Revista Analytica Edição 108

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Artigo 1 Autores: Gabriela Cirilo Machado 1 ; Thiago Machado Pasin 2 ; Arlete Barbosa dos Reis 3 ; Juan Pedro Bretas Roa 4 ; David Lee Nelson 5 ; Vivian Machado Benassi 6 * Cultivo de Rhizopus Sp. Al131 sob Diferentes Resíduos Agroindustriais para a Obtenção de Amilases com Alto Potencial de Aplicação Comercial Imagem Ilustrativa 8 Revista Analytica | Ago/Set 2020 Resumo O potencial de fungos filamentosos para a produção enzimática está presente em diversas linhas de pesquisa devido ao baixo custo e as condições de fácil alcance para o cultivo laboratorial desses micro- organismos. Dentre as enzimas descritas e de grande aplicação industrial, destacam-se as amilases. Então, esse trabalho objetivou otimizar os parâmetros físico-químicos do cultivo do fungo filamentoso Rhizopus sp. AL131 para produção de amilases e, posteriormente, a caracterização bioquímica das enzimas. Para tal, cultivou-se o Rhizopus sp. AL131 em três distintos meios, à 35 ºC, em estufa bacteriológica, durante dez dias, sendo retirados a cada 24 horas. Após padronização do meio submerso, variou-se sua composição, analisando a solução salina, fontes de nitrogênio e carbono, bem como a influência do pH inicial do meio na produção amilolítica. Por fim, verificou- -se a influência do pH e da temperatura no ensaio enzimático. Os resultados mostram que a enzima obteve maior atividade no quarto dia de cultivo do Rhizopus sp. AL131 em meio submerso SR contendo solução salina SR e CP, utilizando-se peptona como fonte nitrogenada, e arroz moído como fonte de carbono, com pH inicial de 4,5. As condições ótimas de pH e temperatura da amilase foram 5,0 à 50 ºC, respectivamente. Esses resultados demonstram o alto potencial de aplicação biotecnológica e industrial do fungo Rhizopus sp. AL131 para a produção de amilases através do reuso de resíduos gerados pela indústria produtora de arroz, representando uma alternativa econômica, sustentável e inovadora para obtenção destas enzimas de alto valor agregado. Palavras-chave: Atividade amilolítica; Enzima; Fermentação submersa; Fungo filamentoso. Abstract The potential of filamentous fungi for enzymatic production is present in several lines of research due to the low cost and easy- -to-reach conditions for laboratory cultivation of these microorganisms. Among the enzymes described and of great industrial application, amylases stand out. So, this work aimed to optimize the physical-chemical parameters of the cultivation of the filamentous fungus Rhizopus sp. AL131 for the production of amylases and, subsequently, the biochemical characterization of these enzymes. For this, Rhizopus sp. AL131 was cultivated in three different media, at 35 ºC, in a bacteriological incubator, for ten days, being removed every 24 hours. After standardization of the submerged medium, its composition was ranged, the saline solution was analyzed, different sources of nitrogen and carbon were tested, as well as the influence of the initial pH of the medium in the amylolytic production. Finally, the influence of pH and temperature on the enzymatic assay was verified. The results showed that the enzyme obtained greater activity on the fourth day of cultivation of Rhizopus sp. AL131 in submerged SR medium containing SR and CP saline solution, using peptone as a nitrogen source, and ground rice as a carbon source, with an initial pH of 4.5. The optimum pH and temperature for the amylase activity were 5.0 to 50 ºC, respectively. These results demonstrate the high potential for biotechnological and industrial application of the fungus Rhizopus sp. AL131 for the production of amylases through the reuse of residues generated by the rice producing industry, representing an economical, sustainable and innovative alternative for obtaining these high added value enzymes. Keywords: Amylolytic activity; Enzyme, Filamentous fungus; Submerged fermentation.
