Lsamp geeni promootorite—1a ja 1b—ekspressiooni kvantitatiivne ...

TARTU ÜLIKOOL
LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND
ARSTITEADUSKOND
FÜSIOLOOGIA INSTITUUT
TAAVI VANAVESKI
Lsamp geeni promootorite—1a ja 1b—ekspressiooni kvantitatiivne tuvastamine
Bakalaureusetöö (12 EAP)
Juhendajad PhD Mari-Anne Philips
PhD Kersti Lilleväli
Tartu 2012

Sisukord
KASUTATUD LÜHENDID ...................................................................................................... 3
SISSEJUHATUS ........................................................................................................................ 4
1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ................................................................................................. 5
1.1 Immuunoglobuliini superperekond ................................................................................... 5
1.2 IgLON perekond ............................................................................................................... 6
1.3 LSAMP ........................................................................................................................... 10
1.3.1 LSAMP ja närvisüsteemi talitluse häired ................................................................. 12
1.4 Lsamp promootorid......................................................................................................... 15
2. EKSPERIMENTAALOSA................................................................................................... 17
2.1 Töö eesmärgid................................................................................................................. 17
2.2 Materjal ja metoodika ..................................................................................................... 18
2.2.1 Katseloomad ............................................................................................................. 18
2.2.2 Tõstetud pluss-puuri test........................................................................................... 19
2.2.3 Ajuosade ja organite prepareerimine ........................................................................ 19
2.2.4 RNA eraldamine ja cDNA süntees ........................................................................... 20
2.2.5 Reaalaja-PCR ........................................................................................................... 20
2.2.6 Andmete statistiline analüüs ..................................................................................... 22
2.3 Töö tulemused ja arutelu................................................................................................. 23
2.3.1 Reaalaja PCRi tulemused ......................................................................................... 23
2.3.2 Käitumiskatse tulemused .......................................................................................... 24
2.3.3 Arutelu ...................................................................................................................... 25
KOKKUVÕTE ......................................................................................................................... 28
SUMMARY.............................................................................................................................. 29
KASUTATUD KIRJANDUS................................................................................................... 31
KASUTATUD INTERNETIAADRESSID.............................................................................. 36
TÄNUAVALDUSED ............................................................................................................... 37
LISAD....................................................................................................................................... 38
2

KASUTATUD LÜHENDID
CGC– väikeaju granulaarrakud (ingl. k. cerebellar granule cells)
DRG– dorsaaljuure ganglion (ingl. k. dorsal root ganglion)
ECM– ekstratsellulaarne maatriks (ingl. k. extracellular matrix)
GPI– glükosüül-fosfatidüül-inositool (ingl. k. glycosylphosphatidylinositol)
HPRT– hüpoksantiin guaniin fosforibosüül transferaas (ingl. k. hypoxanthine guanine
phosphoribosyl transferase)
Ig– immuunoglobuliin (ingl. k. immunoglobulin)
IgCAM– immuunoglobuliin raku adhesiooni molekul (ingl. k. immunoglobulin cell adhesion
molecule)
IgLON– immuunoglobuliin LON (ingl. k. immunoglobulin LON)
IgSF– immuunoglobuliini superperekond/ülemperekond (ingl. k. immunoglobulin
superfamily)
LSAMP– limbilise süsteemiga seotud membraanvalk (ingl. k. limbic-system associated
membrane protein)
Lsamp– limbilise süsteemiga seotud membraanvalku (LSAMPi) kodeeriv geen
OBCAM– opioide siduv raku adhesiooni molekul (ingl. k. opioid-binding cell adhesion
molecule)
SEM– keskväärtuse standardviga (ingl. k. standard error of the mean)
3

SISSEJUHATUS
Kõiki inimkeha varieeruvaid rakke hoiavad koos rakk-rakk vahendatud interaktsioonid.
Seejuures omavad põgusad ühendused funktsionaalset rolli ja pidevad stabiilsed ühendused
fikseerivat. Koed koosnevad rakkudest, mis on adhesioonimolekulide poolt kleepuvalt seotud.
Rakk-rakk interaktsioonidele lisanduvad veel rakk-ekstratsellulaarne maatriks ehk ECM
vahendatud interaktsioonid. Paljud ECMi komponendid on sekreteeritavad makromolekulid,
mis reguleerivad koos rakk-rakk vahendatud interaktsioonidega rakkude elutegevust
(Strachan ja Read, 2011).
Käesolevas töös on vaatluse all üks rakk-rakk vahendatud adhesioonimolekul limbilise
süsteemiga seotud membraanvalk (LSAMP). Kuigi LSAMPi on suhteliselt palju uuritud, pole
antud adhesioonimolekuli täpne bioloogiline funktsioon veel teada. Mitmed tööd on näidanud
molekuli esinemist limbilise süsteemi kortikaalses ja subkortikaalses regioonis (Levitt, 1984;
Pimenta jt., 1996a), kuid selle molekuli ekspressioon ei piirdu ainult limbilise süsteemiga
(Cote jt., 1995; Reinoso jt., 1996). Ekspressioon on tuvastatud ka neerus, kus LSAMP
ekspressiooni vähenemine seostus neeruvähiga (Chen jt., 2003).
Lsamp geenil oli algselt teada üks promootor kuni Pimenta ja Levitt (2004) avastasid
alternatiivse promootori, mistõttu on praeguse seisuga Lsamp geenil teadaolevalt kaks
promootorit. Seoses alternatiivse promootori avastamisega tuntakse esimesi eksoneid
vastavalt 1a ja 1b (Pimenta ja Levitt, 2004). Käesolev töö püüab kvantitatiivselt eristada kahe
promootori 1a ja 1b transkriptsioonilist aktiivsust, nii metsiktüüpi hiire ajus kui ka organites.
Täpsemalt vaadeldakse töös Lsamp promootorite 1a ja 1b ekspressiooni erinevusi metsiktüüpi
hiire ventraalses striaatumis ja temporaalsagaras. Töös tuuakse välja ka loomkatses selgunud
Lsamp promootorite ekspressiooni ja käitumuslike eripärade seosed või nende puudumised.
Antud töö koostati Tartu Ülikooli Arstiteaduskonna füsioloogia instituudis.
4

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE
1.1 Immuunoglobuliini superperekond
IgLON perekonna 4 esindajat, kaasa arvatud Lsamp, moodustavad väikese osa
immunoglobuliini superperekonnast (IgSF). Ig superperekonnas kuulub IgLON raku
adhesioonimolekulide (IgCAM) hulka. Ig superperekonna adhesioonimolekulide kõik
esindajad omavad teatud ühiseid tunnuseid. Nende hulgas Ig domeene, mida on enamasti mitu
kordust. Ig domeenid koosnevad antiparalleelsetest β-kiududest (β-strand), mis moodustavad
β-lehti (β-sheet). β-lehed on stabiliseeritud neid ühendavate disulfiidsidemete poolt.
Voltumise tõttu on Ig domeenid vastupidavad proteasoomidele ja väga stabiilsed rakuvälises
keskkonnas. Ig domeenide voltumine tagab lingude vahel asuvate aminohapete
presenteerimise opositsioonilisele adhesioonimolekulile. Seega paikneb antigeeni äratundev
ala lingus ning vastav regioon määrab interaktsioonide korral adhesiooni tugevuse ja
afiinsuse. Samas on suurim geneetiline varieeruvus omane just lingule, mis seletab paljude
erinevate adhesioonivõimaluste esinemist ning adhesioonimolekulide suurt arvukust
vaatamata nende sarnasele struktuurile (Colman ja Filbin, 2006).
Raku adhesioonimolekulid on olulised rakkudevaheliste sidemete moodustumises närvikoes
ja väljaspool närvikude. Nende roll kerkib esile juba varajases embrüogeneesis, alates
neuraaltoru initsiatsioonist kuni täiskasvanud organismi rakkudevaheliste sidemete
fikseerimiseni. Närvikoes avaldub CAM funktsioon ka neuronite migratsioonis,
kasvukoonuste moodustumises ja väljakasvus, sünapsite stabiliseerimises ning närvirakkude
regeneratsioonis pärast vigastust. Rakkudevahelised interaktsioonid on määratud paljude
adhesioonimolekulide poolt, sealhulgas toimuvad nii rakk-rakk vahendatud kui ka rakkekstratsellulaarne
maatriks (ECM) vahendatud interaktsioonid. Rakkude käitumise koes
määravad enamasti mitmed faktorid, nende hulgas rohked adhesioonimolekulid raku pinnal
ning difuussed molekulid ekstratsellulaarses maatriksis. Närvisüsteemis esineb 3 peamist
CAMide alamgruppi: kadheriinid, integriinid ja IgCAMid. Kadheriinid ja IgCAMid loovad
rakk-rakk interaktsioone, samas kui integriinid interakteeruvad ECM komponentidega.
Adhesioonimolekulid erinevad seondumiseelistuse ja afiinsuse poolest ning seondumise
tüübilt. Tüübilt on võimalik eristada homo- ja heterofiilseid interaktsioone. IgLON
perekonnas on näidatud mõlemate seondumisviiside, nii homo- kui ka heterofiilsete
esinemine (Zhukareva ja Levitt, 1995; Gil jt., 1998; Marg jt., 1999; Lodge jt., 2000; Gil jt.,
2002). Seondumise käigus toimub signaalse transduktsiooniraja aktivatsioon, mille tulemus
5

