Alpha-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre ...

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1. Auflage 2009
© 2009 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-941703-24-7
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
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www.dvg.net

Aus dem Institut für Physiologische Chemie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Alpha-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe
und ihre Bedeutung im Hinblick auf das
Hyperlipämie-Syndrom des Ponys
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Britta Zahn
aus Frankfurt a. M.
Hannover 2009

Wissenschaftiche Betreuung: Univ. – Prof. Dr. Dr. h.c. H. – P. Sallmann
1. Gutachter: Univ. – Prof. Dr. Dr. h.c. H. – P. Sallmann
2. Gutachter: Univ. – Prof. Dr. M. Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2009

Meinen Eltern
und meiner Tochter Lena Svenja

Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ........................................................................................................................... 1
2 Literaturübersicht zur Regulation des Fettstoffwechsels über Katecholaminrezeptoren... 3
3 Material und Methoden ...................................................................................................... 9
3.1 Versuchsaufbau .......................................................................................................... 9
3.2 Versuchstiere.............................................................................................................. 9
3.3 Gewinnung und Lagerung des Fettgewebes............................................................. 11
3.4 Präparation der Adipozytenplasmamembran ........................................................... 12
3.5 Proteinbestimmung................................................................................................... 15
3.6 Bestimmung von Markerenzymen ........................................................................... 15
3.6.1 Aktivität der 5’-Nucleotidase ........................................................................... 15
3.6.2 Aktivität der Cytochrom–C–Oxidase............................................................... 17
3.7 Messung der Adrenozeptoren per Radioligand-Bindungsassay............................... 18
3.7.1 Radioassay zur Bestimmung der α-adrenergen Rezeptoren............................. 18
3.7.2 Bestimmung der Rezeptoranzahl ..................................................................... 19
3.8 Adipozytenhistologie und Morphometrie ................................................................ 20
3.9 Statistische Auswertung ........................................................................................... 20
4 Ergebnisse ........................................................................................................................ 21
4.1 Ernährungszustand der Pferde und Ponys................................................................ 21
4.2 Ausbeute der Plasmamembrangewinnung ............................................................... 21

INHALTSVERZEICHNIS
4.3 Reinheit der Plasmamembranfraktion...................................................................... 21
4.3.1 5’Nucleotidase.................................................................................................. 21
4.3.2 Cytochrom-C-Oxidase ..................................................................................... 22
4.4 Optimierung der Radioligandenkonzentration zur Rezeptorenmessung.................. 23
4.4.1 α1-Adrenozeptoren............................................................................................ 23
4.4.2 α2-Adrenozeptoren ........................................................................................... 25
4.5 Proteinbindungskurve............................................................................................... 26
4.5.1 Proteinbindungskurve für die α1-Adrenozeptoren ........................................... 26
4.5.2 Proteinbindungskurve für die α2-Adrenozeptoren ........................................... 27
4.6 Ergebnisse der Rezeptorenmessung bei Pferd und Pony ......................................... 27
4.6.1 Anzahl der Bindungsstellen ............................................................................. 27
4.6.2 Vergleich der Adrenozeptor-Subtypen bei Pony und Pferd............................. 29
4.7 Adipozytenhistologie und Morphometrie ................................................................ 31
4.7.1 Vergleich Pony – Pferd .................................................................................... 31
4.7.2 Beziehung zwischen Adipozytengröße und Ernährungszustand ..................... 35
5 Diskussion ........................................................................................................................ 39
5.1 Versuchsanstellung und Methodik........................................................................... 39
5.1.1 Versuchstiere und Probenmaterial ................................................................... 39
5.1.2 Plasmamembranpräparation............................................................................. 40
5.2 Radioassay zur Bestimmung der α-adrenergen Rezeptoren..................................... 43

INHALTSVERZEICHNIS
5.3 Adipozytenmorphologie........................................................................................... 44
5.4 Bedeutung der eigenen Ergebnisse im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom... 46
5.4.1 Ätiologie der equinen Hyperlipämie ................................................................ 46
5.4.2 Klinische Symptomatik, Diagnose und Prognose ............................................ 47
5.4.3 Prärezeptale Faktoren der Lipolyse.................................................................. 49
5.4.4 Katecholaminrezeptoren................................................................................... 51
5.4.5 Postrezeptale Faktoren der Lipolyse ................................................................ 54
5.5 Schlussfolgerung ...................................................................................................... 55
6 Zusammenfassung............................................................................................................ 56
7 Summary .......................................................................................................................... 58
8 Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 60
9 Anhang ............................................................................................................................. 72
9.1 Bezugsquellen .......................................................................................................... 72
9.1.1 Verwendete Geräte / Software ......................................................................... 72
9.1.2 Reagenzien ....................................................................................................... 73
9.2 Zusammensetzungen der Pufferlösungen................................................................. 74
9.2.1 Pufferlösungen zur Adipozytenplasmamembranpräparation ........................... 74
9.2.2 Pufferlösungen zur Bestimmung der Enzymaktivitäten................................... 74
9.2.3 Pufferlösungen zur Rezeptorenmessung .......................................................... 75
9.3 Tabellen.................................................................................................................... 76

Abkürzungsverzeichnis
α alpha
A. Arterie
Aa. Arterien (arteriae)
Abb. Abbildung
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
AMP Adenosinmonophosphat
AP Alkalische Phosphatase
ATGL Adipose Trigyceride Lipase
ATP Adenosintriphosphat
ß beta
BCS Body Condition Scoring
BMI Body Mass Index
BSA Bovines Serumalbumin
Bspez. Spezifische Bindung
BUN Blood Urea Nitrogen
bzgl. bezüglich
bzw. beziehungsweise
c Konzentration
ca. circa
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
CCK Cholecystokinin
CCO Cytochrom C - Oxidase
cm Zentimeter
CPM counts per minute
CREA Creatinin
d. h. das heißt
DB cAMP Dibuturyl - zyklisches Adenosinmonophosphat
DPM desintegrations per minute
E Extinktion
EGTA Ethylenglycoltetraacetat

EIA Enteroinsulare Achse
et al. und andere (et alii)
f. folgende
FFS Freie Fettsäuren
fmol Femtomol
g Gramm
g Erdbeschleunigung (9,81 m 2 )
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
G – Protein guanylnucleotidbindendes Protein
Gi – Protein inhinbierendes G- Protein
Gs – Protein stimulierendes G- Protein
GGT Gamma Glutamyl Transferase
GIP Glucose-abhängiges Insulinotropes Polypeptid
GTP Guanosintriphosphat
H Homogenat
[ 3 H] Tritium
hgr. hochgradig
HSL Hormonsensitiven Lipase
i.d.R. in der Regel
kBq Kilobequerell
KD Gleichgewichtsdissoziationskonstante
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
LDH Laktat Dehydrogenase
LPL Lipoprotein Lipase
LSC Liquid Szintilation Cocktail
m Meter
mm Millimeter
M Mitochondrienfraktion
M Molar
MBq Megabecquerel (Aktivität einer radioaktiven Substanz [s-1])
mg Milligramm

min. Minute
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
mRNA messenger Ribonukleinsäure (messenger ribonucleinacid)
µg Mikrogramm
µg/ml Mikrogramm pro Milliliter
µl Mikroliter
µm Mikrometer
n Umfang der Stichprobe
5’NT 5’Nucleotidase
nM Nanomolar
nm Nanometer
NSB Nichtspezifische Bindung
o. g. oben genannte(n)
p Irrtumswahrscheinlichkeit
P Pellet
pH pH-Wert (negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration)
PIP2 Phosphatidylinositolbisphosphat
PKA Proteinkinase A
PKC Phosphokinase C
PLC Phospholipase C
PM Plasmamembranfraktion
pmol Picomol
pmol/l Picomol pro Liter
resp. respektive
RGS Protein Regulator of G-protein Signaling
SD Standardabweichung (standarddeviation)
SDH Sorbit Dehydrogenase
SEM Standardfehler des Mittelwerts (standarderror of the mean)
s. o. siehe oben
Stm. Stockmaß
R 2 Korrelationskoeffizient
RIA Radioimmuntest (radioimmunoassay)

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
TC Gesamtradioaktivität (totalcounts)
TCE Trichloressigsäure
TGL Triglyceride
u. und
u. a. unter anderem
u.d.N. unter der Nachweisgrenze
U Units
UpM Umdrehungen pro Minute
Ü Überstand
V. Vene
v. a. vor allem
VIP Vasoaktives intestinales Polypeptid (vasoactiv intestinal polypeptide)
VLDL Lipoproteine sehr niedriger Dichte (very low density lipoproteins)
z. B. zum Beispiel
z. Zt. zur Zeit

1 Einleitung
1. EINLEITUNG
Das equine Hyperlipämie-Syndrom beschreibt eine Entgleisung des Fettstoffwechsels, die
weltweit v. a. bei Ponys der kleineren Rassen vorkommt. Insbesondere sind Shetlandponys
und Kreuzungen hieraus, Miniponys und Esel betroffen, Großpferde erkranken hingegen nur
selten. Adipöse Tiere sind besonders gefährdet. Die Inzidenz liegt bei 5%, die Mortalität wird
mit 20 – 95% beziffert, wobei deutliche Rasseunterschiede beschrieben werden. Die
Hyperlipämie tritt infolge verschiedener Stresssituationen, wie z.B. Hunger, Trächtigkeit,
Parasitenbefall oder anderer Vorerkrankungen auf. Auch scheinen hormonelle Imbalancen
z.B. durch endogene ACTH-, Katecholamin- oder Cortisolausschüttungen bei der
Ätiopathogenese des Hyperlipämie-Syndroms eine Rolle zu spielen (DÜHLMEIER 1998,
BREIDENBACH et al. 1999, WRAGE 2002, RIEBANDT 2005).
Bei Ponys ist nach definierten Hungerphasen eine im Vergleich zum Pferd um das 7-fache
erhöhte Lipolyse und daraus resultierend höhere Plasmalipidspiegel (FFS, Triglyceride,
VLDL) festgestellt worden (BREIDENBACH et al. 1999). Diese deutliche
Lipolysesteigerung bei Ponyadipozyten konnte lediglich durch Stimulation mit Noradrenalin,
nicht jedoch durch cAMP bewirkt werden (RIEBANDT 2005). Bislang ist noch nicht
ausreichend geklärt, welche molekularen Mechanismen der Ätiologie des Hyperlipämie-
Syndroms zu Grunde liegen.
Die Wirkung von Noradrenalin auf den Fettstoffwechsel wird über plasmamembranständige
Katecholaminrezeptoren an Adipozyten vermittelt. Diese Adrenozeptoren stellen
Transmembranrezeptoren dar, die über Secondmessenger-Systeme die Wirkung von
Katecholaminen ermöglichen. Im Fettgewebe sind mindestens 5 Subtypen der adrenergen
Rezeptoren bekannt, wovon ß1, 2 und ß3-Adrenozeptoren über gekoppelte Gs-Proteine die
Lipolyse stimulieren, während α2-Adrenozeptoren per Gi-Proteine antilipolytisch wirken. Der
Rezeptorensubtyp α1 hat eine untergeordnete Funktion im Lipidmetabolismus. α1–
Adrenozeptoren bewirken den Anstieg von intrazellulärem Ca 2+ und aktivieren die
Phosphokinase C. Sie stimulieren die Glykogenolyse, aktivieren die Pyruvatdehydrogenase
und regulieren somit gewissermaßen den Glucoseuptake bzw. die Glucoseutilisation.
1

