生物制品分离制备技术实验指导 - 沈阳农业大学网络教学平台

主编 : 陈 丽 静副 主 编 : 钟鸣李 浩 戈马慧编 辑 委 员 会 :( 按 拼 音 排 序 )钟 鸣张丽马 慧刘 少 霞林 景 卫李 浩 戈郭 志 富陈 丽 静陈贵主 审 : 钟 鸣 秦 利

前言生 物 制 品 分 离 制 备 技 术 是 运 用 现 代 科 学 理 论 与 方 法 研 究 生 物 物 质 的 制 备 分 离 的 一 门实 验 课 , 其 主 要 内 容 是 从 发 酵 液 、 动 植 物 细 胞 培 养 液 、 酶 反 应 液 或 动 植 物 组 织 细 胞 与 体 液等 中 分 离 、 纯 化 生 物 产 品 的 过 程 , 研 究 各 类 生 物 产 品 的 提 取 、 分 离 、 纯 化 和 制 备 技 术 。 通过 学 习 使 学 生 能 掌 握 生 化 分 离 中 重 要 分 离 技 术 的 原 理 和 方 法 , 介 绍 主 要 的 新 型 生 化 分 离 技术 , 使 学 生 对 本 学 科 的 前 沿 和 发 展 方 向 有 全 面 的 了 解 。本 课 程 设 置 了 提 取 分 离 、 鉴 定 技 术 的 大 量 实 验 操 作 内 容 , 以 期 通 过 对 知 识 的 学 习 与 操作 练 习 , 使 同 学 们 充 分 了 解 技 术 原 理 并 熟 练 掌 握 各 种 生 物 物 质 的 提 取 、 分 离 、 纯 化 和 制 备的 常 用 方 法 , 主 要 包 括 离 心 技 术 、 细 胞 破 碎 技 术 、 萃 取 技 术 、 固 相 析 出 技 术 、 色 谱 技 术 和膜 分 离 技 术 等 。同 时 , 针 对 选 修 本 方 向 的 是 高 年 级 同 学 , 已 系 统 学 习 过 有 机 化 学 、 分 析 化 学 、 物 理 化学 、 生 物 化 学 、 基 因 工 程 、 细 胞 工 程 、 酶 工 程 及 发 酵 工 程 等 课 程 , 为 进 一 步 培 养 和 锻 炼 同学 们 运 用 理 论 知 识 、 独 立 操 作 、 分 析 思 考 和 解 决 问 题 的 能 力 , 本 课 程 选 择 了 验 证 性 实 验 、综 合 性 实 验 , 自 行 设 计 性 实 验 , 即 将 一 些 实 验 项 目 设 计 成 自 行 摸 索 最 适 条 件 的 探 讨 型 试 验 ,这 是 和 以 往 实 验 教 材 最 大 的 不 同 之 处 , 目 的 是 使 同 学 们 在 开 放 的 实 验 环 境 下 , 充 分 发 挥 主观 能 动 性 , 摸 索 试 验 条 件 , 解 决 具 体 问 题 , 培 养 应 用 基 本 理 论 去 分 析 和 解 决 实 际 问 题 的 能力 。我 们 希 望 通 过 这 些 实 验 和 探 索 , 让 同 学 们 获 得 生 物 制 品 的 分 离 、 纯 化 和 制 备 最 基 本 的实 验 技 术 训 练 , 增 强 学 生 的 动 手 能 力 , 学 会 熟 练 地 使 用 各 种 大 型 分 离 设 备 和 精 密 的 分 析 仪器 , 使 学 生 学 会 设 计 一 个 实 验 的 基 本 思 路 , 掌 握 各 个 实 验 的 基 本 原 理 , 学 会 严 密 地 组 织 自己 的 实 验 , 合 理 地 安 排 实 验 步 骤 和 时 间 , 提 高 学 生 的 综 合 设 计 能 力 , 为 今 后 独 立 科 研 和 工作 打 下 扎 实 的 基 础 。i

学 生 实 验 守 则生 物 制 品 分 离 制 备 技 术 实 验 教 学 是 生 物 科 学 技 术 学 院 生 物 制 剂 制 备 工 程 、 微 生 物 与 酶工 程 、 细 胞 工 程 等 专 业 方 向 的 重 要 方 向 课 程 , 是 使 学 生 进 一 步 理 论 联 系 实 际 , 掌 握 生 物 制品 提 取 、 分 离 和 检 定 的 基 本 操 作 技 能 , 提 高 学 生 分 析 和 解 决 问 题 能 力 ; 养 成 严 密 科 学 态 度和 良 好 工 作 作 风 必 不 可 少 的 教 学 环 节 。 为 保 证 实 验 教 学 及 科 研 的 顺 利 进 行 , 所 有 进 入 实 验室 的 学 生 均 应 遵 守 本 守 则 :1 学 生 必 须 按 时 到 指 定 实 验 室 做 实 验 , 不 得 迟 到 、 早 退 。2 实 验 前 , 学 生 必 须 预 习 实 验 指 导 书 规 定 的 有 关 内 容 。3 进 入 实 验 室 必 须 保 持 安 静 , 不 准 高 声 喧 闹 , 注 意 环 境 卫 生 , 不 吸 烟 、 不 随 地 吐 痰 、 不 乱抛 纸 屑 杂 物 , 爱 护 公 物 。4 实 验 时 , 要 严 肃 认 真 , 正 确 操 作 , 仔 细 观 察 , 真 实 记 录 实 验 数 据 和 结 果 。 不 做 与 实 验 无关 的 事 , 不 动 与 实 验 无 关 的 设 备 , 不 进 入 与 实 验 无 关 的 场 所 。5 实 验 中 要 注 意 安 全 , 遵 守 “ 实 验 室 安 全 规 则 ” 及 有 关 的 操 作 规 程 。 对 违 反 本 守 则 和 有 关 规章 制 度 造 成 的 事 故 , 要 认 真 追 究 当 事 人 的 责 任 , 严 肃 处 理 。6 仪 器 设 备 发 生 不 正 常 现 象 或 发 现 仪 器 设 备 损 坏 , 应 及 时 报 告 指 导 老 师 , 查 明 原 因 。 凡 属违 反 操 作 规 程 导 致 仪 器 设 备 损 坏 的 , 要 追 究 责 任 , 照 章 赔 偿 。 凡 隐 瞒事 故 不 报 者 , 从 重 处 理 。7. 保 持 实 验 室 内 整 洁 , 学 生 采 取 轮 流 值 日 , 每 次 实 验 完 毕 , 负 责 整 理 公 用 仪 器 , 将 实 验台 、 地 面 打 扫 干 净 , 倒 清 废 物 缸 , 检 查 水 、 电 和 门 窗 是 否 关 闭 。8. 废 弃 液 体 ( 强 酸 强 碱 溶 液 必 须 先 用 水 稀 释 ) 可 倒 入 水 槽 内 , 同 时 放 水 冲 走 。 废 纸 、 火 柴头 及 其 他 固 体 废 物 、 带 有 渣 浮 沉 淀 的 废 液 都 应 倒 入 废 品 缸 内 , 不 得 倒 入 水 槽 或 到 处 乱 扔 。9. 实 验 室 内 一 切 物 品 , 未 经 本 室 负 责 教 师 批 准 严 禁 携 出 室 外 , 借 物 必 须 办 理 登 记 手 续 。10. 对 实 验 内 容 和 安 排 不 合 理 的 地 方 可 提 出 改 进 意 见 。 对 实 验 中 出 现 的 一 切 反 常 现 象 应 进行 讨 论 , 并 大 胆 提 出 自 己 的 看 法 , 做 到 生 动 、 活 泼 、 主 动 地 学 习 。ii

实 验 记 录 及 实 验 报 告 的 书 写一 、 实 验 记 录每 次 实 验 前 应 认 真 预 习 , 将 实 验 名 称 、 目 的 和 要 求 、 原 理 、 实 验 内 容 、 操 作 方 法 或 步骤 等 简 单 扼 要 地 写 在 记 录 本 上 。 实 验 记 录 本 应 标 上 页 码 , 不 要 撕 去 任 何 一 页 , 更 不 要 擦 抹及 涂 改 , 写 错 时 可 以 划 去 重 写 。 记 录 时 必 须 使 用 钢 笔 或 圆 珠 笔 。 实 验 中 观 察 到 的 现 象 、 结果 和 数 据 , 应 及 时 地 直 接 记 在 记 录 本 上 , 绝 对 不 可 以 用 纸 片 做 记 录 或 写 在 草 稿 纸 上 。 原 始记 录 必 须 准 确 、 简 练 、 详 尽 、 清 楚 。 从 实 验 开 始 就 应 养 成 这 种 良 好 的 习 惯 。 应 做 到 正 确 记录 实 验 结 果 、 切 忌 夹 杂 主 观 因 素 , 这 是 十 分 重 要 的 。 在 实 验 条 件 下 观 察 到 的 现 象 , 应 如 实仔 细 地 记 录 下 来 。 在 定 量 实 验 中 观 测 的 数 据 , 如 称 量 物 的 质 量 、 滴 定 管 的 读 数 、 分 光 光 度计 的 读 数 等 , 都 应 设 计 表 格 准 确 记 下 读 数 , 并 根 据 仪 器 的 精 确 度 准 确 记 录 有 效 数 字 。 例 如 ,光 密 度 值 为 0.050 不 应 写 成 O.05。 每 一 项 结 果 最 少 要 重 复 观 测 2 次 以 上 , 当 符 合 实 验 要求 并 确 知 仪 器 工 作 正 常 后 再 写 在 记 录 本 上 。 实 验 记 录 上 的 每 一 个 数 字 , 都 反 映 1 次 测 量 结果 , 所 以 , 重 复 观 测 时 即 使 数 据 完 全 相 同 也 应 如 实 记 录 下 来 。 数 据 的 计 算 也 应 该 写 在 记 录本 的 另 一 页 上 , 一 般 写 在 正 式 记 录 的 左 侧 。 总 之 , 实 验 的 每 个 结 果 都 应 正 确 无 遗 漏 地 做 好记 录 。 实 验 中 使 用 仪 器 的 类 型 、 编 号 以 及 试 剂 的 规 格 、 化 学 式 、 分 子 量 、 准 确 的 浓 度 等 ,都 应 记 录 清 楚 , 以 便 总 结 实 验 时 进 行 核 对 和 作 为 查 找 成 败 原 因 的 参 考 依 据 。 如 果 发 现 记 录的 结 果 有 可 疑 、 遗 漏 、 丢 失 等 , 都 必 须 重 做 实 验 。 将 不 可 靠 的 结 果 当 作 正 确 的 记 录 , 在 实际 工 作 中 可 能 造 成 难 以 估 计 的 损 失 。 所 以 , 在 学 习 期 间 应 一 丝 不 苟 , 努 力 培 养 严 谨 的 科 学作 风 。二 、 实 验 报 告 的 书 写实 验 结 束 后 , 应 及 时 整 理 和 总 结 实 验 结 果 , 写 出 实 验 报 告 。 实 验 报 告 一 般 包 括 以 下几 个 部 分 :( 一 ) 目 的 和 要 求( 二 ) 内 容( 三 ) 原 理( 四 ) 试 剂 和 仪 器( 五 ) 操 作 步 骤( 六 ) 结 果 与 讨 论在 写 实 验 报 告 时 , 可 以 按 照 实 验 内 容 分 别 写 原 理 、 操 作 方 法 、 结 果 与 讨 论 等 。 原 理部 分 应 简 述 基 本 原 理 。 操 作 方 法 ( 或 步 骤 ) 可 以 采 用 工 艺 流 程 图 的 方 式 或 自 行 设 计 的 表 格 来表 示 。 某 些 实 验 的 操 作 方 法 可 以 与 结 果 或 讨 论 部 分 合 并 , 自 行 设 计 各 种 表 格 综 合 书 写 。 结果 与 讨 论 包 括 实 验 结 果 及 观 察 现 象 的 小 结 、 对 实 验 遇 到 的 问 题 和 思 考 题 进 行 探 讨 , 以 及 对实 验 的 改 进 意 见 等 。iii