on rakuline vastus. Erinevad seondumised ja seondumiste kombinatsioonid annavad rakule
edasi eluliselt vajalikku teavet keskkonna ja teiste rakkude kohta tema ümber ning kutsuvad
esile erinevaid rakulisi vastuseid.
Neuroni arengule on omane väljakasvude teke, dendriitide ja aksoni moodustumine. Akson
peab läbima pikki vahemaid närvisüsteemis, et jõuda märklaudrakuni. Aksoni väljakasvu
juhib lamenenud tipuga kasvukoonus, millele on omane CAM vahendatud adhessiivsete
kontaktide loomine. Kasvukoonus reageerib ekstratsellulaarses maatriksis esinevatele
difuussetele või fikseeritud molekulidele. Fikseeritud molekulid on CAMid, mis asuvad gliia,
teiste rakkude või vanemate aksonite pinnal. Aksonit juhtivad CAM interaktsioonid on
laialdased ja ei piirdu ühe molekuliga. Enamasti saab kasvukoonus palju erinevaid signaale
korraga, mille summeeritud tulem määrab kasvu või inhibitsiooni. CAMid liidavad oma
interaktsioonide tulemusena rakumembraane ja tagavad rakkude struktuurse paiknemise
teineteise suhtes. Raku küpsemisel CAMide siduvad omadused võimenduvad ning raku
asukoht fikseerub. Asukoht võib siiski dünaamiliselt aja jooksul muutuda. Raku membraanil
toimub pidev adhesiivsete kontaktide katkemine ja taasteke. Stabiilsete kontaktide
moodustumisel on oluline õigete adhesioonipartnerite ekspresseerumine vastasrakul. Sel juhul
tagavad raku membraanil õige partneri leidnud CAMid normaalse koestruktuuri tekke ja
säilimise. Vigastuste korral on võimalik regeneratsioon, kus omavad samuti olulist rolli CAM
interaktsioonid (Colman ja Filbin, 2006).
1.2 IgLON perekond
IgLON perekond koosneb neljast liikmest: LSAMP (Levitt jt., 1984), Neurotrimin /CEPU-1
(vastavalt roti ja kana ortoloogid) (Struyk jt., 1995; Spaltmann ja Brümmendorf, 1996),
OBCAM (opioid-binding cell adhesion molecule) (Schofield jt., 1989) ja Kilon/Neurotractin
(vastavalt roti ja kana ortoloogid) (Funatsu jt., 1999; Marg jt., 1999). Kõiki IgLON perekonna
liikmeid iseloomustab kolme Ig domeeni esinemine ning membraani külge kinnitumine GPI
(glükosüül-fosfatidüül-inositool) ankruga. Perekonna esindajad on tugevalt konserveerunud
IgCAMid, mis on seotud rakk-rakk vahendatud adhesiooniga. IgLONite konserveerumine on
kõrgeim Ig domeenides, näiteks OBCAMi ja Neurotrimini kolm Ig domeeni on 94% ulatuses
identsed. Perekonnasiseselt ulatub LSAMP homoloogia rotis 55 protsendini Neurotrimini ja
56 protsendini nii OBCAMi kui ka Kiloni korral. Roti ja inimese OBCAMi liikidevahelised
homoloogid on 98% ulatuses identsed. Lsamp korral ulatub ortoloogide identsus 94
6

protsendini. Perekonnasisene ja liikidevaheline kõrge konserveerumine viitab IgLON
perekonna olulisele konserveerunud funktsioonile. Kuid siiani pole põhjalikult näidatud,
milline oluline funktsioon on selle kõrge konserveerumise põhjus.
Küll on näidatud IgLON perekonna adhesioonimolekulide erinev ekspressioon arenevas ja
täiskasvanud organismis. OBCAMi esinemine on detekteeritav roti ajus embrüonaalse arengu
16. päeval (E16). Arengu käigus ekspresseerub OBCAM haistesibulas, suuraju koores,
hippokampuses, striaatumis, septumis, taalamuses, väikeaju koores, väikeaju tuumades,
ajutüve tuumades ja seljaajus. Seejuures esineb OBCAM ainult hallolluses. Täiskasvanud
rotis ekspressioonimuster muutub, esinedes peamiselt suuraju koores, hippokampuses,
vähemal määral haistesibulas ja vaheajus ning madal ekspressioon esineb väikeajus,
piklikajus ja seljaajus. Ekspressioon jaotub kahe isovormi vahel, millest levinum on 51-kDa
isovorm, ainult väikeajus ja haistesibulas esineb 46-kDa vorm. Täielikult diferentseerunud
hippokampuse ja kortikaalsetel neuronitel avaldub OBCAM rakukehal ja dendriitidel, kuid
mitte aksonite väljakasvudel.
LSAMP ekspresseerub peamiselt limbilises süsteemis, kuhu kuulub hippokampus, amügdala,
septum, limbiline koor, forniks ja taalamuse anterioorsed tuumad. LSAMP ekspressioon on
roti ajus detekteeritav embrüonaalse arengu 15. päeval (E15). Varajases embrüogeneesis
ekspresseerub LSAMP aksonite pinnal. Täiskasvanud isendis LSAMP ekspressioon aksonitel
puudub. Ekspressioon esineb hoopis postsünaptiliselt rakukehal ja dendriitidel. Kuna
postsünaptiliselt on LSAMP detekteeritav ainult rakukehal ja dendriitidel ning mitte enam
aksoni pinnal, leiab LSAMPi korral aset ilmselt funktsiooni osaline muutumine arengu
käigus.
Neurotrimin avaldub roti närvisüsteemis, sealhulgas seljaajus, dorsaaljuure ganglionis (DRG)
ja eesajus. Sünnihetkel (P0) avaldub haistesibulas, piriformses koores, keskajus, taalamuses,
hüpotaalamuses, hippokampuses, basaalganglionis ja kortikaalplaadil. Arengu käigus avaldub
müelineerimata aksonitel, kuid hilisem avaldumine domineerib sünaptilistes
ühenduskohtades.
Ka Kiloni avaldumine piirdub närvisüsteemiga ja on detekteeritav embrüonaalse arengu 16.
päeval (E16), millest alates ekspressioonitase kasvab. Arengu käigus avaldub suuraju koores,
ajutüves, hippokampuses ja vähesel määral väikeajus. Täiskasvanud rotis avaldub Kilon
peamiselt haistesibulas, suuraju koores, vaheajus, hippokampuses ja väikeajus ning esineb
antud regioonides neuronite rakukehal ja dendriitidel postsünaptiliselt (Lajtha jt., 2007).
7

IgLON perekonna adhesioonimolekulide suhteliselt suur sarnasus ning ekspressioonialade
kattumine võib osalt olla seletatav nende omavaheliste interaktsioonidega. On näidatud, et
Neurotrimin moodustab cis-homodimeere ja multimeere ning Neurotrimin kui ka LSAMP
loovad homofiilseid trans-interaktsioone. Samas interakteeruvad nad mõlemad ka
teineteisega trans-heterofiilselt (Zhukareva ja Levitt, 1995; Gil jt., 1998, 2002). Kilon
interakteerub nii homo- ja heterofiilselt OBCAMiga (Miyata jt., 2003). Neurotractin, Kiloni
kana ortoloog, interakteerub CEPU-1 ja LSAMP molekuliga. Näidatud on ka interaktsioone
OBCAMi ja CEPU-1 vahel kana mudelis, kus CEPU-1 esindab kanas Neurotrimini
homoloogi (Marg jt., 1999). Kana puhul näidati kõigi seni teadaolnud IgLON
perekonnaliikmete LSAMP, OBCAM ja CEPU-1 võimet moodustada homofiilseid
interaktsioone iseendaga (Lodge jt., 2000). Seega on näidatud, et IgLON perekonna liikmed
moodustavad nii homofiilseid kui ka heterofiilseid interaktsioone, mis siiski varieeruvad
stabiilsuselt (Zhukareva ja Levitt, 1995; Gil jt., 1998; Marg jt., 1999; Lodge jt., 2000; Gil jt.,
2002).
Hilisem uuring näitas IgLON perekonna liikmete võimet moodustada rakumembraani
lipiidiparvedel (lipid rafts) dimeere. Samuti mõned heterofiilsed interaktsioonid on
tugevamad kui homofiilsed ja IgLON perekonna liikmed võivad toimida
adhesioonimolekulidena heterofiilsete dimeeride korral. Kaks heterofiilset IgLONit
moodustavad funktsionaalse Digloni. Neljast IgLONist saab moodustada kuni 6 heterofiilset
Diglonit (Reed jt., 2004). Eelnevate uuringute kohaselt on IgLONitele omased ka homofiilsed
interaktsioonid (Gil jt., 1998; Lodge jt., 2000) ning ka homofiilsed dimeerid võivad
moodustuda. Kuid homofiilsete dimeeride moodustumine toimub väiksema afiinsusega ning
heterofiilse partneri lisamisel tekivad eelistatult heterofiilsed dimeerid ehk Diglonid. Diglonid
omavad funktsionaalset rolli neuroni väljakasvude inhibitsioonis ja ilmselt ka aktivatsioonis.
Kõrgema heterofiilse afiinsuse tõttu esinevad LSAMP ja OBCAM Diglonitena. Samas
CEPU-1 korral on täheldatud homofiilsete interaktsioonide domineerimist heterofiilsete üle
(Reed jt., 2004). Neurotrimin, närilise CEPU-1 ortoloog, moodustab membraanil
homodimeere (Struyk., 1995), kuid võib Lsamp 1b promootori ekspressiooni ulatuslikku
kattumise tõttu toimida ka heterofiilse dimeerina (Gil jt., 2002; Catania jt., 2008; füsioloogia
instituut, avaldamata andmed). LSAMP:OBCAM ja LSAMP:CEPU-1 dimeeride
moodustuvad kõrge afiinsusega. Võttes arvesse CEPU-1 ja Neurotrimini suhtelist sarnasust
võib ka Neurotrimin moodustada homo- ja heterofiilseid dimeere. Ka Kilon moodustab
heterodimeere (Marg jt., 1999; Miyata jt., 2003). LSAMPi, OBCAMi ja Kiloni korral on
8

heterofiilsed interaktsioonid dominantsed, samas kui CEPU-1 omab ka tugevaid homofiilseid
interaktsioone (Reed jt., 2004).
Joonis 1. Võimalike heterofiilsete dimeeride ehk Diglonite jaotus. Neli IgLONit moodustavad
kuus heterofiilset Diglonit (Reed jt., 2004).
IgLON perekonna täpne funktsioon on seni avastamata, kuid üha enam uuringuid omistab
IgLONitele võimaliku tuumor-supressori rolli (Chen jt., 2003; Ntougkos jt., 2005; Wang jt.,
2008; Yen jt., 2009). Hiljutine uuring rõhutas LSAMP rolli tuumor-supressorina neerus (Chen
jt., 2003) ning kogu IgLON perekonda on seostatud munasarja epiteeli vähiga. Vähi koes on
IgLONite ekspressioon vähenenud või puudub täiesti. Munasarja epiteeli vähi korral ilmneb
statistiliselt oluline positiivne korrelatsioon (p

