células satélites (Stiegler, Rett et al., 1989) que também expressam<br />
receptores de androgênios (Tessari, Biolo et al., 1990). A exposição a<br />
androgênios, de maneira dose dependente, aumenta a expressão de IGF-1 no<br />
músculo diafragma de ratos (Tessari, Inchiostro et al., 1991).<br />
Os efeitos de estrogênios e progesterona sobre o metabolismo de<br />
proteínas é pouco conhecido. A menopausa está associa<strong>da</strong> à per<strong>da</strong> muscular<br />
acelera<strong>da</strong> (Mooradian, Morley et al., 1987). Contudo, não está claro se a<br />
reposição de estrogênio pode aumentar ou não a massa muscular. Alguns<br />
estudos têm evidenciado que a terapia de substituição hormonal não previne<br />
15
mu<strong>da</strong>nças promovi<strong>da</strong>s pela menopausa na composição do corpo (Beckett,<br />
1992) ou melhora na massa muscular (Nair, Halli<strong>da</strong>y et al., 1987; Newman,<br />
Heslin et al., 1994), o que é contrariado por outros estudos que mostraram a<br />
melhora <strong>da</strong> potência muscular (Nair, Garrow et al., 1983; Pacy, Cheng et al.,<br />
1990; Pacy, Bannister et al., 1991). Um mecanismo pela qual a per<strong>da</strong> de<br />
estrogênio pode contribuir para a sarcopenia relaciona<strong>da</strong> com a i<strong>da</strong>de pode ser<br />
devido ao aumento de citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e TNF-alfa<br />
(Palmer, 1990; Pearlstone, Wolf et al., 1994). IL-6 diminui níveis de IGF-1 tanto<br />
in vitro e in vivo (Pozefsky, Felig et al., 1969; Preedy e Garlick, 1985). Baixo<br />
nível de IGF-1 pode estimular a IL-6, sugerindo um elo entre IGF-1 e IL-6<br />
(Preedy e Garlick, 1988). Cappola e colaboradores examinaram os efeitos dos<br />
baixos níveis de IGF-1 e altos níveis de IL-6 (individualmente e combinados)<br />
sobre a mobili<strong>da</strong>de, habili<strong>da</strong>de e morte celular (Cappola, Bandeen-Roche et al.,<br />
2001). Estes autores concluíram que a combinação de baixos níveis de IGF-1 e<br />
altos de IL-6 confere um risco progressivo de não habili<strong>da</strong>de e morte em<br />
mulheres mais velhas, sugerindo um efeito na falta de regulação dos sistemas<br />
imune e endócrino (Ramsay, 1966). Deficiência de estrogênio aumenta vias<br />
pró-inflamatórias, uma vez que o estrogênio diminui a expressão de IL-6 e<br />
apresenta efeitos inibitórios sobre as vias do NF-kB (Reeds e Palmer, 1983;<br />
Reeds, Hay et al., 1985) e AP-1 para a transcrição do gene do TNF-alfa<br />
(Rennie, 1985). Além disto, foi mostrado que o estrogênio afeta a expressão de<br />
HSP70 em diversos tecidos, incluindo a do músculo esquelético (Rennie,<br />
Bennegard et al., 1984). A indução de HSP70 após exercício muscular foi<br />
maior em ratos machos do que em fêmeas (Rennie, Edwards et al., 1982).<br />
16
Glicocorticóides, glucagon e catecolaminas são considerados os mais<br />
importantes hormônios catabólicos. Estes hormônios são elevados em<br />
situações clínicas de estresse intenso (Alberti, Batstone et al., 1980) e a per<strong>da</strong><br />
de proteínas é vista resultando no aumento <strong>da</strong> quebra de proteínas em<br />
excesso.<br />
O tratamento com glicocorticóides induz a um decréscimo <strong>da</strong> síntese de<br />
proteína e, possivelmente, a um aumento <strong>da</strong> quebra de proteínas em animais<br />
(Florini, 1987; Garlick, Burns et al., 1988; Sugden e Fuller, 1991). Na síndrome<br />
de Cushing, o aumento <strong>da</strong> produção glicocorticóide mostra um grande efeito<br />
sobre o músculo esquelético com marca<strong>da</strong> destruição e fraqueza muscular.<br />
Também o mesmo ocorre com administração intensiva de cortisol numa<br />
varie<strong>da</strong>de de situações clínicas (Horber, Scheidegger et al., 1985). Apesar de o<br />
tratamento com prednisona (glicocorticóide sintético) melhorar a potência e a<br />
função muscular em pacientes com DMD (Distrofia muscular de Duchenne) não<br />
foram encontra<strong>da</strong>s diferenças nas taxas de síntese protéica (Rifai, Welle et al.,<br />
1995). A ação específica dos glicocorticóides sobre o metabolismo de proteínas<br />
musculares é difícil de ser determina<strong>da</strong>, pois outros hormônios também são<br />
afetados pelo tratamento.<br />
O glucagon atua principalmente no fígado, entretanto, a incubação de<br />
músculo de rato com altas concentrações de glucagon resulta no decréscimo<br />
<strong>da</strong> síntese de proteínas (Preedy e Garlick, 1985; 1988). A liberação de<br />
aminoácidos a partir do músculo pode estar aumenta<strong>da</strong> (Kraenzlin, Keller et al.,<br />
1989) ou diminuí<strong>da</strong> (Del Prato, Defronzo et al., 1990) em similares protocolos<br />
de infusão <strong>da</strong> epinefrina.<br />
17
Os hormônios <strong>da</strong> tireóide, embora essenciais para o crescimento,<br />
exibem efeito catabólico no músculo esquelético durante os estados de<br />
hipotireoidismo e hipertireoidismo (Ramsay, 1966; Kissel e Mendell, 1992),<br />
determinando fraqueza muscular e, posteriormente, per<strong>da</strong> <strong>da</strong> massa muscular<br />
(Zurcher, Horber et al., 1989). A tireoidectomia induz à atrofia muscular pela<br />
diminuição <strong>da</strong> síntese e aumento <strong>da</strong> degra<strong>da</strong>ção de proteínas (Garlick, Burns<br />
et al., 1988), porém também no hipertireoidismo tem sido reportado aumento<br />
do catabolismo protéico (Gelfand, Hutchinson-Williams et al., 1987).<br />
Prostaglandinas e citocinas são importantes reguladoras do<br />
metabolismo de proteínas musculares (Palmer, 1990; Bistrian, Schwartz et al.,<br />
1992), aumentam a síntese de proteínas musculares induzi<strong>da</strong> pela insulina<br />
(Reeds e Palmer, 1983; Reeds, Hay et al., 1985). Contudo, a influência sobre a<br />
ação <strong>da</strong> insulina pode ser diferente em humanos e em animais, dependendo do<br />
tipo de prostaglandina e <strong>da</strong> espécie animal (Garlick, Burns et al., 1988; Stiegler,<br />
Rett et al., 1989). Citocinas estão entre os prováveis mediadores <strong>da</strong><br />
sarcopenia, observa<strong>da</strong> durante diversos estados de doenças (Bistrian,<br />
Schwartz et al., 1992). Em ratos, estas geralmente induzem destruição<br />
muscular pelo aumento <strong>da</strong> quebra de proteínas (Kettelhut, Wing et al., 1988;<br />
Flores, Bistrian et al., 1989; Goodman, 1991). Os efeitos diretos e indiretos de<br />
prostaglandinas e citocinas sobre o metabolismo de proteínas no músculo em<br />
humanos ain<strong>da</strong> precisam ser estabelecidos.<br />
18
1.5 Influência do sistema imune no músculo esquelético<br />
O microambiente tecido muscular esquelético contém, além <strong>da</strong>s células<br />
musculares e respectivos progenitores, vários tipos celulares, como:<br />
fibroblastos, células endoteliais e do sistema imune, que contribuem para a<br />
funcionali<strong>da</strong>de e manutenção <strong>da</strong> homeostase.<br />
O sistema imunológico inato é vital para o processo de cicatrização.<br />
Macrófagos e neutrófilos, presentes no processo inflamatório que acompanha a<br />
lesão muscular, apresentam um papel importante na remoção de debris<br />
tissulares. Entretanto, em modelos de lesão muscular já foi mostrado que<br />
neutrófilos podem promover <strong>da</strong>no muscular através <strong>da</strong> produção de moléculas<br />
citotóxicas e citolíticas (Tidball, 2005), além de aumentar o estresse oxi<strong>da</strong>tivo<br />
(Beray-Berthat, Croci et al., 2003; Tidball e Wehling-Henricks, 2007a; b).<br />
Camundongos deficientes de neutrófilos apresentam uma regeneração tecidual<br />
eficiente sem formação de cicatriz (Wadman, 2005). Além <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de<br />
fagocítica, os macrófagos secretam citocinas, fatores de crescimento e óxido<br />
nítrico (NO) (Shi, Wakil et al., 1997; Cowin, Brosnan et al., 1998; Oliveira, El-<br />
Cheikh et al., 2000; Sandler, Mentink-Kane et al., 2003; Park e Barbul, 2004).<br />
NO regula a formação de colágeno, a proliferação celular e a contração <strong>da</strong><br />
lesão em modelos animais de reparo tecidual (Hesse, Modolell et al., 2001;<br />
Witte e Barbul, 2002; Park e Barbul, 2004). No músculo esquelético já foi<br />
mostrado que macrófagos são essenciais para desencadear o processo de<br />
regeneração após transplante de mioblastos (Lescaudron, Peltekian et al.,<br />
1999). Além disso, o meio condicionado de cultura de macrófagos peritoneais<br />
19
pode aumentar a proliferação de mioblastos in vitro, bem como o número de<br />
células expressando Myo-D. A primeira população de macrófagos que entra no<br />
músculo lesado tem grande capaci<strong>da</strong>de fagocítica e participa na destruição de<br />
restos celulares e, posteriormente, uma população mais regulatória estimularia<br />
a regeneração, promovendo o reparo do sarcolema lesado (Tidball e Wehling-<br />
Henricks, 2007a).<br />
O sucesso <strong>da</strong> regeneração e crescimento muscular parecem depender<br />
<strong>da</strong> ativação seqüencial e subseqüente supressão <strong>da</strong> sinalização de citocinas.<br />
Três citocinas comumente classifica<strong>da</strong>s como inflamatórias, fator de necrose<br />
tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1b) e interleucina-6 (IL-6),<br />
apresentam efeitos diversos no músculo esquelético (Tsujinaka, Fujita et al.,<br />
1996; Langen, Schols et al., 2002). Tanto TNF-α como IL-6, em baixas<br />
concentrações, podem atuar como fator de crescimento para o músculo<br />
esquelético (Warren, Hulderman et al., 2002; Li, 2003), mas também podem<br />
induzir destruição em altas concentrações ou com exposições crônicas<br />
(Tsujinaka, Fujita et al., 1996; Langen, Schols et al., 2002). TNF-α está<br />
freqüentemente associado a doenças de destruição muscular. Contudo, este<br />
também é crítico para o sucesso <strong>da</strong> regeneração muscular a partir de injúria<br />
por cardiotoxina (Chen, Gerken et al., 2005). IL-1b pode suprimir a síntese de<br />
proteínas (Cooney, Maish et al., 1999; Strle, Broussard et al., 2004) e induzir<br />
fibrose cardíaca (Hwang, Lee et al., 2001). Na inflamação do tecido muscular,<br />
várias populações de células do sistema imune expressam e liberam diferentes<br />
citocinas e quimocinas, contudo, recentes descobertas também indicam que<br />
células musculares são fontes destes fatores. Mioblastos humanos produzem<br />
uma varie<strong>da</strong>de de citocinas constitutivamente, tais como, IL-6 e TGF-β. Outras<br />
20
citocinas como IL-4, IL-10 e IFN-γ e também IL-1α, IL-1β e TNF-α são<br />
encontra<strong>da</strong>s em mioblastos somente depois de estimulação. Receptores<br />
específicos de citocinas não têm sido descritos em células musculares,<br />
entretanto, o fato de mioblastos responderem a várias citocinas in vitro sugere<br />
a presença de tais receptores. Diferentes citocinas aumentam a expressão de<br />
quimocinas CXCL8 (IL-8), CXCL9, CXCL10, CCL3 (MIP-1a), CCL20 (MIP-3a) e<br />
CCL5 (RANTES) em miotubos de humanos. Dados sobre a expressão de<br />
receptores de quimocinas sobre células musculares são escassos. CCR1 e<br />
CCR5 são expressos em células musculares não necróticas, porém CCR2B é<br />
detectável em células satélites e fibras regenerando-se (Figarella-Branger,<br />
Civatte et al., 2003).<br />
Mioblastos de humanos podem expressar uma varie<strong>da</strong>de de moléculas<br />
imunológicas, incluindo MHC, moléculas coestimulatórias (Nagaraju, 2001), e<br />
secretam várias citocinas, quimocinas e moléculas de adesão celular (Figarella-<br />
Branger, Civatte et al., 2003) tão bem como receptores do sistema imune<br />
(Mantegazza, Hughes et al., 1991; Roy, Dansereau et al., 1991; Goebels,<br />
Michaelis et al., 1992; Wiendl, Behrens et al., 2000). Em condições<br />
inflamatórias, células musculares expressam moléculas de MHC I e II e,<br />
também, moléculas de adesão, citocinas e receptores de quimocinas e<br />
moléculas co-estimulatórias. Mioblastos de humanos expressam<br />
constitutivamente LFA-1 (molécula de adesão do tipo 1 associa<strong>da</strong> à função do<br />
linfócito), embora LFA-1, LFA-2 e LFA-3 não sejam detectáveis em miotubos.<br />
Depois <strong>da</strong> estimulação, in vitro, com citocinas pró-inflamatórias, a molécula de<br />
adesão intercelular -1 (ICAM-1) é detectável na superfície de mioblastos<br />
(Marino, Scuderi et al., 2003). Mioblastos não expressam as moléculas co-<br />
21
estimulatórias B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) (Behrens, Kerschensteiner et al.,<br />
1998; Bernasconi, Confalonieri et al., 1998), mas expressam B7-H1, um outro<br />
membro <strong>da</strong> família B7, durante processos inflamatórios. B7-H1 exerce fortes<br />
proprie<strong>da</strong>des imunoinibitórias sobre as células T CD4 e CD8 . Assim, B7-H1<br />
poderia atuar como um imunorregulador negativo produzido pelas células<br />
musculares para controle <strong>da</strong> inflamação local (Wiendl, Mitsdoerffer et al., 2003).<br />
1.6 Interações do tecido muscular e tecido adiposo<br />
O tecido adiposo é um tecido conjuntivo especializado e apresenta<br />
várias funções, como: isolamento térmico, barreira física ao trauma,<br />
armazenamento energético e secreção de proteínas e peptídios bioativos com<br />
ação local e à distância, sendo também considerado como um órgão endócrino<br />
ativo (Prins, 2002; Fantuzzi, 2005; Trayhurn e Wood, 2005). Este tecido está<br />
disperso pelo organismo, em depósitos sem ligação física entre si, cuja<br />
ativi<strong>da</strong>de secretória é regula<strong>da</strong> por mecanismos humorais e hormonais não<br />
totalmente esclarecidos. Nestes depósitos individuais de tecido adiposo,<br />
encontram-se vários tipos celulares (macrófagos, fibroblastos, pré-adipócitos e<br />
adipócitos) com ativi<strong>da</strong>de secretora variável. O tecido adiposo se comunica<br />
com outros órgãos através de ácidos graxos livres e adipocinas. Este tecido<br />
secreta mais de 50 adipocinas, podendo-se agrupá-las de acordo com as suas<br />
principais funções: imunológica, cardiovascular, metabólica e endócrina. Dentro<br />
do primeiro grupo, incluem-se IL-6, TNF-α e os componentes do sistema<br />
complemento B, C3 e D (adipsina). Estas moléculas têm funções bem defini<strong>da</strong>s<br />
nos estágios inflamatórios, mas também são produzi<strong>da</strong>s pelo tecido adiposo<br />
22
em condições não-inflamatórias. Tanto TNF-α como IL-6 exercem um papel<br />
importante no metabolismo dos lípidios e <strong>da</strong> glicose, como, por exemplo,<br />
inibindo a lipoproteína lipase, induzindo a lipólise e aumentando a captação de<br />
glicose. Os níveis de IL-6 estão aumentados na obesi<strong>da</strong>de e diminuem com a<br />
per<strong>da</strong> de peso, sendo também um marcador de resistência à insulina (Prins,<br />
2002; Berg e Scherer, 2005). Os componentes do sistema complemento<br />
adipsina ou fator D foram as primeiras proteínas identifica<strong>da</strong>s como sendo<br />
produzi<strong>da</strong>s pelo adipócito. A presença dos fatores B e D é necessária à síntese<br />
de fator C3a, a partir de C3. O fator C3a é posteriormente clivado em ASP<br />
(proteína estimuladora de acilação) (Prins, 2002; Xu, Barnes et al., 2003). Esta<br />
proteína intervém na síntese e no armazenamento de triglicerídeos (TG). A sua<br />
deficiência (em ratos) está associa<strong>da</strong> à diminuição <strong>da</strong> gordura corporal e ao<br />