实 验 一 重 组 菌 发 酵 产 酶 过 程 监 测一 、 实 验 目 的了 解 重 组 菌 发 酵 产 酶 原 理 和 过 程 , 掌 握 重 组 菌 生 长 过 程 监 测 和 无 菌 取 样 技 术 。二 、 实 验 原 理通 过 基 因 重 组 技 术 可 以 使 外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) 中 得 到 大 量 表 达 主要 是 因 为 :E.coli 携 带 的 表 达 载 体 上 通 常 都 有 一 个 强 的 启 动 子 , 这 样 启 动 子 控 制 下 的 外 源基 因 能 够 得 到 很 高 的 表 达 量 ; 同 时 , 表 达 载 体 通 常 在 细 胞 中 是 多 个 拷 贝 , 这 样 使 得 外 源 基因 在 细 胞 的 基 因 剂 量 也 大 大 增 加 , 从 而 也 能 够 是 目 的 基 因 的 表 达 量 增 加 。通 常 一 个 外 源 基 因 在 E.coli 中 表 达 时 , 细 胞 内 的 大 部 分 物 质 被 用 来 产 生 外 源 基 因 的 产 物 ,这 样 细 胞 本 身 用 于 自 身 生 长 繁 殖 的 营 养 很 大 部 分 被 占 夺 , 最 终 导 致 E.coli 细 胞 的 生 长 明 显受 到 抑 制 , 表 现 为 最 终 生 长 密 度 不 高 , 目 的 蛋 白 产 量 不 高 , 为 了 克 服 这 一 缺 陷 , 一 般 的 做法 是 使 表 达 载 体 上 控 制 外 源 基 因 转 录 的 启 动 子 是 可 以 控 制 的 , 也 就 是 说 在 细 菌 生 长 的 初 始阶 段 , 让 其 积 累 较 多 的 菌 体 , 此 时 表 达 载 体 上 的 启 动 子 不 表 现 出 转 录 活 性 或 者 活 性 非 常 低 ,当 细 胞 长 到 一 定 浓 度 后 , 改 变 一 定 的 外 界 环 境 后 ( 如 添 加 某 种 物 质 或 培 养 条 件 改 变 ), 启动 子 的 活 性 抑 制 被 解 除 , 此 时 外 源 基 因 便 大 量 转 录 表 达 , 最 后 目 的 基 因 编 码 的 产 物 能 够 得到 很 高 的 产 量 。重 组 大 肠 杆 菌 (E.coli) 生 产 木 聚 糖 酶 的 途 径 为 : 重 组 E.coli 携 带 有 重 组 质 粒pHsh-xynB,xynB 基 因 是 来 源 于 极 端 嗜 热 厌 氧 菌 海 栖 热 袍 菌 (thermotoga maritima) 的 编 码木 聚 糖 酶 的 一 个 基 因 ,pHsh 是 一 种 新 型 的 大 肠 杆 菌 表 达 载 体 , 其 上 有 来 源 于 根 据 E.coli热 休 克 基 因 启 动 子 保 守 序 列 设 计 而 成 的 独 特 新 型 热 激 启 动 子 Hsh promoter, 当 重 组 菌 在30℃ 生 长 时 , 热 激 启 动 子 Hsh promoter 对 它 下 游 的 目 的 基 因 xynB 的 转 录 活 性 非 常 低 , 这样 重 组 菌 能 够 快 速 地 生 长 到 一 个 较 高 的 细 胞 密 度 , 当 细 胞 生 长 到 对 数 期 (OD600=0.6~1.0)早 期 时 , 通 过 快 速 提 高 生 长 温 度 到 42℃( 即 热 激 方 式 ) 使 得 热 激 启 动 子 Hsh promoter 的活 性 抑 制 得 到 解 除 。 此 时 编 码 木 聚 糖 酶 的 基 因 xynB 就 开 始 大 量 表 达 。 同 时 , 该 表 达 载 体的 复 制 子 使 得 xynB 基 因 在 E.coli 中 有 很 高 的 拷 贝 数 , 拷 贝 数 可 以 达 到 500~600 个 ∕ 细 胞 ,这 样 使 得 目 的 基 因 能 在 E.coli 中 达 到 很 高 的 表 达 量 。重 组 菌 中 木 聚 糖 酶 的 活 性 随 发 酵 时 间 不 断 发 生 变 化 , 可 以 通 过 定 时 取 样 监 测 它 的 产 酶过 程 。 定 时 取 样 测 定 重 组 菌 的 细 胞 密 度 OD 600 , 重 组 菌 的 酶 活 随 着 细 胞 密 度 的 增 加 不 断 增加 , 当 细 胞 密 度 达 到 比 较 稳 定 的 值 时 , 由 于 木 聚 糖 酶 对 应 的 mRNA 的 稳 定 性 很 高 , 所 以1

在 以 后 持 续 的 几 个 小 时 , 酶 活 仍 然 持 续 的 增 加 , 当 酶 活 性 开 始 下 降 时 终 止 发 酵 。三 、 实 验 材 料 和 设 备A. 菌 种大 肠 杆 菌 E. coli JM109(pHsh-xynB) 携 带 有 重 组 质 粒 pHsh-xynBB. 培 养 基重 组 大 肠 杆 菌 的 培 养 基 采 用 LB 培 养 基 :液 体 培 养 基 : 胰 蛋 白 胨 10 g/L, 酵 母 粉 5 g/L,NaCl 10 g/L。固 体 培 养 基 : 胰 蛋 白 胨 10 g/L, 酵 母 粉 5 g/L,NaCl 10 g/L, 琼 脂 15 g/L。灭 菌 前 调 pH 到 7.0~7.5 左 右 , 两 种 培 养 基 最 后 都 要 加 氨 苄 青 霉 素 至 终 浓 度 100/mL。C. 实 验 设 备分 光 光 度 计 , 台 式 离 心 机 , 离 心 机 , 离 心 管 若 干 (50-100 mL/ 支 ), 超 净 工 作 台 , 可以 控 温 的 摇 床 , 无 菌 移 液 管 , 三 角 瓶 ( 需 要 1 L、100 mL、500 mL 各 若 干 ),1.5 mL 小 塑料 管 , 无 菌 水四 、 实 验 步 骤1 种 子 培 养实 验 前 一 天 用 重 组 质 粒 pHsh-xynB 新 鲜 转 化 大 肠 杆 菌 E. coli JM109 获 得 重 组 菌 , 晚 上待 菌 落 肉 眼 可 见 后 , 挑 取 单 菌 落 接 种 于 30mL 加 有 氨 苄 青 霉 素 的 LB 培 养 基 , 在 30℃ 下200rpm 振 荡 培 养 过 夜 。2 发 酵 流 程次 日 以 1%~2% 接 种 量 接 入 到 新 鲜 的 含 氨 苄 青 霉 素 的 LB 培 养 基 中 , 于 30℃ 下 培 养至 细 胞 到 达 对 数 期 早 期 (OD 600 值 大 概 为 0.7~0.8) 时 , 将 装 有 重 组 菌 的 三 角 瓶 移 入 42℃摇 床 中 , 以 此 时 为 0 时 刻 计 时 , 分 别 在 0h、2h、4h、6h、8h、10h 使 用 无 菌 操 作 取 样 测OD 600 值 , 并 各 保 留 1mL 样 品 离 心 收 集 细 胞 , 用 无 菌 水 洗 细 胞 一 次 , 用 1mL 的 无 菌 水 重新 悬 浮 后 保 存 于 -20℃ 用 于 次 日 酶 活 性 测 定 。10h 发 酵 结 束 后 , 将 剩 下 的 发 酵 液 全 部 离 心 收集 细 胞 , 用 无 菌 水 洗 涤 一 次 , 再 次 离 心 细 胞 后 放 置 于 -70℃ 用 于 重 组 酶 的 纯 化 。2

实 验 二 、 重 组 菌 细 胞 破 碎 及 酶 活 检 测一 、 实 验 目 的掌 握 超 声 波 细 胞 破 碎 方 法 及 木 聚 糖 酶 活 性 测 定 方 法二 、 实 验 原 理超 声 波 是 指 频 率 超 过 人 耳 可 听 范 围 (16~21kHz) 的 波 , 即 频 率 为 20kHz 以 上 的 波 。 微 生物 细 胞 在 超 声 波 的 作 用 下 , 细 胞 结 构 受 到 破 坏 , 而 使 细 胞 破 碎 。 超 声 波 进 行 细 胞 破 碎 的 效果 与 微 生 物 的 种 类 、 浓 度 、 超 声 波 频 率 、 输 出 功 率 和 破 碎 时 间 有 密 切 关 系 。 使 用 超 声 波 必须 注 意 的 是 控 制 强 度 在 一 定 限 度 , 即 刚 好 低 于 溶 液 产 生 泡 沫 的 水 平 。木 聚 糖 酶 的 活 性 通 常 是 测 定 其 水 解 底 物 木 聚 糖 后 生 成 的 产 物 的 还 原 末 端 —— 木 糖 的增 加 量 来 进 行 的 , 而 木 糖 的 含 量 可 以 利 用 其 与 某 些 显 色 试 剂 ( 如 DNS 试 剂 ,PAHBAH)反 应 后 生 成 在 特 定 波 长 下 有 特 异 吸 收 峰 的 有 色 化 合 物 , 从 而 通 过 分 光 光 度 法 测 出 。三 、 实 验 材 料 和 设 备A. 试 剂1 测 定 酶 活 用 试 剂 : 在 实 验 一 已 配 制20.5 % 燕 麦 木 聚 糖 :0.5 木 聚 糖 溶 于 100 mL 无 菌 水 中 , 在 磁 力 搅 拌 器 上 搅 拌 使 之 呈 均 一 的 悬 浮 液 , 加 终浓 度 0.02% 的 叠 氮 化 钠 防 止 微 生 物 生 长 。3 8X Binding buffer:40 mmol/L 咪 唑 ,4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH7.9 Tris-HCl , 最 终 pH 调 到 7.9B. 实 验 设 备分 光 光 度 计 、 水 浴 锅 、pH 计 、 冰 、 烧 杯 、 煮 沸 电 炉 、 煮 沸 用 的 浮 漂 、 移 液 管 、 磁 力搅 拌 器 、 超 声 破 碎 仪 、 高 速 离 心 机 、 离 心 管四 、 实 验 步 骤1 取 前 日 分 别 在 0h、2h、4h、6h、8h、10h 所 取 的 1mL 样 品 及 用 适 量 1X Binding buffer悬 浮 的 10h 发 酵 结 束 后 的 细 胞 ( 由 100 mL 发 酵 液 离 心 来 的 细 胞 用 4 mL 1X Binding buffer重 悬 ), 室 温 溶 化 后 , 用 超 声 波 破 碎 仪 破 碎 细 胞 。1mL 样 品 的 超 声 条 件 为 :50 Hz 超 声 15s,间 隔 10 秒 , 如 此 多 次 即 可 。 用 1X Binding buffer 悬 浮 的 细 胞 次 数 应 该 适 当 延 长 , 当 溶 液变 清 即 可 停 止 。2 破 碎 后 的 样 品 在 12000g,4℃ 离 心 20min, 弃 沉 淀 。1mL 的 样 品 用 来 检 测 酶 活 性 , 用3

1X Binding buffer 悬 浮 的 细 胞 样 品 次 日 用 于 酶 的 纯 化 , 此 时 放 置 于 -70℃ 保 存 。3 0h、1h、4h、6h、8h、9h、10h 时 的 样 品 中 木 聚 糖 酶 活 性 的 测 定 :记 录 好 各 个 取 样 点 时 测 得 的 数 据 , 将 其 代 入 实 验 一 所 得 标 准 曲 线 方 程 中 后 算 出 每 mL 发 酵液 的 酶 活 性 。注 意 : 每 个 时 刻 的 样 品 需 做 三 次 平 行 , 所 有 平 行 样 品 应 该 一 批 次 同 时 做 完 , 以 减 小 不 同 批次 实 验 引 起 的 误 差 ; 酶 液 可 能 要 适 当 经 过 稀 释 , 以 使 最 后 读 出 的 A 405 值 在 0.1~1 之 间 ,正 式 实 验 前 应 该 做 预 实 验 摸 索 好 稀 释 倍 数 。4

实 验 三双 水 相 萃 取 糖 化 酶一 、 实 验 目 的1. 通 过 实 验 使 学 生 了 解 双 水 相 萃 取 在 生 物 活 性 物 质 提 取 中 的 重 要 作 用 ;2. 加 深 对 分 配 系 数 K、 相 比 R、 收 率 Y 等 基 本 概 念 的 认 识 及 相 图 的 制 作 ;3. 掌 握 液 液 萃 取 中 基 本 实 验 技 术 ;二 、 实 验 原 理双 水 相 现 象 是 当 两 种 聚 合 物 或 一 种 聚 合 物 与 一 种 盐 溶 于 同 一 溶 剂 时 , 由 于 聚 合 物 之 间或 聚 合 物 与 盐 之 间 的 不 相 溶 性 , 使 得 聚 合 物 或 无 机 盐 浓 度 达 到 一 定 值 时 , 就 会 分 成 不 相 溶的 两 相 , 因 使 用 的 溶 剂 是 水 , 因 此 称 为 双 水 相 。原 则 上 , 无 论 是 天 然 的 还 是 合 成 的 亲 水 聚 合 物 , 绝 大 多 数 在 与 另 一 种 聚 合 物 水 溶 液 混合 时 , 都 可 分 成 两 相 , 构 成 双 水 相 体 系 , 几 种 典 型 的 双 水 相 系 统 见 表 一 。 通 过 溶 质 在 相 间分 配 系 数 的 差 异 而 进 行 萃 取 的 方 法 称 为 双 水 相 萃 取 。表 一几 种 典 型 的 双 水 相 系 统聚 丙 二 醇聚 乙 二 醇硫 酸 葡 聚 糖 钠 盐羧 甲 基 葡 聚 糖 钠 盐羧 甲 基 葡 聚 糖 钠 盐聚 乙 二 醇聚 乙 二 醇 , 聚 乙 烯 醇 , 葡 聚 糖 (Dex), 羟 丙 基 葡 聚 糖聚 乙 烯 醇 , 葡 聚 糖 (Dex), 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮聚 丙 烯 乙 二 醇甲 基 纤 维 素羧 甲 基 纤 维 素 钠 盐磷 酸 钾 , 硫 酸 铵 , 硫 酸 钠 , 硫 酸 镁 , 酒 石 酸 钾 钠双 水 相 萃 取 技 术 是 分 离 纯 化 蛋 白 质 混 合 物 等 生 物 大 分 子 的 有 效 方 法 。 双 水 相 系 统 通 常是 由 水 溶 性 的 两 种 聚 合 物 组 成 或 一 种 水 溶 性 聚 合 物 与 一 种 盐 组 成 , 其 中 水 占 有 较 大 的 比 例(70-95%), 相 对 于 传 统 溶 剂 萃 取 来 说 , 双 水 相 萃 取 的 最 大 优 势 在 于 双 水 相 体 系 可 为 生 物活 性 物 质 提 供 一 个 温 和 的 活 性 环 境 , 因 而 可 在 萃 取 过 程 中 保 持 生 物 物 质 的 活 性 和 构 象 , 而且 双 水 相 技 术 具 有 处 理 量 大 、 能 耗 低 、 易 连 续 化 操 作 和 工 程 放 大 等 优 点 ; 在 蛋 白 质 、 酶 、核 酸 等 生 物 大 分 子 的 分 离 纯 化 等 方 面 受 到 广 泛 重 视 , 是 一 种 有 发 展 潜 力 的 易 于 工 业 化 应 用的 生 物 分 离 技 术 。生 物 大 分 子 在 双 水 相 上 相 和 下 相 的 浓 度 比 被 定 义 为 分 配 系 数 (K=C t /C b )。 在 双 水 相 系统 中 有 许 多 因 素 影 响 分 配 系 数 , 包 括 系 统 本 身 的 因 素 如 系 统 组 成 、 聚 合 物 分 子 量 、 聚 合 物浓 度 、 盐 和 离 子 强 度 、pH 等 , 以 及 目 标 产 物 的 性 质 如 疏 水 作 用 、 电 荷 、 分 子 量 等 , 利 用双 水 相 技 术 , 通 过 大 量 实 验 研 究 , 可 以 获 得 特 定 蛋 白 质 和 生 物 大 分 子 的 最 适 宜 分 离 的 相 系统 和 最 优 分 配 的 。 在 生 化 分 离 中 得 到 广 泛 应 用 的 双 水 相 体 系 有 : 聚 乙 二 醇 (PEG)/ 葡 聚 糖5