Lsamp geenis on seostatud enesetapuga inimesel (Must jt., 2008) ning Lsamp geeni
ekspressiooni puudumine on seotud muutunud sotsiaalse ning ärevuskäitumisega Lsamp -/-
hiirtel (Innos jt., 2012). Lisaks assotseerusid polümorfismid Neurotrimini geenis
intelligentsusega (Pan jt., 2011). Kõrgelt konserveerunud IgLON perekonna
adhesioonimolekulid osalevad seniste uuringute alusel peamiselt kõrgemates
ajufunktsioonides, kuid võivad olla ka tuumor-supressorid.
1.3 LSAMP
Limbilise süsteemiga seotud membraanvalk on Lsamp geeni poolt kodeeritud 64- kuni 68-
kDa tugevalt glükosüleeritud molekul, mida iseloomustavad 3 immuunoglobuliini (Ig)
domeeni. LSAMP ekspresseerub enamasti limbilises süsteemis, kuhu kuuluvad hippokampus,
amügdala, septum, limbiline koor, forniks ja taalamuse anterioorsed tuumad (Levitt, 1984;
Cote jt., 1995). Varajases embrüogeneesis ekspresseerub LSAMP aksonite pinnal.
Täiskasvanud isendis LSAMP ekspressioon aksonitel puudub. Ekspressioon esineb
postsünaptiliselt ainult rakukehal ja dendriitidel (Cote jt., 1995). Rõhutada tuleb
ekspressioonimustri muutust arengu käigus. Ekspressiooni vahetumine aksonite pinnalt
rakukeha ja dendriitide pinnale võib olla tingitud funktsiooni muutumisest arengu käigus.
Lsamp geenil on näidatud kahe esimese eksoni 1a ja 1b olemasolu. Lisaks esineb Lsamp
geenil alternatiivne splaissimine, mille funktsioon on seni ebaselge, kuid võib olla seotud
valgu ekspressiooni regulatsiooniga, mõjutamata seejuures valgu funktsiooni (Pimenta ja
Levitt, 2004). LSAMPil pole küll lahustuvat isovormi näidatud, kuid Neurotrimini ja
Neurotrimini kana ortoloogi CEPU-1 puhul on olemas lisaks GPI ankruga vormile ka
lahustuv isovorm (Gil jt., 1998; Lodge jt., 2000) ning ka Kilon omab lahustuvat 2 Ig
domeeniga isovormi (Marg jt., 1999). LSAMPi puhul on ilmselt tegemist fikseeritud
adhesioonimolekuliga, samas kui Neurotrimin ja Kilon omavad ka regionaalset rolli, mis
avaldub lahustuva isovormi kaudu. LSAMP mõjutab rakk-rakk adhesiooni nii-öelda
kohalikult, mistõttu adhesioonipartner peab omama seondumisel kompetentsi. Näidatud on
IgLONite võimet perekonnasiseste homo- ja heterofiilsete interaktsioonide läbi kas
stimuleerida või inhibeerida neuriitide väljakasvu (Zhukareva ja Levitt, 1995; Spaltmann ja
Brümmendorf, 1996; Gil jt., 1998; Mann jt., 1998; Marg jt., 1999; Lodge jt., 2000; Gil jt.,
2002). LSAMP toimib ilmselt adhesiivsetes kontaktides heterofiilse Diglonina. Heterofiilsed
10

interaktsioonid on tunduvalt tugevamad kui homofiilsed ning LSAMP mõju avaldub seega
heterofiilsete Diglonite kaudu (Reed jt., 2004).
Joonis 2. LSAMP afiinsus IgLON perekonna adhesioonipartnerite suhtes (Reed jt., 2004).
Samas eeldab heterofiilsete Diglonite moodustumine perekonnasiseselt teatud kattuvusi
ekspressiooni mustris. Seda on näidatud kana arenevas embrüos. Enamasti esineb kaks või
enam IgLONit samal ajal kindlas koes. LSAMP ja CEPU-1 esinevad kana silma välimises
põimikkihis, samas LSAMP ja OBCAM esinevad sisemises põimikkihis (Lodge jt., 2000).
Need andmed sobituvad suurepäraselt heterogeensete Diglonite hüpoteesiga, kusjuures
välimises põimikkihis moodustuvad sel juhul CL-Diglonid (CEPU-1:LSAMP dimeerid), mis
interakteeruvad transheterofiilselt ja sisemises põimikkihis moodustuvad LO-Diglonid
(LSAMP:OBCAM dimeerid), mis samuti interakteeruvad transheterofiilselt. LSAMPi ja
OBCAMi korral esinevad heterofiilsed cis-interaktsioonid, mille tulemusena moodustunud
Diglonid interakteeruvad trans-heterofiilselt. Vastavad interaktsioonid on ka kõige tugevamad
LSAMP afiinsuselt. LSAMP ekspressiooni korral tuleb arvestada adhesioonipartnerite
esindatusega ajus. LSAMP omab tugevat afiinsust Neurotrimini/CEPU-1 ja OBCAMi
molekulide suhtes (Reed jt., 2004). Ka Kiloni korral on histokeemiliselt näidatud roti ajus
ekspressiooni mustrite kattumist. Seejuures kattus Lsampi ja Kiloni mRNA ekspressioon
täielikult vaheaju, keskaju ja ajusilla tuumades. Samuti on näidati ekspressiooni osalist
kattumist, mis eeldab teiste IgLONite osavõttu või Neurotrimin-Neurotrimin homofiilseid
interaktsioone (Bräuer jt., 2000). Kuna LSAMP homofiilsed interaktsioonid nii cis ja trans on
tunduvalt nõrgemad heterofiilsetest on võimalik, et LSAMP omab ühes piirkonnas ka mitut
adhesioonipartnerit. Samas kui LSAMP ekspressioon on madal, domineerivad ilmselt teiste
IgLONite vahelised interaktsioonid.
11

1.3.1 LSAMP ja närvisüsteemi talitluse häired
LSAMP omab arengus ja närvisüsteemi talitluses spetsiifilist funktsiooni ja avaldub limbilises
süsteemis (Pimenta ja Levitt, 2004). Limbilise süsteemi all mõistetakse aju kortikaalset ja
subkortikaalset osa, mis hõlmavad mitut omavahel funktsionaalselt seotud ajuosa. Nende seas
on olulisemad komponendid vöökäär, hippokampus, osa taalamusest, hüpotaalamus,
amügdala ehk mandelkeha, forniks, haistekoor ja neid siduvad juhteteed. Need ajuosad
vahendavad pikaajalist mälu, lõhnataju, emotsioone, mõnu- ja valutunde taju ning nendest
tulenevat käitumist. Limbiline süsteem on oluline motivatsiooni, emotsioonide ja mälu
kujunemisel ning kujundab emotsionaalset ja seksuaalkäitumist. Hüpotaalamus-hüpofüüs raja
kaudu avalduvad limbilise süsteemi mõjud somaatilises ja vegetatiivses närvisüsteemis.
Limbilist süsteemi struktuure on seostatud ärevusega. Samas ärevus on levinud depressiooni
korral ning esineb paanikahäirete, sotsiaalse foobia, obsessiiv-kompulsiivse käitumise ja
posttraumaatilise stressi korral (Clark jt., 2010).
Närvisüsteemi korrektne funktsioneerimine sõltub spetsiifiliste ühenduste moodustumisest
ning vastavate ühenduste loomisel osalevad paljud molekulid. Keerukad närvivõrgud saavad
moodustuda õigete adhesiivsete kontaktide korral. Sel juhul avaldub Lsamp roll koostöös
mitmete teiste molekulidega. Käesoleva hetkeni on näidatud LSAMPi interakteerumist teiste
IgLONitega. Koostöös omavad IgLONid bifunktsionaalset rolli, seda nii homo- ja
heterofiilselt. IgLONid nii stimuleerivad adhesiooni ja neuriitide kasvu kui ka inhibeerivad
(Zhukareva ja Levitt, 1995; Spaltmann ja Brümmendorf; 1996 Gil., 1998; Mann jt., 1998;
Marg jt., 1999; Lodge jt., 2000; Gil jt., 2002). Lsamp geeni regioonspetsiifiline avaldumine
niivõrd mitmekülgse struktuuri ja funktsiooniga ajuosas võib olla seotud inimese
neuropsühhiaatriliste haiguste ja neuroloogiliste kõrvalekallete esinemisega (Pimenta ja
Levitt, 2004).
12