aumento <strong>da</strong> sensibili<strong>da</strong>de à insulina (Prins, 2002; Havel, 2004). No grupo <strong>da</strong>s<br />
adipocinas com função predominantemente cardiovascular, destacam-se as<br />
moléculas do eixo renina angiotensina e o inibidor de ativação do<br />
plasminogênio (PAI-1). Há uma forte associação entre obesi<strong>da</strong>de e o risco<br />
cardiovascular, sobretudo <strong>da</strong> gordura visceral (Gregoire, 2001; Prins, 2002; Xu,<br />
Barnes et al., 2003; Berg e Scherer, 2005). O tecido adiposo influencia<br />
diretamente o metabolismo de lípidios e carboidratos. As adipocinas envolvi<strong>da</strong>s<br />
nestes processos são os ácidos graxos livres (AGL), a adiponectina, a<br />
resistina, o AGRP (agouti related petide) e a visfatina. O paradigma <strong>da</strong> função<br />
endócrina do tecido adiposo é a leptina. A sua produção é quase exclusiva do<br />
tecido adiposo e desempenha um papel fun<strong>da</strong>mental na regulação dos<br />
depósitos energéticos, <strong>da</strong> fertili<strong>da</strong>de e do sistema imunológico (Fantuzzi, 2005;<br />
Mitchell, Armstrong et al., 2005). Além <strong>da</strong> produção de leptina, o adipócito tem<br />
23
uma função importante no metabolismo dos hormônios esteróides,<br />
predominantemente de interconversão. O tecido adiposo intervém no<br />
metabolismo dos esteróides sexuais em duas vias bioquímicas: a via 17-β<br />
hidroxiesteróide oxireductase, que cataliza a conversão de androstenediona em<br />
testosterona e a de estrona em estradiol e a outra via dependente <strong>da</strong><br />
aromatase P450 que cataliza a conversão de androstenediona em estrona e de<br />
testosterona em estradiol. Estas vias contribuem significativamente para os<br />
níveis de esteróides sexuais na mulher (sobretudo na pós-menopausa). Assim,<br />
as adipocinas desempenham um papel importante na homeostasia energética,<br />
sensibili<strong>da</strong>de à insulina, resposta imunológica e doença vascular (Gregoire,<br />
2001; Prins, 2002; Xu, Barnes et al., 2003; Fantuzzi, 2005).<br />
Os adipócitos podem se expandir dentro e fora <strong>da</strong>s fibras musculares<br />
esqueléticas, influenciando as células musculares via sinalização parácrina e<br />
endócrina. O tecido adiposo comunica-se com o músculo esquelético através<br />
de mediadores metabólicos, incluindo os ácidos de gorduras livres e<br />
adipocinas. Adipocinas, tais como TNF-α, IL-6, leptina, MCP-1, TIMP-1 (inibidor<br />
tipo 1 de metaloproteinase tecidual) e a glicoproteína transportadora de retinol<br />
(RBP-4), estão implica<strong>da</strong>s no desenvolivimento de resistência à insulina no<br />
músculo (Sartipy e Loskutoff, 2003; Yang, Graham et al., 2005) . A<br />
adiponectina é um hormônio protéico envolvido na manutenção <strong>da</strong> homeostase<br />
energética nos tecidos metabolicamente ativos através <strong>da</strong> ativação de<br />
receptores <strong>da</strong> adiponectina, AdipoR1 e AdipoR2, que sinalizam quinase<br />
dependente de AMP (AMPK) no fígado e no músculo (Bluher, Bullen et al.,<br />
2006). A adiponectina também exerce ações antinflamatórias por reduzir a<br />
24
expressão <strong>da</strong> molécula de adesão vascular-1 (VCAM-1), E-selectina, ICAM-1 e<br />
IL-8 em células endoteliais <strong>da</strong> aorta induzi<strong>da</strong>s por TNF-α (Ouchi, Kihara et al.,<br />
1999; Kobashi, Urakaze et al., 2005). Além disso, a adiponectina também inibe<br />
o fator nuclear-κB (NF-κB) estimulado por TNF-α em células endoteliais e<br />
macrófagos (Ouchi, Kihara et al., 2000; Kobashi, Urakaze et al., 2005;<br />
Yamaguchi, Argueta et al., 2005), estimula a produção <strong>da</strong> citocina<br />
antinflamatória IL-10 por macrófagos (Wulster-Radcliffe, Ajuwon et al., 2004),<br />
aumenta a produção do inibidor de metalloproteinase-1 em macrófagos de<br />
humanos (Kuma<strong>da</strong>, Kihara et al., 2004) e também atua como um importante<br />
regulador <strong>da</strong> sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS).<br />
O tecido adiposo, além de contribuir com fatores endócrinos e<br />
metabólicos para o tecido muscular, também pode ser uma origem de células-<br />
tronco com capaci<strong>da</strong>de miogênica (Zuk, Zhu et al., 2002; Mizuno, 2003; Strem,<br />
Hicok et al., 2005). Células-tronco do tecido adiposo podem ser rapi<strong>da</strong>mente<br />
induzi<strong>da</strong>s a diferenciar-se em tecido muscular quando estimula<strong>da</strong>s por fatores<br />
miogênicos ou ain<strong>da</strong> em macrófagos a partir de pré-adipócitos (Charriere,<br />
Cousin et al., 2003).<br />
Também fatores derivados do músculo (miocinas) podem afetar as<br />
células adiposas. As miocinas, assim como as adipocinas, fazem parte <strong>da</strong><br />
sinalização entre músculo e tecido adiposo, importante na modulação <strong>da</strong> taxa<br />
de massa de gordura e resistência à insulina. A IL-6 é fortemente produzi<strong>da</strong> no<br />
músculo esquelético durante e após o exercício (Steensberg, Keller et al.,<br />
2002). A estimulação de curta duração de miócitos com IL-6 por concentrações<br />
similares àquelas durante o exercício tem um efeito positivo sobre a<br />
sensibili<strong>da</strong>de à insulina nas células musculares esqueléticas (Weigert, Hennige<br />
25
et al., 2005), indicando um papel importante no suprimento de energia durante<br />
o exercício porque também ativa a lipólise no tecido adiposo (Van Hall,<br />
Steensberg et al., 2003). Outra miocina, IL-15, secreta<strong>da</strong> por miócitos,<br />
influencia na proliferação de adipócitos e secreção de adiponectina (Quinn,<br />
Strait-Bodey et al., 2005).<br />
1.7 Receptores de estrogênios – Moduladores e bloqueadores<br />
Os efeitos do estradiol são mediados através de receptores localizados<br />
no núcleo e atuam como fatores de transcrição (Aran<strong>da</strong> e Pascual, 2001;<br />
Klinge, 2001). A expressão do gen é regula<strong>da</strong> pela união direta de estradiol ao<br />
receptor de estrogênio e se liga a uma seqüência específica do DNA chama<strong>da</strong><br />
de elemento de resposta ao estrogênio (ERE) (Klinge, Jernigan et al., 2004).<br />
Receptores de estrogênios também estão localizados na membrana celular e<br />
são importantes nos efeitos metabólicos imediatos (Klinge, Jernigan et al.,<br />
2004). O primeiro receptor de estrogênio foi denominado ER-α em 1986<br />
(Green, Kumar et al., 1986) e somente 10 anos depois foi identificado o<br />
segundo receptor de estrogênio, ER-β (Kuiper e Gustafsson, 1997). Existe uma<br />
grande similari<strong>da</strong>de entre estes dois receptores, sugerindo que o ER-β pode<br />
reconhecer e unir-se a elementos responsivos ao estrogênio (EREs) tal com o<br />
ER-α, mas ca<strong>da</strong> receptor pode ter distintos espectros de ligantes, sendo<br />
possível que o ER-β antangonize as ações ER-α.<br />
Tecidos-alvo para estrogênio incluem os alvos clássicos, com alto<br />
conteúdo de ER-α: útero, glândulas mamárias, placenta, fígado, sistema<br />
nervoso central, sistema cardiovascular e osso e os alvos não clássicos, como:<br />
a próstata, testículos, ovário, glândula pineal, glândula tireóide, pele,<br />
26
paratireóide, adrenais, pâncreas, tecido linfóide e trato urinário, onde<br />
predomina o ER-β e a expressão do ER-α é muito pouco ou quase<br />
imensurável. O músculo esquelético expressa receptores de estrogênio, sendo<br />
assim, responsivo para estrogênio (Dionne, Lesage et al., 1979; Meyer e Rapp,<br />
1985; Gustafsson, 1999; Lemoine, Granier et al., 2002; Lemoine, Granier et al.,<br />
2003; Wiik, Glenmark et al., 2003). No músculo maduro, o estrogênio ativa a<br />
expressão de cadeia pesa<strong>da</strong> <strong>da</strong> miosina (MHC), fenótipo do músculo e,<br />
portanto, previne injúria muscular (Warren, Williams et al., 1996; Stupka,<br />
Lowther et al., 2000; Kadi, Karlsson et al., 2002; Tiidus, 2003; Feng, Li et al.,<br />
2004). O estrogênio regula vias de sinalização de receptores acoplados à<br />
proteína G, na qual tem sido identificado como regulador do crescimento<br />
muscular (Kraus, Bernard et al., 1989; Sillence, Reich et al., 1995; Enns, Iqbal<br />
et al., 2008; Enns e Tiidus, 2008). Mioblastos também possuem receptores de<br />
estrogênios funcionalmente competentes e que podem transativar genes<br />
endógenos como c-fos e erg-1 na proliferação de mioblastos (Kahlert, Grohe et<br />
al., 1997).<br />
Mediadores químicos que inibem a função dos estrogênios são<br />
chamados de antiestrogênios. Estes podem ser de dois tipos: moduladores dos<br />
receptores de estrogênio (SERMs) e inibidores <strong>da</strong> aromatase. Tamoxifen,<br />
raloxifene e ICI 182,780 (faslodex, fulvestrant) são exemplos de SERMs. As<br />
classes de SERMs apresentam ativi<strong>da</strong>de dupla de agonista e antagonista,<br />
dependendo do subtipo de receptor no mesmo tecido e/ou em tecidos<br />
diferentes; também podem ser específicos para um subtipo de receptor<br />
(Stewart e Stern, 1986; Rutqvist e Mattsson, 1993; Wenger, 2002; Jensen e<br />
Jor<strong>da</strong>n, 2003; Lewis e Jor<strong>da</strong>n, 2005). O tamoxifen tem sido terapeuticamente<br />
27
usado para mulheres com câncer de mama como um agente antiestrogênico<br />
desde 1970. Este também funciona como um agente estrogênico no osso e no<br />
metabolismo de gordura. O tamoxifen é um modulador seletivo do receptor de<br />
estrogênios (Goldenberg e Froese, 1982; Perry, Kang et al., 1995; Ferlini,<br />
Scambia et al., 1999) que funciona como antagonista em alguns tecidos como<br />
na mama e útero e agonista em outros tecidos tais como coração e osso<br />
(Stewart e Stern, 1986; Love, Mazess et al., 1992; Rutqvist e Mattsson, 1993;<br />
Li, Takahashi et al., 1996; Fitts, Klein et al., 2001; Eugster, Rubin et al., 2003;<br />
Jensen e Jor<strong>da</strong>n, 2003; Fitts, Klein et al., 2004). No músculo, apresenta<br />
proprie<strong>da</strong>des agonistas uma vez que fêmeas ovariectomiza<strong>da</strong>s trata<strong>da</strong>s com<br />
este agente modulador tiveram destruição muscular reduzi<strong>da</strong> de modo<br />
semelhante aos ratos machos (Koot, Amelink et al., 1991). Os inibidores de<br />
aromatase letrozole, anastrozole e exemestane atuam como antiestrogênios<br />
por bloquearem a conversão de androgênios em estrogênios ativos.<br />
1.8 Distrofia muscular de Duchenne<br />
A distrofia muscular do tipo Duchenne (DMD) é uma miopatia<br />
inflamatória grave de evolução fatal, caracteriza<strong>da</strong> pela destruição progressiva<br />
<strong>da</strong>s fibras musculares esqueléticas e substituição precoce por tecido conjuntivo<br />
e adiposo (Duchenne, 1868; Dubowitz, 1985; Hoffman, Brown et al., 1987;<br />
Deconinck e Dan, 2007; Hopf, Turner et al., 2007). A presença de mutações no<br />
cromossomo X (locus Xp21) é a base genética responsável pela distrofia<br />
muscular de Duchenne (Greenstein, 1977; Emery, 1989; Fayssoil, Orlikowski et<br />
al., 2008). O produto normal do gene DMD é uma proteína de 427 kDa<br />
denomina<strong>da</strong> distrofina, presente nas células musculares esqueléticas estria<strong>da</strong>s<br />
28
normais, células endoteliais e algumas células do sistema nervoso central<br />
(Mehler, 2000; Cyrulnik e Hinton, 2008) . Nos indivíduos com DMD, a distrofina<br />
está ausente ou é expressa como molécula trunca<strong>da</strong> não-funcional (Mendell,<br />
Sahenk et al., 1995; Van Der Berg, 1995; Den Dunnen e Beggs, 2006). O gene<br />
<strong>da</strong> distrofina é extremamente grande (3,4 Mb), contém 79 exons e 2,4 milhões<br />
de bases. A sua grande complexi<strong>da</strong>de propicia uma alta taxa de novas<br />
mutações, sendo que, em 65% dos pacientes, ocorre per<strong>da</strong> de uma parte do<br />
DNA (deleção), em 5%, duplicação do gene e, em 30% dos casos, mutações<br />
pontuais (Hoffman, 1996; Lim e Rando, 2008).<br />
A distrofina é a proteína mais abun<strong>da</strong>nte na fibra muscular,<br />
representando aproxima<strong>da</strong>mente 5% <strong>da</strong>s proteínas do citoesqueleto. Tal<br />
proteína apresenta localização na porção interna do sarcolema, formando uma<br />
trama associa<strong>da</strong> a um complexo de glicoproteínas (DGC) constituído pelas<br />
distroglicanas, sarcoglicanas, sintrofinas, distrobrevinas, sarcospana e -<br />
actinina (Watkins, Cullen et al., 2000; Kanagawa e To<strong>da</strong>, 2006). Atualmente,<br />
acredita-se que todo esse complexo DGC-distrofina, além do suporte estrutural,<br />
participe na transdução de sinais provenientes <strong>da</strong> interação <strong>da</strong> fibra muscular<br />
com a matriz extracelular (Watkins, Cullen et al., 2000; Ervasti, 2007). A<br />
organização desse complexo é essencial para a integri<strong>da</strong>de <strong>da</strong> fibra muscular,<br />
uma vez que defeitos em outras proteínas do complexo resultam em diferentes<br />
tipos de distrofias musculares (Allikian e Mcnally, 2007).<br />
O papel <strong>da</strong> distrofina no músculo esquelético ain<strong>da</strong> não está totalmente<br />
eluci<strong>da</strong>do, embora existam várias hipóteses para sua função como proteína<br />
estrutural de membrana, estabilizadora do sarcolema durante o estresse <strong>da</strong><br />
29
contração muscular, proteína estabilizadora de outras proteínas membranares<br />
e proteína moduladora <strong>da</strong> homeostase dos íons cálcio. Estas hipóteses não<br />
são excludentes entre si, podendo a distrofina exercer mais de uma função no<br />
músculo. A deficiência ou ausência <strong>da</strong> distrofina leva à fosforilação acentua<strong>da</strong>,<br />
alteração na homeostase do cálcio intracelular, redução do conteúdo de<br />
triglicerídeos, instabili<strong>da</strong>de e per<strong>da</strong> <strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de do sarcolema, culminando<br />
com apoptose e necrose <strong>da</strong>s fibras musculares e liberação de enzimas como<br />
piruvato e creatinaquinase (Tews, Goebel et al., 1997; Infante e Huszagh,<br />
1999; Deconinck e Dan, 2007). Na DMD, o músculo responde com ciclos de<br />
regeneração e degeneração, numa tentativa, sem sucesso, de substituir a<br />
per<strong>da</strong> <strong>da</strong>s fibras musculares (Cullen e Mastaglia, 1980; Miike, 1983; Brasseur,<br />
Onolfo et al., 1997). Os efeitos epistáticos decorrentes <strong>da</strong> deficiência de<br />
distrofina são de grande importância, influenciando na gravi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> doença.<br />
Por exemplo, a ausência de distrofina produz uma doença progressiva em<br />
humanos e em gatos, mas uma doença benigna em camundongos que<br />
apresentam expectativa de vi<strong>da</strong> normal. Além disso, o comprometimento<br />
muscular difere entre os músculos, o que ressalta a importância <strong>da</strong> influência<br />
de fatores epigenéticos (Tidball e Wehling-Henricks, 2004).<br />
As anormali<strong>da</strong>des histológicas mais comuns na miofibra na DMD são:<br />
desorganização <strong>da</strong>s ban<strong>da</strong>s I e Z; presença de fibras arredon<strong>da</strong><strong>da</strong>s com<br />
tamanho variado (fibras gigantes e pequenas) com sarcoplasma<br />
grosseiramente granular; vacuolização e fragmentação; nucleação central;<br />
mionecrose e fibrose intersticial precoce, geralmente associa<strong>da</strong> à deposição de<br />