(Dex) 体 系 ,PEG/ 盐 等 体 系 。分 离 某 一 生 物 大 分 子 , 两 相 系 统 的 选 择 原 则 , 必 须 有 利 于 目 的 产 物 的 萃 取 和 分 离 , 同时 又 要 兼 顾 到 聚 合 物 的 物 理 性 质 。 如 甲 基 纤 维 素 和 聚 乙 烯 醇 , 引 起 年 度 太 高 而 限 制 了 它 们的 应 用 。PEG 和 Dex 因 其 无 毒 性 和 良 好 的 可 调 性 而 得 到 广 泛 的 应 用 。糖 化 酶 亦 称 淀 粉 α-1,4 葡 萄 糖 苷 酶 。 这 类 酶 作 用 于 淀 粉 分 子 末 端 , 从 淀 粉 非 还 原 性 末端 顺 次 切 开 α-1,4 糖 苷 键 , 生 成 葡 萄 糖 。 它 们 也 能 作 用 于 支 链 淀 粉 的 α-1,6 键 , 但 速 度 较慢 , 因 此 分 解 产 物 全 部 为 葡 萄 糖 , 作 用 结 果 使 糖 的 还 原 能 力 迅 速 增 高 。 糖 化 酶 在 食 品 、 酿造 工 业 上 有 着 广 泛 用 途 , 是 酶 制 剂 工 业 上 一 个 重 要 品 种 。 国 内 生 产 糖 化 酶 的 菌 种 主 要 是 黑曲 霉 和 根 霉 。本 实 验 选 用 PEG400-(NH 4 ) 2 SO 4 为 双 水 相 系 统 , 从 发 酵 液 中 萃 取 糖 化 酶 。表 观 分 配 系 数 : 相 比 :VtR =Vb收 率 :YVtCtV C VCttbbRK1RK式 中 :C b 、C t 分 别 为 下 、 上 相 酶 浓 度 ( 活 性 );V b 、V t 分 别 为 下 相 、 上 相 的 体 积 。分 配 系 数 K 与 温 度 、 压 力 以 及 溶 质 和 溶 剂 的 性 质 有 关 , 与 溶 质 的 浓 度 无 关 。物 料 衡 算 : 加 入 的 原 液 总 酶 活 = 上 相 酶 活 × 上 相 体 积 + 下 相 酶 活 × 下 相 体 积CtK = Cb三 、 实 验 仪 器 与 药 品仪 器 : 天 平 、 恒 温 水 浴 、 离 心 机 、 液 相 混 合 器 ; 刻 度 试 管 、 吸 管 、 酸 式 滴 定 管 等 ;药 品 : 发 酵 液 、PEG400、(NH 4 ) 2 SO 4 、NaOH(C.P)、2% 可 溶 淀 粉 、0.15 M NaOH、1 M H 2 SO 4 ;四 、 实 验 步 骤1. PEG400-(NH 4 ) 2 SO 4 双 水 相 系 统 相 图 的 制 作水 性 两 相 的 形 成 条 件 和 定 量 关 系 常 用 相 图 表 示 , 由 上 、 下 相 中 PEG 和 (NH 4 ) 2 SO 4 的浓 度 可 在 PEG-(NH 4 ) 2 SO 4 浓 度 图 中 得 到 点 , 顺 次 连 接 这 些 点 得 到 一 曲 线 , 称 为 双 节 线 。 双节 线 下 方 为 一 相 区 , 上 方 为 两 相 区 。1.1 配 制 40% 的 硫 酸 铵 溶 液 ( 已 经 配 好 )。 在 具 塞 三 角 瓶 中 准 确 称 量 约 7 g 左 右 , 实 验中 量 取 7.19g 的 PEG400;6

1.2 按 实 验 记 录 部 分 的 表 依 次 进 行 , 先 加 入 5 mL 水 ( 此 时 体 系 澄 清 )。 然 后 用 滴 定 管慢 慢 加 入 40%(NH 4 ) 2 SO 4 溶 液 , 不 断 摇 匀 , 直 至 试 管 开 始 出 现 混 浊 为 止 , 记 录 加 入 的(NH 4 ) 2 SO 4 的 体 积 和 质 量 ;1.3 按 实 验 记 录 部 分 的 表 依 次 进 行 , 加 入 适 量 水 ( 水 的 加 量 ), 使 体 系 变 澄 清 , 并 继 续加 入 40%(NH 4 ) 2 SO 4 , 使 系 统 再 次 变 混 浊 , 记 录 加 入 的 体 积 和 质 量 ;1.4 如 此 反 复 操 作 , 计 算 达 到 混 浊 时 PEG 和 (NH 4 ) 2 SO 4 在 系 统 中 的 重 量 百 分 浓 度 , 得出 PEG 和 (NH 4 ) 2 SO 4 的 双 节 线 图 。2. 双 水 相 系 统 中 蛋 白 质 分 配 系 数 的 测 定2.1 按 实 验 记 录 部 分 的 表 中 所 示 的 顺 序 , 干 燥 的 50mL 的 离 心 管 适 量 PEG400, 再 加 入适 量 40% (NH 4 ) 2 SO 4 溶 液 , 加 入 适 量 水 补 足 到 30mL, 在 混 合 器 上 混 匀 , 再 加 入 1mL 酶 液 ,于 混 合 器 上 混 合 2 min。 然 后 离 心 5 min( 混 匀 过 程 一 律 手 动 进 行 上 下 混 匀 )。2.2 取 出 读 取 上 、 下 相 体 积 及 总 体 积 , 按 表 二 中 所 示 的 稀 释 倍 数 取 样 稀 释 后 , 分 别 测其 酶 活 。 酶 原 液 稀 释 20 倍 测 定 。2.3 糖 化 酶 活 力 测 定 方 法2.3.1 糖 化 : 在 干 燥 试 管 中 , 加 入 2% 可 溶 淀 粉 溶 液 5 mL, 再 加 入 pH 4.5 的 醋 酸 - 醋 酸钠 缓 冲 液 1.25 mL, 加 入 0.5 mL 稀 释 酶 液 , 迅 速 摇 匀 计 时 ( 空 白 实 验 用 0.5 mL 蒸 馏 水 代替 酶 液 ) 在 50°C 恒 温 水 浴 中 准 确 保 温 60 min, 加 入 四 滴 1M NaOH。2.3.2 定 糖 : 吸 出 1 mL 糖 化 液 , 稀 释 一 定 倍 数 用 SBA 测 定 ( 显 示 值 在 0~100 之 间 为正 常 , 如 果 超 过 100 请 根 据 显 示 数 值 稀 释 相 应 倍 数 再 次 测 定 )五 、 注 意 事 项1. FEG400 比 较 粘 稠 , 在 取 用 时 尽 量 慢 一 点 , 保 证 所 取 体 积 ;2. 实 验 开 始 前 要 准 确 称 量 空 瓶 的 重 量 , 实 验 过 程 中 每 步 加 水 和 加 硫 酸 铵 溶 液 步 骤 必 须称 量 总 体 系 的 重 量 ;3. 在 滴 定 的 过 程 中 轻 轻 的 振 荡 三 角 瓶 , 尽 量 减 慢 硫 酸 铵 滴 定 的 速 率 , 并 时 刻 观 察 瓶 中液 体 的 变 化 , 注 意 滴 定 终 点 ;4. 这 个 实 验 是 两 个 小 实 验 , 实 验 步 骤 比 较 多 , 做 实 验 前 要 按 照 一 定 的 顺 序 进 行 , 按 实验 步 骤 做 好 组 内 分 配 工 作 , 对 所 做 实 验 做 好 标 记 , 特 别 是 在 稀 释 过 程 中 要 在 试 管 上 贴 好 标签 , 同 时 准 确 记 录 记 录 实 验 数 据 ;5. 实 验 完 毕 , 做 好 清 洁 工 作 。六 、 实 验 结 果以 下 是 两 个 实 验 的 数 据 记 录 表 :7

1. 两 相 图 实 验 数 据 :所 取 的 PEG 质 量 为 7.19g; 其 中 瓶 质 量 为 78.29g:表 二两 相 图 数 据 记 录 表次 数水 体 积水 的 质40% 硫 酸 铵 溶 液硫 酸 铵总 溶 液 体PEG 含 量硫 酸 铵 含(mL)量 (g)( 非 溶系 累 计 量%(g/g)量 %(g/g)gmL液 ) 累 积量 (g)(g)1 5 5.03 1.42 1.15 0.568 13.64 52.71 4.162 3 3.02 2.61 2.10 1.612 19.27 37.31 8.373 3 3.02 7.37 6.10 4.56 29.66 24.24 15.374 3 2.99 11.69 9.70 9.236 44.33 16.22 20.835 5 5.06 22.26 18.60 18.14 71.66 10.03 25.312. 双 水 相 系 统 中 蛋 白 质 分 配 系 数 的 测 定表 三双 水 相 系 统 中 蛋 白 质 分 配 系 数 的 测 定编 号PEG 加40% 硫PEG硫 酸PEG 相 ( 上 相 t) 水 相 ( 下 相 b)相 比分 配收 率入量(mL)酸 铵 加入 量(mL)含量铵 含量体积(mL)测得酶稀释倍体 积测得酶稀释倍系 数(%)活数活数A 3 21 0.1 0.28 4 68 10 26.75 7 1 0.15 97.1 93.6B 6 21 0.2 0.28 11.6 61 5 19.2 4 0.60 76.3 97.9C 9 11.25 0.3 0.15 22 44 5 9.3 16 2.37 13.8 97.0D 9 21 0.3 0.28 14 29 5 16.3 30.86 48.3 97.6CtVt其 中 分 配 系 数 : K = 相 比 : R =CVbb收 率 : Y=上 相 酶 总 量上 、 下 相 酶 总 量VtCt=V C + V CttbbRK=1+RK式 中 : Cb、Ct 分 别 为 下 、 上 相 酶 浓 度 ( 活 性 );8

Vb、Vt 分 别 为 下 相 、 上 相 的 体 积 。物 料 衡 算 : 加 入 的 原 液 总 酶 活 = 上 相 酶 活 × 上 相 体 积 + 下 相 酶 活 × 下 相 体 积说 明 : 其 中 的 酶 活 是 以 葡 萄 糖 的 含 量 为 准 的 , 因 为 酶 浓 度 越 大 , 酶 活 就 越 高 , 最 后 得到 的 葡 萄 糖 的 含 量 也 就 越 高 , 因 此 在 计 算 时 统 一 以 葡 萄 糖 的 浓 度 为 基 准 衡 量 酶 活 的 大 小 ,注 意 相 应 的 稀 释 倍 数 即 可 , 而 且 计 算 时 相 应 的 结 果 都 是 两 者 相 比 , 也 就 不 存 在 单 位 的 不 统一 的 问 题 。七 、 实 验 结 果 及 讨 论1. 在 PEG400-(NH4)2SO4 双 水 相 系 统 相 图 中 , 根 据 实 验 所 得 数 据 , 作 出 PEG400-(NH4)2SO4双 水 相 系 统 的 相 图 , 如 下 图 所 示 , 在 双 水 相 中 , 由 不 同 的 PEG 含 量 下 , 滴 定 所 用 的 (NH4)2SO4的 量 :图 一 PEG400-(NH4)2SO4 双 水 相 系 统 相 图2. 根 据 实 验 所 得 数 据 , 计 算 各 种 系 统 的 相 比 , 糖 化 酶 在 各 种 双 水 相 系 统 中 的 分 配 系 数及 收 率 , 讨 论 其 结 果 。编 号测 量 参 数原 液 总 酶 活 相 比 分 配 系 数 收 率A 2907.25 0.15 97.1 93.6B 3614.8 0.60 76.3 97.9C 4988.8 2.37 13.8 97.0D 2078.9 0.86 48.3 97.69