Joonis 3. Limbiline süsteem inimese ajus. Limbilise süsteemi põhiosad on välja toodud
rohelisega (NCBI Bookself, Purves jt., 2001).
Lsamp seotust on näidatud sotsiaalse käitumisega hiirtel, samas Lsamp -/- hiirte korral esineb
normaalne ajustruktuuride anatoomia. Samuti ei erinenud Lsamp +/+ ja Lsamp -/- hiired
motoorsete võimete, lihasjõu, haiste ja mehaanilise taju, ega ka nägemise ja kuulmise poolest.
Ka õppimisvõimelt ei jäänud Lsamp -/- hiired metsiktüüpi hiirtele alla. Samas täheldati
Lsamp -/- hiirte muutunud sotsiaalset käitumist. Vurrude trimmimine, mis on oluline
sotsiaalse hierarhia kujunemisel, puudus täielikult Lsamp -/- hiirtel. Samasoolised
interaktsioonid olid Lsamp -/- hiirtel tugevalt häiritud, samas kui vastassoolised
13

interaktsioonid olid normaalsed. Selline käitumine lubab oletada Lsamp -/- hiirte
ebakompetentsust samasooliste liigikaaslastega lävimisel. Ebakompetentsust samasoolistes
suhetes kinnitas metsiktüüpi isaste hiirte tunduvalt agressiivsem käitumine. Näiteks ei
täheldatud Lsamp -/- hiirte korral ühtegi rünnakut puurikaaslaste vastu. Pluss-puuri testis
sisenesid Lsamp -/- hiired avatud õlgadele ettevaatamatult, mis näitab nende võimetust
hinnata ohte ja/või alanenud ärevust. Looduses langevad ettevaatamatud loomad enamasti
kiskja saagiks. Samuti näidati Lsamp -/- hiirtel tunduvalt suuremat liikuvusaktiivsust, mis on
samuti oluline kiskja saagiks langemisel. Katseseerias täheldati ka Lsamp -/- hiirte madalamat
motiveeritust põgeneda ning samas oli neid kergem puurist püüda. Üllatav oli hiirte
ujumiskiiruse erinevus, kus Lsamp -/- ujusid tunduvalt aeglasemalt ja nende puhul täheldati
vees hõljumist, mis viibimisel eluohtlikus seisundis viitab motivatsiooni puudumisele või
alanenud ärevusele. Eelnevast lähtuvalt on Lsamp võimalik roll seotud evolutsiooniliselt
jätkusuutliku lähenemisega uutele ja stressirohketele keskkondadele. Lsamp -/- hiirtel esineb
kohanemisraskusi uute ja stressirohkete olukordadega (Innos jt., 2012).
Innose (2012) poolt kirjeldatud käitumine omab paralleele Heinrich Klüveri ja Paul Bucy
poolt läbiviidud katse tulemustega. Heinrich Klüveri ja Paul Bucy sooritasid reesus ahvidega
mitmeid katseid, kus nad eemaldasid suure osa temporaalsagara mediaalsest osast, mistõttu
suur osa limbilisest süsteemist neil ahvidel puudus. Nende katse tulemusena esines ahvidel
kummaline käitumine, mida tuntakse Klüver-Bucy sündroomi nime all. Sel juhul esineb
visuaalne agnoosia, mille puhul ahvid ei tundnud ära objekte, kuigi nende silmanägemine oli
korras. Lisandus kummaline käitumine, mille puhul ahvid toppisid valimatult asju suhu, neil
esines hüperaktiivsus, hüperseksuaalsus ning märkimisväärne muutus sotsiaalses käitumises.
Ahvid olid metsikut päritolu ja polnud harjunud inimesega, nende käitumine oli enne
vägivaldne ja hirmunud kontaktis inimesega. Operatsioonijärgselt olid ahvid aga täiesti
taltunud ega näidanud inimese kohaloleku puhul ei hirmu ega viha. Samuti ei reageerinud
loomad presenteeritud maole, mis tervele loomale on tugevalt ärritav stiimul. Sarnane
sündroom esineb ka inimestel, kellel on bilateraalselt kahjustunud temporaalsagarad. Nendel
inimestel esineb samuti suurenenud isu ja kummalised oraalsed kombed ning seksuaalne
väärkäitumine. Hiljem selgus, et samane sündroom saadakse ka ainult amügdalade
eemaldamisel (NCBI Bookself, Purves jt., 2001). Oluline on märkida LSAMP avaldumine
amügdalas. LSAMP avaldub ka ülejäänud limbilises süsteemis ja limbilisest süsteemist
väljaspool. Ilmselt pole LSAMP roll erinev amügdalas ja ülejäänud ajus. Kuid ainuüksi
LSAMPi ekspressiooni häirumine amügdalas võib põhjustada võimalikke kõrvalekaldeid
käitumises.
14

1.4 Lsamp promootorid
Lsamp geen on ebatavaliselt suur, koosneb hiirel 11 eksonist ning jaotub üle 2,2 Mbp ala
(Pimenta ja Levitt, 2004). Lsamp geeni iseloomustab liikidevaheline tugev konserveerumine.
Inimese ja roti ortoloog omavad 94% DNA järjestuse homoloogiat ja märkimisväärset 99%
valgu järjestuse homoloogiat. Erineb 338 aminohappest vaid neli (Va155Leu, Ala91Ser,
Leul71Thr ja Phe332Leu). Nende nelja aminohappe erinemine valgu tertsiaarset struktuuri ei
muuda. Järjestuse analüüs toob välja signaalpeptiidi kodeeriva ala, mis vastutab valmiva
peptiidi toimetamise eest endoplasmaatilisse retiikulumi. Ilmneb ka GPI domeen, kus paikneb
valgu hüdrofoobset C-terminust kodeeriv ala koos kaheksa võimaliku glükosülatsiooni
saidiga. Järjestusest ilmneb kolme C2 Ig domeeni olemasolu ja märkimisväärne sarnasus
OBCAMi ning Neurotriminiga, vastavalt 55% ja 54% geenijärjestuse homoloogia põhjal
(Pimenta jt., 1996b).
Geen on veel ebaharilik, sest omab kahte esimest eksonit 1a ja 1b. 1a ja 1b eksonit eraldab
inimesel 1,6 Mbp intron, mis on geeni ebatavalise suuruse põhjus. Geeni ebatavaline struktuur
võib olla tingitud keerukast ekspressiooni regulatsiooni mehhanismist. Rotil esineb 1a´ ekson,
mis jääb 1,6 Mbp ala keskele ja jagab vastava ala kaheks introniks. Rotil osaleb 1a´ ekson
alternatiivses splaissimises. Geenil esineb alternatiivne splaissimine eksoni 7 ja 8 korral, mille
tulemusena lisandub või puudub 69-nukleotiidne ehk 23-aminohappeline insert. Vastava
inserdi funktsioon pole teada, kuid tegemist võib olla regulatoorse funktsiooniga. Geenil on
registreeritud kolm eri pikkuses transkripti 1,6; 3,3 ja 8.0 kb, samas on näidatud vaid üks
kodeeritav produkt. Suurte geenide puhul on nende konserveerumise põhjuseks regulatoorsed
alad 5´-UTR ja/või 3´-UTR regioonis ning intronitel. Seda on ka näidatud Ig superperekonna
puhul, kus L1 ja neurogranin CAMid sisaldavad esimeses intronis regulatoorseid elemente,
sealhulgas võimendusjärjestust (enhancer) ja vaigistajat (silencer). Antud juhul reguleerib
vastav mehhanism koespetsiifilist avaldumist, mis võib osutuda tõeseks ka Lsampi korral
(Kallunki jt., 1995, 1997, 1998; Edelman ja Jones, 1998; Pimenta ja Levitt, 2004). Samas
kahe promootori olemasolu võib tagada paindlikku ekspressiooni arenenud ja arenevas
organismis (Ayoubi ja Van De Ven, 1996).
Geeni struktuuris on liigiti erinevus, alternatiivsel 1a eksonil esineb närilise korral ka 1a´
lisaks avastatud 1b eksonile. Kuid 1a´ ekson näib vastutavat alternatiivse splaissimise eest
ainult rotil. Hiirel toimub signaalpeptiidi kodeerimine 1a ja 1a´. Inimesel paikneb 1a ja 1b
vahel peaaegu 1,6 Mbp intron ja signaalpeptiid kodeeritakse 1a ja 1b eksonite poolt. 69-
15

nukleotiidne signaaljärjestuse esimene osa paikneb 1a eksonil ja teine osa 1b eksoni lõpus.
Kui transkriptsioon algab 1a promootorilt, lisandub 1b eksonist signaalpeptiidi kodeeriv osa
aga ülejäänud 1b eksonist jääb transkriptist välja. Samas 1b promootori poolt kodeeritavas
transkriptis on vaid 1b lõpuosas olev osaline signaaljärjestus.
Närilise geenis paikneb vastavalt 1a ja 1a´, millele järgneb 1b, seejärel eksonid 2 kuni 9.
Inimesel 1a´ puudub ja on seega 10 eksonit. Eksonid 1a ja/või 1b kuni ekson 6 ja 9
kodeerivad Lsamp cDNAd. Esimene Ig domeen asub täielikult eksonis 2, teine Ig domeen
eksonis 3 ja 4 ning viimane kolmas Ig domeen asub eksonis 5 ja 6. Eksonite 3 ja 4 vahele jääb
179 kb intron ning eksonite 5 ja 6 vahele 0,5 kb intron. Eksonid 7 ja 8, vastavalt 12 ja 11
koodonit, alluvad alternatiivsele splassimisele, mistõttu lisandub või puudub 69-nukleotiidne
insert. Eksonis 9 paikneb valgu C-terminust kodeeriv ala ja 3´-UTR koos
polüadenülatsioonisaididga. Ekson 1a´ on oluline ainult närilisel, hiirel signaalpeptiidi
kodeerimisel ja rotil splassimisel. Inimesele on oluline 1a ja 1b eksonid, mis sisaldavad
sarnaselt närilistega mõlemad ühte 5´-UTR saiti ja ühte promootorit.
Joonis 4. Lsamp struktuur hiire (A), inimese (B) ja roti (C) genoomis (Pimenta ja Levitt,
2004).
Lsamp geen on inimese ja närilise vahel evolutsiooniliselt konserveerunud. Omab keerukat
geeni regulatsiooni mehhanismi, kuigi ekspresseeritav valk on sama ning lahustuva isovormi
esinemist pole näidatud. Regulatoorne mehhanism sisaldab kahte promootorit ja alternatiivset
splaissimist, mille käigus tekib teadaolevalt kuni kolm transkripti (1,6; 3,3 ja 8 kb) ning lisaks
omab geen ilmselt koespetsiifilisi regulatoorseid alasid (Pimenta ja Levitt, 2004). Arvestades
LSAMPi rolli neuronite adhesioonis võib paindlik regulatoorne kontroll olla hädavajalik
ekspresseerumisel eri kudedes arenenud kui ka arenevas organismis.
16

