Revista Analytica Edição 108

Artigo 1
Autores:
Gabriela Cirilo Machado 1 ; Thiago Machado Pasin 2 ; Arlete Barbosa dos Reis 3 ;
Juan Pedro Bretas Roa 4 ; David Lee Nelson 5 ; Vivian Machado Benassi 6 *
10
Revista Analytica | Ago/Set 2020
Imagem Ilustrativa
Distintas fontes de carbono foram analisadas
na proporção de 1 % (m/v), sendo
glicose; galactose; sacarose; lactose; maltose;
leite em pó; casca de banana; arroz
moído; farinha de chia; farelo de trigo; farinha
de milho; farinha de linhaça marrom;
flocos de aveia; amido de milho; casca de
batata; casca de mandioca; polpa de mandioca;
farinha de aveia e amido solúvel,
sendo mantidos à 35ºC, de forma estacionária
em estufa bacteriológica.
Por fim, variou-se o pH inicial do meio de
cultivo submerso nos seguintes valores 4,0;
4,5; 5,0; 5,5; 6,0 e 7,0, sendo mantidos em
estufa bacteriológica, de forma estacionária
durante quatro dias, à 35ºC. Decorrido o
tempo de cultivo, as culturas foram filtradas
em bomba à vácuo utilizando-se papel filtro
Whatman nº 1, e o filtrado foi utilizado
como extrato bruto extracelular enzimático.
Determinação da Atividade Amilolítica
A atividade enzimática foi estimada utilizando-se
como substrato 1 % (m/v) de
amido em tampão acetato de sódio 100
mM pH 5,5, e a formação de açúcares redutores
foi quantificada com o ácido 3’,5’-
dinitrosalicílico (DNS) (MILLER, 1959). O
ensaio foi realizado pela mistura de 500 µL
do substrato e 500 µL do extrato bruto enzimático,
sendo mantidos à 55ºC, durante 5
minutos. Decorrido o tempo de incubação,
alíquotas de 200 µL da reação foram retiradas
e inseridas em 200 µL de DNS. O branco
foi realizado pela retirada do tempo zero da
reação. Após a fervura, durante 5 minutos,
e resfriamento, foram adicionados 2 mL de
água destilada em cada tudo. A leitura foi
feita em 540 nm em espectrofotômetro
RayLigh UV - 2601®.
A curva padrão consistiu-se de uma solução
de glicose (0,1 a 1,0 mg/mL), e a unidade de
atividade das amilases foi determinado como
U.mL-1, sendo U definida como a quantidade
de enzima que hidrolisa um µmol de substrato
por minuto, nas condições do ensaio, sendo a
atividade total (U total) calculada pela multiplicação
da atividade pelo volume do extrato
bruto extracelular enzimático, ou seja, U total
= U.mL-1 x volume do filtrado.
Caracterização bioquímica da amilase
A análise do efeito da temperatura e do pH
na atividade amilolítica foi realizado utilizando-se
um Delineamento Composto Central
Rotacional (DCCR2), incluindo três repetições
do ponto central, totalizando 12 ensaios
(RODRIGUES; IEMMA, 2014) (Tabela 1). Os
dados foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) utilizando o programa Protimiza
Experimental Design. Os efeitos foram considerados
significativos para p < 0,10.
Tabela 1: Valores utilizados no DCCR2
Resultados e Discussão
Segundo Londoño-Hernández et al. (2017),
em condições físico-químicas ideais, os fungos
filamentosos podem eficientemente
utilizar uma grande variedade de substratos,
produzindo vários bioprodutos de interesse,
tais como enzimas. Estes bioprodutos são
classificados como seguros visto que não
contêm nenhum componente prejudicial aos
seres humanos e ao meio ambiente. Neste trabalho
foi possível observar este fenômeno, o
meio de cultivo mais favorável à produção de
amilases por Rhizopus sp. AL131 foi o SR utilizando
amido como fonte de carbono, obtendo
maior atividade enzimática no quarto dia de
crescimento do micro-organismo com 203,87
U totais, quando em comdição estacionária.
Este resultado foi seguido pelo meio CP com
uma atividade de 106,82 U totais, após cinco
dias de cultivo; e o meio Khanna com uma atividade
de 80,10 U totais, sendo mantido durante
seis dias de forma estacionária em estufa
Atividade Amilolítica (U totais)
200
150
100
50
CP
SR
Khanna
0
0 2 4 6 8 10
Tempo de crescimento do fungo (dias)
Figura 1: Produção de amilases pelo fungo Rhizopus sp.
AL131 em distintos meios de cultura em função do tempo de
cultivo.
bacteriológica, à 35ºC (Figura1). Analisando a
composição dos meios de cultura utilizados, é
possível observar que eles possuem composições
semelhantes. Os principais componentes
comuns entre eles são os íons metálicos e
o extrato de levedura, indispensáveis para
o crescimento e a produção enzimática por
diversas espécies fúngicas (BENASSI et al.,
2014). Entretanto, a presença de fosfato monoamônico
(NH4H2PO4) e peptona apenas no
meio SR pode ter favorecido uma maior produção
de amilases pelo Rhizopus sp. AL131.
Contrariamente, o meio Khanna possuiu a
menor quantidade de extrato de levedura
entre os meios analisados e uma variedade
de sais muito maior que os demais, fatores
esses que podem ter inibido a produção enzimática.
Estes resultados obtidos corroboram
com os observados por Peixoto- Nogueira et
al. (2007) e Almeida (2017), cujos micro-organismos
Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis
e A. brasiliensis, respectivamente,
obtiveram uma notável atividade amilolítica
em meio SR. Ainda segundo Almeida (2017),
a produção enzimática de forma estacionária
economiza energia quando comparado ao
processo agitado, por aumentar a viabilidade
do projeto, sendo um ponto favorável industrialmente.
Vale citar que foi observado um
incremento na atividade enzimática até o
quarto dia de fermentação do fungo Rhizopus
sp. AL131, sendo este o pico de atividade máxima
(Figura1). Esse tempo é relativamente
curto levando a uma diminuição no custo de
produção da referida enzima em larga escala
(SILVA et al., 2011). Após o período de 96 horas,
ocorreu a diminuição da atividade, sendo