实 验 四蛋 白 质 的 水 解 和 氨 基 酸 的 纸 层 析 法 分 离一 、 实 验 目 的1. 学 习 水 解 蛋 白 质 的 方 法 。2. 掌 握 纸 层 析 的 基 本 技 术 。3. 学 习 用 纸 层 析 分 离 、 鉴 定 氨 基 酸 的 方 法 。二 、 实 验 原 理1. 蛋 白 质 的 水 解蛋 白 质 可 以 用 酸 、 碱 或 酶 如 胃 蛋 白 酶 , 胰 蛋 白 酶 , 糜 蛋 白 酶 水 解 成 最 终 产 物 氨 基 酸 。实 验 室 中 常 使 用 酸 解 法 水 解 蛋 白 质 。 当 在 6mol/L 盐 酸 溶 液 中 将 蛋 白 质 在 110℃ 加 热 大 约20 h, 肽 键 断 裂 , 此 时 蛋 白 质 完 全 分 解 为 氨 基 酸 。酸 法 水 解 蛋 白 质 的 优 点 是 在 水 解 过 程 中 不 发 生 外 消 旋 作 用 , 所 得 到 的 氨 基 酸 均 为 L一 氨 基 酸 。 大 多 数 氨 基 酸 在 煮 沸 酸 中 是 稳 定 的 , 但 色 氨 酸 则 完 全 被 破 坏 。 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸在 酸 解 过 程 中 或 多 或 少 地 也 有 破 坏 。 色 氨 酸 的 水 解 产 物 已 知 是 一 种 棕 黑 色 的 物 质 —— 腐 黑质 , 因 此 , 用 酸 法 水 解 蛋 白 质 得 到 的 水 解 液 为 棕 黑 色 的 。2. 纸 层 析 法 分 离 氨 基 酸纸 层 析 是 以 滤 纸 作 为 支 持 物 的 分 配 层 析 法 。 它 利 用 不 同 物 质 在 同 一 推 动 剂 中 具 有 不 同的 分 配 系 数 , 经 层 析 而 达 到 分 离 的 目 的 。 在 一 定 条 件 下 , 一 种 物 质 在 某 溶 剂 系 统 中 的 分 配系 数 是 一 个 常 数 , 若 以 K 表 示 分 配 系 数层 析 溶 剂 ( 又 称 推 动 剂 ), 是 选 用 有 机 溶 剂 和 水 组 成 的 。 滤 纸 纤 维 素 与 水 有 较 强 的 亲和 力 ( 纤 维 素 分 子 的 葡 萄 糖 基 上 的 -OH 基 与 水 通 过 氢 键 相 作 用 ) 能 吸 附 很 多 水 分 , 一 般 达滤 纸 重 的 22% 左 右 ( 其 中 约 有 6% 的 水 与 纤 维 素 结 合 成 复 合 物 ), 由 于 这 部 分 水 扩 散 作 用降 低 形 成 固 定 相 ; 而 推 动 剂 中 的 有 机 溶 剂 与 滤 纸 的 亲 和 力 很 弱 , 可 在 滤 纸 的 毛 细 管 中 自 由流 动 , 形 成 流 动 相 。 层 析 时 , 点 有 样 品 的 滤 纸 一 端 浸 入 推 动 剂 中 , 有 机 溶 剂 连 续 不 断 地 通过 点 有 样 品 的 原 点 处 , 使 其 上 的 溶 质 依 据 本 身 的 分 配 系 数 在 两 相 间 进 行 分 配 。 随 着 有 机 溶剂 不 断 向 前 移 动 , 溶 质 被 携 带 到 新 的 无 溶 质 区 并 继 续 在 两 相 间 发 生 可 逆 的 重 新 分 配 , 同 时溶 质 离 开 原 点 不 断 向 前 移 动 , 溶 质 中 各 组 分 的 分 配 系 数 不 同 , 前 进 中 出 现 了 移 动 速 率 差 异 ,通 过 一 定 时 间 的 层 析 , 不 同 组 分 便 实 现 了 分 离 。 物 质 的 移 动 速 率 以 Rf 值 表 示 :10

各 种 化 合 物 在 恒 定 条 件 下 , 层 析 后 都 有 其 一 定 的 Rf 值 , 借 此 可 以 达 到 定 性 、 鉴 别 的目 的 。溶 质 的 结 构 与 极 性 、 溶 剂 系 统 的 物 质 组 成 与 比 例 、pH 值 、 滤 纸 的 质 地 以 及 层 析 的 温度 、 时 间 等 都 会 影 响 Rf 值 。三 、 仪 器 试 剂 和 材 料1. 仪 器(1) 干 燥 箱 ; (2) 水 浴 锅(3) 安 培 瓶 ; (4) 层 析 缸(5) 吹 风 机 ; (6) 喷 雾 器2. 试 剂(1)6mol/L HCl(2) 标 准 氨 基 酸 (lmL/mL): 称 取 亮 氨 酸 、 天 冬 氨 酸 、 丙 氨 酸 、 缬 氨 酸 、 组 氨酸 各 lmg, 分 别 溶 于 lmL 0.01mol/L 的 HCl 溶 液 中 , 保 存 于 冰 箱(3) 展 层 剂 : 正 丁 醇 :88% 甲 酸 : 水 =15:3:2(V/V)(4)0.5% 的 茚 三 酮 丙 酮 溶 液(5)10% 异 丙 醇 溶 液3. 材 料(1) 层 析 滤 纸 (10cm × 10cm), 普 通 滤 纸 (21cm × 21cm)(2) 毛 细 管 、 培 养 皿 、 镊 子四 、 操 作 步 骤1. 蛋 白 质 的 水 解称 取 0.2g 酵 母 粉 , 放 进 一 个 小 安 培 瓶 中 , 向 瓶 中 加 入 l mL 6mol/L 的 盐 酸 , 于 喷灯 火 焰 上 封 口 。 将 安 培 瓶 放 入 干 燥 箱 内 , 在 110℃ 下 水 解 20 h 后 , 把 安 培 瓶 内 的 水 解 液倒 进 蒸 发 皿 内 , 将 蒸 发 皿 放 于 沸 水 浴 上 加 热 以 除 去 水 解 液 中 的 盐 酸 。 将 水 解 液 蒸 干 , 溶 解于 0.5—l mL 10% 的 异 丙 醇 中 。2. 纸 层 析 法 分 离 氨 基 酸取 1 张 10 × 10cm 的 层 析 滤 纸 放 在 普 遍 滤 纸 上 , 用 直 尺 和 铅 笔 在 距 滤 纸 底 边 2 cm处 划 一 条 平 行 于 底 边 的 很 轻 的 直 线 做 为 基 线 。 沿 直 线 以 一 定 的 间 隔 做 标 记 以 指 示 标 准 氨 基酸 和 蛋 白 质 水 解 液 的 加 样 位 置 。 用 毛 细 管 吸 少 量 氨 基 酸 样 品 点 于 标 记 的 位 置 上 。 点 样 时 ,11

毛 细 管 口 应 与 滤 纸 轻 轻 接 触 , 样 点 直 径 一 般 控 制 在 0.3 cm 之 内 。 用 吹 风 机 稍 加 吹 干 后 再点 下 一 次 , 重 复 3 次 , 每 次 的 样 品 点 应 完 全 重 合 。 加 样 完 毕 后 , 将 滤 纸 卷 成 圆 筒 状 , 使 基线 吻 合 , 两 边 不 搭 接 , 用 针 和 线 将 纸 两 边 缝 合 。 将 点 好 样 品 的 滤 纸 移 入 层 析 缸 中 ( 层 析 缸内 事 先 加 入 一 个 注 人 40 mL 展 层 剂 的 直 径 为 10 cm 的 培 养 皿 , 使 液 层 厚 度 为 1cm 左 右 , 盖上 层 析 缸 的 盖 子 20 min, 以 保 证 罩 内 有 一 定 蒸 汽 压 ), 采 用 上 行 法 进 行 展 层 。 当 溶 剂 前 沿上 升 到 距 纸 上 端 Icm 时 , 取 出 滤 纸 , 立 即 用 铅 笔 记 下 溶 剂 前 沿 的 位 置 , 剪 断 缝 线 , 用 吹 风机 吹 干 滤 纸 上 的 溶 剂 。 之 后 用 前 三 酮 丙 酮 溶 液 均 匀 地 喷 洒 在 滤 纸 有 效 面 上 , 切 勿 喷 得 过 多致 使 斑 点 扩 散 。 然 后 将 滤 纸 放 入 烘 箱 , 于 80 ℃ 下 显 色 5 min 后 取 出 。五 、 结 果 处 理用 铅 笔 轻 轻 描 出 显 色 斑 点 的 形 状 , 并 用 一 直 尺 度 量 每 一 显 色 斑 点 中 心 与 原 点 之 间 的 距离 和 原 点 到 溶 剂 前 沿 的 距 离 , 计 算 各 色 斑 的 Rf 值 , 与 标 准 氨 基 酸 的 Rf 值 对 照 , 确 定 水 解液 中 含 有 哪 些 氨 基 酸 。六 、 注 意 事 项1. 点 样 时 要 避 免 手 指 或 唾 液 等 污 染 滤 纸 有 效 面 ( 即 展 层 时 样 品 可 能 达 到 的 部 分 )。2. 点 样 斑 点 不 能 太 大 ( 直 径 应 小 于 0.3 cm), 防 止 层 析 后 氨 基 酸 斑 点 过 度 扩 散 和 重叠 , 且 吹 风 温 度 不 宜 过 高 , 否 则 斑 点 变 黄 。3. 展 层 开 始 时 切 勿 使 样 品 点 浸 入 溶 剂 中 。4. 作 为 展 层 剂 的 正 丁 醇 要 重 新 蒸 馏 , 甲 酸 须 用 分 析 纯 的 。 且 展 层 剂 要 临 用 前 配 制 ,以 免 发 生 酯 化 , 影 响 层 析 结 果 。5. 如 果 样 品 中 溶 质 种 类 较 多 , 且 某 些 溶 质 在 某 一 溶 剂 系 统 中 的 Rf 值 十 分 接 近 时 , 单向 层 析 分 离 效 果 不 佳 , 则 可 采 用 双 向 层 析 , 即 将 样 品 点 在 一 方 形 滤 纸 的 角 上 , 先 用 一 种 溶剂 系 统 展 层 。 滤 纸 取 出 干 燥 后 , 再 将 滤 纸 转 90 度 角 , 用 另 一 溶 剂 系 统 展 层 。 所 得 图 谱 分别 与 这 两 种 溶 剂 系 统 中 作 的 标 准 物 质 层 析 图 谱 对 比 , 即 可 对 混 合 物 样 品 中 各 成 分 进 行 鉴定 。七 、 思 考 题l. 为 什 么 点 样 时 要 避 免 手 指 或 唾 液 等 污 染 滤 纸 有 效 面 ?2. 影 响 物 质 移 动 速 率 几 值 的 因 素 有 哪 些 ?实 验 五 HPLC 测 定 混 合 药 物 含 量12

实 验 五香 菇 多 糖 的 分 离 提 取一 、 实 验 目 的让 学 生 了 解 香 菇 多 糖 的 理 化 性 质 及 提 取 工 艺 流 程 , 掌 握 真 空 浓 缩 技 术 。二 、 实 验 原 理香 菇 是 一 种 药 食 两 用 真 菌 , 具 有 提 高 免 疫 力 、 抗 癌 、 降 糖 等 多 种 生 理 功 能 。 水 溶 性多 糖 作 为 香 菇 主 要 活 性 成 分 之 一 , 主 要 以 β-1,3- 葡 聚 糖 的 形 式 , 分 子 量 从 几 万 到 几 十 万 不等 。 通 过 有 机 溶 剂 提 取 , 真 空 浓 缩 技 术 进 行 分 离 提 取 。三 、 实 验 材 料 与 试 剂原 料 : 干 香 菇 500g试 剂 : 氯 仿 、 正 丁 醇 、 医 用 纱 布 、 浓 硫 酸 、 重 蒸 酚 、 工 业 酒 精四 、 实 验 仪 器组 织 捣 碎 机 、 水 浴 锅 、 旋 转 蒸 发 器 、1cm 比 色 皿 、751 分 光 光 度 计 、 电 子 天 平 、 台 式 离 心机 、 试 管 、 量 筒 、 烧 杯 、 玻 璃 棒五 、 提 取 工 艺 流 程1. 1kg 干 香 菇 切 成 小 块 , 以 1:10( 重 量 比 ) 加 入 水 , 用 组 织 捣 碎 机 进 行 均 质 ;2. 取 200mL 均 质 液 放 入 1L 烧 杯 中 , 再 加 入 300mL 蒸 馏 水 , 加 热 至 沸 后 , 温 火 煮 沸 1 小 时 ,( 注 意 : 煮 沸 过 程 中 用 玻 璃 棒 不 断 搅 拌 , 以 免 烧 杯 底 部 发 生 糊 结 ; 并 间 歇 加 入 少 量 水 ,使 杯 内 液 体 体 积 保 持 在 500mL 左 右 ;3. 加 热 完 毕 后 , 将 杯 内 液 体 用 8 层 纱 布 过 滤 , 除 去 残 渣 , 上 清 液 转 入 另 一 烧 杯 中 ;4. 将 上 清 液 倒 入 圆 底 烧 瓶 中 , 在 旋 转 浓 缩 仪 上 进 行 浓 缩 , 浓 缩 条 件 为 -0.1MPa 、60℃,浓 缩 液 体 积 至 100 mL 左 右 停 止 ;5. 将 浓 缩 液 在 1×10000 g 离 心 10 min, 将 上 清 液 转 入 另 一 烧 杯 , 除 去 残 渣 ;6. 上 清 液 中 加 入 等 体 积 的 氯 仿 正 丁 醇 浓 液 ( 体 积 比 为 4:1), 搅 拌 5 min, 静 置 30 min;7. 将 混 合 液 体 在 1×5000g 下 离 心 20 min, 分 离 水 相 ;8. 在 水 相 中 加 入 终 浓 度 为 80% 的 酒 精 , 搅 拌 均 匀 , 静 置 20 min,1×5000g 下 离 心 10 min;9. 取 出 沉 淀 物 , 放 入 已 称 重 的 干 燥 表 面 皿 中 , 在 真 空 干 燥 箱 中 80℃ 下 真 空 干 燥 ;10. 干 燥 后 , 称 重 , 计 算 多 糖 的 产 率 ;11. 准 确 称 取 干 燥 后 多 糖 20 mg 于 500 mL 容 量 瓶 中 , 加 水 定 容 ;12. 取 定 容 液 2 mL 加 入 6% 苯 酚 1 mL, 混 匀 , 再 加 入 浓 硫 酸 5mL, 混 匀 , 放 置 20 min 后 , 于13