2. EKSPERIMENTAALOSA
2.1 Töö eesmärgid
1. Kvantitatiivse reaalaja-PCRiga määrata Lsamp promootorite 1a ja 1b ekspressioon
metsiktüüpi hiirte
A. organites
B. ajuosades, sealhulgas suuremas mahus ventraalses striaatumis ja temporaalsagaras
2. Võrrelda Lsamp ekspressiooni 1a ja 1b promootoritelt.
3. Hinnata promootorite erineva aktiivsuse suurust ning bioloogilist mõju.
4. Hinnata seoseid metsiktüüpi hiirte promootorite 1a ja 1b ekspressiooni ning käitumise
vahel.
17

2.2 Materjal ja metoodika
2.2.1 Katseloomad
Katseloomadena kasutati 129sv ja BL/6 tüüpi isaseid hiiri ning juhuslikult valitud 129sv ja
BL/6 isaseid hiiri organite korral. Katseloomad paljundati Tartu Ülikooli Arstiteaduskonna
vivaariumis ja genotüpiseeriti Tartu Ülikooli Arstiteaduskonna füsioloogia instituudis. Hiirte
geneetiline taust oli 129S6/SvEvTac (129sv) ja C57BL/6 (BL/6). Gruppe 1 ja 2 (tabel 1)
vaadeldi kui ühte ja nendega viidi läbi käitumiskatsed samal ajal samades tingimustes. Grupi
3 eesmärk oli kvantiteerida 1a ja 1b promootorite ekspressioon eri ajuosades edasiste
uuringute jaoks. Grupi 4 eesmärk oli pakkuda avaldatud kirjandusele kinnitust ja
lähtematerjali edasiste uuringute jaoks.
Tabel 1. Katseloomade jaotus gruppidesse.
Grupp Taust
Hiirte Käitumiskatse
arv
Eraldati
1. 129sv 16 + ventraalne striaatum, temporaalsagar
2. BL/6 15 + ventraalne striaatum, temporaalsagar
3. 129sv 4 ajusild, haistesibul, hippokampus, hüpofüüs,
keskaju, otsmikukoor, piklikaju, primaarne
somatosensoorne koor, seljaaju, septum,
taalamus, temporaalsagar, ventraalne
striaatum, väikeaju
4. juhuslikult
valitud BL/6
ja 129sv
2 kops, neer, maks, silm, süda, testis
Loomad olid katsete teostamise ajal vanuses 8 nädalat. Katseloomi hoiti puurides 7-9 kaupa,
iga katsegrupi hiired eraldi. Katseloomad elasid 12 h/12 h valge/pime tsüklis 22 o C juures,
valge tsükli algusega kell 7 hommikul. Hiirtele oli võimaldatud vaba juurdepääs granuleeritud
spetsiaaltoidule ja joogiveele tilgapudelist. Antud tööga seotud loomkatse viidi läbi valge
tsükli ajal kella 13:00 ja 19:00 vahel. Enne katse läbi viimist harjutati närilisi vähemalt tund
aega katseruumi tingimustega. Katse teostati Eesti Vabariigi Põllumajandusministeeriumi
poolt välja antud loa alusel (number 39, välja antud 2005). Kõik loomadega seotud
protseduurid olid heaks kiidetud Tartu Ülikooli Loomkatsete Eetika Komitee poolt.
18

2.2.2 Tõstetud pluss-puuri test
Tõstetud pluss-puuri testis (elevated plus-maze test) kasutatakse neljast õlast koosnevat nn
pluss-puuri, mille kaks õlga on avatud ja kaks suletud. Avatud õlgadel puuduvad seinad,
samas kui suletud õlad on kahelt küljelt ja ühes kinnises otsas ümbritsetud 14 cm kõrguse
seina poolt. Samuti on pluss-puur tõstetud 30 cm kõrgusele maapinnast. Plusspuuri õlgade
kandva pinna pikkus on 17,5 cm keskkoha suhtes ja laius 5 cm.
Katsesessioonid salvestati videolindile pluss-puuri kohale kinnitatud kaamera abil. Katse
alguses lisatakse näriline pluss-puuri keskele, näoga suletud õla suunas. Iga katselooma kohta
on ette nähtud standartne 5-minutiline sessioon (Lister, 1987). Seejärel pluss-puuri pind
puhastati 5% etanooli vesilahusega. Katseandmete töötlus toimus treenitud spetsialisti poolt
kogutud videomaterjali põhjal.
Katseandmete analüüsil mõõdeti: avatud õlgadele väljumiste arvu kordades, avatud õlgadel
veedetud aega sekundites, avatud ja suletud õlgade kogukülastusarvu kordades, avatud õlgade
ja kõigi õlgade külastuste suhet, avatud õlgadel aset leidnud pealangetamiste arvu kordades,
avatud õlgadel joonte ületamiste arvu kordades. Kõige olulisemad parameetrid ärevuse
hindamisel on avatud õlgadel veedetud aeg (time on open arms), avatud õlgadele väljumiste
arv kordades (open arm entries) ning avatud õlgade ja kõigi õlgade külastuste suhe
(open/closed arm entries ratio) (Lister, 1987).
2.2.3 Ajuosade ja organite prepareerimine
Katseloomad surmati tservikaalse disslokatsiooni läbi. Seejärel eemaldati pea keha küljest,
järgnes aju eraldamine koljust. Eemaldatud aju prepareeriti jääl, treenitud eksperdi poolt
eraldati vastavad struktuurid, mis on grupiti välja toodud tabelis 1. Organite eraldamine
toimus pea eemaldamise järgselt. Võimalusel eemaldati terviklik organ. Eraldatud
ajustruktuurid ja organid külmutati koheselt vedelas lämmastikus ning säilitati temperatuuril -
80 o C. Hiire aju prepareerimiseks vajalikud juhised saadi hiire aju atlasest (Franklin ja
Paxinos, 1997).
19

2.2.4 RNA eraldamine ja cDNA süntees
Hiire rakuline RNA eraldati organite ja ajuosade homogeniseerimisel. Homogeniseerimisel
kasutati Trizol® reagenti (Invitrogen) ning tootja juhiseid. Proovid homogeniseeriti esialgu
100 μl Trizol reagendis. Seejärel proovid uhmerdati ja lisati ülejäänud osa reagenti, kuni
soovitud 500 μl mahuni. Inkubeeriti toatemperatuuril 5 minutit ja lisati kloroform (Sigma-
Aldrich) ning raputati tuube 15 sekundit. Seejärel inkubeeriti veel 2 minutit ja tsentrifuugiti
eeljahutatud tsentrifuugis (Eppendorf 5810 R) 12 000 rpm 15 min 4 o C juures. RNAd sisaldav
vesifaas tõsteti ümber uude eppendorffi ja lisati 250 μl isopropanooli (Naxo BioTop) RNA
sadestamiseks. Proovid segati ja inkubeeriti 10 minutit toatemperatuuril ja tsentrifuugiti
12 000 rpm 10 min 4 o C juures. Järgnevalt isopropanool eemaldati ning RNA sadet pesti 1 ml
75% etanooliga. Proovid tsentrifuugiti viimast korda 7500 rpm 10 min 4 o C juures. Etanool
eemaldati ning RNA sade suspendeeriti üles 50 μl vees. RNA konsentratsioonid mõõdeti
vortexi järgselt NanoDrop ND-1000 spektrofotomeetril (NanoDrop Technologies).
cDNA sünteesil kasutati SuperScript III pöördtranskriptaasi (Invitrogen) ning oligo dT 18
oligonukleotiide vastavalt tootja juhendile. 20 μl reaktsiooni kohta võeti 2 µg, 1 μl (500μg/ml)
oligo(dT) 18 praimerit (Invitrogen) ja 1 µl 10 mM dNTP segu (Fermentas). Praimerite
seondumisel inkubeeriti proove 5 min 65 o C juures. Seejärel tõsteti tuubid reaktsiooni
peatamiseks 1 min jääle. cDNA sünteesiks lisati proovidele 4 µl 5X First-Strand Buffer [250
mM Tris-HCl (pH 8,3 toatemperatuuril), 375 mM KCl, 15 mM MgCl], 1 µl 0.1 M DTT, 1,5
µl H 2 O ja 1,5 µl SuperScript III pöördtranskriptaasi (200 U/µl). Proove inkubeeriti 60 min
50 o C juures. Seejärel peatati reaktsioon hoides katsuteid 15 min 70 o C juures. Sünteesitud
cDNA proovid säilitati -80 o C juures.
2.2.5 Reaalaja-PCR
Praimerite selektsioon leidis aset Primer3 tarkvara vahendusel. Parimad praimerid testiti
kontrollides amplikonide spetsiifilisust geelelektroforeesil, et kinnitada nende efektiivsus ja
spetsiifilisus, seejärel testiti valitud praimereid ka reaalaja-PCR (qRT-PCR)reaktsioonis.
HPRT koduhoidja praimerid valiti eelnevalt läbiviidud katsete põhjal. Valitud praimerid on
välja toodud alljärgnevas tabelis 2. Praimerite paigutus Lsamp geenil on esitatud alljärgneval
joonisel 5. Lsamp eksonite 1a ja 1b korral kasutati universaalset sondi ja universaalset reverse
praimerit. Mõlemal juhul erines forward praimer. Praimeri disaini käigus valiti forward
praimerid nii, et tekkiksid ühepikad transkriptid.
20