1. EINLEITUNG
Untersuchungen zum Besatz der Adipozytenmembran mit lipolysestimulierenden ß-
Adrenozeptoren im equinen Fettgewebe konnte keine Erklärung der gesteigerten
Lipolyseempfindlichkeit von Ponys liefern (WRAGE 2002). Da die α–Adrenozeptoren als
Gegenspieler der ß–Rezeptoren fungieren, könnte eine verminderte Hemmung der Lipolyse
durch eine geringere Besatzdichte von α-Adrenozeptoren im Fettgewebe von Ponys
ursächlich für die Entstehung der Hyperlipämie sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der α-
Adrenozeptorenbesatz der Fettzellmembran bei Pferd und Pony im Vergleich gemessen, um
die beobachteten rassespezifischen Unterschiede hinsichtlich der Ätiopathogenese des
Hyperlipämie-Syndroms bewerten zu können. Das Großpferd entwickelt diese
Stoffwechselerkrankung äußerst selten (NAYLOR et al. 1980; FIELD 1988; DUNKEL u. Mc
KENZIE 2003).
Für die Rezeptorenmessung musste zunächst aus Fettgewebsproben die
Adipozytenplasmamembran isoliert werden, der dann hochspezifische radioaktiv markierte
α-adrenerge Liganden zugesetzt wurden. Die Rezeptorbindungsstellen konnten dann per
ß-Counter gemessen werden.
2

2. LITERATURÜBERSICHT
2 Literaturübersicht zur Regulation des Fettstoffwechsels über
Katecholaminrezeptoren
Im nachfolgenden Literaturteil wird lediglich auf die Bedeutung der Katecholaminrezeptoren
für die Regulierung der Lipolyse des weißen Fettgewebes eingegangen, weil die
Rezeptorenanalyse (α-Rezeptoren) das Kernstück der Arbeit darstellt und auf die anderen
wichtigen Aspekte der Hyperlipämie-Erkrankung des Ponys sowohl in mehreren Vorläufer-
Dissertationen der Arbeitsgruppe ausführlich eingegangen wurde (DÜHLMEIER 1998,
WRAGE 2002, RIEBANDT 2005), als auch wichtige Hyperlipämiebefunde zu den
Ergebnissen der Arbeit im Diskussionsteil in Beziehung gesetzt werden.
Im Fettmetabolismus vermitteln an der Adipozytenplasmamembran im Wesentlichen α– und
ß-Rezeptoren die (anti-) lipolytische Wirkung der Katecholamine Adrenalin und
Noradrenalin. Die ß-adrenergen Rezeptoren beinhalten die Subtypen ß1, 2, 3 und stimulieren
intrazellulär die Lipolyse durch Aktivierung einer Signalkaskade. Bei den α-Adrenozeptoren
sind die Subtypen α1 und α2 zu differenzieren, wobei als Gegenspieler der ß-Rezeptoren v. a.
der Subtyp α2 fungiert. Die α1–Rezeptoren scheinen eine eher untergeordnete Rolle bei der
Lipolyse im Fettgewebe zu spielen. Sie bewirken den Anstieg von intrazellulärem Ca 2+ und
aktivieren die Phosphokinase C, ferner stimulieren sie die Glykogenolyse und aktivieren die
Pyruvatdehydrogenase (LAFONTAN und BERLAN 1993).
Die Katecholaminrezeptoren (α und ß) sind G-Protein-gebundene Transmembranrezeptoren,
d.h. durch die Bindung von (Nor-) Adrenalin an den Rezeptor wird die Konformation des
heterotimeren G–Protein (guanylnucleotidbindendes Protein) geändert. Über die aktivierte
GTP–Form wird wiederum die membranständige Adenylatcyclase stimuliert (Gs gekoppelt an
ß–Rezeptoren), oder inhibiert (Gi gekoppelt an α–Rezeptoren). In der Folge steigt (Gs) bzw.
sinkt (Gi) die Konzentration von cAMP, wodurch die Aktivität der Proteinkinase A (PKA)
und schließlich der Hormonsensitiven Lipase (HSL) reguliert wird. Die aktivierte
(phosphorylierte) HSL katalysiert die Hydrolyse der Triglyzeride (TGL). Eine erhöhte cAMP-
Konzentration, verbunden mit einer gesteigerten cAMP-abhängigen PKA-Aktivität, führt
folglich zu gesteigerter Lipolyserate (STRALFORS und HONNOR 1989; LAFONTAN et al.
1995, 1997).
3

2. LITERATURÜBERSICHT
In der Signalkaskade sind die G-Proteine in höherer Konzentration als die entsprechenden
Rezeptoren zu finden, was in einer Signalverstärkung resultiert. Ein Rezeptor kann bis zu 100
Gs-Moleküle aktivieren (NOBLES et al. 2005).
REITHMANN et al. (1990) berichten von einem 2-fachen Anstieg der Gi-α-Untereinheiten
nach Stimulation mit Noradrenalin an der Herzmuskelzelle. Diese Zunahme der Gi-α-Proteine
geht einher mit einer Verminderung der Adenylatcyclase-Aktivität um 30%. Inwieweit dieses
Phänomen auch für die Fettzelle gilt, bleibt abzuklären.
4

2. LITERATURÜBERSICHT
Abb. 1: Regulation der Lipolyse über adrenerge Rezeptoren (modifiziert nach Lafontan et al. 1995,
1997)
Das membrangebundene Multiproteinsystem aus Adrenozeptoren, heterotrimeren G-Proteinen und
einem Teil der Enzyme (PIP2=Phosphatidylinositolbisphosphat, Phospholipase C) vermittelt die
Wirkungen von Katecholaminen (Adrenalin, Noradrenalin) im weißen Fettgewebe. Drei ß-
Rezeptoren-Subtypen (ß1, 2, 3) aktivieren über stimulierende Gs-Proteine die Aktivität der
Adenylatcyclase, was über eine Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration zur Aktivierung
der cAMP–abhängigen PKA führt. Diese wiederum phosphoryliert bzw. aktiviert die
Hormonsenstitive Lipase als Schlüsselenzym der Lipolyse.
Der α2–Adrenozeptorsubtyp wirkt über inhibierende G–Proteine antagonistisch zu den ß-Rezeptoren
und damit antilipolytisch.
Die Stimulation des α1–Adrenozeptorsubtyps vermittelt über ein Gq–Protein und Phospholipase C die
Glykogenolyse, Laktatproduktion und –freisetzung in der Fettzelle.
5

2. LITERATURÜBERSICHT
Das Vorkommen und Verteilungsmuster der Adrenozeptorensubtypen an der Adipozyten-
plasmamembran ist abhängig von der Spezies und der Lokalisation des Fettgewebes. Es ist in
der Literatur vielfach beschrieben, dass viszerales Fettgewebe lipolytisch aktiver erscheint als
z. B. subkutanes Fett. Eine Erklärung hierfür wäre, dass im viszeralen Fett weniger α2– und
mehr ß–Adrenozeptoren als im subkutanen Fett zu finden sind.
α1-Rezeptoren sind u. a. in humanen, Ratten-, Hamster-, und Schaffettzellen beschrieben
worden (FAIN u. GARCIA-SAINZ 1983). Ihre Stimulation bewirkt die Aktivierung der
Glycogenphosphorylase und Pyruvatdehydrogenase und vermittelt das Inaktivieren der
Glycogensynthase. Die Aufnahme von Glucose via PLC – PKC – Kaskade und Aktivierung
der PI – 3 – Kinase steigt (CHENG et al. 2000; BOSCHMANN et al. 2002). Als Funktion im
Fettgewebe sind demzufolge Laktatproduktion und –freisetzung aus Glucose zu nennen
(LAWRENCE und LARNER 1977; FAINTRENIE und GÉLOËN 1996).
Die Anzahl der α2–Rezeptorenbindungsstellen ist z.B. bei Mensch und Hamster größer als bei
Kaninchen und Meerschweinchen. Bei Ratten wird die geringste bzw. keine
α2-Rezeptorendichte beschrieben (LAFONTAN u. BERLAN 1993). Mit der
α1-Rezeptorenanzahl im weißen Fettgewebe verhält es sich ähnlich. Hier sind ebenfalls bei
der Ratte im Vergleich zu Mensch und Hamster deutlich weniger α1–Adrenozeptoren
nachgewiesen worden (ARNER 1992).
Bei Schweinen zeigten COUTINHO et al. (1993) einen Zusammenhang der antilipolytischen
Aktivität von α2–Rezeptoren mit der Zellgröße und dem Androgenstatus. Sie stellten bei
kastrierten Tieren größere Fettzellen mit fehlender Hemmung der Lipolyse durch α2-
Adrenozeptoren fest. Eine ähnliche Situation beschrieben PECQUERY et al. (1988) beim
Hamster. Bei kastrierten Tieren war der antilipolytische Effekt im Gegensatz zu mit
Testosteron behandelten kastrierten Hamstern um die Hälfte verringert.
Des Weiteren wird von einer unterschiedlichen Affinität der Rezeptoren bezüglich Adrenalin
und Noradrenalin berichtet. So zeigt der α2–Rezeptor die höchste Affinität für Noradrenalin,
gefolgt von ß1 ≥ ß2 > ß3. Für Adrenalin zeigt sich folgende Affinität: α2 > ß2 > ß1 > ß3
(LAFONTAN et al. 1997; CAREY 1998). Dieses lässt den Schluss zu, dass in Ruhephasen
die antilipolytische Wirkung der α–Adrenozeptoren überwiegt, während bei körperlicher
6