tecido adiposo. DMD ain<strong>da</strong> permanece uma doença incurável e os tratamentos<br />
disponíveis clinicamente são todos paliativos. A terapia celular com<br />
30
transferência de mioblastos e células-tronco poderia corrigir os problemas<br />
primários, porém ain<strong>da</strong> existem várias dificul<strong>da</strong>des a serem supera<strong>da</strong>s nesse<br />
tipo de tratamento (Rodino-Klapac, Chicoine et al., 2007). A obtenção de um<br />
vetor apropriado para um gene tão grande como o <strong>da</strong> distrofina, a expressão<br />
limita<strong>da</strong> de distrofina numa pequena área próxima à inoculação e a meia vi<strong>da</strong><br />
curta do mioblasto transfectado bem como a rejeição imunológica ain<strong>da</strong> são<br />
obstáculos a serem superados (Bog<strong>da</strong>novich, Perkins et al., 2004; Negroni,<br />
Butler-Browne et al., 2006). Outra esperança é o tratamento como<br />
oligonucleotídeos tanto para correção <strong>da</strong> tradução como para terapia gênica,<br />
mas o alto custo, a não-disponibili<strong>da</strong>de sistêmica e a rejeição imunológica<br />
ain<strong>da</strong> são problemas a serem solucionados para o uso como terapêutica<br />
(Bertoni, 2008).<br />
1.9 Camundongo mdx - modelo murino <strong>da</strong> DMD<br />
O camundongo distrófico mdx, mutante de uma colônia de<br />
C57BL10/ScSn, apresenta uma mutação pontual na região HqBpa do<br />
cromossomo X (Smith e Schofield, 1994), ocasionando a substituição de uma<br />
Citosina por Timina no par de nucleotídeos 3185 do exon 23 do gene <strong>da</strong><br />
distrofina. Isto determina um código de terminação no lugar <strong>da</strong> Glutamina,<br />
gerando uma proteína trunca<strong>da</strong> com 27% do tamanho normal que não é<br />
expressa (Sicinski, Geng et al., 1989). O camundongo mdx apresenta níveis<br />
muito elevados <strong>da</strong> enzima creatinaquinase no soro, o que indica extensa<br />
degeneração muscular. Contudo, esses animais desenvolvem fenótipo benigno<br />
<strong>da</strong> doença com poucos sintomas clínicos aparentes, apresentando uma<br />
31
sobrevi<strong>da</strong> praticamente normal e uma regeneração do tecido muscular eficiente<br />
(Bulfield, Siller et al., 1984).<br />
O músculo do mdx apresenta poucas alterações histológicas no período<br />
pós-natal, porém, logo após o desmame, inicia-se a fase de mionecrose<br />
extensa (Cullen e Mastaglia, 1980) acompanha<strong>da</strong> por intenso infiltrado<br />
inflamatório constituído principalmente de macrófagos, linfócitos T e raros<br />
linfócitos B (Mcdouall, Dunn et al., 1990; Spencer, Walsh et al., 1997; Lagrota-<br />
Candido, Vasconcellos et al., 2002). Na oitava semana de vi<strong>da</strong> pós-natal, a<br />
mionecrose é parcialmente compensa<strong>da</strong> pela regeneração <strong>da</strong> miofibra, sendo<br />
evidente um elevado número de fibras regenera<strong>da</strong>s com nucleação central<br />
(Nonaka, 1998). Nos camundongos mdx mais idosos- com 24 semanas- ain<strong>da</strong><br />
ocorre uma discreta mionecrose com redução na regeneração e aumento na<br />
fibrose, porém, após 52 semanas de vi<strong>da</strong> pós-natal, os camundongos mdx<br />
apresentam um declínio significativo do peso corporal e <strong>da</strong> massa muscular<br />
(Lefaucheur, Pastoret et al., 1995). As fibras musculares do mdx idoso<br />
apresentam grande variação no tamanho, inclusive com miofibras atrofia<strong>da</strong>s,<br />
fragmenta<strong>da</strong>s e aumento <strong>da</strong> fibrose no endomísio (Pastoret e Sebille, 1995;<br />
Lagrota-Candido, Vasconcellos et al., 2002).<br />
Resultados <strong>da</strong> dissertação de mestrado (Salimena, Lagrota-Cândido et<br />
al.,2004) mostraram que camundongos mdx machos e fêmeas apresentavam<br />
diferenças no processo de regeneração muscular nas diferentes fases <strong>da</strong><br />
doença. As fêmeas apresentavam menor inflamação e mionecrose, porém<br />
maior regeneração muscular e deposição de tecido adiposo que os<br />
camundongos machos na i<strong>da</strong>de adulto jovem (6 semanas pós-natal), porém as<br />
alterações eram mais graves nas fêmeas idosas (24 semanas). Estes <strong>da</strong>dos<br />
32
sugerem que os hormônios femininos são particularmente responsáveis pelas<br />
diferenças na lesão muscular do camundongo mdx, favorecendo a resolução<br />
<strong>da</strong> mionecrose e promovendo a regeneração dos músculos esqueléticos.<br />
33
2. OBJETIVOS<br />
2.1 Objetivo geral<br />
Estu<strong>da</strong>r a influência do dimorfismo sexual na lesão muscular de<br />
camundongos mdx com distrofia muscular de Duchenne.<br />
2.2 Objetivos específicos<br />
Comparar as alterações histomorfológicas presentes nos músculos<br />
esqueléticos (solear e gastrocnêmio) na fase de regeneração nos<br />
camundongos distróficos machos e fêmeas após castração cirúrgica e<br />
tratamento com agonista do receptor de estrógeno (tamoxifen).<br />
Analisar a expressão <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s metaloproteinases, MMP-9 e MMP-2,<br />
nos músculos esqueléticos (gastrocnêmio) de camundongos mdx machos e<br />
fêmeas após castração cirúrgica.
Diferenciar os tipos de miofibras (I, IIA e IIB) presentes na fase de<br />
regeneração muscular de camundongos mdx machos e fêmeas após<br />
castração cirúrgica.<br />
Analisar nos animais submetidos à castração cirúrgica e tratados com<br />
tamoxifen o fenótipo: <strong>da</strong>s células com marcadores de células-tronco<br />
hematopoiéticas (SCA-1), macrófagos (Mac-1+, F4/80) presentes nos focos<br />
de inflamação; <strong>da</strong>s células regenerando com marcadores de molécula de<br />
adesão NCAM; e dos adipócitos.<br />
Relacionar as diferenças <strong>da</strong> miopatia entre os gêneros e o possível efeito<br />
benéfico dos agonistas de estrogênio na modulação do microambiente <strong>da</strong><br />
lesão muscular do camundongo mdx.<br />
35
3. MATERIAL E MÉTODOS<br />
3.1 Animais<br />
Camundongos distróficos mdx e controle não-distróficos C57BL10/J<br />
(C57) foram mantidos no Biotério de Patologia Celular do Instituto de Biologia<br />
<strong>da</strong> Universi<strong>da</strong>de Federal Fluminense (<strong>UFF</strong>) em gaiolas plásticas forra<strong>da</strong>s com<br />
maravalha de pinus autoclava<strong>da</strong>, em ambiente com temperatura (20 o C) e ciclo<br />
de luz (12h/12h) controlados, recebendo suplemento vitamínico vitagold<br />
semanalmente, ração (Nuvital, Paraná, Brasil) e água filtra<strong>da</strong> ad libitum.<br />
3.2 Castração cirúrgica<br />
Camundongos mdx e C57 machos e fêmeas selecionados com i<strong>da</strong>de de<br />
28 dias foram anestesiados com ketamina (50mg/kg) e xilasina (20mg/kg). As<br />
fêmeas
foram submeti<strong>da</strong>s à ovariectomia (OVX) através de duas pequenas incisões<br />
para-espinhais na região dorsal entre a crista ilíaca e as costelas mais<br />
inferiores; e já os machos foram submetidos à orquiectomia (OOX) através de<br />
incisão mediana do saco escrotal. O grupo SHAM recebeu apenas a incisão<br />
cirúrgica sem a retira<strong>da</strong> <strong>da</strong>s gôna<strong>da</strong>s. Camundongos machos e fêmeas, não<br />
operados, pareados também na mesma i<strong>da</strong>de, foram usados como controle.<br />
Os animais foram sacrificados por inalação de éter e, 4 semanas após cirurgia,<br />
na i<strong>da</strong>de correspondente à fase de regeneração muscular (8 semanas), foram<br />
estu<strong>da</strong>dos . Após assepsia com solução de álcool io<strong>da</strong>do, os músculos<br />
gastrocnêmio e solear foram cui<strong>da</strong>dosamente dissecados e retirados.<br />
3.3 Análise histológica<br />
Os músculos gastrocnêmio e solear foram fixados em formol Millonig<br />
tamponado (pH 7,2) durante 48h na temperatura ambiente. Após lavagem em<br />
água corrente durante 4 h os tecidos foram desidratados em soluções<br />
crescentes de álcool etílico (70%, 95%, 100%) durante 60 minutos em ca<strong>da</strong><br />
etapa e passados 3 vezes em álcool absoluto. Posteriormente, foram<br />
submetidos a 3 passagens em xilol para a completa retira<strong>da</strong> do álcool e <strong>da</strong><br />
gordura do material. A impregnação e a inclusão com parafina foram<br />
realiza<strong>da</strong>s em duas incubações a 60 o C por 1 hora. Todo o processamento foi<br />
feito automaticamente por meio de um processador de tecidos (LuPe PT -5,<br />
Brasil). Os blocos foram cortados semi-serialmente em micrótomo Spencer 820<br />
(American Optical, USA) na espessura de 5 m e colocados em lâminas<br />
desengordura<strong>da</strong>s, previamente filma<strong>da</strong>s, com solução glicerol-albumina. Em<br />
segui<strong>da</strong>, os cortes foram desparafinizados em três lavagens de 3 minutos com<br />
37
xilol e hidratados em concentrações decrescentes de etanol (100% I e II, 95% e<br />
70%) durante 3 minutos para ca<strong>da</strong> etapa e submersos em água destila<strong>da</strong> por<br />
também 3 minutos.<br />
A digitalização dos fragmentos de músculo corados foi obti<strong>da</strong> por meio<br />
de uma câmera digital Sound Vision (USA) acopla<strong>da</strong> ao microscópio Axioplan<br />
(Zeiss, Oberkolchen, Germany), sendo analisa<strong>da</strong> a totali<strong>da</strong>de de cortes<br />
transversais com objetiva 20x. A mionecrose foi identifica<strong>da</strong> pela presença de<br />
fibras degenerando-se e necróticas, com sarcoplasma eosinofílico pálido e<br />
infiltrado inflamatório, enquanto fibras regenerando-se foram identifica<strong>da</strong>s pelo<br />
citoplasma fortemente basofílico e nucleação central. A superfície total e área<br />
ocupa<strong>da</strong> pela mionecrose e fibras regenerando-se foram determina<strong>da</strong>s com o<br />
Programa de análise de Imagens Scion (National Institute of Health Image<br />
Program, USA). A diferença entre as duas medi<strong>da</strong>s foi expressa como<br />
percentual de área patológica do tecido.<br />
3.4 Reação histoquímica <strong>da</strong> miosina-ATPase<br />
Cortes congelados de 10 m de espessura de músculo esquelético<br />
(solear, gastrocnêmio) foram processados para coloração <strong>da</strong> Miosina-ATPase<br />
em pH 9,4 (Hayashi e Freiman, 1966). Os cortes foram incubados em uma<br />
solução de ATP e cloreto de cálcio pH 9,4 por 30 minutos em temperatura<br />
ambiente, deixados no cloreto de cálcio a 1% por 5 minutos e, posteriormente,<br />
no cloreto de cobalto a 5% por 5 minutos. A seguir, os cortes foram lavados em<br />
4 passagens rápi<strong>da</strong>s na água destila<strong>da</strong> e deixados de 15 a 30 segundos no<br />
sulfeto de amônia a 0,1%; em segui<strong>da</strong>, os cortes foram desidratados em álcool<br />
absoluto, passados em xilol e montados em bálsamo. Os tipos de miofibras<br />
38
foram classificados segundo o padrão de coloração: cor branca para as fibras<br />
do tipo I, par<strong>da</strong> para as fibras do tipo IIA e cor escura para fibras do tipo IIB<br />
(Round, Matthews et al., 1980).<br />
3.5 Reação histoquímica: tecido adiposo<br />
Cortes congelados de 10 m de espessura do músculo esquelético-<br />
gastrocnêmio- foram processados para coloração do tecido adiposo segundo o<br />
método Oil Red O (ORO) (Casselman, 1954). Os cortes foram bem lavados em<br />
água destila<strong>da</strong>, depois rapi<strong>da</strong>mente passados em fosfato triatil (60%). Em<br />
segui<strong>da</strong>, foram incubados com oil red por 15 minutos. Novamente foram<br />
passados em fosfato tritehyl, em segui<strong>da</strong>, bem lavados com água destila<strong>da</strong>. Os<br />
núcleos foram contracorados com hematoxilina de Mayer por 2 minutos. Os<br />
cortes foram desidratados em álcool absoluto, passados em xilol e montados<br />
em bálsamo.<br />
3.6 Imunohistoquímica<br />
Os músculos, gastrocnêmio e solear, de camundongos mdx controle,<br />
SHAM e castrados foram cui<strong>da</strong>dosamente removidos e congelados em<br />
nitrogênio líquido. Cortes de 8 m de espessura foram colocados em lâminas<br />
desengordura<strong>da</strong>s e previamente filma<strong>da</strong>s com poli-L-lisina (Sigma Chemical,<br />
Mo, USA) e mergulhados em PBS por 5 minutos para hidratação. A inibição <strong>da</strong><br />
peroxi<strong>da</strong>se endógena foi feita com água oxigena<strong>da</strong> a 3% por 30 min. As<br />
lâminas foram hidrata<strong>da</strong>s com PBS durante 5 minutos e logo após houve a fase<br />
39
de bloqueio de ligações inespecíficas com PBS/BSA a 2% por 30 minutos a 37 o<br />
C. A seguir, os cortes foram incubados com anticorpo primário diluído em PBS<br />
(1 h, 37 o C) (Ver Tabela 1). Após três lavagens de 5 minutos com PBS, os<br />
cortes foram incubados com anticorpo secundário apropriado (30 min/ 23 o C)<br />
em câmara úmi<strong>da</strong> (ver tabela II). Após novas lavagens com PBS/BSA a 0,1%,<br />
a ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> peroxi<strong>da</strong>se foi revela<strong>da</strong> com aminoametilcarbazol (AEC, Sigma)<br />
na presença de água oxigena<strong>da</strong> a 3%. Todos os cortes foram contracorados<br />
suavemente com hematoxilina de Mayer e montados em gelatina, glicerina e<br />
fenol.<br />
40
Tabela 2 - Relação de anticorpos monoclonais utilizados na<br />
imunohistoquímica.<br />
Especifici<strong>da</strong>de Origem Formato Fonte Diluição<br />
NCAM rato purificado BD -PharMingen 1/200<br />
SCA1 rato purificado BD -PharMigen 1/200<br />
F4/80 rato purificado Serotec<br />
Mac 1<br />
1/40<br />
rato biotinilado BD-PharMingen 1/30<br />
Tabela 3- Relação de conjugados utilizados na imunohistoquímica<br />
Conjugado<br />
Anti-IgG de rato/peroxi<strong>da</strong>se<br />
Anti-IgG de coelho<br />
Estreptoavidina/peroxi<strong>da</strong>se<br />
Marca Diluição<br />
Sigma 1/400<br />
Zymed 1/400<br />
Sigma 1/200<br />
Foram obti<strong>da</strong>s imagens digitaliza<strong>da</strong>s <strong>da</strong> área total do corte transversal<br />
com objetiva 20x. As imagens foram quantifica<strong>da</strong>s no programa Scion.<br />
41
3.7 Zimografia<br />
Os músculos foram dissecados, pesados, imediatamente congelados em<br />
nitrogênio líquido e homogeneizados em tampão de extração 100 mM Tris–<br />
HCl, pH 7.6, 200 mM NaCl, 100 mM CaCl2 e a 1% Triton X-100 a 4°C. Após a<br />
centrifugação a 15000xg, foram prepara<strong>da</strong>s alíquotas de 100μL e procedeu-se<br />
à dosagem de proteína pelo método de Lowry (Lowry, Rosebrough et al.,<br />
1951). As zimografias foram executa<strong>da</strong>s segundo protocolo previamente<br />
descrito (Heussen e Dowdle, 1980) em gel de poliacrilami<strong>da</strong> SDS-PAGE a<br />
7,5%, contendo gelatina (Merck do Brasil) na concentração de 2 mg/mL e géis<br />
de entra<strong>da</strong> poliacrilami<strong>da</strong> a 5% (w/v). A eletroforese foi realiza<strong>da</strong> com a<br />
concentração de 60 g de proteína para ca<strong>da</strong> uma <strong>da</strong>s amostras aplica<strong>da</strong>s nos<br />
géis a 165 Volts por um tempo médio de 60 minutos (Power Pac 200 – Bio-<br />
Rad, EUA). Após a eletroforese, os géis foram lavados duas vezes a 2.5%<br />
Triton X-100 para total remoção do SDS, em segui<strong>da</strong> procedeu-se à incubação<br />
a 37 ◦ C em tampão contendo 10 mM Tris–HCl buffer, pH 7.5, 5 mM CaCl2,<br />
ZnCl2 1μM. SDS é o agente responsável pela ativação <strong>da</strong>s metaloproteinases<br />
mesmo na forma inativa sem clivagem proteolítica (Talhouk, Chin et al., 1991).<br />
