CamSep 2 S

ZASTOSOWANIE HPLC W BADANIACH
WOLNYCH RODNIKÓW I ANTYOKSYDANTÓW
Bronisław K. GŁÓD, Paweł PISZCZ, Paweł WANTUSIAK, Iwona KIERSZTYN
Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaska, ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce
Wolne rodniki i/lub antyoksydanty są istotne w naukach bio-medycznych oraz chemii
żywności i środowiska. Oznaczać je można różnymi technikami analitycznymi. Szczególną rolę
odgrywają techniki oparte na HPLC.
W trakcie wykładu omówiona zostanie możliwość zastosowania HPLC do oznaczania
zarówno wolnych rodników jak i antyoksydantów. W szczególności przedstawione zostaną techniki
oznaczania sumarycznego uszkodzenia oksydacyjnego przez wolne rodniki oraz całkowitego
potencjału antyoksydacyjnego (CPA).
CPA odniesione do, wygenerowanego w reakcji Fentona, rodnika hydroksylowego oparte są
analizie produktu reakcji z rodnikiem tzw. sensora. W wyniku konkurencyjnych reakcji próbki i
sensora zmiana powierzchni piku jest miarą CPA. Przebadano różne sensory (kwas salicylowy, p-
hydroksybenzoesowy, tereftalowy), warunki przeprowadzenia reakcji (pH, temperatura, czas
reakcji, stężenia reagentów), fazy stacjonarne (RP-18, IEC, GPC), ruchome (stężenie
rozpuszczalnika organicznego, pH) oraz detektory (UV, fluorymetryczny, elektrochemiczny, MS).
Zaletą opracowanej metody jest możliwość odniesienie CPA do najbardziej reaktywnego,
występującego w naturze, rodnika hydroksylowego i łatwej możliwości przeprowadzania pomiarów
przy różnych pH. Zbadano również możliwość zastosowania RP-HPLC z detekcją
elektrochemiczną do oznaczania CPA odniesionego do rodnika DPPH, stosowanego do oznaczeń
CPA za pomocą EPR i fotometrii. Nowa koncepcja polega na pomiarze sumarycznego pola
powierzchni pików próbki z chromatogramu zarejestrowanego za pomocą detektora
elektrochemicznego. W stosunku do pomiarów elektrochemicznych technika ta charakteryzuje się
znacznie niższym progiem wykrywalności i wyższą czułością. Ponadto zaletą proponowanego
rozwiązania jest odnoszenie CPA do różnych klas związków i antyoksydantów różnej mocy.
Opracowane metody zastosowane zostały do wyznaczania CPA czystych związków oraz
próbek rzeczywistych, surowicy krwi z różnych stanów chorobowych oraz różnych próbek
produktów spożywczych (ekstrakty ziół, napoje alkoholowe, wyroby pszczelarskie). Wyniki
skorelowane zostały z opracowanymi wcześniej i/lub znanymi metodami z literatury (TRAP,
metoda DPPH, Folina – Ciocalteua, różne techniki elektrochemiczne) oraz z parametrami
obliczonymi metodami numerycznymi (logP, E HOMO , H).
19