2. LITERATURÜBERSICHT
Aktivität, also in Stresssituationen, mit steigender Konzentration an Katecholaminen, die
lipolytische ß–Rezeptorenwirkung zum Tragen kommt.
Während ß–Adrenozeptoren verhältnismäßig empfindlich bezüglich Desensibilisierung sind,
konnte sowohl bei α1– als auch bei α2–Rezeptoren an Adipozyten keine Desensibilisierung
festgestellt werden. Es wird sogar bei juvenilen Individuen, insbesondere kurz nach der
Geburt, von gesteigerter α2–Antwort berichtet (ARNER 1992). Desensibilisierung von ß-
Rezeptoren an Adipozyten sind bei Mensch, Ratte, Hund und Hamster festgestellt worden
(LAFONTAN et al. 1997).
Diverse Hormone bewirken Veränderungen bezüglich der Expression und Funktion von
Adrenozeptoren im humanen Fettgewebe. Beispielsweise steigern Androgene die Sensitivität
und ß–Rezeptorenzahlen. Insulin und Laktat hingegen bewirken eine verminderte Sensitivität
und die Translokation bzw. Internalisation der ß–Rezeptoren (ARNER 1992). Ebenso führen
Östrogene zu einer reduzierten Lipolyse, was bezüglich der größeren Empfindlichkeit von
Ponystuten, am Hyperlipämie–Syndrom zu erkranken, noch Fragen offen lässt.
GESTA et al. (2001) beschreiben verminderte Bindungseigenschaften und Affinitäten von
Adrenalin gegenüber α2-Adrenozeptoren im humanen Fettgewebe nach
Bromopalmitatinkubation.
Eine Schlüsselrolle in der Signalkaskade der Lipolyse kommt sicherlich dem Verhältnis der
Bindungsstellen von ß/α2-Rezeptoren zu. Allerdings sind auch hier speziesspezifische
Unterschiede zu vermerken. Beim Hund konnte eine Änderung des ß/α2- Verhältnisses in
Abhängigkeit vom Ernährungszustand nachgewiesen werden (TAOSIS et al. 1987,1989).
Übergewichtige Hunde zeigten erhöhte α2- und verminderte ß-Rezeptorenzahlen, durch
welche eine verminderte lipolytische Effizienz der Katecholamine bedingt ist.
ARNER (2005) berichtet von genetischen Faktoren, die beim Menschen Einfluss auf die
Lipolyse nehmen. Beschriebene Genvariationen gehen mit Adipositas einher und beziehen
sich auf die ß2- und ß3–Adrenozeptoren. Des Weiteren könnte ein spezifisches G–Protein
(G–ß3), das sowohl α- als auch ß-Rezeptoren mit der Adenylatcyclase verbindet, mit einer
veränderten Lipolyseaktivität in Zusammenhang gebracht werden. Inwieweit
7

2. LITERATURÜBERSICHT
Genveränderungen bei Equiden einen Einfluss auf die Adrenozeptoren und schließlich einer
veränderten Lipolyseaktivität unterschiedlicher Rassen nehmen, ist bislang unklar.
In Bezug auf die Entwicklung der Fettzelle ist bei verschiedenen Spezies ein geringerer α2-
Rezeptorenbesatz bzw. gar ein Fehlen desselben bei juvenilen Tieren festgestellt worden. Mit
zunehmendem Alter und Adipozytengröße steigt somit z. B. bei 20 – 25 Wochen alten
Hamstern die Zahl der α2 - Adrenozeptoren an der Fettzelle im Vergleich zu 4 – 5 Wochen
alten Tieren (CARPENE et al. 1983). Eine parallele Änderung des ß-Rezeptorenbesatzes
konnte in Hamsterfett im Gegensatz zu Hunde- und Kaninchenfettzellen nicht beobachtet
werden.
8

3 Material und Methoden
3.1 Versuchsaufbau
3. MATERIAL UND METHODEN
Ziel der Arbeit war die Untersuchung des Vorkommens und der Verteilung von α-adrenergen
Rezeptoren im Fettgewebe von Pferden und Ponys.
Dazu musste zunächst aus dem aus Schlachtkörpern gewonnenen Gewebe die
Plasmamembran der Adipozyten isoliert werden. Die Aufarbeitung erfolgte in Anlehnung an
die Methode von BELSHAM et al. (1980), modifiziert von NICOLAS et al. (1990) und
WRAGE (2002). Um die Ausbeute der Präparation zu erhöhen, war eine Optimierung des
Vorgehens nötig.
Dabei wurde die Gewinnung der Plasmamembranfraktion durch verschiedene
Homogenisationsschritte und differenzielle Zentrifugation erreicht.
Um den Aufreinigungsgrad bzw. die Ausbeute an Plasmamembran und den
membrangebundenen Adrenozeptoren zu bestimmen, erfolgten Messungen des Proteingehalts
sowie der Aktivität spezieller Markerenzyme in den Präparationsstufen.
Die Messung der Rezeptoren in der Plasmamembranfraktion erfolgte nach der Methode von
RE et al. (2001), indem hochspezifisch radioaktiv markierte α-adrenerge Liganden der
präparierten Membranfraktion zugesetzt wurden und mittels ß-Counter die gebundene
Radioaktivität gemessen werden konnte.
3.2 Versuchstiere
Das für diese Arbeit benötigte Fettgewebe wurde von 11 Pferden und 11 Ponys, die zur
Gewinnung von Lebensmitteln in der Rossschlachterei Knoche & Sohn, Helmstedt getötet
wurden, entnommen. Es wurden gezielt Tiere in mindestens gutem Ernährungszustand
ausgesucht, die zur Probengewinnung während der Schlachtung herangezogen wurden.
Das Durchschnittsalter der Pferde lag bei 13,1 ± 9,2 Jahren, das der Ponys bei 13,8 ± 6,8
Jahren. Das durchschnittliche Stockmaß der Pferde betrug 1,70 ± 0,03 m, das der Ponys 1,14
9

3. MATERIAL UND METHODEN
± 0,21 m. Die Pferde wogen im Mittel 622,7 ± 91,8 kg, die Ponys hatten ein
Durchschnittsgewicht von 260,6 ± 125,2 kg.
Anhand der Körpergröße und des Körpergewichts wurden die Tiere zunächst in die
Ernährungszustände „gut“ und „adipös“ eingeteilt. Als Richtwerte für einen guten
Ernährungszustand dienten hier folgende Werte ( Tab. 1):
Tab. 1. Lebendmasse ausgewachsener gut genährter Pferde verschiedener Rassen
(Durchschnitt von Stuten und Wallachen)
Rasse kg KGW
Shetlandpony 100 - 200
Deutsches Reitpony 300 - 350
Deutsches Warmblut 550 - 650
Aus Empfehlungen zur Energie- und Nährstoffversorgung der Pferde (1994)
Eine genauere Beschreibung des Ernährungszustandes gewährleistet das Body Condition
Scoring, bei dem an definierten Körperstellen adspektorisch und palpatorisch die Ausbildung
von Körperfett und Muskulatur nach einem Punktesystem bewertet wird. Da diese relativ
aufwändige Methode kurz vor der Schlachtung nicht möglich war, musste eine andere
Möglichkeit zur Verifizierung des Ernährungszustandes zur Anwendung kommen.
Eine Variante ist hier der Body Mass Index, der folgendermaßen berechnet wird:
BMI = Körpergewicht (KGW in kg) / Körpergröße (Stm. in m)²
Nach DONALDSON et al. (2004) korreliert der Body Condition Score mit dem Body Mass
Index mit einem Korrelationskoeffizienten von r = 0,60, sodass der BMI hier als objektives
Maß des Ernährungszustandes verwendet werden kann.
Setzt man bei dem Body Condition Scoring (BCS) auf der Skala von 1 – 9 die Werte 5 und 6
für einen normalen, d. h. guten Ernährungszustand fest, entsprechen die Werte 7 bis 9 einer
sehr guten bis hgr. adipösen Kondition. Nach DONALDSON et al. (2004) kann ein BCS von
5 – 6 mit den BMI-Werten von 190 – 210, ein BMI ab 220 mit den BCS - Werten 7 – 9 in
10

3. MATERIAL UND METHODEN
Verbindung gebracht werden. Dementsprechend sind die Tiere in dieser Studie mit einem
BMI um 190 als gut und solche mit einem BMI über 220 als adipös eingestuft worden.
Detaillierte Angaben hierzu finden sich in Tabelle 2 und 3 im Anhang auf S. 76 und 77.
3.3 Gewinnung und Lagerung des Fettgewebes
Sämtliche Tiere wurden morgens zwischen 6 00 und 7 30 Uhr geschlachtet. Die Pferde und
Ponys wurden durch einen Bolzenschuss betäubt und unmittelbar danach durch Eröffnung der
großen Blutgefäße am Kaudalende der Drosselrinne (V. jugularis, Aa. carotides communes)
und einem Einstich in Richtung Herz (A. und V. cervicales superficiales) ausgeblutet.
Im direkten Anschluss an die Ausweidung konnte das Fettgewebe schlachtwarm entnommen
und in verschließbare, mit körperwarmer physiologischer Kochsalzlösung gefüllte Gefäße
gegeben werden. Diese wurden in eine mit temperiertem Leitungswasser gefüllte Isolierbox
verbracht und so bei 37°C ins Labor transportiert.
Es wurde sowohl subkutanes Fettgewebe aus der Leistenregion, als auch Bauchhöhlenfett
verwendet. Die Proben stammten, sofern der Ernährungszustand der Tiere es erlaubte, in
gleichem Umfang aus demselben Bereich. Das subkutane Fett wurde in einer Größe von ca. 2
x 3 cm aus der Leistengegend, das Bauchhöhlenfett direkt rechts und links der Linea alba
gelegen (ca. 8 cm Probenbreite je Seite) von je etwa zwei Handbreit kaudal des Sternums bis
etwa eine Handbreit kaudal des Nabels entnommen.
Zur Lagerung wurden die Proben folgendermaßen vorbereitet:
Im Labor wurde das Fettgewebe in handwarmer 0,9%-iger Kochsalzlösung gewaschen und
von den Resten der Faszien, des Bauchfells sowie der großen Blutgefäße befreit.
Danach wurde je ein Stück Bauch- und Leistenfett in einer Größe von ca. 2 x 3 cm in Alufolie
verpackt und in flüssigen Stickstoff verbracht. Das verbliebene Bauchfett, ca. 320 g, wurde in
16 Szintillationsgefäßen in Portionen zu je ca. 20 g bei –80°C tiefgefroren und gelagert.
11