Os géis foram corados pelo Coomassie blue R250 (Sigma Chem. Co, USA) e<br />
descorados em solução descorante contendo 50% de metanol, 10% de ácido<br />
acético e 40% de H2O.<br />
A ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> gelatinase foi visualiza<strong>da</strong> por ban<strong>da</strong>s não marca<strong>da</strong>s em<br />
um fundo azul representando áreas de proteólise no substrato de proteína. As<br />
metaloproteases são secreta<strong>da</strong>s na forma latente e necessitam <strong>da</strong> clivagem do<br />
terminal peptídico NH2 para ativação. A análise semiquantitativa foi feita<br />
42
usando o programa de análise de imagem (Scion Program National Institutes of<br />
Health, Image Program, EUA).<br />
3.8 Preparação <strong>da</strong> resina Elvax com tamoxifen<br />
O ELVAX é uma resina industrial composta de acetato de etileno<br />
vinil (também conhecido como EVA), bastante usado em neurociências para<br />
estudos de liberação local de drogas e macromoléculas em geral, como os<br />
antagonistas de receptores glutamatérgicos ou inibidores de cinases (Cline e<br />
Constantine-Paton, 1990; Jablonska, Gier<strong>da</strong>lski et al., 1999; Colonnese, Shi et<br />
al., 2003). Este trabalho utilizou o protocolo já estabelecido para liberação de<br />
macromoléculas via ELVAX (Smith, Cordery et al., 1995).<br />
Esferas de ELVAX 40W (DuPont, USA) foram lava<strong>da</strong>s com trocas diárias<br />
de álcool etílico a 95% durante 5 a 7 dias sob agitação constante. Ao final<br />
deste período, os glóbulos foram secos e posteriormente submetidos à<br />
dissolução em diclorometano (100mg/ml) sob agitação durante 5 a 10 minutos.<br />
Após a dissolução completa, foi adicionado a droga tamoxifen (10 l/ml) ao<br />
volume final <strong>da</strong> solução de ELVAX diluído em diclorometano e homogeneizado<br />
em um agitador de tubos durante 1 minuto. Ao final desta etapa, os tubos<br />
contendo a preparação foram rapi<strong>da</strong>mente imersos em uma mistura de gelo<br />
seco/acetona (com temperatura em cerca de -80ºC) por 30 minutos para que<br />
houvesse a repolimerização do ELVAX. O conteúdo dos tubos, já<br />
repolimerizado, foi removido e transferido para um congelador a -4ºC e mantido<br />
por pelo menos 5 dias. Após este período, as amostras foram liofiliza<strong>da</strong>s a<br />
vácuo por 12 horas. Durante este procedimento o tubo ficou imerso em um<br />
43
uma mistura de gelo e álcool etílico a 95% com temperatura em torno de 4ºC.<br />
A amostra de ELVAX livre de diclorometano, com forma cilíndrica e com<br />
diâmetro relativamente constante, foi armazena<strong>da</strong> em freezer a -20ºC. Os<br />
cilindros de ELVAX foram incluídos em meio de inclusão (OCT) e cortados em<br />
criostato com espessura 120 m. Os cortes de ELVAX permaneceram a -20ºC<br />
desde o momento <strong>da</strong> criomicrotomia até o momento exato do implante nos<br />
animais.<br />
3.9 Implante de elvax no músculo esquelético<br />
Camundongos mdx, machos e fêmeas, selecionados com i<strong>da</strong>de de 4<br />
semanas, foram anestesiados intraperitonealmente com injeção de ketamina e<br />
xilasina (70 e 20 mg/kg body weight). Numa pequena incisão cirúrgica<br />
longitudinal feita através <strong>da</strong> pele e <strong>da</strong> fáscia na parte posterior <strong>da</strong> pata traseira,<br />
na altura do músculo gastrocnêmio direito, foi cui<strong>da</strong>dosamente coloca<strong>da</strong> a<br />
esfera de ELVAX (120μm de diâmetro) contendo tamoxifen (1mM). O grupo<br />
controle recebeu somente o implante de ELVAX com PBS.Todos os grupos de<br />
animais receberam igual alimentação para evitar interferência nos resultados.<br />
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, 8 semanas após<br />
cirurgia, na i<strong>da</strong>de correspondendo a mu<strong>da</strong>nças no microambiente associa<strong>da</strong>s<br />
com regeneração muscular. Após assepsia local com solução de álcool io<strong>da</strong>do,<br />
os músculos gastrocnêmios foram cui<strong>da</strong>dosamente dissecados e retirados. O<br />
implante de ELVAX com tamoxifen e com PBS foi colocado no gastrocnêmio<br />
direito (TXGd). O músculo gastrocnêmio esquerdo (TXGe) sem implante<br />
44
(ELVAX), foi também retirado para verificar um possível efeito sistêmico do<br />
tamoxifen neste músculo esquelético.<br />
45
4. RESULTADOS<br />
4.1 Efeito <strong>da</strong> castração no músculo esquelético do mdx<br />
Foram estu<strong>da</strong>dos os músculos gastrocnêmio e solear dos três grupos de<br />
machos e fêmeas na i<strong>da</strong>de de 8 semanas:<br />
Grupo 1 mdx controle<br />
Grupo 2 mdx SHAM operado, não-castrado<br />
Grupo 3 mdx castrado (macho: orquiectomizado -OOX ou fêmea:<br />
ovariectomizado -OVX).<br />
Foram estu<strong>da</strong>dos dois tipos de músculos: o músculo gastrocnêmio, o<br />
mais acometido na distrofia muscular de Duchenne, e o solear. Conforme<br />
publicamos anteriormente (Salimena, Lagrota-Candido et al., 2004), o músculo<br />
gastrocnêmio <strong>da</strong>s fêmeas mdx do grupo controle (não opera<strong>da</strong>s) apresentou<br />
foco inflamatório mais discreto, menor área de mionecrose e maior<br />
regeneração do que os machos mdx pareados (Figura 1D e 1A). Neste trabalho<br />
verificamos que este perfil também é repetido no músculo solear (Figura 2D e<br />
2A).
O músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos castrados<br />
(Figura 1C) apresentou maiores infiltrado inflamatório e mionecrose, e menor<br />
área de miofibras com regeneração do que os camundongos mdx machos<br />
controle (Figura 1A). O mesmo foi observado nas fêmeas (Figura 1D, 1E, 1F),<br />
já que as fêmeas castra<strong>da</strong>s (OVX) apresentaram mais mionecrose e focos com<br />
inflamação do que o grupo controle e também em relação ao grupo SHAM<br />
(operado, mas não castrado) (Figura 1F e 1D/1E). Entretanto, os grupos de<br />
camundongo mdx fêmeas controle e castra<strong>da</strong>s apresentaram áreas<br />
regenerando-se maiores que o grupo mdx fêmea SHAM (Figura 1D/1F e 1E).<br />
Este padrão também foi observado de modo semelhante no músculo solear<br />
(Figura 2).<br />
47
Figura 1- Efeito <strong>da</strong> castração na histologia do músculo gastrocnêmio do mdx.<br />
Coloração de picrosírios nos cortes histológicos do músculo gastrocnêmio de<br />
machos (A, B, C) e fêmeas (D, E, F). Controle não castrado (A, D),<br />
SHAM=operado e não castrado (B, E) e castrado (C, F). Barra = 100 m.<br />
Estrela = infiltrado inflamatório, seta = miofibra em regeneração.<br />
48
Figura 2 - Efeito <strong>da</strong> castração na histologia do músculo solear do mdx.<br />
Coloração de picrosirius nos cortes histológicos do músculo solear de machos<br />
(A, B, C) e fêmeas (D, E, F). Controle não castrado (A, D), SHAM = operado e<br />
não castrado (B, E) e castrado (C, F). Barra = 100 m. Estrela = infiltrado<br />
inflamatório, seta = miofibra em regeneração.<br />
49
A análise histomorfométrica mostrou que camundongos mdx machos<br />
controle e SHAM apresentavam um aumento significativo (p< 0.001) <strong>da</strong>s áreas<br />
com mionecrose em relação às fêmeas parea<strong>da</strong>s, tanto no músculo<br />
gastrocnêmio como no solear (Figura 3). Entre os camundongos mdx machos,<br />
os castrados e SHAM apresentaram aumento significativo (p
%<br />
%<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0<br />
Figura 3- Morfometria do músculo gastrocnêmio e solear <strong>da</strong>s áreas com<br />
mionecrose do mdx.<br />
Machos - gastrocnêmio<br />
*<br />
Machos -solear<br />
*<br />
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos e fêmeas. Ca<strong>da</strong> barra<br />
representa a média de 3 animais e seu desvio padrão. Azul =controle,<br />
vinho=SHAM operado, sem castração e amarelo=castrado. * p
Figura 4- Morfometria <strong>da</strong>s áreas com miofibras em regeneração do músculo<br />
gastrocnêmio e solear do mdx.<br />
*<br />
* *<br />
*<br />
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos e fêmeas. Ca<strong>da</strong> barra<br />
representa a média de 3 animais e seu desvio padrão. Azul = controle, vinho =<br />
SHAM operado, sem castração e amarelo = castrado. Eixo y = percentual <strong>da</strong><br />
área total ocupa<strong>da</strong> pelas fibras em regeneração.<br />
*<br />
* *<br />
52
4.2 Distribuição <strong>da</strong>s miofibras segundo ativi<strong>da</strong>de ATPase<br />
Foram estu<strong>da</strong>dos dois tipos de músculo: o gastrocnêmio, de contração<br />
rápi<strong>da</strong>, composto essencialmente de fibras brancas/glicolíticas, especializado<br />
em veloci<strong>da</strong>de e força; e o solear, de contração lenta, composto por fibras<br />
vermelhas/ oxi<strong>da</strong>tivas e com maior resistência à fadiga. Pelo padrão <strong>da</strong><br />
ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> miosina-ATPase em pH 9.6, as miofibras do Tipo I apresentam<br />
coloração branca (baixa ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> miosina-ATPase), as do Tipo IIB<br />
apresenta coloração escura (alta ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> miosina-ATPase) e as do Tipo<br />
IIA, uma coloração intermediária correspondendo a uma ativi<strong>da</strong>de intermediária<br />
<strong>da</strong> miosina-ATPase. Para este estudo foram realizados cortes histológicos<br />
transversais de 10 m de espessura dos músculos esqueléticos, gastrocnêmio<br />
e solear, de pelo menos 3 animais e analisados cinco campos de fotografias<br />
com objetiva de 20x.<br />
O músculo gastrocnêmio dos camundongos C57BL10 não-distróficos<br />
(Mccormick, Burns et al., 2004) apresentou predominância de fibras do tipo IIB<br />
(55% - 60%), um percentual menor de fibras do tipo IIA (35% - 32%) e poucas<br />
fibras do tipo I (5% - 8%); enquanto o solear tinha percentual maior de<br />
miofibras do tipo I (80% - 85%), menos IIA (19% - 14%) e poucas do tipo IIB<br />
(1%). Contudo, compararando-se os <strong>da</strong>dos <strong>da</strong> literatura do percentual do grupo<br />
dos camundongos C57 com os grupos distróficos percebeu-se uma diminuição<br />
significativa <strong>da</strong>s miofibras do tipo IIB e um aumento <strong>da</strong>s miofibras do tipo IIA<br />
em ambos os sexos dos camundongos distróficos. As fêmeas mdx<br />
53
apresentaram um número maior <strong>da</strong>s miofibras IIA e IIB em comparação com os<br />
grupos dos camundongos mdx machos (Figura 5 D, E, F x 5 A, B, C).<br />
No músculo distrófico gastrocnêmio dos grupos mdx machos e fêmeas<br />
controle, SHAM e castrados foi observa<strong>da</strong> (Figuras 5 e 9) pouca per<strong>da</strong> <strong>da</strong>s<br />
miofibras do tipo I, sem significativa diferença entre os grupos mdx machos.<br />
Entretanto, nos grupos mdx fêmeas, houve diferenças significativas (p
Figura 5 - Ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> Miosina-ATPase no músculo gastrocnêmio do mdx.<br />
Fragmentos (10μm) do músculo esquelético gastrocnêmio de mdx machos (A,<br />
B, C) e fêmeas (D, E, F). Foram utilizados pelo menos 3 animais por grupo.<br />
Controle (A, D); SHAM operado (B, E); castrado (C, F). Barra = 100 m. Estrela<br />
= fibra de IIA, seta = fibra tipo IIB<br />
55
Figura 6 - Ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> Miosina-ATPase no músculo solear do mdx após a<br />
castração.<br />
Fragmentos (10μm) do músculo esquelético de mdx machos (A, B, C) e fêmeas<br />
(D, E, F). Foram utilizados pelo menos 3 animais por grupo. Controle (A, D);<br />
SHAM operado (B, E); castrado (C, F). Barra-100μm. Estrela = fibra de IIA, seta<br />
= fibra tipo IIB, seta grossa = fibra IA<br />
56
A análise histomorfométrica do músculo gastrocnêmio mostrou (Figura<br />
7) que nos camundongos machos mdx o percentual de miofibras do tipo I foi<br />
muito baixo em relação ao C57: controle (3%) e nos grupos SHAM e OOX<br />
(2%). Contudo, predominaram as miofibras tipo IIA no controle (55,67%),<br />
SHAM (42,67%) e OOX (36,42%). O percentual <strong>da</strong>s miofibras IIB não era muito<br />
alto: controle (35,18%), SHAM (30,91%) e OOX (25,21%). Nas fêmeas mdx<br />
parea<strong>da</strong>s, a marcação <strong>da</strong>s miofibras do tipo I também era baixa nos grupos<br />
controle (8%), SHAM (7,7%) e OVX (5%) enquanto predominavam miofibras do<br />
tipo IIA nos grupos controle (63,5%), SHAM (49,83%) e OVX (46,32%). O<br />
percentual <strong>da</strong>s miofibras IIB também diminuiu: controle (43,3%), SHAM (35,2%)<br />
e OVX (30%). Todos estes <strong>da</strong>dos foram comparados com o músculo<br />
gastrocnêmio dos camundongos C57BL10 não distróficos - fibras do tipo IIB<br />
(60- 65%), um percentual menor de fibras do tipo IIA (32-35%) e poucas fibras<br />
do tipo I (5-8%).<br />
Também foram observa<strong>da</strong>s diferenças significativas entre controle, SHAM<br />
e castrados no percentual de miofibras do tipo I e IIA no músculo solear dos<br />
camundongos mdx machos e fêmeas. Análise histomorfométrica do músculo<br />
solear mostrou (Figura 8) que nos camundongos machos mdx o percentual de<br />
miofibras do tipo I era muito mais alto no controle (70%) do que nos grupos<br />
SHAM e OOX (65% e 61%), mas quando comparado com o grupo C57(<strong>da</strong>dos<br />
<strong>da</strong> literatura: miofibras do tipo I – 80-85%) tinha ocorrido uma pequena per<strong>da</strong><br />
destas miofibras (5 a 10%). Contudo, aumentaram em média 50% as miofibras<br />
do tipo IIA nos mdx machos controle (35,6%), SHAM (32,67%) e OOX (30,2%)<br />
em relação aos grupos de camundongos machos C57 (IIA -15% a 19%). E o<br />
percentual <strong>da</strong>s miofibras IIB era muito baixo: controle (0,8%), SHAM (0,9%) e<br />
57
OOX (0,5%). Nas fêmeas mdx parea<strong>da</strong>s, a marcação <strong>da</strong>s miofibras do tipo IIB<br />
também era baixa, controle (1%), SHAM (0,7%) e OVX (1,5%), enquanto<br />
predominavam miofibras do tipo I: controle (78%), SHAM (75,7%) e OVX<br />
(75,8%). O percentual <strong>da</strong>s miofibras IIA dos camundongos mdx fêmeas:<br />
controle (33,8%), SHAM (29,3%) e OVX (26,2%), também aumentou em média<br />
de 50%, comparados aos camundongos C57 (miofibras IIA -14% a 19%)<br />
(Figura 8).<br />
58
%<br />
%<br />
%<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Tipo I - Machos<br />
Tipo IIA - Machos<br />
Tipo IIB - Machos<br />
Figura 7 - Morfometria <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de Miosina-ATPase do músculo gastrocnêmio<br />
após a castração em camundongos mdx machos e fêmeas.<br />
As barras representam a média e o desvio padrão (n=3). Azul = controle, vinho<br />
= SHAM, operado e amarelo = castrado.<br />
* * 60<br />
* *<br />
*<br />
*<br />
%<br />
%<br />
%<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
100<br />
80<br />
40<br />
20<br />
0<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Tipo I - Fêmeas<br />
*<br />
Tipo IIA - Fêmeas<br />
Tipo IIB - Fêmeas<br />
* *<br />
59
%<br />
%<br />
100<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Tipo IIA - Machos<br />
TipoIIB - Machos<br />
Figura 8 - Morfometria <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de Miosina-ATPase do músculo solear de<br />
camundongos mdx machos e fêmeas.<br />
As barras representam a média e o desvio padrão (n=3). Azul = controle, vinho<br />
= SHAM, operado e amarelo = castrado.<br />
%<br />
%<br />
100<br />
100<br />
80<br />
60<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0<br />
