生物制品分离制备技术实验指导 - 沈阳农业大学网络教学平台

实 验 二 、 重 组 菌 细 胞 破 碎 及 酶 活 检 测一 、 实 验 目 的掌 握 超 声 波 细 胞 破 碎 方 法 及 木 聚 糖 酶 活 性 测 定 方 法二 、 实 验 原 理超 声 波 是 指 频 率 超 过 人 耳 可 听 范 围 (16~21kHz) 的 波 , 即 频 率 为 20kHz 以 上 的 波 。 微 生物 细 胞 在 超 声 波 的 作 用 下 , 细 胞 结 构 受 到 破 坏 , 而 使 细 胞 破 碎 。 超 声 波 进 行 细 胞 破 碎 的 效果 与 微 生 物 的 种 类 、 浓 度 、 超 声 波 频 率 、 输 出 功 率 和 破 碎 时 间 有 密 切 关 系 。 使 用 超 声 波 必须 注 意 的 是 控 制 强 度 在 一 定 限 度 , 即 刚 好 低 于 溶 液 产 生 泡 沫 的 水 平 。木 聚 糖 酶 的 活 性 通 常 是 测 定 其 水 解 底 物 木 聚 糖 后 生 成 的 产 物 的 还 原 末 端 —— 木 糖 的增 加 量 来 进 行 的 , 而 木 糖 的 含 量 可 以 利 用 其 与 某 些 显 色 试 剂 ( 如 DNS 试 剂 ,PAHBAH)反 应 后 生 成 在 特 定 波 长 下 有 特 异 吸 收 峰 的 有 色 化 合 物 , 从 而 通 过 分 光 光 度 法 测 出 。三 、 实 验 材 料 和 设 备A. 试 剂1 测 定 酶 活 用 试 剂 : 在 实 验 一 已 配 制20.5 % 燕 麦 木 聚 糖 :0.5 木 聚 糖 溶 于 100 mL 无 菌 水 中 , 在 磁 力 搅 拌 器 上 搅 拌 使 之 呈 均 一 的 悬 浮 液 , 加 终浓 度 0.02% 的 叠 氮 化 钠 防 止 微 生 物 生 长 。3 8X Binding buffer:40 mmol/L 咪 唑 ,4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH7.9 Tris-HCl , 最 终 pH 调 到 7.9B. 实 验 设 备分 光 光 度 计 、 水 浴 锅 、pH 计 、 冰 、 烧 杯 、 煮 沸 电 炉 、 煮 沸 用 的 浮 漂 、 移 液 管 、 磁 力搅 拌 器 、 超 声 破 碎 仪 、 高 速 离 心 机 、 离 心 管四 、 实 验 步 骤1 取 前 日 分 别 在 0h、2h、4h、6h、8h、10h 所 取 的 1mL 样 品 及 用 适 量 1X Binding buffer悬 浮 的 10h 发 酵 结 束 后 的 细 胞 ( 由 100 mL 发 酵 液 离 心 来 的 细 胞 用 4 mL 1X Binding buffer重 悬 ), 室 温 溶 化 后 , 用 超 声 波 破 碎 仪 破 碎 细 胞 。1mL 样 品 的 超 声 条 件 为 :50 Hz 超 声 15s,间 隔 10 秒 , 如 此 多 次 即 可 。 用 1X Binding buffer 悬 浮 的 细 胞 次 数 应 该 适 当 延 长 , 当 溶 液变 清 即 可 停 止 。2 破 碎 后 的 样 品 在 12000g,4℃ 离 心 20min, 弃 沉 淀 。1mL 的 样 品 用 来 检 测 酶 活 性 , 用3