3. MATERIAL UND METHODEN
3.4 Präparation der Adipozytenplasmamembran
Alle im Folgenden verwendeten Puffer und Lösungen, sowie deren Zusammensetzung sind
im Anhang auf Seite 74 f. näher beschrieben. Die nachfolgend detailliert beschriebene
Präparation ist auch im Flussschema auf Seite 14 wiedergegeben.
Das equine Fettgewebe wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und mit dem Skalpell grob
zerkleinert. Pro Ansatz wurden 2 Portionen von je 40 - 45 g so vorbereitetes Gewebe in je 120
ml Saccharoseextraktionsmedium gegeben und 5 Sekunden mittels eines Ultra-Turraxes Typ
T45 homogenisiert. Zur Entfettung und der Entfernung noch vorhandener grober
Gewebsanteile wurde dieses Homogenat über Gaze (Maschenweite 250 µm, Eckert) filtriert.
Zur Protein- und Enzymbestimmung wurden je 100 µl des Extraktes entnommen und in
Eppendorfcups bis zur weiteren Bearbeitung auf Eis gelagert.
Alle weiteren Präparations- bzw. Zentrifugationsschritte erfolgten bei 0 – 4 °C.
Die Gesamtmenge des Homogenats (H) wurde protokolliert und auf
Polypropylenreagenzgläser (Volumen 40 ml) verteilt. Es folgte eine 15 - minütige
Zentrifugation bei 14500 g (Sorvall® RC - 5B Refrigerated Superspeed Centrifuge), wodurch
man ein Pellet, in dem sich ein Großteil der Adipozytenmitochondrien und andere
Zellfragmente befand, sowie einen Überstand, bestehend aus dem
Saccharoseextraktionsmedium mit der Adipozytenplasmamembran bzw. leichteren Zell- und
evtl. Rest-Blutbestandteilen, erhält.
Das flotierte Fett wurde mit einem Spatel entfernt und der Überstand (Ü14) wiederum über
Gaze filtriert. Zur Dokumentation der Aufreinigungsqualität wurde das Gesamtvolumen
festgestellt und ein Aliquot von 200 µl im Eppendorfcup bis zur Analyse auf Eis gelagert. Das
Pellet (P14) wurde in 400 µl gepufferter Kochsalzlösung resuspendiert, 100 µl zur Protein-
und Enzymbestimmung abgenommen und der Rest verworfen. Der Überstand wurde nun
wiederum in Polypropylenröhrchen (40 ml) überführt und bei 39000 g für 30 Minuten
zentrifugiert.
Anschließend wurde der nun erhaltene Überstand (Ü39) in einen Messzylinder überführt, um
dessen Volumen zu ermitteln, 200 µl zur Präparationskontrolle abgenommen und der Rest
12

3. MATERIAL UND METHODEN
verworfen. Die maßgeblich die Adipozytenplasmamembran enthaltende obere Schicht des
Pellets (P39) wurde vorsichtig mit 400 µl gepufferter Kochsalzlösung abgespült,
resuspendiert und auf neue Polypropylenröhrchen verteilt. Auch hiervon wurde ein Aliquot
von 100 µl zur Aufreinigungskontrolle abgenommen und in einem Eppendorfcup gegeben.
Die Röhrchen wurden mit ca. 30 ml gepufferter Kochsalzlösung aufgefüllt und weitere 30
Minuten bei 39000 g zentrifugiert. Die untere Pelletfraktion (M) wurde ebenfalls in
gepufferter Kochsalzlösung (200 µl) aufgenommen, resuspendiert und in ein Eppendorfcup
überführt. Bis zur Protein- und Enzymmessung wurden 100 µl in einem Eppendorfcup auf Eis
gelagert, der Rest dieser Fraktion wurde verworfen.
Das nach der Waschung erhaltene Pellet der aufgereinigten Plasmamembran (PM) wurde
nach Absaugen des Überstandes mittels einer Wasserstrahlpumpe wiederum in 400 µl der
Kochsalzlösung (gepuffert) resuspendiert, ein Aliquot von 100 µl zur Enzymbestimmung
abgenommen und in Kryoröhrchen bei –80°C eingefroren und so bis zur Rezeptorenmessung
gelagert.
13

3. MATERIAL UND METHODEN
Übersicht der Adipocytenplasmamembranpräparation
2 x 40-45g Fettgewebe bei Raumtemperatur auftauen, mit Skalpell grob zerkleinern und in je 120 ml
Saccharoseextraktionsmedium geben
5 Sekunden homogenisieren (Ultra-Turrax) und filtrieren
100µl H zur Enzymbestimmung entnehmen
auf Reagenzgläser verteilen und 15 Minuten bei 14500g zentrifugieren
Flotiertes Fett entfernen, Überstand (Ü14) filtrieren, Gesamtvolumen dokumentieren
200µl Ü14 zur Enzymbestimmung entnehmen
Pellet (P14) in 400µl gepufferter NaCl-Lösung resuspendieren
100µl P14 zur Enzymbest. entnehmen und Rest
verwerfen
Ü14 auf Reagenzgläser verteilen und 30 Minuten bei 39000g zentrifugieren
Gesamtvolumen Überstand (Ü39) ermitteln
200µl Ü39 zur Enzymbest. Entnehmen und
Rest verwerfen
Pellet fraktioniert in gepufferter NaCl-Lösung resuspendieren
Obere Schicht (P39) auf neue Reagenzgläser verteilen
100µl P39 zur Enzymbestimmung entnehmen
100 µl der unteren Schicht (M) zur Enzymbest. in ein Eppendorfcup überführen Rest verwerfen
P39 für 30 Minuten bei 39000g zentrifugieren
Überstand absaugen und Pellet (PM) in 400µl gepufferter NaCl-Lösung aufnehmen, resuspendieren
100µl zur Enzymbestimmung entnehmen
PM in Kryoröhrchen überführen und bei –80°C bis zur Rezeptorenmessung lagern
14

3.5 Proteinbestimmung
3. MATERIAL UND METHODEN
Um die Ergiebigkeit der Plasmamembranaufarbeitung verifizieren zu können, musste der
Proteingehalt der einzelnen Aufarbeitungsfraktionen (Homogenat – H, Überstand 14 – Ü 14,
Pellet 14 – P 14, Überstand 39 – Ü 39, Pellet 39 – P 39, Mitochondrien – M, Plasmamembran
– PM) gemessen werden. Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte nach der
Mikromethode nach LOWRY (1951).
In einem Probenansatz wurden die jeweiligen Aufarbeitungsfraktionen zunächst 1:10
verdünnt und dann in einem Doppelansatz gemessen.
Dazu wurden je 100 µl der verdünnten Probe in ein Eppendorfcup pipettiert und je 1 ml
eiskalte 10%-ige TCE hinzugegeben. Im Anschluss mussten die Proben in einer
Eppendorftischzentrifuge 5 Minuten bei 14000 g zentrifugiert werden. Danach wurde der
TCE - Überstand abgegossen, die Eppendorfcups kräftig ausgeschlagen und mit je 100 µl 1 M
NaOH beschickt und gemischt. Hiernach folgte eine zehnminütige Inkubation bei 37°C. Im
Folgenden wurden die Proben mit 1 ml der Lowry 1 - Lösung und 100 µl der Lowry 2 -
Lösung versetzt, 2 Minuten auf einem Rüttler durchmischt und mit geschlossenem Deckel
weitere 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Als Standard kam Bovines Serumalbumin in einer
Konzentration von 25 µg/100 µl zur Anwendung, der Blindwert bestand aus Reinstwasser.
Die Messung erfolgte nach kurzem Abkühlen auf Eis und erneutem Durchmischen
photometrisch (Ultrospec III Spectrophotometer, Pharmacia LKB) bei 750 nm.
3.6 Bestimmung von Markerenzymen
Zur Kontrolle der Ergiebigkeit bzw. Aufreinigung der Plasmamembran während der
Präparation wurden die Markerenzyme 5’Nucleotidase und Cytochrom-C-Oxidase verwendet.
3.6.1 Aktivität der 5’Nucleotidase
Die 5’Nucleotidase (5’NT) stellt ein membranspezifisches Markerenzym dar, welches
Phosphat von Nucleotiden abspaltet. Wird zu der Plasmamembran Adenosinmonophosphat
(AMP) hinzugegeben, bildet das freigesetzte Phosphat mit Molybdat-Malachitgrün einen
Farbkomplex und kann photometrisch gemessen werden.
15