490 nm 测 吸 光 度 ;13. 葡 萄 糖 标 准 曲 线 的 制 定 : 准 确 称 取 葡 萄 糖 20 mg 定 容 于 500 mL 容 量 瓶 中 , 分 别 取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 及 1.8 mL, 补 水 至 2 mL, 依 12 步 骤 反 应 液 , 并 分 别 测 吸光 度 , 根 据 葡 萄 糖 浓 度 和 吸 光 度 绘 制 标 准 曲 线 ;14. 根 据 香 菇 多 糖 吸 光 度 和 葡 萄 糖 标 准 曲 线 , 计 算 多 糖 纯 度 。六 、 思 考 题1. 根 据 以 上 实 验 步 骤 , 表 达 多 糖 产 率 及 纯 度 的 计 算 公 式 ;2. 利 用 所 学 生 物 化 学 知 识 , 分 析 多 糖 沉 淀 原 理 。14

实 验 六大 豆 蛋 白 的 提 取 与 含 量 测 定一 、 实 验 目 的让 学 生 掌 握 大 豆 蛋 白 的 提 取 原 理 和 方 法 ; 学 习 计 算 粗 提 产 率 及 蛋 白 质 收 率 。掌 握 Folin 酚 法 测 定 蛋 白 浓 度 的 原 理 和 方 法 实 验 原 理 。二 、 实 验 原 理大 豆 中 含 有 丰 富 的 蛋 白 质 、 根 据 其 性 质 不 同 , 可 以 分 为 水 溶 蛋 白 、 盐 溶 蛋 白 、 醇 溶蛋 白 、 碱 溶 蛋 白 。 将 豆 粉 依 次 用 上 述 溶 剂 提 取 , 并 用 有 机 溶 剂 沉 淀 , 可 制 得 各 部 分 蛋 白 质的 干 粉 。 本 实 验 主 要 是 水 溶 提 取 大 豆 蛋 白 。 称 出 提 出 蛋 白 质 的 重 量 , 已 知 原 料 重 量 , 可 以求 出 蛋 白 质 的 收 率蛋 白 质 浓 度 可 以 从 它 们 的 物 理 化 学 性 质 , 如 比 重 、 紫 外 吸 收 , 折 射 率 等 测 定 而 得 知 ;或 用 化 学 方 法 , 如 定 氮 、 双 缩 脲 反 应 ,Folin 酚 试 剂 反 应 等 方 法 来 计 算 。 其 中 双 缩 脲 法 和Folin 酚 法 是 一 般 实 验 室 中 常 用 的 方 法 , 它 们 操 作 简 便 , 迅 速 , 不 需 要 复 杂 而 昂 贵 的 仪 器 。Folin 酚 法 灵 敏 度 高 , 比 双 缩 脲 法 灵 敏 100 倍 。Folin 酚 法 所 用 试 剂 是 由 两 部 分 组 成 , 试 剂 甲 相 当 于 双 缩 脲 试 剂 , 可 与 蛋 白 质 中 的 肽链 起 显 色 反 应 。 试 剂 乙 中 的 磷 钼 酸 和 磷 钨 酸 在 碱 性 条 件 下 不 稳 定 , 易 被 酚 类 还 原 而 呈 兰 色( 钼 兰 和 钨 兰 混 合 物 )由 于 蛋 白 质 中 含 有 带 酚 基 的 酷 氨 酸 还 原 呈 兰 色 , 溶 液 兰 色 的 深 浅 与 蛋 白 浓 度 有 较 好 的线 性 关 系 。 因 此 用 Folin 酚 法 测 定 蛋 白 质 含 量 , 灵 敏 度 较 高 。样 品 中 含 酚 类 化 合 物 及 柠 檬 酸 均 有 干 扰 作 用 , 如 果 样 品 酸 度 较 高 则 显 色 较 浅 , 要 提 高碳 酸 钠 一 氢 氧 化 钠 的 浓 度 。 此 法 也 可 测 定 溶 液 中 酪 氨 酸 的 色 氨 酸 的 浓 度 。Folin 酚 法 有 不 少 具 有 操 作 方 法 , 但 基 本 原 理 都 是 一 个 , 只 是 在 各 溶 液 的 浓 度 及 填 加量 上 , 保 温 的 温 度 及 保 温 时 间 上 有 所 不 同 而 已 , 本 实 验 所 介 绍 的 是 本 室 常 用 的 , 灵 敏 度 较高 的 操 作 方 法 。三 、 实 验 材 料 与 试 剂1、 实 验 材 料1) 豆 粉2) 本 实 验 所 提 取 大 豆 蛋 白 水 提 取 液 , 经 合 适 稀 释 至 可 测 定 范 围 。15

2、 提 取 试 剂(1)10%Nacl(2)0.2%NaoH(3)75% 乙 醇 (4)6mol/L HCL(5) 1mol/L HCL (6)1 mol/L NaoH3、 蛋 白 质 浓 度 测 定 试 剂(1)0.03mol/L PH7.8 的 磷 酸 缓 冲 液 。(2)200μg/mL 的 标 准 酪 ( 牛 血 清 ) 蛋 白 溶 液 。(3)Folin 试 剂 甲 :( 俗 称 碱 性 铜 试 剂 ):10gNaoH 溶 于 400mL 水 中 , 再 加 50gNa2CO3;称 取 0.5g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 80mLH2O 中 , 再 加 0.25gCuSO4; 以 上 两 溶 液 混 合 定 容 到500mL, 冰 箱 保 存 可 用 一 个 月(4)、Folin 试 剂 乙 : 在 2 L 磨 口 回 流 装 置 的 烧 瓶 内 , 加 钨 酸 钠 (NaWO4·2H2O)100g,钼 酸 钠 (NaMoO·2M2O)25g, 蒸 馏 水 700mL,85% 的 磷 酸 50 mL, 浓 盐 酸 100 mL, 充分 混 合 后 , 小 火 回 流 10 小 时 , 再 加 硫 酸 锂 (Li2SO4)150g, 蒸 馏 水 50mL 及 数 滴 溴 。然 后 开 口 沸 腾 15min, 以 驱 除 过 量 的 溴 , 冷 却 后 定 容 到 1000mL, 过 滤 后 呈 金 黄 色 , 于棕 色 并 中 保 存 , 可 使 用 多 年 。上 述 制 备 的 Folin 试 剂 乙 的 贮 备 液 浓 度 一 般 在 2mol/L 左 右 , 几 种 操 作 方 案 都 是 把Folin 试 剂 乙 稀 释 至 1mol/L 的 酸 度 作 为 应 用 液 , 我 们 是 把 贮 备 液 于 作 用 前 稀 释 18 倍 , 使之 浓 度 为 0.1mol/L 略 高 。 这 种 稀 释 18 倍 后 的 Folin 试 剂 乙 就 是 下 文 称 之 为 应 用 液 ,Folin试 剂 乙 贮 备 液 浓 度 的 标 定 , 一 般 是 以 酚 酞 为 指 示 剂 , 用 Folin 试 剂 乙 去 滴 定 1mol/L 左 右的 标 准 NaOH 溶 液 , 当 溶 液 颜 色 由 红 变 为 紫 灰 色 , 再 突 然 变 成 黑 绿 既 为 终 点 。 如 果 用NaOH 去 滴 定 Folin 乙 , 终 点 不 太 好 掌 握 , 溶 液 的 颜 色 是 由 浅 黄 色 变 为 浅 绿 色 , 再 变 为灰 紫 色 为 终 点 。四 、 实 验 器 材(1) 离 心 机 (2) 烧 杯 (3) 滴 管 (4)PH 试 纸 等(5) 试 管 10 支 (6) 试 管 架 一 个 (7) 移 液 管 :(5mL、1mL)(8) 移 液 管 架 (9) 洗 瓶 (10) 恒 温 水 浴 (11)723 型 分 光 光 度 计五 、 提 取 工 艺 流 程1、 水 抽 提1) 将 豆 粉 5g 用 约 40 毫 升 左 右 的 蒸 馏 水 少 量 多 次 的 添 加 搅 拌 , 常 温 下 搅 拌 抽 提 15min,16

3800r/min 离 心 15min, 取 上 清 液 , 如 上 清 液 不 清 澈 再 经 过 滤 。2) 取 上 清 液 1 毫 升 稀 释 50 倍 留 做 蛋 白 测 定 。3) 其 余 清 液 加 入 等 体 积 在 冰 箱 中 预 冷 的 丙 酮 , 用 滴 管 少 量 多 次 慢 慢 滴 加 ( 搅 拌 )6mol/L和 1 mol/L HCL, 调 PH4.5~5.0,3800r/min, 离 心 15min, 收 集 沉 淀 物 , 反 复 用 丙 酮 搅 拌 洗涤 离 心 2 次 , 得 到 粉 末 状 蛋 白 质 干 粉 , 称 重 , 计 算 粗 产 率 。蛋 白 质 产 率 =蛋 白 质 产 物 重 量原 料 总 重 量×100%2、 标 准 曲 线 的 制 作 :标 准 酪 蛋 白 溶 液 : 用 0.03mol/L 的 磷 酸 缓 冲 液 溶 解 的 酪 蛋 白 , 浓 度 为 200μg/mL。 用 一支 0.5mL 移 液 管 分 别 取 上 述 标 准 酪 蛋 溶 液 0mL, 0.1mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL 各 加 到 一 支 试 管 中 去 , 将 此 吸 管 用 0.03mol/LPH7.8 的 磷 酸 缓 冲 液 , 反 复 洗 净 , 再 用同 一 支 移 液 管 ( 防 止 未 经 标 定 吸 量 管 的 相 对 误 差 的 影 响 ) 取 上 述 缓 冲 液 将 每 支 试 管 中 的 溶液 补 加 至 1mL。 再 在 另 一 支 试 管 中 加 入 1mL 缓 冲 液 作 空 白 对 照 。 于 上 述 试 管 中 各 加 入1mLFolin 试 剂 甲 并 不 时 地 进 行 振 荡 ,10min 后 再 加 入 后 1in 试 剂 乙 的 应 用 液 4 毫 升 。 立 既 摇匀 放 入 55℃ 水 溶 中 保 湿 5min。 取 出 后 用 自 来 水 冷 却 1min。 于 波 长 650nm 进 行 比 色 测 定 各 管的 OD 值 , 以 蛋 白 质 的 浓 度 为 横 坐 标 ,OD 值 为 纵 坐 标 , 既 可 得 到 标 准 曲 线 。3、Folin- 酚 法 测 定 蛋 白 质 含 量 工 作 曲 线 的 制 作 :取 7 支 试 管 ( 干 燥 的 ) 按 下 表 顺 序 分 别 加 入 各 种 试 剂 并 进 行 反 应 和 测 定试 管 号 1 2 3 4 5 6 7蛋 白 质 标 准 液 (mL)00.10.20.40.60.81.0(mg)00.020.040.080.120.160.2PH7.8 的 buffer(mL) 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0Folin- 甲 试 剂 (mL) 1 1 1 1 1 1 1于 室 温 下 不 停 地 振 荡 10minFolin- 乙 应 用 液 (mL) 4 4 4 4 4 4 4A650 值立 即 摇 匀 , 在 55℃ 恒 温 水 浴 中 保 温 5min, 用 流 水 冷 却 1min 后 , 测 A6504、 样 品 测 定 :取 两 支 试 管 ( 平 行 ) 各 加 入 待 测 的 蛋 白 质 样 品 液 1mL( 不 加 buffer), 其 他 操 作 同 工作 曲 线 ( 可 取 两 支 试 管 编 号 8、9, 与 工 作 曲 线 同 时 进 行 反 应 和 比 色 测 定 );17

试 管 号 8 9蛋 白 质 稀 释 液 (mL)1 1(mg)PH7.8 的 buffer(mL) 0 0Folin- 甲 试 剂 (mL) 1 1于 室 温 下 不 停 地 振 荡 10minFolin- 乙 应 用 液 (mL) 4 4立 即 摇 匀 , 在 55℃ 恒 温 水 浴 中 保 温 5min, 用 流 水 冷 却 1min 后 , 测 A650A650 值5 蛋 白 质 浓 度 的 计 算 :Pr(mg/mL)=A650 值 对 应 的 mg 数 (Pr)Pr 溶 液 的 mL 数× 稀 释 倍六 、 思 考 题1、 用 丙 酮 沉 淀 蛋 白 时 , 为 何 要 调 PH4.5~5.0?2、 大 豆 中 哪 类 蛋 白 含 量 最 多 ?3、 采 用 Folin 的 酚 法 测 定 样 品 的 蛋 白 质 含 量 时 , 样 品 中 的 什 么 物 质 对 测 定 结 果 有 干 扰 ?4、 作 为 标 准 蛋 白 的 酪 蛋 白 在 应 用 时 有 何 要 求 。18

