In vitro Untersuchungen zur Wirkung von Phytopharmaka auf die ...

34 Methoden
3.2 Messung der Radikalbildung mittels Luminol-vermittelter
Chemilumineszenz
Die Messung der Radikalproduktion erfolgte mittels Luminol-vermittelter Chemilumineszenz.
Dieses Verfahren beruht darauf, dass Luminol mit ROS unter Bildung von 5-
Aminophthalsäure und Emission von Licht der Wellenlänge 425 nm reagiert. Die
Photonen können im Luminometer gemessen werden, wobei das verwendete Gerät,
Luminometer TD-20/20 (Turner Designs, Promega, Mannheim), keine direkte Photonenzählung
in „counts per minute“ durchführte, sondern nur eine Integration über
die Messzeit und den Messwert als so genannte „relative light units“ (RLU) lieferte.
Ileumpräparate der WT- und der GPx1-KO-Maus sowie humane Gewebeproben
wurden, wie in Kap. 2.6 beschrieben, vorbereitet und vor Beginn jeder Messung
gewogen, um die späteren Messergebnisse auf das Gewicht beziehen zu können.
Nach Messung der basalen Radikalproduktion wurde die Wirkung von STW 5 auf die
Peroxid-stimulierte Radikalbildung wie im folgenden Schema veranschaulicht
untersucht: Die mit Gewebe und Lösung beschickten Küvetten wurden im konstant auf
37°C beheizten Luminometer platziert und die Radikalbildung jeweils für zehn Minuten
gemessen:
495µl Tyrode +
5µl Luminol [110µM]
Ileumpräparat Peroxid bzw.
STW 5
STW 5 bzw.
Peroxid
10 Min. 10 Min. 10 Min. 10 Min.
RLU RLU RLU RLU
Die Peroxide H2O2 und tBHP wurden jeweils in den Konzentrationen 10, 500 und
1000 µM eingesetzt. STW 5 [10 µl/ml] wurde einerseits nach, andererseits am WT-
Ileum auch vor der Peroxid-Applikation zupipettiert.
Zur Kontrolle wurden Referenzmessungen ohne Ileumpräparate durchgeführt, um die
Chemilumineszenz der Peroxide mit Luminol zu zeigen. Diese ermittelten „Peroxid-
Leerwerte“ sind ebenfalls im Ergebnisteil dargestellt. Die Radikalbildung der untersuchten
Ileumpräparate wurde in RLU sowie in RLU pro g Gewebe angegeben.