Introdução Os fungos filamentosos destacam-se dentre os micro-organismos conhecidos por seus produtos naturais bioativos. O uso de fungos em bioprocessos tem aumentado demasiadamente em importância devido à produção de várias enzimas com diferentes características físico-químicas e excelente potenciais para a aplicação nos mais diversos setores industriais (PASIN et al., 2019). Dentre as principais vantagens do uso desse micro-organismo para a produção enzimática destaca-se o custo benefício do cultivo, fácil manipulação para obtenção enzimática de interesse, possibilidade de uma produção em larga escala e excreção do produto de interesse (LUCAS et al, 2020). Esses fungos aparecem como principal foco biotecnológico atual, sendo suas enzimas testadas para substituição de diversos processos químicos convencionais (SENA et al., 2006), apresentando alternativas atrativas para a resolução de problemas nos mais amplos campos industriais e preservacionistas, possibilitando a substituição de reagentes químicos caros e altamente poluentes para o meio ambiente, por um produto que, após o uso, é facilmente degradável e, dessa maneira, não provoca danos à natureza (PASIN et al., 2014). Segundo Orlandelli et al. (2012), as enzimas são proteínas que atuam como catalisadores de reações químicas executando transformaçãoes altamente seletivas, estão presentes no metabolismo de todo organismo vivo e apresentam diversas propriedades que as tornam atrativas em processos de biotransformações. Além do substrato, a síntese de enzimas por micro-organismos é altamente influenciada por alguns fatores, tais como tempo de cultivo, fontes de nitrogênio e carbono, temperatura e pH (FREITAS; MARTINS; FERREIRA, 2014). Entretanto, esta síntese de ocorrencia natural não está disponível em quantidades suficientes para as aplicações industriais. Nesse sentido, faz-se necessário o isolamento de cepas microbianas que produzem a enzima desejada e a otimização das condições de cultivo, visando uma maior produção enzimática (OYEKELE; OYEWOLE; EGWIM, 2011). As enzimas amilolíticas degradam o amido presente em sementes de cereais como milho e tubérculos, ou raízes como batata e mandioca. O amido é o mais importante polissacarídeo de reserva do reino vegetal, possuindo em sua constituição amilose e amilopectina (PASIN et al., 2019). Guandalini (2007) salienta que as amilases são vantajosas por sua capacidade de acelerar reações contínuas sob condições moderadas, além de proporcionarem hidrólises não específicas e a ausência da formação de produtos indesejados. Apesar de uma demanda crescente, a maior barreira na ampla utilização de enzimas em processos industriais é devido ao seu alto custo de produção (SENA et al., 2006). Por sua vez, o uso de substratos de baixo custo para a produção enzimática é especialmente interessante por ser uma alternativa para que esse produto chegue ao seu consumidor de forma menos oneroso (FREITAS; MARTINS; FERREIRA, 2014). Diante do exposto, esse trabalho objetivou padronizar os parâmetros físico-químicos do cultivo do Rhizopus sp. AL131 para produção de amilases, utilizando-se fonte de carbono de baixo custo (resíduos agroindustriais), além de caracterizar bioquimicamente as enzimas amilolíticas. Material e Métodos Micro-organismo em estudo O micro-organismo em estudo foi isolado nas dependências da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri campus JK, Diamantina, Minas Gerais, sendo identificado como Rhizopus sp. AL131, de acordo com as características morfológicas e microscópicas (BENASSI; ALMEIDA, 2018). Ele foi cadastrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen), número A64AD93. O micro-organismo foi mantido em meio de cultivo sólido aveia (EMERSON, 1941), à 35ºC, durante cinco dias, posteriormente, mantidos à 4ºC até o uso nos experimentos. Condições de cultivo e produção de amilases usando diferentes resíduos agroindustriais como fontes de carbono Uma suspensão de esporos do Rhizopus sp. AL131 (1,27 x 106 esporos. mL-1) foi inoculada em 25 mL de meio de cultivo, contidos em Erlenmeyer de 125 mL. Inicialmente, foram analisados três distintos meios de cultura submersos: SR (RIZZATTI et al., 2001), Khanna (KHANNA et al., 1995) e CP (PEIXOTO et al., 2003), contendo amido como fonte de carbono, sendo mantidos à 35ºC, de forma estacionária em estufa bacteriológica, durante dez dias, sendo retirados triplicatas de meios a cada 24 horas para análise da atividade amilolítica. Posteriormente, analisou-se o efeito da solução de sais no meio de cultivo padronizado para crescimento do fungo Rhizopus sp. AL131 e produção amilolítica, sendo essas: (1) sais CP; (2) sais SR; (3) 0,05 % (m/v) de sais Wesson Cinetica®; (4) sais SR acrescido de sais CP; (5) sais SR acrescido de 0,05 % (m/v) de sais Wesson Cinetica®; (6) sais CP acrescido de 0,05 % (m/v) de sais Wesson Cinetica®; e um meio controle sem solução de sais, sendo mantidos à 35ºC, de forma estacionária em estufa bacteriológica, pelo tempo determinado no experimento anterior. Em seguida, foram analisadas diferentes fontes de nitrogênio: (1) 0,47 % (m/v) de extrato de levedura; (2) 0,47 % (m/v) de peptona; (3) 0,47 % (m/v) de ureia; (4) 0,45 % (m/v) de extrato de levedura acrescido de 0,02 % (m/v) de peptona; (5) 0,45 % (m/v) de extrato de levedura acrescido de 0,02 % (m/v) de ureia; (6) 0,45 % (m/v) de ureia acrescido de 0,02 % (m/v) de peptona; (7) 0,40 % (m/v) de extrato de levedura acrescido de 0,02 % (m/v) de peptona e de 0,05 % (m/v) de ureia, além do controle sem nenhuma fonte de nitrogênio, sendo mantidos à 35ºC, de forma estacionária em estufa bacteriológica, por um tempo prédeterminado. Revista Analytica | Ago/Set 2020 9
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