实 验 七 大 蒜 细 胞 SOD 的 提 取 和 分 离一 、 实 验 目 的通 过 大 蒜 细 胞 SOD 的 提 取 与 分 离 , 学 习 和 掌 握 蛋 白 质 和 酶 的 提 取 与 分 离 的 基 本 原 理 和操 作 方 法 。二 、 实 验 原 理超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 是 一 种 具 有 抗 氧 化 、 抗 衰 老 、 抗 辐 射 和 消 炎 作 用 的 药 用 酶 。它 可 催 化 超 氧 负 离 子 (O 2- ) 进 行 歧 化 反 应 , 生 成 氧 和 过 氧 化 氢 。 大 蒜 蒜 瓣 和 悬 浮 培 养 的大 蒜 细 胞 中 含 有 较 丰 富 的 SOD, 通 过 组 织 或 细 胞 破 碎 后 , 可 用 pH7.8 磷 酸 缓 冲 液 提 取 出 。由 于 SOD 不 溶 于 丙 酮 , 可 用 丙 酮 将 其 沉 淀 析 出 。 植 物 叶 片 在 衰 老 过 程 中 发 生 一 系 列 生 理生 化 变 化 , 如 核 酸 和 蛋 白 质 含 量 下 降 、 叶 绿 素 降 解 、 光 合 作 用 降 低 及 内 源 激 素 平 衡 失 调 等 。这 些 指 标 在 一 定 程 度 上 反 映 衰 老 过 程 的 变 化 。 近 来 大 量 研 究 表 明 , 植 物 在 逆 境 胁 迫 或 衰 老过 程 中 , 细 胞 内 自 由 基 代 谢 平 衡 被 破 坏 而 有 利 于 自 由 基 的 产 生 。 过 剩 自 由 基 的 毒 害 之 一 是引 发 或 加 剧 膜 脂 过 氧 化 作 用 , 造 成 细 胞 膜 系 统 的 损 伤 , 严 重 时 会 导 致 植 物 细 胞 死 亡 。 自 由基 是 具 有 - 未 配 对 价 电 子 的 原 子 或 原 子 团 。 生 物 体 内 产 生 的 自 由 基 主 要 有 超 氧 自 由 基(O )、 羟 自 由 基 (OH)、 过 氧 自 由 基 (ROD)、 烷 氧 自 由 基 (RO) 等 。 植 物 细 胞 膜 有酶 促 和 非 酶 促 两 类 过 氧 化 物 防 御 系 统 , 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)、 过 氧 化 氢 酶 (CAT)、 过氧 化 物 酶 (POD) 和 抗 坏 血 酸 过 氧 化 物 酶 (ASA-POD) 等 是 酶 促 防 御 系 统 的 重 要 保 护 酶 。抗 坏 血 酸 (VC)、VE 和 还 原 型 谷 胱 甘 肽 (GSH) 等 是 非 酶 促 防 御 系 统 中 的 重 要 抗 氧 化 剂 。SOD、CAT 等 活 性 氧 清 除 剂 的 含 量 水 平 和 O 2- 、H 2 O 2 、OH. 和 O 2 等 活 性 氧 的 含 量 水 平 可作 为 植 物 衰 老 的 生 理 生 化 指 标 。由 于 超 氧 自 由 基 (O ) 为 不 稳 定 自 由 基 , 寿 命 极 短 , 测 定 SOD 活 性 一 般 为 间 接 方 法 。并 利 用 各 种 呈 色 反 应 来 测 定 SOD 的 活 力 。 核 黄 素 在 有 氧 条 件 下 能 产 生 超 氧 自 由 基 负 离 子O , 当 加 入 NBT 后 , 在 光 照 条 件 下 , 与 超 氧 自 由 基 反 应 生 成 单 甲 月 替 ( 黄 色 ), 继 而 还原 生 成 二 甲 月 替 , 它 是 一 种 蓝 色 物 质 , 在 560nm 波 长 下 有 最 大 吸 收 。 当 加 入 SOD 时 , 可以 使 超 氧 自 由 基 与 H+ 结 合 生 成 H2O2 和 O2, 从 而 抑 制 了 NBT 光 还 原 的 进 行 , 使 蓝 色 二甲 月 替 生 成 速 度 减 慢 。 通 过 在 反 应 液 中 加 入 不 同 量 的 SOD 酶 液 , 光 照 一 定 时 间 后 测 定560nm 波 长 下 各 液 光 密 度 值 , 抑 制 NBT 光 还 原 相 对 百 分 率 与 酶 活 性 在 一 定 范 围 内 呈 正 比 ,以 酶 液 加 入 量 为 横 坐 标 , 以 抑 制 NBT 光 还 原 相 对 百 分 率 为 纵 坐 标 , 在 坐 标 纸 上 绘 制 出 二者 相 关 曲 线 , 根 据 SOD 抑 制 NBT 光 还 原 相 对 百 分 率 计 算 酶 活 性 。 找 出 SOD 抑 制 NBT 光19

还 原 相 对 百 分 率 为 50% 时 的 酶 量 作 为 一 个 酶 活 力 单 位 (U)。三 、 器 材 与 试 剂1、 器 材恒 温 水 浴 锅 、 冷 冻 高 速 离 心 机 、 可 见 分 光 光 度 计 、 研 钵 、 玻 棒 、 烧 杯 、 量 筒2、 材 料 和 试 剂1)、 新 鲜 蒜 瓣2)、0.05mol/L 磷 酸 缓 冲 液 (pH7.8)3)、 氯 仿 - 乙 醇 混 合 液 : 氯 仿 : 无 水 乙 醇 =3:54)、 丙 酮 : 用 前 需 预 冷 至 4-10℃5)、0.05mol/L 碳 酸 盐 缓 冲 液 (pH10.2)6)、0.1mol/LEDTA 溶 液7)、2mmol/L 肾 上 腺 素 溶 液四 、 实 验 步 骤1、 组 织 细 胞 破 碎 : 称 取 5g 大 蒜 蒜 瓣 , 置 于 研 钵 中 研 磨 。2、SOD 的 提 取 : 破 碎 后 的 组 织 中 加 入 2-3 倍 体 积 的 0.05mol/L 磷 酸 缓 冲 液 (pH7.8), 继续 研 磨 20min, 使 SOD 充 分 溶 解 到 缓 冲 液 中 , 然 后 在 5000rpm 下 离 心 15min, 取 上 清 液 。3、 除 杂 蛋 白 : 上 清 液 加 入 0.25 体 积 的 氯 仿 - 乙 醇 混 合 液 搅 拌 15min,5000rpm 离 心 15min,得 到 的 上 清 液 为 粗 酶 液 。4、SOD 的 沉 淀 分 离 : 粗 酶 液 中 加 入 等 体 积 的 冷 丙 酮 , 搅 拌 15min,5000rpm 离 心 15min,得 SOD 沉 淀 。 将 SOD 沉 淀 溶 于 0.05mol/L 磷 酸 缓 冲 液 (pH7.8) 中 , 于 55-60℃ 热 处 理 15min,得 到 SOD 酶 液 。5、SOD 活 力 测 定取 3 根 小 试 管 , 将 上 述 提 取 液 、 粗 酶 液 和 酶 液 分 别 取 样 , 按 下 表 分 别 加 进 各 种 试 剂和 样 品 液 , 测 定 各 自 的 SOD 活 力 。 单 位 (mL)试 剂 空 白 管 对 照 管 样 品 管碳 酸 缓 冲 液 5.0 5.0 5.0EDTA 溶 液 0.5 0.5 0.5蒸 馏 水 0.5 0.5 -样 品 液 - - 0.5混 合 均 匀 , 在 30℃ 水 浴 中 预 热 5min肾 上 腺 素 液 - 0.5 0.520

加 入 肾 上 腺 素 后 , 继 续 保 温 2min, 然 后 立 即 在 480nm 处 测 定 光 密 度 。 对 照 管 和 样 品 管的 光 密 度 值 分 别 为 A 和 B。在 上 述 条 件 下 ,SOD 抑 制 肾 上 腺 素 自 氧 化 50% 所 需 的 酶 量 定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。 即 :酶 活 力 ( 单 位 )=2(A-B)N/A式 中 ,N—— 样 品 稀 释 倍 数 ;2—— 抑 制 肾 上 腺 素 自 氧 化 50% 的 换 算 系 数 。五 、 实 验 结 果根 据 提 取 液 、 粗 酶 液 和 酶 液 的 酶 活 力 和 体 积 , 计 算 纯 化 提 取 率 。六 、 注 意 事 项1、 酶 液 提 取 时 , 为 了 尽 可 能 保 持 酶 的 活 性 , 尽 可 能 在 冰 浴 中 研 磨 , 在 低 温 中 离 心 。2、 肾 上 腺 素 容 易 被 氧 化 , 故 操 作 时 要 尽 量 快 。以 对 单 糖 混 合 液 进 行 分 离 。 以 纤 维 素 作 为 支 持 物 , 把 它 均 匀 地 涂 布 在 玻 璃 板 上 成 一 薄 层 ,然 后 在 此 薄 层 上 进 行 层 析 即 为 纤 维 素 薄 层 层 析 。 纤 维 素 是 一 种 惰 性 支 持 物 , 它 与 水 有 较 强的 亲 和 力 而 与 有 机 溶 剂 亲 和 力 较 弱 。 层 析 时 吸 着 在 纤 维 素 上 的 水 是 固 定 相 , 而 展 层 溶 剂 是流 动 相 。 当 欲 被 分 离 的 各 种 物 质 在 固 定 相 和 流 动 相 中 的 分 配 系21

实 验 八 、 血 清 胆 固 醇 的 定 量 测 定 ( 磷 硫 铁 法 )一 、 实 验 目 的 :掌 握 磷 硫 铁 法 测 定 血 清 胆 固 醇 的 原 理 、 方 法 及 临 床 意 义 。二 、 实 验 原 理 :总 胆 固 醇 的 测 定 有 化 学 比 色 法 ( 磷 硫 铁 法 和 邻 苯 二 甲 醛 法 ) 和 酶 学 方 法 ( 试 剂 盒 ) 两 类 。本 实 验 采 用 磷 硫 铁 法 测 定 血 清 胆 固 醇 含 量 。用 无 水 乙 醇 提 取 血 清 中 的 胆 固 醇 , 再 与 硫 磷 铁 试 剂 作 用 , 产 生 颜 色 反 应 , 呈 色 度 与 胆固 醇 含 量 成 正 比 , 可 用 比 色 法 测 定 血 清 中 胆 固 醇 含 量 。血 清 经 无 水 乙 醇 处 理 , 蛋 白 质 被 沉 淀 , 胆 固 醇 及 其 酯 溶 解 在 无 水 乙 醇 。 在 乙 醇 提 取 液中 , 加 磷 硫 铁 试 剂 , 胆 固 醇 及 其 酯 与 试 剂 形 成 比 较 稳 定 的 紫 红 色 化 合 物 , 此 物 质 在 560nm波 长 处 有 特 征 吸 收 峰 , 可 用 比 色 法 作 胆 固 醇 的 定 量 测 定 。 正 常 血 清 中 胆 固 醇 的 含 量 有 随 年龄 增 大 而 增 加 的 趋 势 , 其 平 均 正 常 值 在 110~220mg/100mL。胆 固 醇 含 量 在 400mg/100mL 内 , 与 A( 或 OD) 值 呈 良 好 线 性 关 系 。三 、 器 材 与 试 剂1、 仪 器 :722 分 光 光 度 计 、 台 式 离 心 机 、 试 管 及 试 管 架 、 刻 度 吸 量 管 或 移 液 器 等 。2、 试 剂 :(1)10% 三 氯 化 铁 溶 液 :10gFeCl 3 .6H 2 O (A.R) 溶 于 磷 酸 (A.R) , 定 容 至 100mL。 储 于 棕色 瓶 , 冷 藏 。(2) 磷 硫 铁 试 剂 : 取 10%FeCl 3 溶 液 1.5mL 于 100mL 棕 色 容 量 瓶 内 , 加 浓 硫 酸 (A.R) 至刻 度 。(3) 胆 固 醇 标 准 储 液 : 准 确 称 取 胆 固 醇 80mg, 溶 于 无 水 乙 醇 , 定 容 至 100mL。(4) 胆 固 醇 标 准 溶 液 : 将 储 液 用 无 水 乙 醇 准 确 稀 释 10 倍 即 得 。 每 毫 升 含 0.08mg 胆 固 醇 。(5) 无 水 乙 醇 (A.R) 、 无 水 乙 醇 (A.R) 。四 、 实 验 步 骤(1) 吸 取 血 清 0.1mL 于 干 燥 离 心 管 , 先 加 无 水 乙 醇 0.4mL, 摇 匀 后 再 加 无 水 乙 醇 2.0 mL,摇 匀 ,10 分 钟 后 离 心 (3000rpm 离 心 5 min), 上 清 液 备 用 ( 分 两 次 加 入 乙 醇 的 目 的 是 使作 用 完 全 )。(2) 取 干 燥 试 管 3 支 , 编 号 , 分 别 加 入 无 水 乙 醇 1.0mL( 空 白 管 )、 胆 固 醇 标 准 溶 液 1.0mL22

( 标 准 管 )、 上 述 乙 醇 提 取 液 1.0mL( 样 品 管 ), 各 管 皆 加 入 磷 硫 铁 试 剂 1.0mL, 摇 匀 ,10分 钟 后 , 分 别 转 移 至 0.50 cm 光 径 的 比 色 杯 内 , 用 分 光 光 度 计 560nm 比 色 。管 号 / 试 剂 测 定 管 标 准 管 空 白 管乙 醇 抽 提 液 1.0 mL胆 固 醇 标 准 应 用 液 1.0 mL无 水 乙 醇1.0 mL磷 硫 铁 试 剂 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mLA(OD)硫 磷 铁 试 剂 须 沿 管 壁 缓 缓 加 入 , 与 乙 醇 液 分 成 两 层 , 立 即 迅 速 振 摇 20 次 , 放 置 10分 钟 ( 冷 却 至 室 温 ) 后 , 于 560nm 进 行 比 色 , 以 空 白 管 调 零 读 取 各 管 吸 光 度 。计 算(1) 通 过 制 作 标 准 曲 线 来 求 得 血 清 胆 固 醇 的 含 量 。(2) 因 胆 固 醇 含 量 在 400mg/100mL 内 , 与 A( 或 OD) 值 呈 良 好 线 性 关 系 , 可 由 吸A2C2光 值 A 的 比 值 求 其 含 量 = , 本 实 验 即 用 此 法 。A C11(3) 如 按 方 法 1 使 用 血 清 为 样 品 , 亦 可 根 据 线 性 关 系 计 算A2100 A2血 清 胆 固 醇 mg%= 血 清 胆 固 醇 mg /100ml= × 0.08×= × 200A 0.04 AA 2 = 标 准 液 吸 光 值 ;A 1 = 样 品 液 吸 光 值注 意 事 项 :1、 颜 色 反 应 与 加 硫 磷 铁 试 剂 混 合 时 的 产 热 程 度 有 关 , 因 此 , 所 用 试 管 口 径 及 厚 度 要一 致 : 加 硫 磷 铁 试 剂 时 必 须 与 乙 醇 分 成 两 层 , 然 后 混 合 , 不 能 边 加 边 摇 , 否 则 显 色 不 完 全 ;硫 磷 铁 试 剂 要 加 一 管 混 合 一 管 , 混 合 的 手 法 , 程 度 也 要 一 致 ; 混 合 时 试 管 发 热 , 注 意 勿 使管 内 液 体 溅 出 , 以 免 损 伤 衣 服 、 皮 肤 、 眼 睛 。2、 所 用 试 管 和 比 色 杯 均 须 干 燥 , 浓 硫 酸 的 质 量 很 重 要 , 放 置 日 久 , 往 往 由 于 吸 收 水分 而 使 颜 色 反 应 降 低 。3、 空 白 管 应 接 近 无 色 , 如 带 橙 黄 色 , 表 示 乙 醇 不 纯 , 应 用 去 醛 处 理 。4、 人 血 清 胆 固 醇 正 常 含 量 为 2.8-5.9mmol/L(110-230mg/dl)。 计 算 公 式 中 的 0.026 为mg/dl 转 换 成 mmol/L 的 系 数 。1123

