In vitro Untersuchungen zur Wirkung von Phytopharmaka auf die ...

36 Methoden
Gelelektrophorese
Mittels der Agarose-Gelelektrophorese wurden die PCR-Produkte, d.h. die Nukleinsäure-Stränge,
nach ihrer Größe unter Anlegen einer Spannung von 77 Volt aufgetrennt.
Bei dieser Methode wurden durch Zugabe von Ethidiumbromid [0,6 µg/ml] zum
Agarose-Gel [1 %] die einzelnen DNA-Fragmente sichtbar gemacht, da Ethidiumbromid
durch Interkalation an die Duplex-DNA bindet und damit eine Intensivierung der
Fluoreszenz-Emission bewirkt. Mit Hilfe der ebenfalls in einer Gelkammertasche applizierten
DNA-Leiter konnten anschließend unter UV-Licht die DNA-Stränge anhand ihrer
Basenpaare identifiziert werden (Abb. 6).
509bp
293bp
DNA-
Leiter GPx1-/- WT
Abb.6: Gelelektrophorese zur
Bestimmung des Genotyps:
Anhand der DNA-Leiter wurden
die Fragmente identifiziert.
3.3.2 Phänotypisierung: Bestimmung der spezifischen Aktivität der
Glutathionperoxidase
Um das Resultat der KO-Manipulation bewerten zu können, sollte die spezifische
Aktivität der GPx in Erythrozyten, in der Leber und im Ileum der GPx1-(-/-)- und der
WT-Maus bestimmt werden. Hierfür wurden einerseits Hämolysate der isolierten
Erythrozyten verwendet, gewonnen durch osmotische Schädigung und anschließende
Zentrifugation. Andererseits wurden Proben aus der Leber und dem Ileum vorbereitet,
indem das jeweilige Gewebe mit dem ca. dreifachen Volumen an Kaliumphosphat-
Puffer homogenisiert und danach bei 5000 U/min für fünf Minuten zentrifugiert
wurde.