Alpha-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre ...

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3. MATERIAL UND METHODEN Übersicht der Adipocytenplasmamembranpräparation 2 x 40-45g Fettgewebe bei Raumtemperatur auftauen, mit Skalpell grob zerkleinern und in je 120 ml Saccharoseextraktionsmedium geben 5 Sekunden homogenisieren (Ultra-Turrax) und filtrieren 100µl H zur Enzymbestimmung entnehmen auf Reagenzgläser verteilen und 15 Minuten bei 14500g zentrifugieren Flotiertes Fett entfernen, Überstand (Ü14) filtrieren, Gesamtvolumen dokumentieren 200µl Ü14 zur Enzymbestimmung entnehmen Pellet (P14) in 400µl gepufferter NaCl-Lösung resuspendieren 100µl P14 zur Enzymbest. entnehmen und Rest verwerfen Ü14 auf Reagenzgläser verteilen und 30 Minuten bei 39000g zentrifugieren Gesamtvolumen Überstand (Ü39) ermitteln 200µl Ü39 zur Enzymbest. Entnehmen und Rest verwerfen Pellet fraktioniert in gepufferter NaCl-Lösung resuspendieren Obere Schicht (P39) auf neue Reagenzgläser verteilen 100µl P39 zur Enzymbestimmung entnehmen 100 µl der unteren Schicht (M) zur Enzymbest. in ein Eppendorfcup überführen Rest verwerfen P39 für 30 Minuten bei 39000g zentrifugieren Überstand absaugen und Pellet (PM) in 400µl gepufferter NaCl-Lösung aufnehmen, resuspendieren 100µl zur Enzymbestimmung entnehmen PM in Kryoröhrchen überführen und bei –80°C bis zur Rezeptorenmessung lagern 14
3.5 Proteinbestimmung 3. MATERIAL UND METHODEN Um die Ergiebigkeit der Plasmamembranaufarbeitung verifizieren zu können, musste der Proteingehalt der einzelnen Aufarbeitungsfraktionen (Homogenat – H, Überstand 14 – Ü 14, Pellet 14 – P 14, Überstand 39 – Ü 39, Pellet 39 – P 39, Mitochondrien – M, Plasmamembran – PM) gemessen werden. Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Mikromethode nach LOWRY (1951). In einem Probenansatz wurden die jeweiligen Aufarbeitungsfraktionen zunächst 1:10 verdünnt und dann in einem Doppelansatz gemessen. Dazu wurden je 100 µl der verdünnten Probe in ein Eppendorfcup pipettiert und je 1 ml eiskalte 10%-ige TCE hinzugegeben. Im Anschluss mussten die Proben in einer Eppendorftischzentrifuge 5 Minuten bei 14000 g zentrifugiert werden. Danach wurde der TCE - Überstand abgegossen, die Eppendorfcups kräftig ausgeschlagen und mit je 100 µl 1 M NaOH beschickt und gemischt. Hiernach folgte eine zehnminütige Inkubation bei 37°C. Im Folgenden wurden die Proben mit 1 ml der Lowry 1 - Lösung und 100 µl der Lowry 2 - Lösung versetzt, 2 Minuten auf einem Rüttler durchmischt und mit geschlossenem Deckel weitere 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Als Standard kam Bovines Serumalbumin in einer Konzentration von 25 µg/100 µl zur Anwendung, der Blindwert bestand aus Reinstwasser. Die Messung erfolgte nach kurzem Abkühlen auf Eis und erneutem Durchmischen photometrisch (Ultrospec III Spectrophotometer, Pharmacia LKB) bei 750 nm. 3.6 Bestimmung von Markerenzymen Zur Kontrolle der Ergiebigkeit bzw. Aufreinigung der Plasmamembran während der Präparation wurden die Markerenzyme 5’Nucleotidase und Cytochrom-C-Oxidase verwendet. 3.6.1 Aktivität der 5’Nucleotidase Die 5’Nucleotidase (5’NT) stellt ein membranspezifisches Markerenzym dar, welches Phosphat von Nucleotiden abspaltet. Wird zu der Plasmamembran Adenosinmonophosphat (AMP) hinzugegeben, bildet das freigesetzte Phosphat mit Molybdat-Malachitgrün einen Farbkomplex und kann photometrisch gemessen werden. 15
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8. LITERATURVERZEICHNIS LAFONTAN, M
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8. LITERATURVERZEICHNIS NOBLES, M.,
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9 Anhang 9.1 Bezugsquellen 9.1.1 Ve
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9. ANHANG 9.2 Zusammensetzungen der
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9.3 Tabellen Tab. 2. Daten der Prob
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9. ANHANG Tab. 4. Aufreinigungsfakt
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9. ANHANG Tab. 6. Aufreinigungsfakt
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Herrn Prof. Dr. Dr. H.-P. Sallmann
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