Tabel 2. Reaalaja-PCRi praimerid.
Oligo Forward Reverse Sond
5’-GCA TTT TGG
5’-TTC TTG TCT
5’-FAM-AAC CGA GGC
Lsamp 1a
AAC CAG CCT CCT
TCT ACC ACA
ACG GAC AAC-NFQ-MGB-
G-3’
CAC CTG-3’
3’
Lsamp 1b
5’-CGA TCG GAA
ACA GTT GCC GC-3’
5’-TTC TTG TCT
TCT ACC ACA
CAC CTG-3’
5’-FAM-AAC CGA GGC
ACG GAC AAC-NFQ-MGB-
3’
HPRT
5’-GCA GTA CAG
CCC CAA AAT GG-3’
5’-AAC AAA GTC
TGG CCT GTA
TCC AA-3’
5’-VIC-AAG CTT GCT GGT
GAA AAG GAC CTC TCG-
TAMRA-3’
Joonis 5. Lsamp geeni transkriptide varieeruv ja universaalne osa. Lsamp 1a ja 1b forward
praimerite ja universaalse reverse praimeri paigutus.
Lsamp transkriptide tase kvantiteeriti reaalaja-PCRi reaktsioonis. 1a, 1b ja HPRT reaktsioonid
viidi läbi eraldi korduste (singleplex) kujul. Kõik reaktsioonid viidi läbi TaqMan®
geeniekspressiooni seguga 10X PCR Buffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl] ja
TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) reagendiga. Kvantitatiivne
reaalaja-PCR viidi läbi ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems)
ja ABI Prism 7900 SDS 2.4.2 tarkvara vahendusel. Reaktsiooni maht oli 10 µl ja igast
proovist (1a, 1b ja HPRT) villiti neli kordust. Lsampi transkriptide ekspressiooni tase mõõdeti
FAM-märgistatud MGB-sondi kasutades ja standardiseeriti koduhoidja geeni HPRT VIC-
21

TAMRA sondi suhtes. HPRT efektiivsus ja stabiilsus on referentsgeenina on eelnevalt
tõestatud (Raud jt., 2009). Andmed analüüsiti ja teisendati 2 -∆CT kujule (Livak ja Schmittgen,
2001).
2.2.6 Andmete statistiline analüüs
Reaalaja-PCRi andmete statistiline analüüs viidi läbi paardumata Studenti T-testiga.
Tulemused väljendati keskmiste väärtustena. Pluss-puuri käitumisandmeid analüüsiti
Windowsil põhineva Statistica 8 tarkvaraga. Korrelatsioonianalüüs promootorite
ekspressiooni andmete ja käitumisandmetega viidi läbi mitteparameetrilise sõltumatute
rühmade Spearmani astak korrelatsiooni testiga.
22

2.3 Töö tulemused ja arutelu
2.3.1 Reaalaja PCRi tulemused
Reaalaja-PCRi abil tuvastati mõlema Lsamp geeni promootori 1a ja 1b transkriptide
ekspressioon ajusillas, haistesibulas, hippokampuses, hüpofüüsis, keskajus, otsmikukoores,
piklikajus, primaarses somatosensoorses koores, seljaajus, septumis, taalamuses,
temporaalsagaras, ventraalses striaatumis ja väikeajus. Viies ajuosas ajusillas, haistesibulas,
primaarses somatosensoorses koores, ventraalses striaatumis ja väikeajus on promootori 1b
transkripti osakaal võrreldes 1a transkriptiga suurem, samas kui ülejäänud kaheksas ajuosas
hippokampuses, hüpofüüsis, keskajus, otsmikukoores, piklikajus, septumis, taalamuses,
temporaalsagaras esineb 1a transkripti rohkem. Märkimisväärsed erinevused 1a ja 1b
promootorite ekspressioonis tulevad välja kuue ajuosa hippokampuse, temporaalsagara,
piklikaju, väikeaju, haistesibula ja primaarse somatosensoorse koore korral. Hippokampuse,
temporaalsagara ja piklikaju korral on 1a promootori ekspressioon suurem, vastavalt 2,6; 1,9
ja 1,6 korda. Samas 1b promootori ekspressioon on kõrgem väikeaju, haistesibula ja
primaarse somatosensoorse koore korral, vastavalt 2,1; 1,7 ja 1,3 korda. Peaaegu võrdne suhe
promootorite ekspressioonis esineb viie ajuosa hüpofüüsi, keskaju, seljaaju, taalamuse ja
ventraalse striaatumi korral. Mõne võrra erineva ekspressioonisuhtega on otsmikukoor,
septum ja ajusild. Otsmikukoore ja septumi korral esineb 1,2 kordne 1a transkripti ülekaal,
samas ajusilla korral 1,2 kordne 1b transkripti ülekaal. Lisas on välja toodud joonis 6, kus
vastavad andmed on esitatud 1a promootori ekspressioonitaseme järgi reastatuna.
Organitest õnnestus Lsamp ekspressioon kvantiteerida silmas ja südames (n=3). Silma korral
selgub äärmiselt kõrge (6,6 kordne) 1a promootori ja 1b promootori transkripti suhe. Südames
avaldub ainult 1b promootori transkript. Käesolevas töös selgus, et enamikes hiire organites
on Lsamp ekspressiooni tase liiga madal, et seda oleks võimalik reaalaja-PCRi kasutades
kvantiteerida. Siiski esines organites teatud amplifikatsioon, kuid kõverate kuju ja kvaliteet ei
võimaldanud ekspressioonitaset kvantiteerida. Reaalaja-PCRi andmetest selgus, et testises ja
neerus esineb ainult 1b transkript, kopsus 1b ja õrnalt ka 1a. Maksa puhul ilmnes üks 1a aga
1b puudus. Kõik eelnevad tulemused kaasa arvatud silm ja süda kinnitati geelelektroforeesiga.
Reaalaja-PCR õnnestus grupi 1 ja grupi 2 korral. 129sv ja BL/6 metsiktüüpi liinide võrdlus ei
näidanud statistiliselt olulisi erinevusi kahepoolse sarnase hajuvusega T-testi korral.
Ventraalse striaatumi 1a promootorite (p=0,74) ja 1b promootorite (p=0,86) võrdlus jäi
statistiliselt ebaoluliseks metsiktüüpi liinide vahelises võrdluses. Samuti jäi temporaalsagara
korral 1a promootori (p=0,49) ja 1b promootori (p=0,56) ekspressioonitasemete võrdlus
23

ebaoluliseks metsiktüüpi liinide vahel. Tulemustest lähtuvalt selgub, et 129sv ja BL/6
metsiktüüpi liinid ei oma 1a ja 1b promootorite ekspressioonis statistiliselt olulist erinevust.
Andmetest on võimalik tuvastada peaaegu võrdne promootorite 1a ja 1b ekspressioonisuhe
ventraalses striaatumis, mis 129sv liini korral on 0,99 ja BL/6 korral 0,88 kordne. Samas
temporaalsagaras on 1a ja 1b promootorite suhe 1a promootori kasuks, vastavalt 129sv korral
1,36 ja BL/6 korral 1,41 kordne. Märkimist väärib ka standardhälvete hajuvus. 1a promootori
ekspressioon hajub 1,9 korda rohkem temporaalsagaras ja 1,3 korda rohkem ventraalses
striaatumis (n=31).
Kuna 129sv ja BL/6 liini 1a ja 1b promootori ekspressioonitasemed ei oma statistiliselt olulist
erinevust, võib neid vaadelda ka ühiste gruppidena eristades ventraalse striaatumi
(n=15+16=31) 1a ja 1b promootoreid ja temporaalsagara (n=15+16=31) 1a ja 1b
promootoreid. Kui võrrelda 1a ja 1b promootori ekspressiooni kahepoolse sarnase hajuvuse
T-testiga selgub, et 1a ja 1b promootorite variatsioon pole statistiliselt oluline (p=0,66)
ventraalse striaatumi korral. Küll aga selgub temporaalsagaras promootorite 1a ja 1b
ekspressiooni väga oluline statistiline erinevus (p0,05).
129sv grupis esines temporaalsagaras 1a promootori ja 1b promootori ekspressioonitaseme
vahel tugev korrelatsioon (r=0,89; p

tingitud 129sv tüüpi hiirte vähesest aktiivsusest, mida on ka enne näidatud (Abramov jt.,
2008). BL/6 tüüpi hiired on tunduvalt aktiivsemad ja neid on ka raskem puurist tabada.
BL/6 hiirte 1a promootori ja 1b promootori ekspressiooni vahel esineb statistiliselt oluline
positiivne korrelatsioon temporaalsagaras (r=0,7; p