Tipo I - Fêmeas<br />
Tipo IIA - Fêmeas<br />
* * 40<br />
20<br />
* *<br />
%<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
Tipo IIB - Fêmeas<br />
* *<br />
60<br />
*
4.3 Influência <strong>da</strong> castração no número de mioblastos ativados<br />
(NCAM) e de células-tronco (Sca-1) presentes nos músculos<br />
esqueléticos (gastrocnêmio e solear) do mdx.<br />
A regeneração muscular, evidencia<strong>da</strong> pelo número de células NCAM,<br />
foi mais significativa no músculo gastrocnêmio em relação ao solear do<br />
camundongo mdx (Figuras 9 e 10). As fêmeas mdx controle apresentaram<br />
maior expressão de NCAM no músculo gastrocnêmio do que os machos mdx<br />
controle (Figura 9D, A). Entretanto, o grupo de camundongos distróficos<br />
operados, mas não castrados (SHAM), mostrou que o estresse <strong>da</strong> cirurgia<br />
induziu a uma menor expressão de miofibras NCAM em ambos os gêneros<br />
(Figura 9E, B). Estes achados foram confirmados pela morfometria (Figura 11).<br />
Contudo, a castração causou uma redução acentua<strong>da</strong> <strong>da</strong> expressão de NCAM<br />
no músculo gastrocnêmio para NCAM nos machos (Figura 9C) e, nas fêmeas,<br />
um intenso aumento (Figura 9F) em relação ao macho pareado castrado<br />
(Figura 9C), porém a expressão de NCAM era semelhante com as fêmeas mdx<br />
controle (Figura 9D).Um padrão similar também foi observado no músculo<br />
solear (Figura 10).<br />
61
Figura 9 - Expressão de NCAM no músculo gastrocnêmio do mdx.<br />
Imunomarcação com anticorpo específico para NCAM em fragmentos<br />
(10μm) do músculo gastrocnêmio de mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D, E, F).<br />
Controle (A, D); SHAM operado (B, E); castrado (C, F). Barra = 100 m.<br />
62
Figura 10 - Expressão de Sca-1 no músculo solear do camundongo mdx.<br />
Imunomarcação com anticorpo específico para Sca-1 em fragmentos (10μm)<br />
do músculo solear de camundongos mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D, E, F).<br />
Controle (A, D); SHAM operado (B, E); castrado (C, F). Barra = 100 m.<br />
63
As análises morfométricas dos músculos gastrocnêmio e solear<br />
mostraram que as fêmeas distróficas controle apresentaram uma<br />
imunomarcação maior do que os machos pareados (fêmea = gastrocnêmio -<br />
300 e solear -89, macho = gastrocnêmio - 238 e solear - 60). Comparando os<br />
grupos controle com os grupos SHAM, nos músculos gastrocnêmio e solear,<br />
nós observamos uma redução (valor de p
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
100<br />
75<br />
50<br />
25<br />
0<br />
Figura 11- Histomorfometria <strong>da</strong> expressão de NCAM no músculo do mdx após<br />
castração cirúrgica.<br />
Machos - gastrocnêmio<br />
*<br />
Machos - solear<br />
* *<br />
Foram analisados fragmentos (10μm) de músculo esquelético imunomarcados<br />
com anticorpo NCAM de mdx macho e fêmea submetidos ou não à castração.<br />
(n=3). Azul = controle, vinho = SHAM operado, sem castração e amarelo =<br />
castrado. Eixo y = número de miofibras positivas para NCAM.<br />
*<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
100<br />
75<br />
50<br />
25<br />
0<br />
Fêmeas - gastrocnêmio<br />
*<br />
Fêmeas - solear<br />
*<br />
65
Independentemente do gênero, a expressão de Sca-1 foi maior no<br />
músculo gastrocnêmio (Figura 12) do que no solear (Figura13). Os grupos de<br />
fêmeas mdx: controle, SHAM e OVX apresentaram mais células Sca-1<br />
positivas no gastrocnêmio do que machos pareados (Figura 12). O estresse <strong>da</strong><br />
cirurgia (grupo SHAM) nos músculos gastrocnêmio e solear causou uma<br />
redução na imunomarcação em ambos os gêneros: machos (Figura 14B, 15B)<br />
e fêmeas (Figuras 12E, 13E). Contudo, a castração cirúrgica nas fêmeas<br />
causou um aumento de células Sca-1 positivas no gastrocnêmio e no solear<br />
(Figuras 12F,13F), <strong>da</strong>do este confirmado pela morfometria (Figura 16). O<br />
oposto ocorreu nos machos mdx castrados, observando-se uma diminuição na<br />
quanti<strong>da</strong>de de células Sca-1 positivas no gastrocnêmio (44%, p
Figura 12 - Expressão de Sca-1 no músculo gastrocnêmio do mdx.<br />
Fragmentos (10μm) do músculo gastrocnêmio de mdx machos (A, B, C) e<br />
fêmeas (D, E, F) corados com anticorpo anti Sca-1. Animais controles (A, D),<br />
SHAM operados (B, E) e castrados (C, F). Anticorpo monoclonal anti-Sca-1.<br />
Controle, SHAM e castrado. Aumento 200x.<br />
67
Figura 13 - Expressão de Sca-1 no músculo solear do mdx.<br />
Fragmentos (10μm) do músculo solear de mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D,<br />
E, F) corados com anticorpo anti Sca-1. Animais controle (A, D), SHAM<br />
operados (B, E) e castrados (C, F). Anticorpo monoclonal anti-NCAM. Controle,<br />
SHAM e castrado. Aumento 200x.<br />
68
100<br />
%<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
100<br />
%<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Figura 14 - Morfometria <strong>da</strong> expressão de Sca-1 no músculo do mdx após<br />
castração cirúrgica.<br />
Machos - gastrocnêmio<br />
* *<br />
Machos - solear<br />
Foram analisados fragmentos (10μm) de músculos esqueléticos (gastrocnêmio<br />
e solear) imunomarcados com anticorpo Sca-1 de mdx macho e fêmea<br />
submetidos ou não à castração. (n=3) Azul = controle, vinho = SHAM operado<br />
e amarelo = castrado. Y = percentual <strong>da</strong> área total ocupa<strong>da</strong> pela<br />
imunomarcação positiva. * p
4.4 Efeitos <strong>da</strong> castração cirúrgica na ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s<br />
metaloproteases 2 e 9 no músculo esquelético<br />
A ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP- 9 no músculo gastrocnêmio de camundongos machos<br />
e fêmeas adultos não-distróficos (C57BL10) não foi detecta<strong>da</strong>, entretanto foram<br />
encontrados constitutivamente baixos níveis de MMP-2 (Figura 15A)<br />
compatíveis com a secreção constitutiva no músculo esquelético (Kherif,<br />
Lafuma et al., 1999). Todos os grupos de camundongos distróficos, machos e<br />
fêmeas, apresentaram a ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP-9, sendo porém mais eleva<strong>da</strong> nos<br />
machos do que nas fêmeas (p
Cm mdxm OVX OVX SHAMf SHAMm SHAMm SHAMm OOX OOX<br />
Figura 15 - Ativi<strong>da</strong>des <strong>da</strong>s MMP-9 e MMP-2 ativas no músculo gastrocnêmio<br />
após a castração cirúrgica.<br />
A- Zimograma ilustrativo: Zimografia de músculo esquelético gsastrocnêmio<br />
após a castração.Cm = controle C57 macho, mdxm = mdx macho, OVX =<br />
Fêmea castra<strong>da</strong>, SHAMf = fêmea SHAM opera<strong>da</strong>, SHAMm = macho SHAM<br />
operado, OOX = macho castrado. As áreas claras são de lise no fundo<br />
corado com Coomassie R-250.<br />
B- Análise semi-quantitativa <strong>da</strong>s ativi<strong>da</strong>des <strong>da</strong> MMP-9 e MMP-2 no músculo<br />
gastrocnêmio de camundongos mdx machos e fêmeas. Azul =controle,<br />
vinho=SHAM operado e amarelo=castrado. Os resultados foram expressos<br />
como média ( SD). UA = uni<strong>da</strong>de arbitrária.<br />
A<br />
B<br />
←MMP-9 MMP-9<br />
71<br />
←MMP-2 ativa
4.5 Efeito do tratamento com tamoxifen no músculo<br />
gastrocnêmio do mdx<br />
Os músculos gastrocnêmios do grupo controle mdx machos apresentaram<br />
menor área de miofibras em regeneração, comparativamente com os grupos<br />
tratados com o tamoxifen (Figura 16A, B, C). O mesmo ocorreu com o grupo<br />
mdx <strong>da</strong>s fêmeas, destacando a maior regeneração nos grupos tratados com<br />
tamoxifen (Figura 16D, E, F). Os grupos de camundongos distróficos, machos e<br />
fêmeas, que receberam tamoxifen local no gastrocnêmio direito apresentaram<br />
mais células musculares basofílicas (Figura 16B, E) do que os grupos mdx,<br />
machos e fêmeas, controle (Figura 16A e D) e tamoxifen não via local<br />
(gastrocnêmio esquerdo - Figura 16C e F).<br />
72
Figura 16 - Efeito do tratamento com tamoxifen na histologia do músculo<br />
gastrocnêmio de mdx machos e fêmeas.<br />
Músculo gastrocnêmio machos (A, B, C) e fêmeas (D, E, F). Controle mdx (A,<br />
D), músculo direito implantado com ELVAX contendo tamoxifen (B, E) e<br />
músculo esquerdo (contralateral) não implantado diretamente com tamoxifen<br />
(C, F). Barra = 100 m. Seta = fibra em regeneração, estrela = infiltrado<br />
inflamatório.<br />
73
Análise histomorfométrica mostrou (Figura 17) que, nos camundongos<br />
machos mdx, o percentual de miofibras em regeneração era menor no grupo<br />
que não recebeu tratamento com tamoxifen (Controle: 180%) e maior nos<br />
grupos com tamoxifen (gastrocnêmio direito: 418% e gastrocnêmio esquerdo:<br />
221%). De modo semelhante, nas fêmeas mdx parea<strong>da</strong>s, a marcação <strong>da</strong>s<br />
miofibras em regeneração também era baixa no grupo controle (331%), porém<br />
maior nos grupos que receberam tamoxifen (gastrocnêmio direito: 458% e<br />
gastrocnêmio esquerdo: 379%). A média <strong>da</strong>s miofibras em regeneração <strong>da</strong>s<br />
fêmeas mdx dos grupos controle e grupo de tamoxifen (gastrocnêmio<br />
esquerdo) foram 2x maiores que dos grupos de machos mdx pareados (Figura<br />
17A). O percentual <strong>da</strong> área de miofibras em regeneração dos machos mdx do<br />
grupo tratado com tamoxifen local (gastrocnêmio direito: 418%) foi semelhante<br />
ao do grupo de fêmeas mdx trata<strong>da</strong>s com tamoxifen local (gastrocnêmio direito:<br />
458%).<br />
Todos os grupos de camundongos fêmeas mdx tiveram maior número<br />
de miofibras íntegras do que mdx machos pareados (Figura 17B). A quanti<strong>da</strong>de<br />
de miofibras íntegras foi maior no gastrocnêmio direito com implante de<br />
tamoxifen nos mdx- machos (254) e fêmeas (326) do que no músculo<br />
contralateral correspondente. Nas fêmeas mdx controle, o número de miofibras<br />
íntegras do gastrocnêmio era menor (106) do que nos grupos tratados com<br />
tamoxifen (gastrocnêmio direito: 326 e gastrocnêmio esquerdo: 261). O mesmo<br />
ocorreu com o grupo dos machos: controle (sem implante): 78; gastrocnêmio<br />
com implante (direito): 254; e gastrocnêmio contralateral (esquerdo): 179.<br />
74
fêmeas<br />
Figura 17 - Morfometria do músculo gastrocnêmio de camundongos mdx<br />
machos e fêmeas após tratamento com tamoxifen<br />
* *<br />
*<br />
fêmeas<br />
*<br />
Análise histológica do músculo gastrocnêmio corado por Giemsa. Em A,<br />
representação gráfica do percentual <strong>da</strong> área ocupa<strong>da</strong> por miofibras se<br />
regenerando basofílicas e com nucleação central. Em B, o número de miofibras<br />
íntegras por corte histológico. Ca<strong>da</strong> barra representa a média de 3 animais e<br />
seu desvio padrão. Branco = mdx (controle), azul = gastrocnêmio direito<br />
implantado com ELVAX sem tamoxifen (PBS) e amarelo= gastrocnêmio<br />
esquerdo não implantado com ELVAX, vermelho = gastrocnêmio direito<br />
implantando com ELVAX contendo tamoxifen e verde = gastrocnêmio esquerdo<br />
não implantado diretamente com ELVAX (contralateral). *p
4.6 Análise de mioblastos ativados (NCAM) e células-tronco (Sca-<br />
1) no músculo esquelético do camundongo mdx tratado com<br />
tamoxifen<br />
Todos os grupos de mdx fêmeas, controle, ELVAX sem tamoxifen (PBS)<br />
e ELVAX com tamoxifen, tiveram maior área de regeneração do que os<br />
machos mdx pareados (Figura 18D, E, F e 18A, B, C). Apesar de o grupo de<br />
fêmeas mdx controle apresentar grande número de células NCAM positivas no<br />
músculo gastrocnêmio comparado com os machos mdx controle (Figura 18D,<br />
A), os mdx, machos e fêmeas, tratados com tamoxifen apresentaram maior<br />
imunomarcação para NCAM em ambos os músculos gastrocnêmios, direito e<br />
esquerdo (Figura 18E, F, B, C) relativamente a todos os outros grupos<br />
estu<strong>da</strong>dos. Estes achados foram confirmados pela morfometria (Figura 20).<br />
Também, independentemente do gênero, a expressão de Sca-1 foi maior no<br />
músculo gastrocnêmio que recebeu tratamento com tamoxifen local (Figura<br />
19). Os grupos de fêmeas mdx: controle, tamoxifen no gastrocnêmio direito e<br />
tamoxifen no gastrocnêmio esquerdo (contralateral), apresentaram de modo<br />
consistente uma quanti<strong>da</strong>de maior de células positivas para Sca-1<br />
comparativamente aos machos pareados (Figura 19).<br />
A análise histomorfométrica (Figura 20), confirmou o aumento significativo<br />
(p
Figura 18 - Imunomarcação para NCAM no músculo gastrocnêmio do mdx<br />
após tratamento com tamoxifen<br />
Imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-NCAM de fragmentos<br />
(10μm) do músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo) de mdx machos (A, B, C)<br />
e fêmeas (D, E, F) tratados com tamoxifen. Mdx machos e fêmeas: Controle (A,<br />
D); tratamento com ELVAX com tamoxifen local - gastrocnêmio direito (B, E) e<br />
contralateral- gastrocnêmio esquerdo (C, F). Barra = 100 m.<br />
77
Figura 19 - Presença de células Sca-1 no músculo gastrocnêmio do mdx<br />
tratado com tamoxifen.<br />
Imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-Sca-1 de fragmentos (10μm)<br />
do músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo) de mdx machos (A, B, C) e<br />
fêmeas (D, E, F) submetidos ao tratamento com tamoxifen. Controle mdx (A,<br />
D); tratamento com ELVAX tamoxifen local - gastrocnêmio direito (B, E) e<br />
contralateral - gastrocnêmio esquerdo (C, F). Barra = 100 m.<br />
78
Figura 20 - Morfometria de NCAM e Sca-1 no músculo do mdx após<br />
tratamento com tamoxifen.<br />
Foram analisados fragmentos (10μm) de músculo esquelético direito e<br />
esquerdo imunomarcados com anticorpo anti-NCAM ou Sca-1 de mdx machos<br />
e fêmeas submetidos ou não a tratamento com tamoxifen. (n=3)<br />
Branco = mdx controle, azul = gastrocnêmio direito implantando com ELVAX<br />
sem tamoxifen e amarelo= gastrocnêmio esquerdo não implantado com<br />
ELVAX, vermelho = gastrocnêmio direito implantando com ELVAX contendo<br />
tamoxifen e verde = gastrocnêmio esquerdo (contralateral) não implantado com<br />
ELVAX diretamente.<br />
*<br />
*<br />
*<br />
* *<br />
*<br />
*<br />
*<br />
79
4.7 Presença de macrófagos: Mac-1 e F4/80 no gastrocnêmio de<br />
mdx tratados com tamoxifen.<br />
Todos os grupos de mdx machos, com e sem tratamento com tamoxifen<br />
tiveram maior área de marcação com os anticorpos específicos para Mac-1 e<br />
F4/80 em relação aos grupos de fêmeas mdx parea<strong>da</strong>s (Figuras 21 e 22). Os<br />
músculos gastrocnêmios (direito e esquerdo) do grupo controle mdx machos<br />
apresentaram maior área com marcação para macrófagos (Mac-1 e F480),<br />
comparados com o grupo tratado com tamoxifen (Figuras 21A e 22A X Figuras<br />
21B, 22B e 21C, 22C). O mesmo ocorreu com o grupo <strong>da</strong>s fêmeas,<br />
destacando-se a maior marcação para macrófagos no grupo controle<br />
comparando com os grupos tratados com tamoxifen (Figuras 23D e 24D x<br />
Figuras 21E, 22E e 21F, 22F). Contudo, os grupos de mdx, machos e fêmeas,<br />
que receberam tamoxifen local, no gastrocnêmio direito, foram os que menos<br />
apresentaram marcação para macrófagos (Figuras 21B, E e 22B, 22E),<br />
comparados com os grupos mdx: controle e gastrocnêmio contralateral<br />
(esquerdo) (Figuras 21A, C, D, F e 22A, C, D, F).<br />
80
Figura 21 - Presença de células Mac-1 no músculo gastrocnêmio do mdx após<br />
tratamento com tamoxifen.<br />
Imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-Mac-1 de fragmentos<br />