3. MATERIAL UND METHODEN
Im Anschluss an die Membranpräparation wurden je Präparationsstufe ein Ansatz und ein
entsprechender Blindwert nach folgendem Schema in Eppendorfcups pipettiert:
50 µl 0,5 M Tris–HCl - Lösung
50 µl 1,8 mM MgCl2 x 6 H2O-Lösung
50 µl verdünnte Probe
(je nach Probenkonzentration 1:20 – H, Ü14, Ü39 bzw. 1:50 - P14, P39, M, PM)
50 µl 10 mM 5’AMP als Substrat der Enzymaktivitätsmessung
bzw. 50 µl Reinstwasser als Probenblindwert
Nach einer kurzen Durchmischung wurden diese Ansätze bei 37°C für 30 Minuten inkubiert
und durch Zugabe von je 50 µl 1 M HCl abgestoppt. Danach wurden die so vorbereiteten
Proben folgendermaßen in Doppelansätzen in eine Mikrotiterplatte pipettiert:
In jede Kavität wurden 20 µl der verdünnten Probe (Ansatz s. o.) vorgelegt und 50 µl
Reinstwasser hinzugegeben. Kurz vor der Messung wurde eine Na-Molybdat/ 2,5 M HCl/
Malachitgrün-Lösung angesetzt und 180 µl je Ansatz hinzupipettiert.
Es folgte eine weitere Inkubation über 2 Minuten bei Raumtemperatur. Das freigesetzte
Phosphat resp. der Molybdat–Malachitgrün-Farbkomplex wurde in einem Photometer
(Spectra Rainbow, SLT) bei 620 nm gemessen.
Zur Ermittlung der Enzymaktivitäten musste parallel eine Standardkurve erstellt werden. Als
Standard wurden in identischen Ansätzen anstelle der Probe verschiedene definierte
Konzentrationen an Phosphat und statt des AMP Reinstwasser pipettiert.
Anhand der Geradengleichung aus der Standardkurve konnte unter Berücksichtigung des
Proteingehaltes die spezifische Aktivität der 5’NT in U/mg berechnet werden.
1 Unit = 1 µmol PO4 wird pro Minute durch 5’NT hydrolysiert.
16

3.6.2 Aktivität der Cytochrom–C–Oxidase
3. MATERIAL UND METHODEN
Die Cytochrom–C–Oxidase (CCO) gilt als Markerenzym für Mitochondrien und wurde nach
einer Methode von STORRIE (1990) gemessen. Die Ansätze wurden wie folgt in
Halbmikroküvetten pipettiert:
900 µl KPO4 – Puffer pH 6,2
100 µl 0,55 mM Cytochrom C
100 µl verdünnte Probe
Nach kurzer Durchmischung erfolgte die photometrische Messung bei einer Wellenlänge von
546 nm (Ultrospec III Spectrophotometer, Pharmacia LKB). Die Extinktionsänderung wurde
über 3 Minuten registriert und in Intervallen von 15 Sekunden protokolliert.
Die Messung wurde nach folgender Formel ausgewertet:
∆E / min x 1,1 (V) x Verdünnungsfaktor
21,1 (Ext.-Koeff.) x 1 (D) x 0,1 (V Probe)
∆E / min = Extinktionsdifferenz pro Minute
V = Volumen des Ansatzes [ml]
D = Schichtdicke der Küvette [cm]
V Probe = Volumen der Probe [ml]
17
= ∆E / min x 0,5213 = U / ml
21,1 (Ext.-Koeff.) = Extinktionskoeffizient des Cytochrom – C [ε λ mol]
Um letztendlich die Aktivitätsangabe der CCO in U/mg Protein zu erhalten, wurde der
Proteingehalt der Probe (mg / ml) mit einbezogen.
1 Unit = 1 µmol Cytochrom C wird pro Minute von der CCO oxidiert.

3. MATERIAL UND METHODEN
3.7 Messung der Adrenozeptoren per Radioligand-Bindungsassay
3.7.1 Radioassay zur Bestimmung der α-adrenergen Rezeptoren
Die Messung der α-adrenergen Rezeptoren im equinen Fettgewebe wurden in Anlehnung an
die Methode von RE et al. (2001), eine Arbeitsgruppe, die α-Adrenozeptoren in der glatten
Muskulatur des equinen Ileums charakterisiert hat, durchgeführt.
Prinzip:
Bevor die Bestimmung der Rezeptoren begonnen werden konnte, musste der aktuelle
Proteingehalt der zuvor bei – 80°C gelagerten Plasmamembranfraktion ermittelt werden.
Hierzu wurden 2 Aliquots aus verschiedenen Aufarbeitungen eines Tieres auf Eis aufgetaut,
gepoolt und 50 µl zur Herstellung einer Verdünnung 1:10 abgenommen. Im Anschluss wurde
der Proteingehalt nach LOWRY (siehe 3.5) bestimmt, um für den Assayansatz eine
Proteinkonzentration von 1 mg/ml einstellen zu können.
Je nach aktuellem und benötigtem Proteingehalt wurden die Membranfraktionen nach dem
Auftauen durch Zentrifugation (20 min bei 31000 g) und Aufnahme des Pellets in einen
Tris-Puffer konzentriert oder entsprechend herunterverdünnt.
Genauere Angaben zu den im Folgenden verwendeten Agenzien sind auf Seite 75 im Anhang
aufgeführt. Die Bindungsassays wurden nach folgendem Schema im Doppelansatz pipettiert:
20 µl [ 3 H]Prazosin (0,148 kBq) bzw. [ 3 H]Rauwolszin (2,9 kBq) in Tris–Mg-Puffer
30 µl Phentolamin bzw. Tris–Mg–Puffer
50 µl Inkubationspuffer
100 µl Plasmamembranfraktion (100µg Protein)
[ 3 H]Prazosin und [ 3 H]Rauwolszin entsprechen spezifischen Radioliganden. [ 3 H]Prazosin
dient als selektiver Antagonist für α1–adrenerge Rezeptoren, [ 3 H]Rauwolszin hingegen als
selektiver Antagonist für α2-adrenerge Rezeptoren. Phentolamin entspricht einem
unspezifischen α-Rezeptorantagonisten und wird zur Bestimmung der Nichtspezifischen
Bindung eingesetzt. Zur Messung der Gesamtbindung wurde statt des Phentolamin die
entsprechende Menge an Tris–Mg-Puffer verwendet.
18

3. MATERIAL UND METHODEN
Dieser Ansatz wurde 30 Minuten bei 30°C inkubiert, anschließend daraus 180 µl entnommen
und in 2 ml eiskalte gepufferte NaCl - Lösung überführt, um die Inkubation zu stoppen. Nun
wurden die Proben in einem Filtersauggerät durch zuvor mit 500 µl gepufferter NaCl -
Lösung benetzte Whatman Glasfaserfilter (GF/C, Durchmesser 25 mm) filtriert und dreimalig
mit je 3 ml eiskalter gepufferter NaCl - Lösung gewaschen. Hiernach wurden die Filter in
Szintillationsgefäße gegeben und mit je 4 ml Szintillationsflüssigkeit (LSC) versehen.
Die gebundene Radioaktivität wurde nun im Liquid Szintillation Analyzer (1600 TR,
Packard) gemessen. Um die Messgenauigkeit zu erhöhen, wurde jeder Ansatz 2 mal 10
Minuten gezählt und daraus ein Mittelwert gebildet.
3.7.2 Bestimmung der Rezeptoranzahl
Um den geeigneten Konzentrationsbereich der Radioliganden zu bestimmen, wurden für die
α1-, wie für die α2-Adrenozeptoren Bindungskurven erstellt, die den optimalen
Bindungsbereich (2,4 nM Prazosin bzw. 6,4 nM Rauwolszin) zeigen. Zur Bestimmung der
Rezeptorenanzahl wurden letztendlich Einpunktmessungen durchgeführt.
Die Proben wurden im ß-Counter gemessen und die Aktivität in DPM (disintegrations per
minute) gezählt. Zunächst wurde die Menge der spezifisch gebundenen Radioliganden
(Bspez). ermittelt, indem die Werte der Nichtspezifischen Bindung (NSB) von denen der
unspezifisch gebundenen Radioliganden subtrahiert wurden. Zur Auswertung wurden diese
Werte unter Bezugnahme der Molarität der Radioliganden und des Proteingehalts der Probe
entsprechend berechnet, so dass die Bindungsstellen der Rezeptoren in fmol/mg Protein
angegeben werden können.
Molarität des Liganden (nM) x Bspez (DPM) x 1000
Total Counts (DPM) x Proteingehalt der Probe (mg/ml)
Bspez = spezifisch gebundene Radioliganden (unspezifisch gebundene Radioliganden-NSB)
Total Counts = Aktivität des Radioliganden im Ansatz
Die Nachweisgrenze für die α1-Adrenozeptoren konnte bei 14,9 fmol/mg Protein und für die
α2-Rezeptoren bei 10,2 fmol/mg Protein festgelegt werden.
19

3. MATERIAL UND METHODEN
3.8 Adipozytenhistologie und Morphometrie
Um die Größe der Adipozyten von Pferden und Ponys definieren zu können, mussten
Gefrierschnitte angefertigt, fotografiert und ausgemessen werden. Hierzu kam sowohl
Abdominal-, als auch Inguinalfett (entnommen wie in 3.3 beschrieben) zur Anwendung.
Das gefrorene Fettgewebe wurde mittels Skalpell in einen ca. 2 x 1 x 0,5 cm großen Block
geschnitten und durch eine Gefrierhilfslösung auf eine –20°C kalte Gewebehalterung
aufgefroren. Nun konnten in dem während des Schneidens bei –20°C gehaltenen Kryotom
(Kryostat Mikrom, Heidelberg Laborgeräte GmbH) Gewebeschnitte von ca. 60 µm Dicke
hergestellt werden. Die Schnitte wurden anschließend auf bei Raumtemperatur temperierte
Objektträger aufgenommen, so dass der jeweilige Schnitt aufgrund der Temperaturdifferenz
am Objektträger haften blieb. Eine Fixation oder Färbung erfolgte nicht, da die Schnitte direkt
im Anschluss im Durchlicht eines digitalen Photomikroskops (Axiophot, Zeiss) bei 25-facher
Vergrößerung betrachtet und fotografiert wurden.
Die Auswertung der Schnitte erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms analySIS® (Soft
Imaging System), wobei manuell pro Tier ca. 200 Zellen ausgezählt, die entsprechende
Fläche umgrenzt und schließlich vom Programm berechnet wurde. Um nun die beiden
Gewebearten von Pony und Pferd miteinander vergleichen zu können, wurde die Zellfläche
von 100 Adipozyten anteilig berechnet.
3.9 Statistische Auswertung
Die ermittelten Daten wurden unter Zuhilfenahme des Programms Sigma Stat 3.0 zunächst
auf Normalverteilung getestet. Mittels t-Test erfolgte eine Prüfung auf statistisch signifikante
Unterschiede. Betrug der p-Wert < 0,05, wurden die Unterschiede als signifikant angesehen
und mit gekennzeichnet.
Das Programm Sigma Plot 8.0 wurde zur Erstellung der Scatchard Plots zur Ermittlung der
Gleichgewichtsdissoziationskonstanten und damit zum Nachweis der Korrektheit der
Ligandenauswahl genutzt.
20