实 验 九 毛 发 中 提 取 L- 胱 氨 酸一 、 实 验 的 意 义 和 目 的( 角 蛋 白 水 解 / 等 电 点 沉 析 法 )胱 氨 酸 是 — 种 含 硫 氨 基 酸 。 在 医 药 上 , 是 一 种 昂 贵 的 化 学 药 品 , 有 促 进 机 体 细 胞 氧 化还 原 机 能 , 维 持 蛋 白 质 构 型 , 促 进 毛 发 生 长 和 防 止 皮 肤 老 化 , 增 加 白 血 球 和 抑 止 病 原 菌 等作 用 。 可 用 于 治 疗 肝 病 和 放 射 病 , 治 疗 膀 胱 炎 、 各 种 脱 发 症 、 神 经 痛 等 , 也 用 于 痢 疾 、 伤寒 、 流 感 、 气 喘 、 湿 疹 等 病 患 者 。 在 食 品 工 业 上 , 可 作 食 品 添 加 剂 , 营 养 增 补 剂 等 。通 过 本 实 验 的 学 习 和 实 践 沉 析 分 离 生 物 物 质 的 方 法 ; 熟 悉 pH 计 的 使 用 。二 、 实 验 原 理胱 氨 酸 多 从 各 种 毛 、 发 、 骨 、 角 等 角 蛋 白 中 水 解 提 取 分 离 获 得 , 也 可 以 采 用化 学 合 成 法 得 到 。 前 法 主 要 是 利 用 胱 氨 酸 的 两 性 电 解 质 性 质 , 在 其 低 的 离 子 强 度 下 ,调 节 由 角 蛋 白 等 水 解 出 的 L- 胱 氨 酸 溶 液 的 pH 至 等 电 点 , 使 其 净 电 荷 为 零 , 溶 解 度 大 为 降低 而 沉 淀 析 出 。三 、 材 料 、 试 剂 和 玻 仪1、 材 料 : 废 杂 毛 ( 猪 毛 、 羊 毛 、 人 发 等 )2、 试 剂 : 盐 酸 (30%、1%)、 氢 氧 化 钠 溶 液 (30%、1%)、 活 性 炭 、 氨 水 、0.05mol/L 溴标 准 溶 液 、0.5% 淀 粉 指 示 液 、0.05mol/L 硫 代 硫 酸 钠 标 淮 溶 液 、 碘 化 钾 、pH 试 纸 、 蒸 馏水 、2% 硫 酸 铜 。3、 仪 器 和 器 皿 : 分 析 天 平 、 搅 拌 器 、 可 调 温 电 炉 、 真 空 泵 、pH 计 、 恒 温 水 浴 锅 , 大烧 瓶 、 回 流 冷 凝 管 、 烧 杯 、 抽 滤 瓶 、 吸 管 、 玻 棒 、 碘 量 瓶 、 碱 式 滴 定 管 等 。4、 其 它 : 定 性 滤 纸 , 手 纸 , 铁 架 台 等 。四 、 实 验 步 骤1、 除 杂 将 毛 发 除 杂 ( 泥 土 、 纸 屑 、 柴 棍 等 杂 物 )、 用 60-80℃ 热 水 洗 涤 去 掉 毛 脂 , 捞起 晒 干 或 80-90℃ 烘 干 备 用 。2、 水 解 向 配 有 搅 拌 器 、 回 流 冷 凝 管 、 温 度 计 及 气 体 吸 收 装 置 ( 吸 收 挥 发 出 的HCL 可 再 利 用 ) 的 三 口 烧 瓶 中 依 次 加 入 300g 毛 发 和 600mL30% 盐 酸 , 在 l02-110℃ 下水 解 9h。 用 双 缩 脲 试 剂 检 验 至 毛 发 完 全 水 解 。 当 水 解 完 全 时 , 停 止 回 流 , 趁 热 抽 滤 , 取滤 液 备 用 。3、 中 和 滤 液 ( 可 取 50mL) 用 30% 氢 氧 化 钠 中 和 , 在 加 氢 氧 化 钠 时 要 不 停 的搅 拌 , 不 断 测 试 (pH 试 纸 测 定 ), 当 pH 为 4 时 ( 此 时 水 解 液 与 碱 液 比 约 为 5:4,v/v),24

改 用 1% 氢 氧 化 钠 中 和 , 至 pH=4.7- 4.8(pH 计 测 定 )。 搅 拌 30min, 低 温 静 置 12h 以 上 。抽 滤 得 粗 品 。( 需 要 时 可 用 离 心 倾 析 法 )4、 提 纯 将 粗 品 溶 于 适 量 的 1% 盐 酸 溶 液 ( 可 用 150mL) 中 , 控 制 温 度 在 90-98℃, 加 入 相 当 于 粗 品 重 量 12%-13% 的 活 性 炭 , 搅 拌 并 脱 色 (2-3h) 至 滤 液 为 无 色 透 明 溶液 。 抽 滤 得 滤 液 , 用 30% 和 1% 的 NaOH 中 和 至 pH4.8 左 右 , 低 温 静 置 24h, 过 滤 收 集 得粗 品 Ⅱ( 如 果 效 果 不 错 , 可 以 作 为 成 品 使 用 )。5、 精 制 取 粗 品 Ⅱ 加 入 8 倍 质 量 的 6% 盐 酸 重 新 溶 解 , 控 制 温 度 在 50-60℃,加 入 活 性 炭 进 行 脱 色 , 保 温 搅 拌 脱 色 1h, 过 滤 后 用 12% 的 氨 水 在 搅 拌 条 件 下 进 行 中和 , 直 至 pH=4.8, 靜 置 5-6h, 即 析 出 精 品 , 用 蒸 馏 水 洗 至 无 氯 离 子 ,60℃ 干 燥 。6、 产 品 检 测 称 取 0.1000g 样 品 置 于 碘 量 瓶 中 , 加 3mL 1mo1/L 氢 氧 化 钠 及 3mL 水溶 解 , 再 加 30mL 水 及 50mL 0.05mol/L 溴 标 准 溶 液 和 10mL 盐 酸 , 立 即 密 封 , 振 摇 5min,放 置 10min, 在 冰 浴 中 冷 却 , 加 2g 碘 化 钾 振 摇 溶 解 , 暗 处 放 置 10min, 用 0.05mol/L 硫 代硫 酸 钠 标 淮 溶 液 滴 定 , 近 终 点 时 , 加 3mL 0.5% 淀 粉 指 示 液 , 继 续 滴 定 至 溶 液 蓝 色 消 失 ,同 时 作 空 白 试 验 。L— 胱 氨 酸 含 量 %(x) 按 下 式 计 算 :x=(V 1 —V 2 )×C×0.02403×100/G式 中V 1 —— 空 白 实 验 中 硫 代 硫 酸 钠 标 淮 溶 液 的 用 量 (d)V 2 —— 硫 代 硫 酸 钠 标 淮 溶 液 的 用 量 (d)C—— 硫 代 硫 酸 钠 标 淮 溶 液 的 浓 度 (mol/L)G—— 样 品 重 量 (g);0.02403—— 每 mmol 的 L— 胱 氨 酸 的 g 数 。五 、 注 意 事 项1、 水 解 终 点 检 查 : 取 反 应 液 2mL, 加 10% 氢 氧 化 钠 2mL, 然 后 滴 入 2% 硫 酸 铜 4-5滴 , 如 不 变 色 , 即 水 解 完 全 。2、pI 值 应 采 用 pH 计 测 量 。3、 反 应 中 温 度 应 较 好 的 控 制 。六 、 实 验 报 告1、 在 脱 色 过 程 中 , 使 用 的 活 性 炭 是 不 是 越 多 越 好 ? 为 什 么 ?2、 简 述 胱 氨 酸 提 取 的 原 理 和 技 术 关 键 。25

实 验 十 植 物 胡 萝 卜 素 的 分 离 与 含 量 测 定一 、 实 验 目 的( 柱 层 析 / 分 光 光 度 法 )1831 年 , 瓦 坎 罗 德 尔 (Wackenroder) 从 胡 萝 卜 中 分 离 到 了 胡 萝 卜 素 , 但 直 到 20 世纪 30 年 代 , 胡 萝 卜 素 的 化 学 结 构 才 得 以 确 定 。 植 物 中 的 胡 萝 卜 素 经 人 体 吸 收 后 , 可 以 在体 内 转 变 为 有 生 理 活 性 的 维 生 素 A, 其 中 起 主 要 作 用 的 是 β- 胡 萝 卜 素 。 胡 萝 卜 素 能 够 治 疗因 维 生 素 A 缺 乏 所 引 起 的 各 种 疾 病 。 此 外 , 胡 萝 卜 素 还 能 够 有 效 清 除 体 内 的 自 由 基 , 预防 和 修 复 细 胞 损 伤 , 抑 制 DNA 的 氧 化 , 预 防 癌 症 的 发 生 。β- 胡 萝 卜 素 还 可 以 作 为 禽 畜 饲料 添 加 剂 , 能 提 高 鸡 的 产 蛋 率 , 还 可 以 提 高 牛 的 生 殖 能 力 。β- 胡 萝 卜 素 具 有 优 良 的 着 色 性能 , 着 色 范 围 是 黄 色 、 橙 红 , 着 色 能 力 强 , 色 泽 稳 定 均 匀 , 能 与 K、Zn、Ca 等 元 素 并 存而 不 变 色 , 尤 其 适 合 添 加 在 儿 童 食 品 中 。 因 此 , 被 广 泛 作 为 食 品 、 饮 料 及 饲 料 的 添 加 剂 使用 。β- 胡 萝 卜 素 本 身 是 油 溶 性 的 , 非 常 适 合 油 性 产 品 或 蛋 白 质 类 产 品 的 开 发 , 如 人 造 奶 油 、胶 囊 、 鱼 浆 制 品 、 素 食 产 品 、 速 食 面 、 调 理 包 等 等 。 因 此 ,β- 胡 萝 卜 素 是 联 合 国 粮 农 组 织和 世 界 卫 生 组 织 食 品 添 加 剂 联 合 委 员 会 认 可 的 无 毒 、 有 营 养 的 食 品 添 加 剂 。 研 究 还 表 明 ,将 抗 氧 化 维 生 素 涂 抹 在 皮 肤 上 , 不 仅 能 防 止 紫 外 线 的 伤 害 , 还 能 促 进 对 已 被 伤 害 皮 肤 的 修复 , 使 皮 肤 保 持 弹 性 ,β- 胡 萝 卜 素 因 而 也 逐 渐 应 用 于 化 妆 品 等 新 兴 市 场 。通 过 本 实 验 的 学 习 , 掌 握 干 法 装 柱 操 作 技 术 和 液 相 色 谱 的 操 作 技 术 , 了 解 液 相 色 谱 的基 本 结 构 和 实 验 的 基 本 原 理 。二 、 实 验 原 理胡 萝 卜 素 常 和 叶 绿 素 、 叶 黄 素 等 共 同 存 在 于 植 物 中 , 这 些 色 素 都 能 被 有 机 溶 剂 提 取 出来 , 对 测 定 胡 萝 卜 素 有 干 扰 , 所 以 要 将 胡 萝 卜 素 与 其 它 色 素 分 开 。 目 前 广 泛 采 用 的 分 离 方法 是 柱 层 析 法 。 利 用 一 定 的 吸 附 剂 对 不 同 色 素 的 不 同 吸 附 能 力 , 将 样 品 提 取 液 中 有 生 理 价值 的 胡 萝 卜 素 从 其 它 色 素 中 分 离 出 来 , 在 适 当 的 条 件 下 , 各 种 色 素 被 吸 附 在 吸 附 柱 的 不 同位 置 上 , 形 成 色 谱 。 然 后 用 洗 脱 剂 将 所 需 要 的 胡 萝 卜 素 洗 脱 下 来 , 在 分 光 光 度 计 上 440nm波 长 处 测 定 其 浓 度 , 从 而 推 算 出 样 品 中 胡 萝 卜 素 的 含 量 。三 、 实 验 样 品 、 器 材 及 试 剂1、 样 品 : 紫 苏 叶2、 器 材 : 恒 温 水 浴 锅 , 有 机 溶 剂 冷 凝 回 流 装 置 , 分 液 漏 斗 125mL, 层 析 柱 200×10mm,抽 滤 装 置 125mL 抽 滤 瓶 , 试 管 , 分 光 光 度 计 。3、 试 剂 : 丙 酮 、 石 油 醚 60~90℃、 无 水 硫 酸 钠 , 吸 附 剂 : 氧 化 镁 ,900℃ 活 化 , 硅 藻 土 ,洗 脱 剂 : 丙 酮 : 石 油 醚 = 3:97。4、 胡 萝 卜 素 标 准 贮 备 液 , 溶 20mg 标 准 胡 萝 卜 素 于 3mL 氯 仿 中 , 然 后 以 石 油 醚 稀 至 50mL,26