(10μm) do músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo) de mdx machos (A, B, C)<br />
e fêmeas (D, E, F) submetidos ao tratamento com tamoxifen. Controle mdx (A,<br />
D); tratamento com ELVAX tamoxifen local - gastrocnêmio direito (B, E) e<br />
contralateral - gastrocnêmio esquerdo (C, F). Barra = 100 m.<br />
81
Figura 22 - Presença de células F4/80 no músculo gastrocnêmio do mdx após<br />
tratamento com tamoxifen.<br />
Imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-F4/80 de fragmentos (10μm)<br />
do músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo) de mdx machos (A, B, C) e<br />
fêmeas (D, E, F) submetidos ao tratamento com tamoxifen. Controle mdx (A,<br />
D); tratamento com ELVAX tamoxifen local - gastrocnêmio direito (B, E) e<br />
contralateral - gastrocnêmio esquerdo (C, F). Barra = 100 m.<br />
82
A análise morfométrica mostrou (Figura 23) que, nos camundongos<br />
machos mdx controle, o percentual de área com marcação para macrófagos<br />
(Mac-1: 86% e F4/80: 76%) era maior (p
Figura 23 - Morfometria <strong>da</strong> quantificação Mac-1 e F4/80 no músculo do mdx<br />
após tratamento com tamoxifen.<br />
Foram analisados fragmentos (10μm) de músculo esquelético direito e<br />
esquerdo imunomarcados com anticorpo Mac-1 e F4/80 de mdx machos e<br />
fêmeas submetidos ao tratamento de ELVAX com tamoxifen. (n=3) Branco =<br />
mdx controle, azul = gastrocnêmio direito implantando com ELVAX sem<br />
tamoxifen (PBS) e amarelo = gastrocnêmio esquerdo (contralateral), vermelho<br />
= gastrocnêmio direito implantando com ELVAX contendo tamoxifen e verde =<br />
gastrocnêmio esquerdo (contralateral). A marcação foi quantifica<strong>da</strong> através do<br />
percentual <strong>da</strong> área total que foi positiva para Mac-1 ou F4/80. * p < 0,05, ** p <<br />
0,01.<br />
*<br />
*<br />
*<br />
*<br />
** **<br />
** **<br />
84
4.8 Efeito <strong>da</strong> castração sobre o número de adipócitos presentes<br />
no músculo gastrocnêmio do mdx<br />
O estudo do músculo gastrocnêmio dos grupos dos camundongos<br />
mdx machos (Figura 24) mostrou que os camundongos mdx machos controle<br />
(Figura 24A) apresentaram igual o número de adipócitos comparados com os<br />
camundongos mdx machos SHAM (Figura 24B) e mdx machos castrados<br />
(Figura 24C). O mesmo ocorreu com o grupo <strong>da</strong>s fêmeas mdx controle<br />
comparado com os grupos fêmeas mdx SHAM e OVX (Figuras 24D, E, F),<br />
estes últimos sem diferença significativa entre si. Se compararmos os grupos<br />
de camundongos mdx fêmeas com os camundongos mdx machos, to<strong>da</strong>s as<br />
fêmeas de todos os grupos controles (não opera<strong>da</strong>s), SHAM (opera<strong>da</strong>s, mas<br />
não castra<strong>da</strong>s) e OVX (castra<strong>da</strong>s) apresentaram maior número de adipócitos<br />
do que os machos mdx pareados (Figuras 24D, E , F e Figuras 24A, B, C).<br />
85
Figura 24 - Efeito <strong>da</strong> castração no número de adipócitos no corte histológico do<br />
músculo esquelético do mdx macho e fêmea.<br />
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D, E,<br />
F). Controle não-castrado (A, D), SHAM=operado e não castrado (B, E) e<br />
castrado (C, F). Barra 100 m.<br />
86
A análise histomorfométrica mostrou que não houve diferença<br />
significativa (p> 0.05) entre os grupos de camundongos mdx machos controle,<br />
SHAM e OOX em relação ao número de adipócitos (controle=5, SHAM=7 e<br />
OOX=7). Entre os grupos <strong>da</strong>s fêmeas mdx (controle=16, SHAM=18 e OVX=16)<br />
também não se observou diferença significativa (p>0.05) do número de<br />
adipócitos (Figura 25). Contudo, a análise estatística mostrou que o número de<br />
adipócitos presentes nos músculos <strong>da</strong>s fêmeas mdx (controle, SHAM e OVX)<br />
era maior que nos grupos dos machos mdx pareados (p
Número adipócitos<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Figura 25 - Morfometria do número de adipócitos presentes no músculo<br />
esquelético do mdx após a castração.<br />
Ca<strong>da</strong> barra representa a média de 3 animais e seu desvio padrão. Azul,<br />
machos e vermelho, fêmeas. Foi quantificado o número de adipócitos por to<strong>da</strong><br />
a área do músculo.<br />
*<br />
ContMdx ShamMdx OOXMdx<br />
*<br />
*<br />
88
4.9 Efeito do tratamento com e sem tamoxifen no número de<br />
adipócitos no músculo esquelético do mdx<br />
O estudo do músculo gastrocnêmio dos grupos dos camundongos<br />
mdx machos controle (Figura 26A) apresentou igual número de adipócitos<br />
comparativamente aos camundongos mdx machos com ELVAX sem tamoxifen<br />
(Figura 26B) e mdx machos com tratamento com tamoxifen (Figura 26C). O<br />
mesmo ocorreu com o grupo <strong>da</strong>s fêmeas mdx controle (Figura 26D),<br />
comparado com os grupos fêmeas mdx com ELVAX sem tamoxifen e com<br />
tamoxifen (Figura 26E, F), não havendo diferença na quanti<strong>da</strong>de de adipócitos.<br />
Se compararmos os grupos de camundongos mdx fêmeas com os<br />
camundongos mdx machos, as fêmeas de todos os grupos controle, ELVAX<br />
sem tamoxifen e com tamoxifen (Figuras 26D, E, F) apresentaram maior<br />
número de adipócitos do que os machos mdx pareados (Figuras 26A, B, C).<br />
89
Figura 26 - Efeito do tratamento com tamoxifen no número de adipócitos.<br />
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D,<br />
E, F). Controle mdx (A, D), ELVAX sem tamoxifen- PBS (B, E) e ELVAX com<br />
tamoxifen (C, F). Barra 100 m.<br />
90
A análise histomorfométrica mostrou não haver diferença significativa<br />
(p> 0.05) entre os grupos de camundongos mdx machos controle, ELVAX sem<br />
tamoxifen-com PBS e ELVAX com tamoxifen com relação ao número de<br />
adipócitos (controle=5, ELVAX sem tamoxifen-PBS = 4 e ELVAX com<br />
tamoxifen = 6). Entre os grupos <strong>da</strong>s fêmeas mdx (controle=16, ELVAX sem<br />
tamoxifen-com PBS=15 e ELVAX com tamoxifen=16), também não se<br />
observou diferença significativa (p>0.05) no número de adipócitos (Figura 27).<br />
Contudo, a análise estatística mostrou que a presença de adipócitos nos<br />
músculos <strong>da</strong>s fêmeas mdx (controle, ELVAX sem tamoxifen-PBS e ELVAX com<br />
tamoxifen) era maior do que os grupos dos machos mdx pareados (p
N° de adipócitos<br />
Figura 27 - Morfometria do número de adipócitos presentes no músculo<br />
esquelético do mdx após implante do ELVAX com e sem tamoxifen.<br />
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos e fêmeas. Ca<strong>da</strong> barra<br />
representa a média de 3 animais e seu desvio padrão. Machos, azul e fêmeas,<br />
vermelho.<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
* * *<br />
Controle Sem TX Com TX<br />
92
5. DISCUSSÃO<br />
O conjunto de resultados deste trabalho suporta a hipótese <strong>da</strong> ação<br />
benéfica dos hormônios sexuais femininos endógenos e do tratmento com<br />
tamoxifen, um modulador do receptor de estrogênio, na regeneração muscular<br />
e na integri<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s miofibras esqueléticas.<br />
Estudos dos sistemas cardiovascular, neuromuscular e outros<br />
mostraram que estrogênios exercem efeitos moduladores na imuni<strong>da</strong>de, como<br />
exemplo a castração cirúrgica de fêmeas (OVX), que causa imunodepressão e<br />
ativa macrófagos para um estado pró-inflamatório (Mendelsohn e Karas, 1999;<br />
Roof e Hall, 2000; Knoferl, Schwacha et al., 2002), porém administração de<br />
17b-estradiol restaura parâmetros <strong>da</strong> imuni<strong>da</strong>de celular de fêmeas<br />
ovariectomiza<strong>da</strong>s e machos com baixos níveis de estrogênio circulante após<br />
trauma hemorrágico (Zellweger, Ayala et al., 1995; Kahlke, Dohm et al., 2000;<br />
Knoferl, Dio<strong>da</strong>to et al., 2000; Knoferl, Jarrar et al., 2001; Porter, Wang et al.,<br />
2001; Pfeilschifter, Koditz et al., 2002). Parte dos efeitos protetores do<br />
estrogênio e <strong>da</strong> regulação <strong>da</strong> resposta imunológica inata, principalmente sobre<br />
os macrófagos, é dependente <strong>da</strong> interação de 17β-
estradiol com receptores de estrogênios (ER) alfa e beta (Mcdonnell, 2004;<br />
Zhang e Trudeau, 2006). A sinalização de ER beta ativa respostas<br />
antinflamatórias, sendo considerado um fator crítico para a sobrevivência<br />
celular (Baker, Brautigam et al., 2004; Wang, Wang et al., 2006) e para a<br />
manutenção <strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de <strong>da</strong> miofibra, porque fêmeas deficientes de<br />
estrogênios apresentam altos níveis de creatinafosfoquinase (CK) após<br />
exercícios (Amelink e Bar, 1986; Bar, Amelink et al., 1988). Neste estudo, todos<br />
os grupos de camundongos mdx fêmeas em comparação com os machos<br />
pareados tiveram pequenos focos de mionecrose e menor infiltrado<br />
inflamatório, porém as fêmeas submeti<strong>da</strong>s à castração cirúrgica (OVX)<br />
apresentaram infiltrado inflamatório mais proeminente do que os machos<br />
pareados.<br />
Hormônio do crescimento (GH) e IGF-1 são fatores de crescimento do<br />
músculo esquelético (Ullman e Oldfors, 1989; Johnson, Halstead et al., 1998) e<br />
do músculo cardíaco (Guler, Zapf et al., 1988), importantes na manutenção do<br />
alto índice de regeneração muscular observado nas fêmeas castra<strong>da</strong>s. Como o<br />
tratamento com estradiol aumenta também os níveis de IGF-1 no soro (Breier,<br />
Gluckman et al., 1988; Enright, Quirke et al., 1990), é possível que estradiol<br />
exógeno possa ser pri<strong>maria</strong>mente responsável pela indução de níveis<br />
aumentados de IGF-1.<br />
Nos músculos esqueléticos maduros, as células satélites estão<br />
normalmente num estado inativo e podem ser ativa<strong>da</strong>s em resposta à lesão<br />
muscular ou doença (Bischoff e Heintz, 1994; Morgan e Partridge, 2003). As<br />
células satélites quando ativa<strong>da</strong>s proliferam e se fundem no local onde<br />
estavam as miofibras necróticas, formando novos miotubos. Estas células são<br />
94
defini<strong>da</strong>s pela sua posição entre a lâmina basal e o sarcolema e, quando<br />
ativa<strong>da</strong>s, pela expressão de proteínas tais com MyoD, M-caderina; c-Met,<br />
Pax7, molécula de adesão N-CAM, CD34 e o fator regulatório miogênico Myf5<br />
(Negroni, Butler-Browne et al., 2006). No músculo adulto, a expressão de<br />
NCAM é restrita à junção neuromuscular, sendo, porém, reexpressa nas<br />
miofibras se regenerando (Bani, Lagrota-Candido et al., 2008). Todos os<br />
grupos de camundongos mdx fêmeas apresentaram maior regeneração nos<br />
músculos de contração rápi<strong>da</strong> (gastrocnêmio) e de contração lenta (solear).<br />
Proporções semelhantes de células satélites foram encontra<strong>da</strong>s entre<br />
indivíduos jovens e idosos e mulheres e homens, sendo que as células<br />
satélites de mulheres apresentaram áreas celulares e nucleares maiores do<br />
que as dos homens (Roth, Martel et al., 2000). A base fisiológica para esta<br />
diferença é desconheci<strong>da</strong>. Em relação a esses <strong>da</strong>dos, a castração nos<br />
camundongos mdx machos (OOX) diminuiu o número de miofibras se<br />
regenerando. Em contraste, as fêmeas mdx castra<strong>da</strong>s (OVX) apresentaram o<br />
número de miofibras se regenerando em quanti<strong>da</strong>de maior que as fêmeas mdx<br />
não castra<strong>da</strong>s (controle). A ovariectomia aumenta os níveis de IGF-1 e com a<br />
ausência na produção de estrogênios pelos ovários, os órgãos periféricos,<br />
como músculo e tecido adiposo, podem estar compensando com o aumento<br />
nos níveis locais de estrogênio. O aumento de IGF-1 pode estar associado à<br />
estimulação <strong>da</strong> proliferação de células satélites como também <strong>da</strong> diferenciação<br />
e fusão para o crescimento dos miotubos (Dodson, Allen et al., 1985; Florini,<br />
Ewton e Roof, 1991; Delany, Pash et al., 1994; Fryburg, Jahn et al., 1995;<br />
Goldspink, Cox et al., 1995). É claro que existem outros fatores de crescimento<br />
responsáveis pela proliferação de células musculares, entres eles, HGF exerce<br />
95
um efeito direto sobre a proliferação e diferenciação de células satélites (Allen,<br />
Sheehan et al., 1995; Bischoff, 1997), além de ser fator quimioatraente para<br />
células satélites. Além dos fatores de crescimento responsáveis pela<br />
proliferação, diferenciação e fusão <strong>da</strong>s células musculares, citocinas (ex: IL-6)<br />
promovem a proliferação e fusão de células satélites (Cantini e Carraro, 1995).<br />
A IL-15 induz a diferenciação de mioblastos (Quinn, Haugk et al., 1995) e LIF,<br />
uma citocina produzi<strong>da</strong> macrófagos e mioblastos, também influencia a<br />
proliferação e diferenciação de células musculares (Austin, Bower et al., 1992;<br />
Barnard, Bower et al., 1994; Kurek, Nouri et al., 1996). Dentre os principais<br />
hormônios responsáveis pela proliferação e diferenciação de mioblastos,<br />
podemos citar insulina, leptina e testosterona (Florini, 1987; Celotti e Negri<br />
Cesi, 1992; Chandler, Byrne et al., 1994; Joubert e Tobin, 1995; Mcfarland,<br />
Pesall et al., 1995; Doumit, Cook et al., 1996; Chen, Zajac et al., 2005; Isidori,<br />
Giannetta et al., 2005; Chen, Li et al., 2006).<br />
Os hormônios corticosteróides inibem a síntese e estimulam a degra<strong>da</strong>ção<br />
de proteínas no músculo esquelético (Haymond e Horber, 1992; Montano e<br />
Lim, 1997; Hasselgren, 1999), mas não alteram o número de mioblastos e nem<br />
o número e tamanho de miotubos formados (Braun, Buschhausen-Denker et<br />
al., 1989). Os corticosteróides usados como terapêutica na DMD são<br />
considerados de grande importância (Brooke, Fenichel et al., 1987; Fenichel,<br />
Florence et al., 1991; Griggs, Moxley et al., 1991) na melhora <strong>da</strong> função e<br />
potência muscular (Fenichel, Cooper et al., 1990; Fenichel, Florence et al.,<br />
1991), talvez devido ao efeito antinflamatório e imunossupressor (Parrillo e<br />
Fauci, 1979; Kissel, Burrow et al., 1991). Entre os efeitos <strong>da</strong> prednisona nos<br />
músculos de pacientes com DMD, observa-se aumento <strong>da</strong> mioglobina (Park,<br />
96
Hill et al., 1979), de células satélites (Schmalbruch e Hellhammer, 1976; Gibson<br />
e Schultz, 1983) e <strong>da</strong> regeneração (Guerriero e Florini, 1980). Os esteróides<br />
também podem promover estabilização de membrana (Seeman, 1966) e<br />
diminuir o número <strong>da</strong> apoptose (Sklar, Hudson et al., 1991). Nos camundongos<br />
distróficos sem castração, de ambos os gêneros, porém submetidos ao<br />
estresse <strong>da</strong> cirurgia, o número de mioblastos proliferando, evidenciados pela<br />
expressão de NCAM, estava reduzido, <strong>da</strong>do este interpretado como sendo em<br />
parte devido ao estresse <strong>da</strong> cirurgia, que, embora promovendo uma maior<br />
liberação de corticosteróides, não foi suficiente para manter ou aumentar o<br />
número de células satélites.<br />
Há uma crescente evidência de que diversos tipos de células residentes e<br />
não residentes encontra<strong>da</strong>s no músculo possam reconstituir o reservatório de<br />
células satélites (Grounds, White et al., 2002; Asakura, 2003; Chen e<br />
Goldhamer, 2003). Nas doenças como DMD, onde células satélites entram<br />
rapi<strong>da</strong>mente num estado de exaustão, outra fonte alternativa podem ser as<br />
