生物制品分离制备技术实验指导 - 沈阳农业大学网络教学平台

实 验 四蛋 白 质 的 水 解 和 氨 基 酸 的 纸 层 析 法 分 离一 、 实 验 目 的1. 学 习 水 解 蛋 白 质 的 方 法 。2. 掌 握 纸 层 析 的 基 本 技 术 。3. 学 习 用 纸 层 析 分 离 、 鉴 定 氨 基 酸 的 方 法 。二 、 实 验 原 理1. 蛋 白 质 的 水 解蛋 白 质 可 以 用 酸 、 碱 或 酶 如 胃 蛋 白 酶 , 胰 蛋 白 酶 , 糜 蛋 白 酶 水 解 成 最 终 产 物 氨 基 酸 。实 验 室 中 常 使 用 酸 解 法 水 解 蛋 白 质 。 当 在 6mol/L 盐 酸 溶 液 中 将 蛋 白 质 在 110℃ 加 热 大 约20 h, 肽 键 断 裂 , 此 时 蛋 白 质 完 全 分 解 为 氨 基 酸 。酸 法 水 解 蛋 白 质 的 优 点 是 在 水 解 过 程 中 不 发 生 外 消 旋 作 用 , 所 得 到 的 氨 基 酸 均 为 L一 氨 基 酸 。 大 多 数 氨 基 酸 在 煮 沸 酸 中 是 稳 定 的 , 但 色 氨 酸 则 完 全 被 破 坏 。 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸在 酸 解 过 程 中 或 多 或 少 地 也 有 破 坏 。 色 氨 酸 的 水 解 产 物 已 知 是 一 种 棕 黑 色 的 物 质 —— 腐 黑质 , 因 此 , 用 酸 法 水 解 蛋 白 质 得 到 的 水 解 液 为 棕 黑 色 的 。2. 纸 层 析 法 分 离 氨 基 酸纸 层 析 是 以 滤 纸 作 为 支 持 物 的 分 配 层 析 法 。 它 利 用 不 同 物 质 在 同 一 推 动 剂 中 具 有 不 同的 分 配 系 数 , 经 层 析 而 达 到 分 离 的 目 的 。 在 一 定 条 件 下 , 一 种 物 质 在 某 溶 剂 系 统 中 的 分 配系 数 是 一 个 常 数 , 若 以 K 表 示 分 配 系 数层 析 溶 剂 ( 又 称 推 动 剂 ), 是 选 用 有 机 溶 剂 和 水 组 成 的 。 滤 纸 纤 维 素 与 水 有 较 强 的 亲和 力 ( 纤 维 素 分 子 的 葡 萄 糖 基 上 的 -OH 基 与 水 通 过 氢 键 相 作 用 ) 能 吸 附 很 多 水 分 , 一 般 达滤 纸 重 的 22% 左 右 ( 其 中 约 有 6% 的 水 与 纤 维 素 结 合 成 复 合 物 ), 由 于 这 部 分 水 扩 散 作 用降 低 形 成 固 定 相 ; 而 推 动 剂 中 的 有 机 溶 剂 与 滤 纸 的 亲 和 力 很 弱 , 可 在 滤 纸 的 毛 细 管 中 自 由流 动 , 形 成 流 动 相 。 层 析 时 , 点 有 样 品 的 滤 纸 一 端 浸 入 推 动 剂 中 , 有 机 溶 剂 连 续 不 断 地 通过 点 有 样 品 的 原 点 处 , 使 其 上 的 溶 质 依 据 本 身 的 分 配 系 数 在 两 相 间 进 行 分 配 。 随 着 有 机 溶剂 不 断 向 前 移 动 , 溶 质 被 携 带 到 新 的 无 溶 质 区 并 继 续 在 两 相 间 发 生 可 逆 的 重 新 分 配 , 同 时溶 质 离 开 原 点 不 断 向 前 移 动 , 溶 质 中 各 组 分 的 分 配 系 数 不 同 , 前 进 中 出 现 了 移 动 速 率 差 异 ,通 过 一 定 时 间 的 层 析 , 不 同 组 分 便 实 现 了 分 离 。 物 质 的 移 动 速 率 以 Rf 值 表 示 :10