试 管 号 8 9蛋 白 质 稀 释 液 (mL)1 1(mg)PH7.8 的 buffer(mL) 0 0Folin- 甲 试 剂 (mL) 1 1于 室 温 下 不 停 地 振 荡 10minFolin- 乙 应 用 液 (mL) 4 4立 即 摇 匀 , 在 55℃ 恒 温 水 浴 中 保 温 5min, 用 流 水 冷 却 1min 后 , 测 A650A650 值5 蛋 白 质 浓 度 的 计 算 :Pr(mg/mL)=A650 值 对 应 的 mg 数 (Pr)Pr 溶 液 的 mL 数× 稀 释 倍六 、 思 考 题1、 用 丙 酮 沉 淀 蛋 白 时 , 为 何 要 调 PH4.5~5.0?2、 大 豆 中 哪 类 蛋 白 含 量 最 多 ?3、 采 用 Folin 的 酚 法 测 定 样 品 的 蛋 白 质 含 量 时 , 样 品 中 的 什 么 物 质 对 测 定 结 果 有 干 扰 ?4、 作 为 标 准 蛋 白 的 酪 蛋 白 在 应 用 时 有 何 要 求 。18
实 验 七 大 蒜 细 胞 SOD 的 提 取 和 分 离一 、 实 验 目 的通 过 大 蒜 细 胞 SOD 的 提 取 与 分 离 , 学 习 和 掌 握 蛋 白 质 和 酶 的 提 取 与 分 离 的 基 本 原 理 和操 作 方 法 。二 、 实 验 原 理超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 是 一 种 具 有 抗 氧 化 、 抗 衰 老 、 抗 辐 射 和 消 炎 作 用 的 药 用 酶 。它 可 催 化 超 氧 负 离 子 (O 2- ) 进 行 歧 化 反 应 , 生 成 氧 和 过 氧 化 氢 。 大 蒜 蒜 瓣 和 悬 浮 培 养 的大 蒜 细 胞 中 含 有 较 丰 富 的 SOD, 通 过 组 织 或 细 胞 破 碎 后 , 可 用 pH7.8 磷 酸 缓 冲 液 提 取 出 。由 于 SOD 不 溶 于 丙 酮 , 可 用 丙 酮 将 其 沉 淀 析 出 。 植 物 叶 片 在 衰 老 过 程 中 发 生 一 系 列 生 理生 化 变 化 , 如 核 酸 和 蛋 白 质 含 量 下 降 、 叶 绿 素 降 解 、 光 合 作 用 降 低 及 内 源 激 素 平 衡 失 调 等 。这 些 指 标 在 一 定 程 度 上 反 映 衰 老 过 程 的 变 化 。 近 来 大 量 研 究 表 明 , 植 物 在 逆 境 胁 迫 或 衰 老过 程 中 , 细 胞 内 自 由 基 代 谢 平 衡 被 破 坏 而 有 利 于 自 由 基 的 产 生 。 过 剩 自 由 基 的 毒 害 之 一 是引 发 或 加 剧 膜 脂 过 氧 化 作 用 , 造 成 细 胞 膜 系 统 的 损 伤 , 严 重 时 会 导 致 植 物 细 胞 死 亡 。 自 由基 是 具 有 - 未 配 对 价 电 子 的 原 子 或 原 子 团 。 生 物 体 内 产 生 的 自 由 基 主 要 有 超 氧 自 由 基(O )、 羟 自 由 基 (OH)、 过 氧 自 由 基 (ROD)、 烷 氧 自 由 基 (RO) 等 。 植 物 细 胞 膜 有酶 促 和 非 酶 促 两 类 过 氧 化 物 防 御 系 统 , 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)、 过 氧 化 氢 酶 (CAT)、 过氧 化 物 酶 (POD) 和 抗 坏 血 酸 过 氧 化 物 酶 (ASA-POD) 等 是 酶 促 防 御 系 统 的 重 要 保 护 酶 。抗 坏 血 酸 (VC)、VE 和 还 原 型 谷 胱 甘 肽 (GSH) 等 是 非 酶 促 防 御 系 统 中 的 重 要 抗 氧 化 剂 。SOD、CAT 等 活 性 氧 清 除 剂 的 含 量 水 平 和 O 2- 、H 2 O 2 、OH. 和 O 2 等 活 性 氧 的 含 量 水 平 可作 为 植 物 衰 老 的 生 理 生 化 指 标 。由 于 超 氧 自 由 基 (O ) 为 不 稳 定 自 由 基 , 寿 命 极 短 , 测 定 SOD 活 性 一 般 为 间 接 方 法 。并 利 用 各 种 呈 色 反 应 来 测 定 SOD 的 活 力 。 核 黄 素 在 有 氧 条 件 下 能 产 生 超 氧 自 由 基 负 离 子O , 当 加 入 NBT 后 , 在 光 照 条 件 下 , 与 超 氧 自 由 基 反 应 生 成 单 甲 月 替 ( 黄 色 ), 继 而 还原 生 成 二 甲 月 替 , 它 是 一 种 蓝 色 物 质 , 在 560nm 波 长 下 有 最 大 吸 收 。 当 加 入 SOD 时 , 可以 使 超 氧 自 由 基 与 H+ 结 合 生 成 H2O2 和 O2, 从 而 抑 制 了 NBT 光 还 原 的 进 行 , 使 蓝 色 二甲 月 替 生 成 速 度 减 慢 。 通 过 在 反 应 液 中 加 入 不 同 量 的 SOD 酶 液 , 光 照 一 定 时 间 后 测 定560nm 波 长 下 各 液 光 密 度 值 , 抑 制 NBT 光 还 原 相 对 百 分 率 与 酶 活 性 在 一 定 范 围 内 呈 正 比 ,以 酶 液 加 入 量 为 横 坐 标 , 以 抑 制 NBT 光 还 原 相 对 百 分 率 为 纵 坐 标 , 在 坐 标 纸 上 绘 制 出 二者 相 关 曲 线 , 根 据 SOD 抑 制 NBT 光 还 原 相 对 百 分 率 计 算 酶 活 性 。 找 出 SOD 抑 制 NBT 光19