células-tronco. Numerosos estudos têm confirmado que células-tronco<br />
residentes e não residentes no músculo são capazes de se fundirem com as<br />
miofibras deficientes de distrofina. De fato, uma porcentagem maior de células<br />
de distrofina positivas foram obti<strong>da</strong>s a partir de células-tronco Sca-1 e CD34+<br />
no camundongo mdx (Gussoni, Soneoka et al., 1999; Asakura, Seale et al.,<br />
2002; Deasy e Huard, 2002; Tamaki, Akatsuka et al., 2002; Tamaki, Akatsuka<br />
et al., 2003). Células oriun<strong>da</strong>s <strong>da</strong> medula óssea ou do músculo esquelético têm<br />
proprie<strong>da</strong>des similares (80% expressam Sca-1), sendo capazes, quando<br />
injeta<strong>da</strong>s por via intravenosa, de restaurar parcialmente a expressão de<br />
distrofina no músculo do camundongo mdx (Gussoni, Soneoka et al., 1999;<br />
97
Jackson, Mi et al., 1999). A marcação de células-tronco (Sca-1) estava maior<br />
em todos os grupos de fêmeas mdx castra<strong>da</strong>s (OVX) em comparação com os<br />
grupos de machos mdx normais e castrados (OOX). Durante a castração<br />
natural, observa<strong>da</strong> no envelhecimento, a produção de hormônios sexuais<br />
femininos pelos ovários é insignificante sendo, então, compensa<strong>da</strong> pela sua<br />
produção em órgãos periféricos. O estrogênio induz a transcrição de fatores<br />
como c-fos e erg-1, que contribuem para a proliferação de mioblastos (Kahlert,<br />
Grohe et al., 1997) e através de vias liga<strong>da</strong>s a receptores acoplados à proteína<br />
G foi identificado que estes hormônios regulam o crescimento do músculo<br />
esquelético (Kraus, Bernard et al., 1989; Sillence, Reich et al., 1995). O limitado<br />
impacto de células-tronco na substituição <strong>da</strong>s fibras deficientes de distrofina<br />
nunca excedeu a 1%, talvez seja porque, em camundongos mdx, as células<br />
satélites e as células-tronco residentes sejam capazes de reposição com<br />
precursores miogênicos por to<strong>da</strong> a vi<strong>da</strong>, o que explicaria também o pobre<br />
recrutamento <strong>da</strong>s células-tronco precursoras <strong>da</strong> medula óssea.<br />
Na DMD, as miofibras do tipo IIB são mais afeta<strong>da</strong>s que fibras<br />
musculares esqueléticas de pequeno calibre (Karpati e Carpenter, 1986). A<br />
heterogenei<strong>da</strong>de de tipos de fibras musculares contribui para uma varie<strong>da</strong>de de<br />
capaci<strong>da</strong>des funcionais, que podem se a<strong>da</strong>ptar mu<strong>da</strong>ndo o tamanho e a<br />
composição do tipo de fibra influencia<strong>da</strong> pela i<strong>da</strong>de, gênero, exercício e<br />
doenças musculares. Contudo, é importante analisar os tipos de miofibras e a<br />
sua evolução durante a doença e verificar o quanto as suas proprie<strong>da</strong>des<br />
bioquímicas, metabólicas, morfológicas e fisiológicas estão sendo influencia<strong>da</strong>s<br />
durante o curso de uma determina<strong>da</strong> doença. Um dos métodos mais<br />
informativos de identificação dos tipos de fibras é a detecção <strong>da</strong> cadeia pesa<strong>da</strong><br />
98
<strong>da</strong> miosina (MHC)(Scott, Stevens et al., 2001; Toniolo, Maccatrozzo et al.,<br />
2007). As miofibras MHC lentas são maiores e estão aumenta<strong>da</strong>s<br />
seletivamente nas populações de miofibras que não se regeneram, enquanto<br />
as fibras de contração rápi<strong>da</strong> IIB, IIX ou IIA estão diminuí<strong>da</strong>s. Em geral, o<br />
aumento de miofibras lentas pode ser devido a respostas a<strong>da</strong>ptativas pelos<br />
sistemas enzimáticos metabólicos e consumo de energia, porque as fibras<br />
lentas têm consumo menor de energia do que as fibras rápi<strong>da</strong>s (Crow e<br />
Kushmerick, 1982). Nossos estudos confirmam os resultados destes autores,<br />
mostrando substituição maior <strong>da</strong>s células musculares glicolíticas (brancas -<br />
contração rápi<strong>da</strong>) por fibras intermediárias (menos rápi<strong>da</strong>s) em ambos os<br />
gêneros do mdx. As miofibras lentas podem ser mais a<strong>da</strong>ptáveis para o<br />
estresse distrófico do que as rápi<strong>da</strong>s para compensar a habili<strong>da</strong>de reduzi<strong>da</strong> <strong>da</strong><br />
função muscular. Dois mecanismos são propostos para explicar o aumento<br />
seletivo <strong>da</strong>s miofibras lentas durante a degeneração muscular progressiva no<br />
mdx: fibras lentas podem ser mais resistentes ao estresse mecânico do que as<br />
miofibras rápi<strong>da</strong>s ou à mu<strong>da</strong>nça de isoformas de MHC rápi<strong>da</strong> para tipo lenta<br />
como visto na hipertrofia e exercício (Gregory, Low et al., 1986). A<br />
sobrevivência seletiva de miofibras lentas pode ser conseqüência <strong>da</strong>s fibras<br />
expressarem mais utrofina, proteína homóloga à distrofina, em comparação às<br />
miofibras rápi<strong>da</strong>s (Gramolini, Belanger et al., 2001; Chakkalakal, Stocksley et<br />
al., 2003).<br />
Estrogênios também parecem influenciar no fenótipo do músculo<br />
esquelético (Florini, Ewton e Magri, 1991; Sillence, Reich et al., 1995). Nossos<br />
resultados mostram que camundongos mdx fêmeas tiveram um maior número<br />
de miofibras de contração lenta e intermediária (tipo I e principalmente IIA)<br />
99
comparados com os grupos de machos pareados. O estresse e a castração,<br />
em ambos os gêneros dos camundongos distróficos, também levaram a uma<br />
diminuição do número de todos os tipos de miofibras, principalmente <strong>da</strong>s<br />
miofibras rápi<strong>da</strong>s nos camundongos mdx machos castrados. Dados <strong>da</strong><br />
literatura indicam que testosterona aumenta as fibras do tipo II (Gutmann,<br />
Hanzlikova et al., 1970) e estrogênio inibe desenvolvimento de fibras do tipo IIB<br />
e ativa formação de miofibras de contração lenta (Simoneau, Lortie et al., 1985;<br />
Suzuki e Yamamuro, 1985). Outras diferenças têm sido relata<strong>da</strong>s entre<br />
gêneros, em relação ao fluxo de sangue, temperatura e diferenças na utilização<br />
de energia devido a diferenças nas dimensões do músculo esquelético. O<br />
gênero também interfere na proporção e no tamanho de tipos de miofibras<br />
(Porter, Stuart et al., 2002). Além disso, a deficiência <strong>da</strong> distrofina pode levar à<br />
mu<strong>da</strong>nça para miofibra do tipo lenta via sinalização calcineurina / NFAT no<br />
músculo esquelético porque a calcineurina e o conteúdo de proteína NFATc1<br />
ativado são mais altos nos camundongos mdx do que nos tipos selvagens<br />
(Allen, Sartorius et al., 2001; Stupka, Plant et al., 2006). Contudo, permanece<br />
possível que ambos os mecanismos possam ser ativados ao mesmo tempo,<br />
porque a cascata calcineurina/NFAT pode regular não somente os promotores<br />
de MHC, mas também o promotor <strong>da</strong> utrofina (Chakkalakal, Stocksley et al.,<br />
2003; Spangenburg e Booth, 2003; Michel, Dunn et al., 2004). A calcineurina,<br />
tem um papel importante influenciando o fenótipo do tipo de fibra (Michel, Dunn<br />
et al., 2004), sendo descrito em ratos e camundongos, a indução <strong>da</strong> transição<br />
de isoformas MHC a partir de rápi<strong>da</strong>s para lentas (Dunn, Burns et al., 1999;<br />
Allen, Sartorius et al., 2001). Uma possibili<strong>da</strong>de é a participação do fator de<br />
crescimento IGF-1, importante para o crescimento pós-natal do músculo<br />
100
esquelético (Lupu, Terwilliger et al., 2001) e capaz de ativar múltiplas vias de<br />
sinalização dependentes de cálcio, incluindo a via calcineurina e NFAT (Michel,<br />
Dunn et al., 2004). A administração de estrogênio aumenta os níveis de<br />
calcineurina e <strong>da</strong> fosfatase de células em cultura (Rider, Foster et al., 1998;<br />
Rider e Abdou, 2001). O aumento na porcentagem <strong>da</strong>s miofibras lentas<br />
também é visto, em outras situações, como treinamento com exercício de alta<br />
intensi<strong>da</strong>de e curta duração e estimulação elétrica crônica de baixa freqüência,<br />
onde se observa mu<strong>da</strong>nça nos subtipos de fibras do tipo II devido à fosforilação<br />
de NFATc1, o que contribui para a transformação de fibras rápi<strong>da</strong>s para lentas.<br />
Os exercícios de longa duração mu<strong>da</strong>m o padrão de expressão <strong>da</strong>s miofibras<br />
do tipo II para I (Delp e Pette, 1994; Pette e Staron, 2001). Uma dieta rica,<br />
contendo 35% de proteína, induz mu<strong>da</strong>nça na isoforma de MHC II para MHC I<br />
no músculo gastrocnêmio de ratos de modo semelhante aos exercícios de<br />
longa duração. Em conjunto, ativi<strong>da</strong>de física (Holloszy, 1967), dieta com alto<br />
conteúdo proteico e hormônios sexuais femininos podem contribuir para a<br />
mu<strong>da</strong>nça de miofibras do tipo rápi<strong>da</strong> para lenta (White, Cattaneo et al., 2000;<br />
Brodsky, Suzara et al., 2004).<br />
Dentre as mais importantes metaloproteinases associa<strong>da</strong>s com a função<br />
e disfunção do músculo esquelético, estão as MMP-9 e MMP-2 (Carmeli, Moas<br />
et al., 2004). Nossos estudos mostram que, no músculo de camundongo<br />
normal, a ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP-9 não era detecta<strong>da</strong> diferentemente <strong>da</strong>quela <strong>da</strong><br />
MMP-2. Estes <strong>da</strong>dos confirmam o reportado na literatura que demonstra que a<br />
MMP-2, mas não a expressão <strong>da</strong> MMP-9, é constitutiva em músculos normais.<br />
Todos os camundongos mdx, machos e fêmeas, apresentaram uma ativi<strong>da</strong>de<br />
aumenta<strong>da</strong> <strong>da</strong>s MMP -2 e -9, em especial os grupos castrados. Sabemos que<br />
101
no camundongo mdx, tanto as formas ativa e pró-ativa <strong>da</strong> MMP-2 e MMP-9 são<br />
expressas em níveis significativamente elevados (Gosselin, Williams et al.,<br />
2007), mas com variações influencia<strong>da</strong>s pela fase <strong>da</strong> doença. A ativação <strong>da</strong><br />
MMP-2 ocorre concomitantemente com a regeneração de novas miofibras, mas<br />
<strong>da</strong> MMP-9 está associa<strong>da</strong> principalmente com a resposta inflamatória,<br />
migração celular e provavelmente com a ativação de células satélites (Kherif,<br />
Lafuma et al., 1999). Nosso estudo apresentou diferenças importantes entre os<br />
gêneros, já que a ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP-9 estava mais eleva<strong>da</strong> em todos os grupos<br />
de camundongos mdx machos comparados com os grupos mdx fêmeas<br />
parea<strong>da</strong>s. O contrário ocorreu com a MMP-2, uma vez que camundongos mdx<br />
fêmeas apresentavam ativi<strong>da</strong>de mais eleva<strong>da</strong> que os mdx machos pareados.<br />
Se hormônios sexuais são potentes inibidores de respostas inflamatórias no<br />
músculo esquelético do mdx, então, pode-se especular que a secreção e<br />
ativação <strong>da</strong> MMP-9 são dependentes <strong>da</strong> modulação hormonal. Outros estudos,<br />
nos modelos de injúria por isquemia e reperfusão, mostram uma redução<br />
marcante <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s MMP-2 e MMP-9 duas e quatro horas após<br />
tratamento com estradiol E2 (Liu, Wen et al., 2005). Estudos no músculo<br />
esquelético de pacientes com DMD e mdx mostram haver um aumento dos<br />
inibidores <strong>da</strong>s MMPs (TIMP-1 e TIMP-2) e <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de MMP-2 e MMP-9<br />
(Kherif, Lafuma et al., 1999; Gosselin, Williams et al., 2007), sugerindo que a<br />
alteração na regulação <strong>da</strong>s MMPs e seus inibidores pode contribuir para a<br />
patogênese do músculo esquelético e que a ativi<strong>da</strong>de hormonal possa controlar<br />
o processo de remodelagem tecidual. De fato, <strong>da</strong>dos <strong>da</strong> literatura indicam que<br />
hormônio sexual feminino é estimulador específico <strong>da</strong> liberação <strong>da</strong> MMP-2<br />
(Wingrove e Stevenson, 1997), um fator importante na remodelagem tecidual,<br />
102
por regular a integri<strong>da</strong>de e composição <strong>da</strong> ECM e do tecido conjuntivo no<br />
músculo esquelético após injúria. Os hormônios corticosteróides inibem a<br />
expressão de genes pró-inflamatórios e podem suprimir a síntese de MMPs.<br />
Este tipo de tratamento pode reduzir a deposição de colágeno subepitelial pela<br />
diminuição <strong>da</strong> expressão <strong>da</strong> MMP-9 (Hoshino, Takahashi et al., 1999).<br />
A inibição <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s MMPs com hormônios esteróides pode ser<br />
usa<strong>da</strong> como estratégia terapêutica para reduzir a severi<strong>da</strong>de por injúria e<br />
reperfusão (Roach, Fitridge et al., 2002). O estrogênio diminui a produção de<br />
citocinas inflamatórias por diferentes tipos de macrófagos, também bloqueia a<br />
produção de MMP-9, prostaglandina E, induz a síntese de óxido nítrico e<br />
atenua a liberação de superóxido e <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de fagocítica (Vegeto, Ghisletti et<br />
al., 2004). Espécies reativas de oxigênio têm um papel importante na ativação<br />
de MMPs. Uma vez que o estrogênio diminui a produção de radicais livres,<br />
(Tiidus e Houston, 1993; Bruce-Keller, Barger et al., 2001) é possível modular a<br />
expressão de MMPs e influenciar a remodelagem do tecido muscular.<br />
Atualmente têm sido usados como alvos farmacêuticos os receptores de<br />
estrogênio, que representam uma descoberta potente para uso de drogas<br />
seletivas e específicas para controlar a evolução de diversas doenças (Barrett-<br />
Connor, Mosca et al., 2006). Receptores de estrogênios endógenos<br />
representam uma grande ferramenta de estudo <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de hormonal sobre as<br />
células inflamatórias e não inflamatórias. Para distinguir os mecanismos de<br />
ação dos hormônios sexuais femininos, usamos tamoxifen, que é capaz de<br />
modular o receptor seletivo de estrogênio (SERM). Esta droga tem efeito<br />
agonista ao do estrogênio nos músculos esqueléticos (Wenger, 2002; Riggs e<br />
Hartmann, 2003). O tratamento com tamoxifen aumentou a regeneração no<br />
103
músculo gastrocnêmio de ambos os sexos, porém maior nos camundongos<br />
mdx fêmeas. Em relação ao tipo de tratamento, a liberação <strong>da</strong> droga local<br />
sobre o músculo gastrocnêmio (direito) ocasionou maior regeneração <strong>da</strong>s<br />
células musculares do que no músculo contralateral. Estudos mostraram outro<br />
modulador de receptor de estrogênio, o raloxifeno, que diminuiu a expressão<br />
<strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de gelatinolítica e estes efeitos foram acompanhados pela redução do<br />
tamanho <strong>da</strong> lesão e inibição do acúmulo de macrófagos em células de<br />
musculatura lisa (Bellosta, Baetta et al., 2007). O tratamento com tamoxifen<br />
induziu um aumento no número de células musculares íntegras nos<br />
camundongos mdx machos e fêmeas, comparados com os grupos controle e<br />
sem tamoxifen. O comprometimento <strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de funcional <strong>da</strong> membrana <strong>da</strong>s<br />
células musculares, comum na DMD, induz um aumento do influxo de cálcio<br />