4 Ergebnisse
4. ERGEBNISSE
4.1 Ernährungszustand der Pferde und Ponys
Die primäre Einteilung der Tiere in gut genährt und adipös wurde durch die Berechnung des
Body Mass Index verifiziert. Anhand der Körpergröße, gemessen als Stockmaß in
Widerristhöhe und des Körpergewichts in kg, wurde für jedes Pferd bzw. Pony der BMI als
objektives Maß für den Verfettungsgrad bestimmt. Die Durchschnittsgröße der Ponys betrug
1,14 m (± 0,2), die Tiere wogen im Mittel 260,5 kg (± 125,2) bei einem BMI von
durchschnittlich 191,1 (± 15,4) und einem Alter von 13,8 Jahren (± 6,8).
Die Pferde hatten ein durchschnittliches Stockmaß von 1,70 m (± 0,3), die Tiere wogen im
Mittel 622,7 kg (± 91,9) bei einem BMI von durchschnittlich 215,1 (± 24,3) und einem Alter
von 13,1 Jahren (± 9,2).
Der Ernährungszustand der Tiere ist somit mindestens als gut zu bezeichnen, wobei 4 der 11
beprobten Ponys und 6 der 11 Pferde adipös waren.
4.2 Ausbeute der Plasmamembrangewinnung
Um ein Maß für die Ergiebigkeit der Plasmamembrangewinnung zu erhalten, wurde der
Proteingehalt der einzelnen Präparationsstufen gemessen. Basierend auf dem
Gesamtproteingehalt des Homogenats wurde für jede Präparationsstufe der prozentuale Anteil
des Proteins berechnet. In der gereinigten Plasmamembran (PM) der Pferde ergab sich eine
Ausbeute von durchschnittlich 1,16% (± 0,40) und in der Ponygruppe konnte für die Endstufe
der Aufarbeitung ein Durchschnittswert von 0,85% (± 0,31) ermittelt werden.
4.3 Reinheit der Plasmamembranfraktion
4.3.1 5’Nucleotidase
Zur Identifikation der Plasmamembran dient das Markerenzym 5’Nucleotidase.
Um die Reinheit der gewonnenen Plasmamembran zu ermitteln, wurde die Anreicherung der
5’Nuclotidase-Aktivität in den einzelnen Aufarbeitungsfraktionen gemessen und schließlich
durch einen Aufreinigungsfaktor dargestellt. Dieser Aufreinigungsfaktor basiert auf dem Wert
21

4. ERGEBNISSE
der spezifischen Aktivität im Homogenat, dem die spezifische Aktivität in der
Plasmamembranfraktion gegenübergestellt wird.
Die durchschnittliche spezifische Aktivität der 5’Nuclotidase liegt in der Homogenatsfraktion
der Pferde bei 737, 6 ± 308,9 mU/mg Protein. Bei den Ponys ergab sich eine durchschnittliche
5’NT-Aktivität des Homogenats von 796,4 ± 377,6 mU/mg Protein.
Bei der Plasmamembranfraktion wurden in der Pferde- bzw. Ponygruppe folgende
Durchschnittswerte erreicht: 4363,5 ± 1876,5 mU/mg Protein (Pferd) und 7029,2 ± 8146,1
mU/mg Protein (Pony).
Daraus ergibt sich für die Pferdegruppe ein Aufreinigungsfaktor von 6,5 ± 2,9 und für die
Ponygruppe ein Wert von 7,9 ± 4,1 im Durchschnitt, d.h. in der Plasmamembranfraktion
konnte das Enzym 5’NT gegenüber dem Homogenat 6,5-fach bzw. 7,9-fach angereichert
werden.
Die einzelnen Aufreinigungsfaktoren der Ponys und Pferde sind tabellarisch im Anhang auf
S. 78 und 79 dargestellt. Bei mehreren Aufarbeitungen pro Tier wurde der Mittelwert zur
Auswertung herangezogen.
4.3.2 Cytochrom-C-Oxidase
Die Cytochrom-C-Oxidase (CCO) ist in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert und
dient daher als Markerenzym für die Mitochondrien.
In den verschiedenen Aufarbeitungsfraktionen ist der höchste Gehalt an spezifischer Aktivität
der CCO in dem Pellet 14 zu finden, in dem der durchschnittliche Aktivitätswert bei 127,5 ±
124,2 U/mg Protein in der Pferdegruppe und bei 171,0 ± 73,0 U/mg Protein bei den Ponys
liegt.
Die durchschnittliche spezifische Aktivität der CCO im Homogenat beträgt beim Pferd 60,4 ±
36,1 U/mg Protein und beim Pony 54,8 ± 25,0 U/mg Protein. In der Plasmamembranfraktion
ergibt sich für die Pferde eine Aktivität von durchschnittlich 70,3 ± 34,2 U/mg Protein und für
die Ponygruppe 100,9 ± 67,9 U/mg Protein.
22

4. ERGEBNISSE
Entsprechend der Darstellung bei der 5’NT ist für die CCO ein Aufreinigungsfaktor gebildet
worden, der die Anreicherung von Mitochondrien in den einzelnen Aufarbeitungsschritten, im
Speziellen in der P14-Fraktion im Verhältnis zum Homogenat beschreibt.
Für die Pferde ergibt sich im Durchschnitt eine 2,6-fache (2,6 ± 1,4) Anreicherung vom
Homogenat zum Pellet14 (das somit den höchsten Gehalt an Mitochondrien aufweist),
wogegen bei den Ponys die spezifische Aktivität der CCO um ein 3,8-faches angereichert
wurde (3,8 ± 1,7).
In den Tabellen 6 und 7 im Anhang auf S. 80 und 81 sind die einzelnen
Aufreinigungsfaktoren der jeweiligen Aufarbeitungsfraktionen zu finden.
4.4 Optimierung der Radioligandenkonzentration zur Rezeptorenmessung
Um einen geeigneten Konzentrationsbereich zum Einsatz der Radioliganden zu finden,
wurden Bindungskurven erstellt. Dazu wurden einer konstanten Proteinmenge verschiedene
Konzentrationen [ 3 H]Prazosin bzw. [ 3 H]Rauwolszin zugegeben.
Es wurde jeweils die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) berechnet, die die Affinität
des Rezeptors bezüglich seines Liganden beschreibt. Die Affinität ist umso höher, je niedriger
der Wert der KD (NELSON und COX 2001) liegt.
4.4.1 α1-Adrenozeptoren
Für die α1–Rezeptoren ergab sich eine geeignete Prazosinkonzentration von 2,4 nM, da bei
steigenden Konzentrationen die Nichtspezifische Bindung in Relation zu den
Rezeptorenbindungsstellen deutlich zunimmt, so dass keine größere Genauigkeit zu erwarten
war (siehe 0).
23

Rezeptorenbindungsstellen
Bound (nM)
Abb.2: Bindungskurve für den α1 - Rezeptor.
Bound / Free (nM)
0,014
0,012
0,010
0,008
0,006
0,004
0,002
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
R 2 R = 0,9642
2 = 0,9642
0,000
0,00 0,01 0,02 0,03
Bound (nM)
y = 0,0191x + 0,0071
R 2 y = 0,0191x + 0,0071
R = 1
2 = 1
4. ERGEBNISSE
Der Kurvenverlauf zwischen den Messpunkten der spezifischen Bindung wurde durch eine
logarithmische Regression angepasst. Durch die Messpunkte der Gesamt- und unspezifischen Bindung
wurden jeweils Geraden gelegt. Auf der x-Achse ist die Konzentration des Radioliganden im
Testansatz, auf der y-Achse ist die Konzentration der gebundenen Aktivität, d. h. die
Rezeptorenbindungsstellen, dargestellt.
24
y = 0,0141x + 0,0048
R 2 y = 0,0141x + 0,0048
R = 0,9997
2 = 0,9997
y = 0,0048Ln(x) + 0,009
R 2 y = 0,0048Ln(x) + 0,009
R = 0,954
2 = 0,954
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
angebotene Aktivität im Testansatz (nM)
Mit der Verwendung eines Scatchard Plots ist
es durch die Linearisierung der Daten möglich,
die KD als Maß der Affinität des Rezeptors
bezüglich des Liganden graphisch darzustellen.
Die Steigung der Geraden entspricht hier dem
negativen reziproken Wert der Gleichgewichts-
dissoziationskonstanten (-1/KD). Bei einem
Korrelationskoeffizienten von R² = 0,96 zeigte
sich ein KD-Wert von 1,64 nmolar und eine
maximale Bindungskapazität von Bmax. 0,023
nM (siehe Abb. 2:).
Nichtspezif.Bindung
Gesamtbindung
Spezif. Bindung
Abb. 2: Scatchard Plot der spezifischen Bindung für die α1-Adrenozeptoren

4.4.2 α2-Adrenozeptoren
4. ERGEBNISSE
Zur Bestimmung der α2-Rezeptoren ergab sich eine geeignete Konzentration von 6,4 nM
[ 3 H]Rauwolszin, da wie in Abb. 2: dargestellt, mit weiter steigender Ligandenkonzentration
keine relevante Steigerung der Bindungsstellen mehr zu erwarten war.
Rezeptorenbindungsstellen
Bound (nM)
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
y = 0,0097x + 0,0547
R 2 = 0,9877
y = 0,041Ln(x) + 0,0294
25
R 2 = 0,9498
y = 0,0023x + 0,0057
R 2 = 0,992
0 5 10 15
angebotene Aktivität im Testansatz (nM Rauwolszin)
Abb. 3: Bindungskurve für den α2-Rezeptor.
Nichtspezif. Bindung
Gesamtbindung
Spezif. Bindung
Der Kurvenverlauf zwischen den Messpunkten der spezifischen Bindung wurde durch eine
logarithmische Regression angepasst. Durch die Messpunkte der Gesamt- und unspezifischen Bindung
wurden jeweils Geraden gelegt. Zur Bezeichnung der Achsen siehe Abb. 2:.
Bound / Free
0,04
0,035
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
R 2 = 0,8863
0
0,05 0,10 0,15 0,20
Bound (nM)
Wie in Abb. 2: dargestellt, wurden hier die Daten für die
α2-Rezeptoren im Scatchard Plot linearisiert. Der Wert der
Gleichgewichtsdissoziationskonstanten beträgt 4,01
molar, Bmax. liegt bei 0,174 nM und das
Bestimmtheitsmaß der Daten liegt bei einem Wert von R²
= 0,95.
Abb. 4: Scatchard Plot der spezifischen Bindung für die α2-Adrenozeptoren