esinemist (Pimenta ja Levitt, 2004). Saadud üldekspressioon kasvab seljaaju-hippokampus
suunas ja seejärel langeb taas somatosensoorse koore suunas. Üldekspressiooni järgi on
Lsamp transkripte enim just hippokampuses, väikeajus, temporaalsagaras ja keskajus. Sealt
edasi toimub kaudaalses suunas üldekspressiooni vähenemine: taalamus, hüpofüüs ja ajusild
ning vähemal määral piklikaju ja seljaaju. Samas väheneb ekspresioon ka pealae suunas.
Lsamp transkripte esineb vähem ventraalses striaatumis ja veelgi vähem somatosensoorses
koores.
Lsamp geenil on kirjeldatud 1,6 Mbp intron, mis võib omada koespetsiifilisi regulatoorseid
motiive. Sel juhul on võimalik Lsamp geeni promootorite erinev ekspresseerumine eri aju
struktuurides, mis seletaks ka saadud katse tulemusi. Üldekspressiooni kasv hippokampuse
suunal on tingitud enamuses 1a promootori ekspressiooni suurenemisest. Seega 1a
promootorit reguleerib üks või mitu transkriptsioonifaktorit, mis on limbilise süsteemi
kesksed. Samas väikeajus kasvab üldine transkriptsiooni tase 1b promootori arvelt. 1b
promootor domineerib ka organites. Seega 1b promootorit mõjutab üks või mitu
transkriptsioonifaktorit, mis on väikeaju kesksed ja peaksid esinema ka organites. Selline
kahe promootoriga koespetsiifiline transkriptsiooni regulatsioon on väga paindlik ja
võimaldab struktuuriti kasutada erinevaid transkriptsioonifaktoreid ekspressiooni kontrollis.
Organid ei pakkunud täies ulatuses kvantitatiivseid tulemusi, mis on tingitud väga madalast
ekspressioonitasemest. Testis, neer, maks ja kops jäid seetõttu kvantiteerimata. Õnnestus
kvantiteerida südame ja silma ekspressioon. Südames selgus ainult 1b promootori transkripti
avaldumine. 1b promootori transkripti esines südames 24 korda vähem kui ajuosade korral
keskmiselt ja 74 korda vähem kui hippokampuses keskmiselt. Silmas on vastavad näitajad
marginaalsemad 1a promootori korral on transkriptsioon 1,4 korda väiksem ja 1b promootori
korral 8 korda väiksem kui ajustruktuurides keskmiselt. Samas silmas on 1a ekspressioon 6,6
korda kõrgem kui 1b promootoril. Silma korral saab veenvalt näidata, et 1a ja 1b promootorit
reguleeritakse erinevate transkriptsioonifaktorite või mehhanismide poolt. Samas tagatakse ka
1b promootori madal ekspressiooni tase südames ja kõrge eksprssiooni tase väikeajus.
Testises ja neerus esineb 1b promootori transkript, samas maksas 1a ja kopsu puhul mõlemad,
kuigi 1b tugevamalt. Eelnevalt on seostatud LSAMPi ekspressiooni neeruvähiga (Chen jt.,
2003) ja saadud tulemuste põhjal võib eeldada, et neeru korral avaldub LSAMP tuumorsupressori
roll 1b promootori kaudu. Lsamp promootorite ekspressiooni avaldumine organites
viitab veelkord koespetsiifilisele ekspressioonile ja vastavate regulatoorsete alade olemasolule
geenis. Regulatoorse rolliga on seostatud esimest intronit inimesel ja 1 ja 2 intronit närilisel
26

(Pimenta ja Levitt, 2004). Positiivne IgLONite ekspressiooni korrelatsioon (p

KOKKUVÕTE
Käesoleva töö eesmärk oli kvantiteerida Lsamp promootorite ekspressioon metsikut tüüpi
hiire ajus. Välja valiti 14 ajuosa, mis kvantiteeriti reaalaja-PCRi kasutades. Kvantiteeriti ka
kahe organi ekspressioon ja nelja organi korral saadi mitte kvantitatiivsed tulemused. Läbi
viidud pluss-puuri käitumiskatse andmed korreleeriti temporaalsagara ja ventraalse striaatumi
promootorite—1a ja 1b—ekspressiooni tasemega. Töös arutleti Lsamp geeni promootorite
ekspressiooni varieeruvuse üle eri aju osades. Arutelu käigus püüti seletada Lsamp geeni
keerukat struktuuri ja funktsiooni kehas.
Töö tulemused saab kokku võtta järgnevalt
Lsamp geen ekspresseerub: primaarses somatosensoorses koores, otsmikukoores,
ventraalses striaatumis, taalamuses, hüpofüüsis, hippokampuses, septumis,
haistesibulas, temporaalsagaras, keskajus, ajusillas, väikeajus, piklikajus, seljaajus,
silmas, südames, kopsus, maksas, neerus ja testises.
Eri aju osades on Lsamp promootorite aktiivsus erinev ja esineb erinev ekspresiooni
suhe promootorite vahel
Inimesel võib Lsamp geeni esimene ning närilisel esimene ja teine intron sisaldada
regulatoorseid motiive, mis tagavad koespetsiifilise avaldumise.
Varem teada olnud Lsamp geeni tuumoreid mahasuruv toime avaldub väga madalas
konsentratsioonis.
Lsamp geen omab olulist rolli neuronite adhesioonis ja ilmselt ka vähkkasvajate
inhibitsioonis. Geeni järjestus ja struktuur on kõrgelt konserveerunud intronites, mis viitab
keerukale regulatoorsele kontrollile. Samas kahe promootori esinemine tagab paindliku
ekspressiooni arenevas ja arenenud organismis. LSAMP roll avaldub koostöös teiste
IgLONitega heterofiilsete dimeeride ehk Diglonite kujul. Edasised uuringud peaksid
keskenduma IgLONite kvantiteerimisele eri aju osades ja organites. Samuti on vaja uurida
lähemalt Lsamp geeni võimalikku tuumor-supressori rolli.
28

Quantitative analysis of Lsamp promoters—1a and 1b
Taavi Vanaveski
Summary
Various cells of the body are kept to together by cell-cell interactions. Some of these
interactions are constant and some short-lived. Long-termed constant interactions cause cells
to adhere and by doing so create the bases of tissue. Current work emphasizes on one of these
cell adhesion molecules of the Ig superfamily named Lsamp. Lsamp gene codes for limbicsystem
associated membrane protein or LSAMP and interacts heterophilically with other
IgLONs. IgLONs are a family of four CAMs, LSAMP was the first member to be identified,
followed by opioid-binding CAM (OBCAM), Neurotrimin (NTM)/CEPU-1 and
Kilon/Neurotractin.
IgLON family members are found in cell surface cholesterol-rich lipid rafts. IgLONs function
predominantly as subunits of heterodimeric proteins named Diglons. Four IgLONs can form
up to six Diglons. Diglons are believed to modulate neurite outgrowth. Recent experiments
report that IgLONs are expressed beyond the nervous system and may have potential roles
beyond the development of the nervous system to include development of other tissues and
organs, and oncogenesis.
In current work Lsamp gene expression was examined by quantitative real-time and both
exons where amplified separately. In this approach two forward primers were used, one for 1a
exon and another for 1b exon. Universal reverse primer was placed on the junction of exons
1a and 1b, on the universal part of the transcript. Real-time results were analysed and
converted to 2 -∆CT . For additional data elevated plus-maze test was performed preceding realtime
PCR.
The expression of temporal lobe and ventral striatum were viewed in correlation with elevated
plus-maze test results. Data showed that 1b promoter of temporal lobe is associated with
anxiety behaviour and 1a promoter of ventral striatum is associated with risk-taking
behaviour. Real-time PCR results of different brain structures showed that Lsamp is not
limbic system specific and expression is also found in organs. Though expression in organs is
mostly too low for quantitative approach and both promoters are not always expressed.
29

The results of current work can be summarized as follows
Lsamp expression can be detected in primary somatosensory cortex, prefrontal
neocortex , ventral striatum, thalamus, hypophysis, hippocampus, septum, olfactory
bulb, temporal lobe, midbrain, pons, cerebellum, medulla, spinal cord, eye, heart,
lung, liver, kidney and testicle.
Expression of Lsamp promoters differs in structures of the brain and organs.
Human first and rats first and second intron may be associated with tissue-spetsific
regulation of Lsamp gene.
Previously reported Lsamp role as tumour-suppressor in organs may have impact in
low concentrations.
Lsamp gene has important role in axon guidance and may also be tumour-supressor. Gene is
highly conserved among species and has very complicated regulation. Two promoters assure
constant expression in developing and adult organism. LSAMP function manifests in cooperation
with other IgLONs as hydrophilic dimers known as Diglons. Future studies should
review IgLON expression in body and reveal Diglon formation. It is also imperative to reveal
IgLONs possible role as tumour-suppressors.
30

KASUTATUD KIRJANDUS
Kasutatud artiklid
1. Abramov, U., Puussaar, T., Raud, S., Kurrikoff, K., Vasar, E. (2008). Behavioural
differences between C57BL/6 and 129S6/SvEv strains are reinforced by enviromental
enrichment. Neuroscience Letters 443: 223-227.
2. Ayoubi, A.T., ja Van De Ven, J.W. (1996). Regulation of gene expression by
alternative promoters. FASEB journal 10: 453–460.
3. Bräuer, A.U., Savaskan, N.E., Plaschke, M., Prehn, S., Ninnemann, O., Nitsch, R,.
(2000). IG-Molecule Kilon Shows Differential Expression Pattern From LAMP in the
Developing and Adult Rat Hippocampus. Hippocampus 10: 632– 644.
4. Catania, E.H., Pimenta, A., Levitt, P. (2008). Genetic deletion of Lsamp causes
exaggerated behavioral activation in novel environments. Behavioural brain research
188: 380-390.
5. Chen, J., Lui, W.O., Vos, M.D., Clark, J. G., Takahashi, M., Schoumans, J., Khoo, K.,
S., Petillo, D., Lavery, T., Sugimura, J., Astuti, D., Zhang, C., Kagawa, S., Maher,
R.E., Larsson, C., Alberts, S.A., Kanayama, H., Teh, T.B. (2003). The t(1;3)
breakpoint-spanning genes LSAMP and NORE1 are involved in clear cell renal cell
carcinomas. Cancer Cell 4: 405-413.
6. Cote, P.Y., Levitt, P., Parent, A. (1995). Distribution of limbic system-associated
membrane protein immunoreactivity in primate basal ganglia. Neuroscience 69: 71–
81.
7. Funatsu, N., Miyata, S., Kumanogoh, H., Shigeta, M., Hamada, K., Endo, Y., Sokawa,
Y., Maekawa, S. (1999). Characterization of a novel rat brain
glycosylphosphatidylinositol-anchored protein (Kilon), a member of the IgLON cell
adhesion molecule family. Journal of chemical biology 274: 8224-8230.
8. Edelman, G.M. ja Jones, F.S. (1998). Gene regulation of cell adhesion: a key step in
neural morphogenesis. Brain research reviews 26: 337–352.
9. Gil, D.O., Zanazzi, G., Struyk, F.A., Salzer, L.J. (1998). Neurotrimin mediates
bifunctional effects on neurite outgrowth via homophilic and heterophilic interactions.
The Journal of Neuroscience 18(22): 9312–9325.
10. Gil, O.D., Zhang, L., Chen, S., Ren, Y.Q., Pimenta, A., Zanazzi, G., Hillman, D.,
Levitt, P., Salzer, J.L. (2002). Complementary expression and heterophilic interactions
between IgLON family members Neurotrimin and LAMP. Journal of Neurobiology
51: 190-204.
31