ativando proteases dependentes de cálcio, tais como calpaínas, aumenta<strong>da</strong>s<br />
em concentração e ativi<strong>da</strong>de nos tecidos distróficos. Portanto, é possível que a<br />
redução na destruição <strong>da</strong> membrana segui<strong>da</strong> ao tratamento com tamoxifen,<br />
seja, em parte, responsável pela estabilização de membrana, assim como pode<br />
ser explica<strong>da</strong> pelo tratamento por hormônios esteróides como a prednisona<br />
(Khan, 1993), pelo estrogênio (Bar, Amelink et al., 1988; Koot, Amelink et al.,<br />
1991; Tiidus e Bombardier, 1999) e pelos efeitos antinflamatórios.<br />
Também foi alvo de nossos estudos o efeito do tratamento com<br />
tamoxifen nas células do infiltrado inflamatório, sendo evidencia<strong>da</strong> por imuno-<br />
histoquímica com os anticorpos F480 e Mac-1+ uma redução acentua<strong>da</strong> na<br />
população de macrófagos no músculo gastrocnêmio dos camundongos mdx<br />
machos e fêmeas comparados com os grupos controle sem tamoxifen. O<br />
infiltrado inflamatório influencia a fisiopatologia <strong>da</strong> lesão muscular na DMD<br />
104
(Spencer e Tidball, 2001; Porter, Stuart et al., 2002). Embora mutações <strong>da</strong><br />
distrofina sejam a causa primária de DMD, o processo secundário, envolvendo<br />
persistente inflamação, prejudica a regeneração e exacerba a progressão <strong>da</strong><br />
doença. Neste sentido, foi evidenciado que a redução no número de<br />
macrófagos em músculos deficientes de distrofina diminui a lesão no sarcolema<br />
(Lundberg, Brengman et al., 1995). Contudo, nem todos os macrófagos são<br />
fagocíticos (St Pierre e Tidball, 1994) e diferentes subpopulações podem<br />
executar funções distintas resultando em efeitos diversos na produção de<br />
citocinas antinflamatórias, efeitos antiapoptóticos e liberação de fatores de<br />
crescimento necessários para um ambiente para favorecer a proliferação e<br />
migração de células satélites para a regeneração <strong>da</strong> miofibra (Chazaud, Sonnet<br />
et al., 2003). Neste contexto, é importante analisar a função específica de ca<strong>da</strong><br />
população de macrófago em relação à regulação <strong>da</strong> inflamação na lesão<br />
muscular na DMD e qual a influência dos hormônios sexuais e drogas<br />
moduladoras (ex., tamoxifen) na função <strong>da</strong>s células do infiltrado inflamatório e<br />
expressão de moléculas de adesão. Existem fortes evidências de que os<br />
estrógenos influenciem as respostas inflamatórias em vários tecidos, inclusive<br />
no músculo esquelético (Amelink, Kamp et al., 1988; Tiidus, Bombardier et al.,<br />
1998). Dados na literatura mostram que os hormônios sexuais femininos<br />
(estrogênios) reduzem o número de células inflamatórias, inibem a expressão<br />
de moléculas de adesão (Schneider e Gallagher, 1999) e também influenciam o<br />
processo de regeneração <strong>da</strong>s miofibras ao induzirem a proliferação de<br />
mioblastos (Schneider e Sannes, 2001). Um achado interessante na lesão<br />
muscular de machos e fêmeas mdx é a presença de tecido adiposo, muito mais<br />
exuberante na fêmea. O tecido adiposo também é visto como um órgão<br />
105
endócrino (Prins, 2002). A adiponectina, hormônio produzido pelo tecido<br />
adiposo, pode funcionar como um modulador atenuando respostas<br />
inflamatórias excessivas numa varie<strong>da</strong>de de tecidos. Esse hormônio reduz a<br />
expressão de molécula de adesão cellular vascular-1 (VCAM-1), E-selectina,<br />
molécula de adesão intracelular-1 e IL-8, a interação de monócitos ativados em<br />
células endoteliais e também inibe a ativação fator nuclear-κB (NF-κB) em<br />
células endoteliais (Ouchi, Kihara et al., 1999; Ouchi, Kihara et al., 2000;<br />
Kobashi, Urakaze et al., 2005). Os hormônios sexuais influenciam nos níveis<br />
plasmáticos de adiponectina e leptina. Assim, o tecido adiposo de mulheres<br />
produz mais adiponectina e leptina do que o tecido adiposo de homens<br />
(Iglesias, Eiras et al., 2006). Experimentos em cultura de células mostram que<br />
a adiponectina tem efeitos antinflamatórios e antiapoptóticos sobre miócitos<br />
cardíacos e fibroblastos (Kobayashi, Ouchi et al., 2004; Lin, Lin et al., 2004;<br />
Shibata, Sato et al., 2005). Camundongos mdx machos apresentaram menor<br />
número de adipócitos do que as mdx fêmeas parea<strong>da</strong>s, podendo ser este<br />
também outro fator que contribui para o menor infiltrado inflamatório nas<br />
fêmeas, embora não se observem grandes diferenças entre o número de<br />
adipócitos no tecido muscular dos grupos de camundongos mdx tratados com<br />
tamoxifen.<br />
A distrofia muscular de Duchenne ain<strong>da</strong> não tem cura; porém os<br />
benefícios, melhora <strong>da</strong> quali<strong>da</strong>de de vi<strong>da</strong> e aumento <strong>da</strong> sobrevi<strong>da</strong>, são obtidos<br />
com o atendimento multiprofissional. A fisioterapia e exercícios aju<strong>da</strong>m na<br />
prevenção <strong>da</strong> contratura muscular permanente em torno <strong>da</strong>s articulações. Às<br />
vezes, a cirurgia se torna necessária para a liberação de músculos contraídos<br />
e doloridos. Inúmeras pesquisas têm sido feitas nos últimos anos para se obter<br />
106
a cura <strong>da</strong> doença. As famílias com membros que apresentam DMD são<br />
instruí<strong>da</strong>s a buscar um aconselhamento genético, para avaliação do risco de<br />
transmissão do traço <strong>da</strong> distrofia muscular aos descendentes. O transplante de<br />
mioblastos não tem tido muito sucesso, uma vez que os mioblastos são<br />
incapazes de migrarem para longe <strong>da</strong> inoculação e 80% sofrem morte maciça<br />
(Bhagavati e Xu, 2004; Negroni, Butler-Browne et al., 2006). Existem as linhas<br />
de pesquisas que se voltam para a terapia genética ou para a terapia<br />
medicamentosa. A terapia genética utiliza a transferência do gene <strong>da</strong> distrofina<br />
ou parte dele para ca<strong>da</strong> célula muscular, ou ain<strong>da</strong>, a correção do defeito<br />
genético por técnicas especializa<strong>da</strong>s. A terapia medicamentosa, realiza<strong>da</strong> com<br />
drogas, não tem ação sobre o gene e atua na célula muscular bloqueando a<br />
sua degeneração. Muitos progressos têm sido feitos nas duas possibili<strong>da</strong>des<br />
de tratamento. A terapia genética ain<strong>da</strong> está sob investigação, pois apesar de<br />
facilitar a produção de distrofina pelos músculos, ain<strong>da</strong> é baixo o nível de<br />
expressão do produto do gene e este estimula uma resposta imune. Contudo,<br />
atualmente, a terapia medicamentosa é a opção mais viável para os pacientes<br />
com DMD. A partir do início <strong>da</strong> déca<strong>da</strong> de 90, alguns trabalhos foram<br />
divulgados relatando benefícios com a corticoterapia (Khan, 1993). A<br />
prednisona, um corticoesteróide, vem sendo investigado como um meio de<br />
alívio temporário para a melhora <strong>da</strong> fraqueza muscular em DMD. Porém, os<br />
efeitos colaterais dos corticóides são grandes (ganho de peso, hipertensão,<br />
obesi<strong>da</strong>de, osteoporose e catarata).<br />
Atualmente, têm sido usados como alvos farmacêuticos os receptores de<br />
estrogênio, que representam uma descoberta potente para uso de drogas<br />
seletivas e específicas para controlar a evolução de diversas desordens<br />
107
patológicas. Receptores de estrogênios endógenos representam uma grande<br />
ferramenta de estudo <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de hormonal sobre as células inflamatórias e<br />
não inflamatórias. Recentemente foi mostrado que a combinação de hormônios<br />
esteróides sexuais com tamoxifen no camundongo mdx tem ação<br />
antinflamatória e imunossupressiva resultando numa significativa melhora <strong>da</strong><br />
força e função muscular esquelética (A.P.Calvalsan, 2005). O tamoxifen<br />
também tem sido apontado como inibidor de fibroblastos e de sua taxa de<br />
síntese de colágeno (Hu, Hughes et al., 1998), eficiente na melhora <strong>da</strong> função<br />
mitocondrial e capaz de ter efeito positivo no balanço pró-oxi<strong>da</strong>nte e<br />
antioxi<strong>da</strong>nte (Ragaz e Coldman, 1998; Zhao, Wang et al., 2006). Aqui<br />
mostramos que o tratamento com tamoxifen induziu um aumento de células<br />
musculares íntegras nos camundongos mdx machos e fêmeas. Embora<br />
mutações <strong>da</strong> distrofina sejam a causa primária de DMD, o processo<br />
secundário, envolvendo persistente inflamação, prejudica a regeneração e<br />
exacerba a progressão <strong>da</strong> doença. Neste sentido, é evidenciado que a redução<br />
do número de macrófagos em músculos deficientes de distrofina diminui a<br />
lesão no sarcolema. Assim, a regulação <strong>da</strong> inflamação e <strong>da</strong> resposta<br />
inflamatória quanto ao tipo de população de macrófagos precisa ser eluci<strong>da</strong><strong>da</strong><br />
no estudo de DMD. Futuramente, outros estudos serão necessários para<br />
quantificar o número total de macrófagos e suas subpopulações pró e<br />
antinflamatórias, bem como a produção local de citocinas, os efeitos na<br />
integri<strong>da</strong>de estrutural <strong>da</strong> membrana <strong>da</strong> célula muscular esquelética e<br />
remodelagem tecidual, para que algo possa ser utilizado como uma estratégia<br />
promisssora no tratamento <strong>da</strong> DMD.<br />
108
6. CONCLUSÕES<br />
►Os grupos de camundongos mdx fêmeas apresentaram pequenos focos de<br />
mionecrose e menor infiltrado inflamatório em comparação com os grupos<br />
machos pareados. Entretanto, as fêmeas que sofreram castração cirúrgica<br />
(ovariectomia) tiveram níveis altos de infiltrado inflamatório assim como os<br />
machos, o que sugere a importância do hormônio sexual feminino na<br />
manutenção <strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de estrutural <strong>da</strong> membrana <strong>da</strong> célula muscular<br />
esquelética.<br />
► A imunomarcação com NCAM de mioblastos regenerando em todos os<br />
grupos de camundongos mdx fêmeas estava em número maior nos músculos<br />
de contração rápi<strong>da</strong> (gastrocnêmio) e de contração lenta (solear) do que nos<br />
mdx machos pareados. Entretanto, nos camundongos machos distróficos<br />
castrados (OOX), houve um decréscimo significativo do número destas células,
mas não nas fêmeas castra<strong>da</strong>s (OVX). Isto indica que a castração nas fêmeas<br />
induza a uma maior produção de hormônios sexuais femininos nos órgãos<br />
periféricos, que continuam protegendo a miofibra. Neste contexto, é importante<br />
monitorar os níveis séricos de hormônios sexuais antes e após a castração.<br />
► A imunomarcação para Sca-1 estava maior em todos os grupos de fêmeas<br />
mdx do que nos machos mdx pareados não-castrados; e menores ain<strong>da</strong> nos<br />
camundongos machos mdx castrados (OOX). Fêmeas mdx castra<strong>da</strong>s (OVX)<br />
também apresentaram valores mais elevados comparativamente aos grupos de<br />
fêmeas mdx controle e SHAM. Estes resultados sugerem que as células-<br />
tronco contribuem de modo mais efetivo na regeneração do músculo<br />
esquelético <strong>da</strong>s fêmeas.<br />
►Pela ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> enzima ATPase, predominantemente, houve substituição<br />
<strong>da</strong>s células musculares glicolíticas (brancas- de contração rápi<strong>da</strong>) por fibras<br />
intermediárias (menos rápi<strong>da</strong>s) em ambos os gêneros distróficos. As miofibras<br />
lentas podem ser mais a<strong>da</strong>ptáveis ao estresse <strong>da</strong> lesão muscular <strong>da</strong><br />
distrofinopatia do que as rápi<strong>da</strong>s. Os camundongos mdx fêmeas tiveram um<br />
maior número de miofibras de contração lenta e intermediária (tipo I e<br />
principalmente IIA) do que os machos pareados. O estresse e a castração, em<br />
110
ambos os gêneros dos camundongos distróficos, também levaram a uma<br />
diminuição do número de todos os tipos de miofibras, principalmente <strong>da</strong>s<br />
miofibras rápi<strong>da</strong>s nos camundongos mdx machos castrados. Estes resultados<br />
estão de acordo com a literatura, mostrando que camundongos mdx têm per<strong>da</strong><br />
do tipo de miofibras rápi<strong>da</strong> (IIB) e um aumento relativo no percentual de<br />
miofibras intermediárias (IIA).<br />
►No músculo do camundongo normal, a ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP-9 está ausente,<br />
enquanto a MMP-2 é constitutiva. Todos os camundongos mdx, machos e<br />
fêmeas, apresentaram ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s MMP-2 e MMP-9 aumenta<strong>da</strong>s, em<br />
especial os grupos castrados. A ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP-9 era maior em todos os<br />
camundongos mdx machos comparados com as mdx fêmeas parea<strong>da</strong>s. Em<br />
contraste, a ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP-2 nos camundongos mdx fêmeas era maior que<br />
nos grupos mdx machos pareados. Estes <strong>da</strong>dos indicam que o aumento <strong>da</strong><br />
ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> MMP-2 nos camundongos mdx fêmeas está associado com maior<br />
regeneração e remodelagem muscular, enquanto o aumento <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong><br />
MMP-9 nos machos, com a maior ativi<strong>da</strong>de inflamatória e mionecrose.<br />
►Camundongos mdx machos e fêmeas tratados com a droga tamoxifen, com<br />
efeitos agonista ao do hormônio estrogênio no músculo esquelético,<br />
apresentaram maior número de células musculares íntegras do que os grupos<br />
111
controle e sem tratamento com tamoxifen. Isto sugere que esta droga, em<br />
ambos os sexos, pode contribuir para manter a integri<strong>da</strong>de estrutural <strong>da</strong><br />
membrana muscular.<br />
► A imunomarcação para população de macrófagos (F4/80 e Mac-1), mostrou<br />
uma maior redução deles no músculo gastrocnêmio dos camundongos mdx<br />
machos e fêmeas tratados com tamoxifen do que nos grupos controle e sem<br />
tamoxifen. Estes <strong>da</strong>dos indicam possíveis efeitos, desta droga com efeitos<br />
antinflamatório e antiapoptótico.<br />
►Não houve diferenças entre o número de adipócitos presentes no músculo<br />
esquelético (gastrocnêmio) dos grupos de camundongos mdx machos e<br />
fêmeas. Entretanto, quando analisamos a diferença entre os gêneros, os<br />
grupos de mdx machos tinham menor número de adipócitos do que os grupos<br />
de mdx fêmeas parea<strong>da</strong>s. Isto sugere que a maior quanti<strong>da</strong>de de adipócitos<br />
pode favorecer o grupo de fêmeas mdx com liberação local de adipocinas,<br />
exercendo efeitos antinflamatórios, antiapoptóticos, anabólicos e também<br />
promovendo a diferenciação em células miogênicas ou em macrófagos<br />
regulatórios.<br />
112
►Em conjunto, os resultados sugerem que os hormônios sexuais femininos<br />
exercem efeitos benéficos no músculo distrófico, especialmente na<br />
manutenção <strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de estrutural <strong>da</strong>s miofibras esqueléticas, nas<br />
ativi<strong>da</strong>des antinflamatória e antiapoptótica, promovendo a regeneração e a<br />
remodelagem muscular.<br />
113
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