4.5 Proteinbindungskurve
4. ERGEBNISSE
Um abschätzen zu können, in welchem Konzentrationsbereich die optimale
Proteinkonzentration bzw. Plasmamembrangehalt im Test liegen muss und inwieweit die Zahl
der Rezeptorenbindungsstellen mit der Proteinkonzentration im Ansatz korreliert, wurde
zunächst für jeden Rezeptorsubtyp je eine Proteinbindungskurve erstellt.
4.5.1 Proteinbindungskurve für die α1-Adrenozeptoren
Die Membranproteinkonzentration im Ansatz der Bindungskurve erstreckte sich von 0,05 –
0,2 mg Protein. Wie in Abb. 5: dargestellt, zeigte sich eine Korrelation von R² = 0,99
zwischen dem Membranproteinangebot und der Bindungsstellen. Für die Einpunktmessung
wurde in der folgenden Reihenanalyse für die Ponys und Pferde jeweils 100 µg Protein
eingesetzt.
dpm (bound)
800
600
400
y = 2764,3x + 74,5
R 2 200
0
= 0,9916
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
mg Protein im Test
Abb. 5: Graphische Darstellung der Proteinbindung für den α1-Rezeptor. Die Messpunkte wurden
durch eine lineare Trendlinie verbunden. Es ergab sich ein Korrelationskoeffizient von R² = 0,99.
26

4. ERGEBNISSE
4.5.2 Proteinbindungskurve für die α2-Adrenozeptoren
Für die α2-Rezeptoren ergab sich ebenso ein sehr hoher Korrelationskoeffizient (R² = 0,99),
weswegen, wie unter 4.5.1. beschrieben, hier ebenfalls eine Proteinmenge von 100 µg/Ansatz
eingesetzt wurde.
dpm (bound)
2700
2200
1700
1200
700
200
27
y = 11950x + 281,5
R 2 = 0,9992
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
mg Protein im Test
Abb. 6: Graphische Darstellung der Proteinbindung für den α2 - Rezeptor. Die Messpunkte wurden
durch eine lineare Trendlinie verbunden. Es zeigt sich ein Korrelationskoeffizient von R² = 0,99.
4.6 Ergebnisse der Rezeptorenmessung bei Pferd und Pony
4.6.1 Anzahl der Bindungsstellen
Die Bestimmung der Bindungskapazität bzw. der Rezeptorenanzahl im equinen Fettgewebe
wurde letztendlich in Einpunktmessungen mit konstanter Proteinmenge in zuvor bestimmten
Konzentrationsbereichen der Liganden durchgeführt.
Vor Beginn jeder einzelnen Messung wurde der aktuelle Proteingehalt der Probe überprüft
und nötigenfalls auf einen Gehalt von 100 µg Protein/Ansatz eingestellt. Anzumerken ist hier,
dass keine signifikanten Diskrepanzen hinsichtlich der Proteinausbeute in der Aufarbeitung
im Vergleich Pony – Pferd festzustellen waren.

4.6.1.1 α1-Adrenozeptoren
4. ERGEBNISSE
Die Ergebnisse des Bindungsassays ergaben für die α1-Adrenozeptoren eine durchschnittliche
Bindungsstellenanzahl von 34,67 (± 15,21) fmol/mg Protein beim Pony und 43,5 (± 17,26)
fmol/mg Protein in der Pferdegruppe. Bei den Pferden konnten für ein Tier aufgrund
unzureichender Probenmenge keine α1-Rezeptorendaten ermittelt werden.
Nach statistischer Auswertung (t-Test) ergaben sich keine signifikanten Unterschiede
zwischen den beiden Rassen (p = 0,255).
Bindungsstellen (fmol/mg Protein) Protein) Protein)
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Abb. 7: Bindungsstellenanzahl der α 1-Rezeptoren im Vergleich Pony – Pferd.
4.6.1.2 α2-Adrenozeptoren
Für die α2-Adrenozeptoren wurden in der Ponygruppe durchschnittlich 110,5 (± 41,2)
fmol/mg Protein gemessen, während bei den Pferden ein Durchschnittswert von 102,4 (±
44,6) fmol/mg Protein ermittelt wurde.
Auch hier zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Daten der beiden
Gruppen (p = 0,66).
28
n.s.
Pony (n = 9) Pferd (n = 10)

4. ERGEBNISSE
Abb. 8: Graphische Darstellung der Bindungsstellenanzahl der α2-Rezeptoren im Vergleich Pony -
Pferd
Bindungsstellen (fmol/mg Protein)
140
120
100
80
60
40
20
0
Pony (n=11) Pferd (n=11)
4.6.2 Vergleich der Adrenozeptor-Subtypen bei Pony und Pferd
Stellt man die beiden α-Rezeptor-Subtypen jeweils einer Rasse einander gegenüber, kann man
einen signifikant höheren Besatz von α2- in Relation zu α1-Adrenozeptoren erkennen. Dies
gilt sowohl für die Pony-, als auch für die Pferdegruppe (p = < 0,001).
29
n.s.

Bindungsstellen (fmol/mg Protein)
4. ERGEBNISSE
Abb. 9: α1- und α2 –Adrenozeptor - Subtypen in der Ponygruppe (: p = < 0,001)
Bindungsstellen (fmol/mg Protein)
1 6 0
1 4 0
1 2 0
1 0 0
8 0
6 0
4 0
2 0
0
160
140
120
100
80
60
40
20
0
α1 (n = 9) α2 (n = 11)
α1 (n = 10) α2 (n = 11)
Abb. 10: α1 - und α2 -Adrenozeptor - Subtypen in der Pferdegruppe (: p = < 0,001)
30

4. ERGEBNISSE
4.7 Adipozytenhistologie und Morphometrie
4.7.1 Vergleich Pony – Pferd
Das Abdominal- bzw. Inguinalfett der Pferde und Ponys wurde per Kryoschnitt in einer Dicke
von ca. 60 µm auf Objektträger verbracht, sofort nativ im Durchlicht mikroskopiert und
schließlich fotografiert.
Als Beispiel ist im Folgenden von jeder Gruppe und jeder Gewebelokalisation je ein Foto
abgebildet.
31

4. ERGEBNISSE
Abb. 11: Foto eines Fettgewebsschnittes (Abdominalfett) des Pferdes (12).Vergrößerung: x25
Abb. 12: Foto eines Fettgewebsschnittes (Abdominalfett) des Ponys (5). Vergrößerung: x25
32

4. ERGEBNISSE
Abb. 13: Foto eines Fettgewebsschnittes (Inguinalfett) des Pferdes (12). Vergrößerung: x25
Abb. 14: Foto eines Fettgewebsschnittes (Inguinalfett) des Ponys (5). Vergrößerung: x25
33

4. ERGEBNISSE
Zur Ermittlung der Zellgröße des Fettgewebes stand lediglich Probenmaterial von je 8
Pferden bzw. Ponys zur Verfügung.
Für die Ponygruppe ergibt sich im Durchschnitt eine Zellfläche von 1,23 (± 0,52) mm²/100
Zellen für das Bauchfett. Die Zellfläche des Inguinalfetts dieser Tiere betrug durchschnittlich
1,11 (± 0,41) mm²/100 Zellen. Damit ergab sich kein statistisch signifikanter Unterschied in
der Zellgröße des Abdominal- bzw. Inguinalfetts beim Pony (p = 0,638).
Beim Pferd nehmen 100 Zellen Abdominalfett durchschnittlich 0,84 (± 0,26) mm² ein,
während das Inguinalfett eine Fläche von 0,62 (± 0,11) mm²/100 Zellen zeigt. Für die
Pferdegruppe ergab sich damit im Gegensatz zum Pony ein signifikanter Unterschied in der
Zellgröße von Abdominal- und Inguinalfett (p = 0,041).
Vergleicht man das Abdominalfett der beiden Gruppen, erscheinen die Adipozyten der Ponys
tendenziell größer als die der Pferde, die ermittelten Daten zeigten mit p = 0,075 allerdings
keinen statistisch signifikanten Unterschied. Im Gegensatz dazu findet sich beim Vergleich
der Inguinalfettgröße von Pony und Pferd ein signifikanter Unterschied (p = 0,005). Die
Adipozyten des Ponyinguinalfettgewebes sind demnach signifikant größer als die der Pferde
(s. Abb. 15:).
Zellfläche (mm²/100 Zellen)
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
n = 8 n = 8 n = 8 n = 8
Abb. 15: Übersicht der Zellgrößen von Pferd und Pony. (: p = 0,005)
34
n.s.
Pony Inguinal-
Pferd Inguinal-
Pony Abdominalfett
Pferd Abdominalfett