此 液 浓 度 为 400mg/L。四 、 操 作 步 骤1、 提 取1.1 称 过 40 目 筛 干 样 品 3g, 放 入 500mL 圆 底 烧 瓶 中 , 加 入 40mL 丙 酮 : 石 油 醚 =3:7混 合 液 , 套 上 球 形 冷 凝 管 ( 以 每 秒 一 滴 的 回 流 速 度 调 整 水 流 加 热 温 度 )。1.2 在 水 浴 中 加 热 回 流 1h。1.3 将 混 合 提 取 液 通 过 塞 脱 脂 棉 漏 斗 滤 入 盛 有 70mL 水 的 125mL 分 液 漏 斗 中 。1.4 残 渣 用 石 油 醚 提 洗 数 次 , 每 次 用 约 5~8mL 石 油 醚 , 提 洗 液 倒 入 分 液 漏 斗 中 。1.5 轻 轻 振 荡 分 液 漏 斗 , 静 置 分 层 放 弃 水 相 , 每 次 用 水 70mL, 重 复 洗 涤 3 次 ( 最 后 一次 水 相 必 须 排 放 干 净 ), 除 去 丙 酮 , 加 一 勺 ( 约 1g) 无 水 Na 2 SO 4 于 分 液 漏 斗 中 吸 除 水 分 。2、 层 析2.1 层 析 柱 制 备(1) 层 析 柱 底 部 塞 脱 脂 棉 。(2) 将 层 析 柱 接 在 抽 滤 瓶 上 抽 气 。(3) 装 入 氧 化 镁 - 硅 藻 土 吸 附 剂 , 装 时 用 手 轻 击 管 柱 , 使 其 更 加 均 匀 , 装 入 吸 附 剂 高 度 约10cm。(4) 加 入 约 1cm 高 的 无 水 Na 2 SO 42.2 层 析(1) 加 石 油 醚 20mL 于 层 析 柱 内 , 使 吸 附 剂 湿 透 并 赶 走 其 中 的 空 气 。(2) 当 无 水 Na 2 SO 4 上 面 还 有 少 量 的 石 油 醚 时 , 立 即 将 提 取 液 自 分 液 漏 斗 注 入 层 析 柱 内 。(3) 取 洗 脱 剂 10mL 分 两 次 洗 涤 分 液 漏 斗 , 待 提 取 液 几 乎 全 部 进 入 Na 2 SO 4 时 , 注 入 层 析柱 内 。(4) 连 续 用 洗 脱 剂 淋 洗 层 析 柱 , 使 胡 萝 卜 素 随 溶 剂 洗 下 , 溶 液 即 出 现 黄 色 。(5) 取 另 一 抽 滤 瓶 收 集 胡 萝 卜 素 溶 液 , 继 续 淋 洗 至 滤 液 由 黄 色 变 成 无 色 为 止 。(6) 用 石油 醚 转 移 胡 萝 卜 素 溶 液 到 50 或 100mL 容 量 瓶 中 并 定 容 。3、 胡 萝 卜 素 溶 液 浓 度 测 定3.1 测 定 单 个 胡 萝 卜 素 标 准 溶 液 ( 浓 度 为 1.24mg/L) 吸 光 度 。( 用 400mg/L 胡 萝 卜 素标 准 贮 备 液 配 制 0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.8mg/L 的 系 列 标 准 溶 液 ,) 于 分 光 光 度计 上 440nm 波 长 处 , 以 石 油 醚 作 参 比 , 测 定 标 准 溶 液 的 吸 光 度 。( 胡 萝 卜 素 的 标 准 溶 液 亦可 用 0.02% 重 铬 酸 钾 溶 液 代 替 。0.02g/100mL, 每 mL 相 当 于 1.24μg 胡 萝 卜 素 .)3.2 样 品 溶 液 浓 度 测 定27

用 石 油 醚 调 整 样 品 溶 液 浓 度 , 使 测 定 所 得 吸 光 度 与 标 准 溶 液 测 得 的 吸 光 度 相 接 近 。3. 3、( 以 系 列 标 准 溶 液 浓 度 为 X, 吸 光 度 为 Y 作 回 归 方 程 , 由 回 归 方 程 求 得 样 品 测 定 溶液 浓 度 ) 与 胡 萝 卜 素 标 准 溶 液 吸 光 度 比 较 , 求 出 测 定 液 中 胡 萝 卜 素 浓 度 mg/L。( 四 ) 结 果 计 算胡 萝 卜 素 (mg/g)=五 、 实 验 报 告样 品 测 定 溶 液 浓 度 (mg/L)× 分 离 定 容 液 体 积 (mL) × 测 定 液 的 稀 释 倍 数样 品 重 (g)×10001、 简 述 胡 萝 卜 素 分 离 的 操 作 过 程 。2、 报 告 实 验 结 果 。28

实 验 十 一 黄 芪 多 糖 的 提 取 、 测 定( 自 行 设 计 实 验 )黄 芪 为 豆 科 植 物 , 是 一 种 常 用 扶 正 中 药 , 性 味 苦 , 微 温 , 古 书 记 载 “ 可 治 一 切 气 衰 血虚 之 症 ”, 具 有 补 气 固 表 的 功 能 。 而 黄 芪 多 糖 能 使 动 物 脾 脏 增 大 , 脾 内 浆 细 胞 增 生 , 促 进抗 体 合 成 。 且 能 对 抗 强 的 松 等 免 疫 抑 制 剂 的 影 响 , 对 抗 体 免 疫 功 能 亦 有 促 进 作 用 。一 、 实 验 材 料 和 试 剂黄 芪 ,95% 乙 醇 , 葡 萄 糖 标 准 品 , 苯 酚 , 浓 硫 酸二 、 实 验 步 骤1. 取 黄 芪 粉 末 80g, 水 煎 煮 两 次 , 第 一 次 10 倍 水 2 小 时 , 第 二 次 8 倍 水 1 小 时 。 合 并提 取 液 。2. 提 取 液 减 压 浓 缩 , 浓 缩 液 加 95% 乙 醇 使 最 后 醇 浓 度 达 70%, 静 置 。3. 沉 淀 部 分 干 燥 , 得 粗 黄 芪 多 糖 。4. 鉴 定 : 苯 酚 - 硫 酸 法29

实 验 十 二 类 胡 萝 卜 素 的 提 取 分 离 与 测 定( 自 行 设 计 实 验 )一 、 实 验 目 的掌 握 从 胡 萝 卜 或 番 茄 中 提 取 分 离 番 茄 红 素 和 β- 胡 萝 卜 素 的 原 理 和 方 法 。二 、 实 验 原 理番 茄 红 素 和 β- 胡 萝 卜 素 分 子 中 的 碳 骨 架 由 8 个 异 戊 二 烯 单 位 连 接 而 成 , 它 们 是 四 萜 类化 合 物 。 都 含 有 一 个 较 长 的 π-π 共 轭 体 系 , 可 吸 收 不 同 波 长 的 可 见 光 , 故 呈 现 一 定 的 颜 色 ,所 以 又 称 为 多 烯 色 素 。 结 构 见 教 材 94 页 。类 胡 萝 卜 素 是 指 结 构 上 与 胡 萝 卜 素 类 似 的 多 个 色 素 的 统 称 , 又 称 为 胡 萝 卜 色 素 类 化 合物 。 此 类 化 合 物 大 多 难 溶 于 水 , 易 溶 于 非 极 性 或 弱 极 性 的 有 机 溶 剂 。三 、 实 验 仪 器 及 试 剂仪 器 : 三 角 瓶 、 分 液 漏 斗 、 减 压 蒸 馏 装 置 、 量 筒 、 烧 杯 、 风 光 光 度 计试 剂 : 番 茄 、 食 盐 、 丙 酮 、 乙 酸 乙 酯 、 石 油 醚 、 乙 醇 、 无 水 硫 酸 镁四 、 实 验 步 骤1. 类 胡 萝 卜 素 的 提 取 :方 法 同 教 材 第 95 页 的 方 法 一 。2. 类 胡 萝 卜 素 的 测 定取 浓 缩 样 品 用 石 油 醚 稀 释 并 定 容 至 25mL 容 量 瓶 中 , 于 445nm 处 测 定 吸 光 度 。 据 标准 曲 线 计 算 类 胡 萝 卜 素 的 浓 度 , 再 计 算 类 胡 萝 卜 素 提 取 率 。 公 式 如 下 :A=0.2751c-0.0013( 参 考 )式 中 :A- 吸 光 度 ;C- 浓 度 ,mg/mL类 胡 萝 卜 素 提 取 率 = nCV/m×100%其 中 :n- 提 取 液 稀 释 倍 数C- 提 取 液 中 类 胡 萝 卜 素 的 浓 度 mg/mLV- 提 取 液 体 积 ,mLm- 番 茄 的 质 量 ,mg30

实 验 十 三 葡 萄 籽 油 的 提 取 与 鉴 定( 自 行 设 计 实 验 )葡 萄 籽 是 葡 萄 酒 厂 的 下 脚 料 , 经 晒 干 后 分 离 葡 萄 皮 、 葡 萄 梗 后 所 得 产 物 , 葡 萄 籽 油 因具 有 保 健 、 美 容 之 功 效 , 价 格 非 常 昂 贵 。葡 萄 籽 油 的 抗 氧 化 能 力 是 所 有 抗 氧 化 物 质 中 最 高 的 , 是 所 有 油 类 亚 油 酸 含 量 最 高 、 不饱 和 脂 肪 酸 比 例 最 高 的 ; 能 够 增 加 血 管 弹 性 、 阻 止 胆 固 醇 堆 积 以 及 减 少 血 小 板 凝 固 ; 葡 萄籽 油 渗 透 力 强 , 口 服 或 直 接 作 用 于 娇 嫩 和 敏 感 皮 肤 , 能 够 保 护 肌 肤 不 被 紫 外 线 破 坏 , 预 防皮 肤 胶 原 纤 维 和 弹 性 纤 维 老 化 , 保 持 皮 肤 弹 性 和 张 力 , 阻 止 皱 纹 产 生 和 皮 肤 下 垂 ; 能 有 效的 从 根 本 上 防 止 过 敏 性 疾 病 。 适 用 于 营 养 健 康 、 保 健 医 疗 或 美 容 产 品 的 营 养 添 加 剂 。一 、 实 验 仪 器 、 材 料 和 试 剂葡 萄 籽 , 石 油 醚 ( 不 同 沸 程 ), 乙 酸 乙 酯 , 正 己 烷索 氏 提 取 器 、 减 压 蒸 馏 装 置 、 滤 纸 、 粉 碎 机 、 恒 温 水 浴 锅二 、 实 验 步 骤1. 取 一 定 量 的 葡 萄 籽 粉 末 , 滤 纸 包 好 , 选 择 提 取 溶 剂 、 确 定 提 取 温 度 、 时 间 、 固 液 比进 行 提 取 葡 萄 籽 油 。2. 提 取 液 减 压 浓 缩 。3. 浓 缩 液 放 至 鼓 风 干 燥 箱 中 干 燥 至 恒 重 。4. 测 定 : 重 量 法 计 算 葡 萄 籽 油 提 取 率 , 并 观 察 颜 色 。31

实 验 十 四 不 同 茶 叶 产 物 的 提 取 及 分 离( 自 行 设 计 实 验 )实 验 要 求 : 了 解 不 同 茶 叶 产 物 的 性 质 和 提 取 工 艺 , 掌 握 溶 剂 萃 取 技 术 和 离 子 沉 淀 方 法 。实 验 内 容 : 茶 叶 中 含 有 大 量 的 茶 多 酚 、 茶 多 糖 等 物 质 , 它 们 具 有 抗 氧 化 、 提 高 免 疫 力 等 生理 功 能 。 茶 多 酚 是 一 种 小 分 子 酚 酸 类 物 质 , 主 要 以 儿 茶 素 、 表 儿 茶 素 的 形 式 存 在 , 可 通 过大 吸 附 树 脂 、 离 子 沉 淀 等 技 术 进 行 提 取 。 茶 多 糖 是 一 种 糖 缀 合 物 , 主 要 与 酚 类 及 蛋 白 质 结合 , 可 通 过 乙 醇 沉 淀 进 行 提 取 分 离 。实 验 所 需 基 本 仪 器 设 备 :1 小 型 万 能 粉 碎 机2 搅 拌 器3 水 浴 锅4 离 心 机5 旋 转 蒸 发 仪6 分 液 漏 斗32

实 验 十 五 豆 粕 中 大 豆 蛋 白 、 低 聚 糖 的 分 离( 自 行 设 计 实 验 )实 验 要 求 : 了 解 大 豆 分 离 蛋 白 、 低 聚 糖 的 性 质 , 掌 中 空 纤 维 滤 膜 浓 缩 分 离 技 术 及 喷 雾 干 燥技 术 。实 验 内 容 : 豆 粕 中 含 有 丰 富 的 蛋 白 质 、 低 聚 糖 、 膳 食 纤 维 等 物 质 。 大 豆 蛋 白 主 要 以 球 蛋 白为 主 , 粘 性 较 低 。 大 豆 低 聚 糖 以 棉 子 糖 、 水 苏 糖 为 主 具 有 较 好 的 双 歧 因 子 功 效 。 通 过 利 用膜 分 离 提 取 和 喷 雾 干 燥 方 法 将 提 取 的 物 质 制 成 粉 末 状 可 溶 性 颗 粒 。实 验 所 需 基 本 仪 器 设 备 :33

其 他 自 行 设 计 实 验 题 目实 验 十 六 发 酵 产 物 的 提 取 分 离 与 纯 化实 验 十 七 辣 椒 红 色 素 的 提 取 与 分 离实 验 十 八 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 红 豆 杉 细 胞 中 紫 杉 醇 的 含 量34