11. Innos, J., Philips, M.A., Raud, S., Lilleväli, K., Kõks, S., Vasar, E. (2012). Deletion of
the Lsamp gene lowers sensitivity to stressful environmental manipulations in mice.
Behavioural brain research 228(1): 74-81.
12. Kallunki, P., Edelman, M.G., Jones, S.F. (1998). The neural restrictive silencer
element can act as both a repressor and enhancer of L1 cell adhesion molecule gene
expression during postnatal development. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 95: 3233–3238.
13. Kallunki, P., Edelman, M.G., Jones, S.F. Tissue-specific expression of the L1 cell
adhesion molecule is modulated by the neural restrictive silencer element. The
journal of cell biology 138 (1997) 1343–1354.
14. Kallunki, P., Jenkinson, S., Edelman, M.G., Jones, S.F., Waterston, H.R., Lindblad-
Toh, K., Birney. (1995). Silencer elements modulate the expression of the gene for the
neuron–glia–cell adhesion molecule Ng-CAM. Journal of chemical biology 270:
21291–21298.
15. Levitt, P. (1984). A monoclonal antibody to limbic system neurons. Science 223: 299–
301.
16. Lister, R. G. (1987). The use of plus-maze test to measure anxiety in the mouse.
Psychopharmaclogy 92(2): 180-185.
17. Livak, K.J. ja Schmittgen T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using
rel-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(CT)) Method. Methods 25: 402-
408.
18. Lodge, A.P., Howard, M.R., McNamee, C.J., Moss, D.J. (2000). Co-localisation,
heterophilic interactions and regulated expression of IgLON family proteins in the
chick nervous system. Molecular brain research 82: 84-94.
19. Mann, F., Zhukareva, V., Pimenta, A., Levitt, P., Bolz, J. (1998). Membrane
associated molecules guide limbic and non-limbic thalamocortical projections. Journal
of Neuroscience 18: 9409-9419.
20. Marg, A., Sirim, P., Spaltmann, F., Plagge, A., Kauselmann, G., Buck, F., Rathjen, F.
G., Brummendorf, T. (1999). Neurotractin, a novel neurite outgrowth-promoting Iglike
protein that interacts with CEPU-1 and LAMP. The journal of cell biology 145:
865-876.
21. Miyata, S., Matsumoto, N., Taguchi, K., Akagi, A., Iino, T., Funatsu, N., Maekawa, S.
(2003). Biochemical and ultrastructural analyses of IgLON cell adhesion molecules,
Kilon and OBCAM in the rat brain. Neuroscience 117: 645-658.
32

22. Must, A., Tasa, G., Lang, A., Vasar, E., Kõks, S., Maron, E., Väli, M. (2008).
Association of limbic system-associated membrane protein (LSAMP) to male
completed suicide. Medical Genetics 9: 34.
23. Ntougkos, E., Rush, R., Scott, D., Frankenberg, T., Gabra, H., Smyth, J.F., Sellar,
G.C. (2005). IgLON family in epithelial ovarian cancer: expression profiles and
clinicopathologic correlates. Clinical cancer research 15;11(16): 5764-8.
24. Pan, Y., Wang, K.-S., Aragam, N. (2011). NTM and NR3C2 polymorphisms
influencing intelligence: Family-based association studies. Progress in Neuro-
Psychopharmacology & Biological Psychiatry 35: 154–160.
25. Pimenta, A.F. ja Levitt, P. (2004). Characterization of the genomic structure of the
mouse limbic system-associated membrane protein (Lsamp) gene. Genomics 83: 790–
801.
26. Pimenta, A.F., Fischer, I., Levitt, P. (1996b). cDNA cloning and structural analysis of
the human limbic-system-associated membrane protein (LAMP). Gene 170: 189– 195.
27. Pimenta, A.F., Reinoso, B.S., Levitt, P. (1996a). Expression of the mRNAs encoding
the limbic system-associated membrane protein (LAMP): II. Fetal rat brain. The
Journal of Comparative Neurology. 375: 289– 302.
28. Raud, S., Sütt, S., Luuk, H., Plaas, M., Innos, J., Kõks, S., Vasar, E. (2009). Relation
between increased anxiety and reduced expression of alpha1 and alpha2 subunits of
GABA A receptors in Wsf1-deficient mice. Neuroscience Letters 460: 138-142.
29. Reed, J., McNamee, C., Rackstraw, S., Jenkins, J., Moss, D. (2004). Diglons are
heterodimeric proteins composed of IgLON subunits, and Diglon-CO inhibits neurite
outgrowth from cerebellar granule cells. Journal of Cell Science 117: 3961-3973.
30. Reinoso, B.S., Pimenta, A.F., Levitt, P. (1996). Expression of the mRNAs encoding
the limbic system-associated membrane protein (LAMP): I. Adult rat brain. The
Journal of Comparative Neurology. 375: 274–288.
31. Schofield, P.R., McFarland, K.C., Hayflick, J.S., Wilcox, J.N., Cho, T.M., Roy, S.,
Lee, N.M., Loh, H.H., Seeburg, P.H. (1989). Molecular characterization of a new
immunoglobulin superfamily protein with potential roles in opioid binding and cell
contact. The EMBO journal 8: 489-495.
32. Spaltmann F. ja Brümmendorf T. (1996). CEPU-1, a novel immunoglobulin
superfamily molecule, is expressed by developing crebellar Purkinje cells. The
Journal of Neuroscience 76(5):1770-1779.
33

33. Struyk, A.F., Canoll, P.D., Wolfgang, M.J., Rosen, C.L., Deustachio, P., Salzer, J.L.
(1995). Cloning of Neurotrimin defines a new subfamily of differentially expressed
neural cell-adhesion molecules. The Journal of Neuroscience 15: 2141-2156.
34. Zhang, Y., Wang, R., Song, H., Huang, G., Yi, J., Zheng, Y., Wang, J., Chen, L.
(2011). Methylation of multiple genes as a candidate biomarker in non-small cell.
Cancer Letters 303: 21–28.
35. Zhukareva, V. ja Levitt, P. (1995). The limbic system-associated membrane-protein
(LAMP) selectively mediates interactions with specific central neuron populations.
Development 121: 1161-1172.
36. Wang, L., Hauser, R.E., Shah, H.S., Seo, D., Sivashanmugam, P., Exum, T.S.,
Gregory, G.S., Granger, B.C., Haines, L.J., Jones, H.J.C., Crossman, D., Haynes, C.,
Kraus, E.W., Freedman, J.N., Pericak-Vance, A.M., Goldschmidt-Clermont, J.P.,
Vance, M.J. (2008). Polymorphisms of the Tumor Suppressor Gene LSAMP are
Associated with Left Main Coronary Artery Disease. Annals of Human Genetics 72:
443–453.
37. Yen, C.-C., Chen, W.-M., Chen, T.-H., Chen, Y.-K. W., Chen, C.-H., P., Chiou, H.-J.,
Hung, G.-Y., Wu, H. H.-T., Wei, C.-J., Shiau, C.-Y., Wu, Y.-C., Chao, T.-C., Tzeng,
C.-H., Chen, P., M., Lin, C.-H., Chen, Y.-J., Fletcher A.J. (2009). Identification of
chromosomal aberrations associated with disease progression and a novel 3q13.31
deletion involving LSAMPgene in osteosarcoma. International journal of oncology
35: 775-788.
Kasutatud raamatud
1. Abel Lajtha, Naren L. Banik, Naren Banik (2007). Handbook of neurochemistry and
molecular neurobiology: Neural protein metabolism and function. Lk 77-80.
2. Clark, L.D., Boutros, N.N., Mendez F.M. (2010). The Brain and Behavior: An
introduction to behavioral neuroanatomy 3 nd ed. Cambridge [jne.] : Cambridge
University Press. Lk 176-214.
3. Colman R.D. ja Filbin T. M. (2006). Cell adhesion molecules, lk. 111-121. George J.
Siegel, R. Wayne Albers, Scott T. Brady, Donald L. Price, Basic neurochemistry :
molecular, cellular and medical aspects 7 nd ed., Amsterdam [jne.] : Elsevier Academic
Press.
34

4. Franklin K., Paxinos G. (1997). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. San
Diego, Academic Press.
5. Purves, D., Augustine, G.J., Fitzpatrick, D. jt. (2001). Neuroscience 2 nd ed.
Sunderland (MA): Sinauer Associates.
6. Strachan, T. ja Read, A. (2011). Cells and cell-cell communication, lk. 91-132. E.
Owen, D. Borrowdale, M. Purton, Human Molecular Genetics 4 nd ed., New York,
USA ja Abingdon, UK, Garland Science, Taylor & Francis Group.
35

KASUTATUD INTERNETIAADRESSID
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
http://frodo.wi.mit.edu/ (primer3)
36

TÄNUAVALDUSED
Tänan oma juhendajat Mari-Anne Philipsit abi ja nõuannete eest käesoleva töö koostamisel.
Tänan Jürgen Innost tema abi eest tulemuste analüüsimisel. Tänan meeldivaid õppejõude,
kelle panus minu haridusse ja haritusse võimaldas koostada käesoleva töö. Tänan Kersti
Lillevälja huvitava õppeaine ja juhendamise eest.
37

LISAD
mRNA ekspressiooni tase eri aju osades
hippokampus
temporaalsagar
keskaju
*temporaalsagar n=31
taalamus
hüpofüüs
piklikaju
väikeaju
septum
ajusild
1b keskmine
1a keskmine
otsmikukoor
primaarne somatosensoorne koor
ventraalne striaatum
*ventraalne striaatum (n=31)
seljaaju
haistesibul
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
2 -∆CT
Joonis 6. Kvantitatiivne mRNA ekspressiooni tase (2 -∆CT ) eri aju osades 1a ja 1b
promootorilt. * võrdlusena lisatud kombineeritud grupi 1 ja 2 andmed (n=31).
38