4. ERGEBNISSE
4.7.2 Beziehung zwischen Adipozytengröße und Ernährungszustand
Um die Adipozytengröße der Ponys und Pferde in Relation zur Körperkondition betrachten zu
können, wurden die Tiere zunächst entsprechend des Ernährungszustandes in Gruppen
(normaler und adipöser Ernährungszustand) eingeteilt.
Stellt man nun eine Verbindung zwischen der Zellgröße und dem Ernährungszustand des
Tieres her, ergibt sich folgendes Bild:
Die Ponys in einem guten (normalen) Ernährungszustand haben mit durchschnittlich 0,94 (±
0,30) mm²/100 Zellen signifikant größere Inguinalfettzellen als die Pferde mit 0,57 (± 0,10)
mm²/100 Zellen in gleicher Kondition (p = 0,028).
Bei den adipösen Tieren lässt sich allerdings kein statistisch signifikanter Unterschied
darstellen, wobei nicht unerwähnt bleiben soll, dass die Anzahl der zur Verfügung stehenden
adipösen Tiere zu gering ist, um eine abgesicherte Aussage dahingehend machen zu können.
Die Inguinalfettzellfläche der adipösen Ponys lag im Durchschnitt bei 1,39 (± 0,47) mm²/100
Zellen, die der Pferde bei 0,69 (± 0,1) mm²/100 Zellen (p = 0,064).
Zellfläche Zellfläche Zellfläche mm² / 100 Zellen
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
(n=5) (n=3) (n=5) (n=3)
Pony Pferd
Abb. 16: Beziehung zwischen der Zellgröße des Inguinalfettes und dem Ernährungszustand
35
normal
adipös

4. ERGEBNISSE
Bezüglich des Abdominalfettes ergab sich weder bei den Tieren in guter Kondition, noch bei
den adipösen Pferden und Ponys ein statistisch signifikanter Unterschied in der
Adipozytengröße. Hinsichtlich der Aussagefähigeit der Werte gilt hier ebenso das im
Zusammenhang mit dem Inguinalfett Beschriebene.
Die Messwerte der gut genährten Ponys lagen im Mittel bei 1,13 (± 0,1) mm²/100 Zellen, die
der Pferde bei 0,74 (± 0,29) mm²/100 Zellen.
Bei den adipösen Tieren konnte für die Ponys eine Bauchfettzellgröße von durchschnittlich
1,4 (± 0,69) mm²/100 Zellen und für die Pferde 0,99 (± 0,05) mm²/100 Zellen ermittelt
werden.
Zellfläche mm² / 100 Zellen
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
(n=5) (n=3) (n=5) (n=3)
Pony Pferd
Abb. 17: Beziehung zwischen der Zellgröße des Abdominalfettes und dem Ernährungszustand
Damit der Ernährungszustand der Tiere genauer eingeschätzt werden kann, wurde eine
Klassifizierung mittels BMI vorgenommen. Um zu eruieren, inwieweit der
Ernährungszustand des Einzeltieres und die Größe der Adipozyten korrelieren, wurden diese
beiden Größen in Beziehung zueinander gesetzt.
36
normal
adipös

Zellfläche mm²/100 Zellen
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
4. ERGEBNISSE
R 2 = 0,3751
37
R 2 = 0,0435
Pony
Pferd
0,00
100 150 200 250
BMI = KGW (kg)/ Stm (m)²
Abb. 18: Graphische Darstellung des Verhältnisses Adipozytengröße (Abdominalfett) –
Ernährungszustand. Pony n = 8, Pferd n = 8.
Für das Bauchfett kann man aus der Graphik keine Korrelation zwischen Ernährungszustand
und Adipozytengröße für die Pferdegruppe ableiten (R² = 0,04).
In der Ponygruppe liegt zwar das Bestimmtheitsmaß deutlich höher (R² = 0,37), dennoch kann
hier nicht von einer direkten Abhängigkeit der beiden Größen voneinander gesprochen
werden.

Zellfläche mm²/100
Zellen
2,00
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
4. ERGEBNISSE
R 2 = 0,5518
38
Pony
Pferd
R 2 = 0,2469
100 150 200 250
BMI = KGW (kg)/ Stm (m)²
Abb. 19: Graphische Darstellung des Verhältnisses Adipozytengröße (Inguinalfett) –
Ernährungszustand. Pony n = 8, Pferd n = 8.
Auch bei dem Inguinalfett der beiden Tiergruppen ist kein linearer Zusammenhang der Daten
festzustellen. Für die Pferde ergibt sich lediglich ein Bestimmtheitsmaß von R² = 0,25 und bei
den Ponys liegt es bei 0,55.
Für die Pferdegruppe kann daher kein direkter Zusammenhang zwischen Zellgröße und BMI
hergestellt werden, bei den Ponys dagegen lässt sich eine tendenzielle Abhängigkeit der
beiden Größen voneinander erkennen (R² = 0,55).
Um allerdings eine allgemeingültige Aussage diesbezüglich zu treffen, ist die n-Zahl zu
gering. Weitere Untersuchungen wären nötig.

5 Diskussion
5.DISKUSSION
Da die Ätiologie des Hyperlipämie-Syndroms des Ponys derzeit trotz diverser Studien noch
nicht eindeutig geklärt ist, sollte diese Arbeit einen ergänzenden Beitrag zum Verständnis der
Pathogenese dieser Fettstoffwechselerkrankung liefern.
Hinsichtlich der bereits durch BREIDENBACH et al. (1999) und RIEBANDT (2005)
festgestellten 7-fach erhöhten Lipolyseempfindlichkeit in Bauchfett-Adipozyten nach
Noradrenalinstimulation beim Pony im Vergleich zu Großpferden, sollte nun der Frage
nachgegangen werden, inwieweit den Katecholaminrezeptoren an den Adipozyten eine
Schlüsselrolle zuzuordnen ist.
In Anlehnung an die Untersuchungen von WRAGE (2002) bezüglich der ß-adrenergen
Rezeptoren im equinen Fettgewebe, war nun der Besatz der Adipozyten mit
α-Adrenozeptoren zu bestimmen. Da die ß-Rezeptoren an der Fettzelle als Aktivatoren der
Lipolyse fungieren, in der Studie von WRAGE aber bei Ponyadipozyten eine signifikant
geringere ß-Adrenozeptorenzahl im Vergleich zu Pferdeadipozyten festgestellt wurde, konnte
hiermit keine Klärung des gesteigerten Lipolysevermögens bei Ponys erlangt werden. Die
vorliegende Studie sollte nun aufzeigen, inwieweit den α-Adrenozeptoren als Gegenspieler
der ß-adrenergen Rezeptoren eine Rolle bei der Entstehung der Hyperlipämie zukommt.
5.1 Versuchsanstellung und Methodik
5.1.1 Versuchstiere und Probenmaterial
Zur Klärung der o. g. Fragestellung wurden auch in der eigenen Untersuchung
Vergleichsmessungen an Probenmaterialien der beiden Rassen durchgeführt, weil bei
Großpferden das Hyperlipämie-Syndrom nur äußerst selten beschrieben ist.
Aufgrund des relativ großen Probenvolumens, welches zur Gewinnung der rezeptorbesetzten
Adipozytenplasmemembran benötigt wurde, war einerseits eine Probenentnahme per Biopsie
nicht möglich. Andererseits waren Probanden, an denen eine mit Narkose bzw. Anästhetika
durchzuführende Operation erfolgen konnte, nicht in ausreichender Anzahl verfügbar, so dass
Schlachttiere zur Beprobung herangezogen werden mussten. Hierdurch konnte entsprechend
39

5. DISKUSSION
keine Homogenität der Tiergruppen gewährleistet werden. Um jedoch die Gruppen so
einheitlich wie möglich zu erhalten, wurden die Tiere sorgfältig selektiert. Bei den Ponys
wurden möglichst nur Shetlandponys oder Kreuzungen aus dieser Rasse beprobt, da bei
diesen Ponys eine besondere Prädisposition zum Hyperlipämie-Syndrom besteht (THILSTED
et al. 1982; WATSON et al. 1992; MOORE et al. 1994; DIETZ u. HUSKAMP 1999). Für die
Pferdegruppe wurden nur Warmblutzuchten, insbesondere Hannoveraner, zur
Probenentnahme herangezogen. Des Weiteren wurden sowohl in der Pony- als auch in der
Pferdegruppe nur Tiere mit mindestens gutem Ernährungszustand ausgewählt. Da die Ponys
und Pferde größtenteils erst kurz vor der Schlachtung angeliefert wurden, ist über die
Fütterung sowie die Haltungsbedingungen nichts bekannt. Aufgrund des geringen
Aufkommens von Schlachtponys konnte keine Selektion nach Geschlecht vorgenommen
werden.
Im Hinblick auf bereits bekannte unterschiedliche Lipolyseaktivitäten in Fettgewebe
verschiedener Lokalisationen (SZALRYD u. KRAEMER 1994; TAVENIER et al. 1995;
BOUSQUET-MELOU et al. 1999) wurden hier Proben sowohl von Bauchhöhlenfett als auch
von subkutanem Inguinalfett genommen. Allerdings konnte lediglich das Bauchfett in die
Rezeptorenmessung einbezogen werden, da eine ausreichende Gewinnung von
Plasmamembran aus dem Inguinalfett technisch sehr oft nicht möglich war. Eine
vergleichende Betrachtung der beiden Gewebelokalisationen konnte dementsprechend nur
bezüglich der Zellgrößen erfolgen.
Die Schlachtung wurde in einem auf die Pferdeschlachtung spezialisierten Familienbetrieb
durchgeführt, in dem die Tiere früh morgens einzeln in einem kleinen Schlachtraum getötet
und im unmittelbaren Anschluss ausgeweidet und in Viertel zerlegt wurden. Die Proben
konnten sofort nach der Ausweidung entnommen und in körperwarmer physiologischer
Kochsalzlösung ins Institut verbracht werden.
5.1.2 Plasmamembranpräparation
Die Gewinnung von Plasmamembranen ist bei der Untersuchung von adrenergen Rezeptoren
an der Fettzelle der essentielle Schritt, von dessen Ergiebigkeit die Effektivität der Messung
der Adrenozeptoren abhängt.
40

5. DISKUSSION
In bisherigen Studien an Fettgewebe, aus dem die Plasmamembran präpariert werden sollte,
wurden überwiegend die Adipozyten nach der Methode von RODBELL (1964) mittels
Collagenaseverdauung isoliert, bevor aus diesen schließlich die Zellmembran gewonnen
wurde. BELSHAM et al. (1980) verwendeten sowohl isolierte Fettzellen als auch intaktes
Fettgewebe aus dem epididymalen Fettpolster der Ratte und entwickelten so eine schnelle und
zuverlässige Methode zur Membranpräparation. Diese Methode, ausgehend von intaktem
Fettgewebe, basiert auf der Trennung der Adipozytenplasmamembran von den Mitochondrien
mittels Percoll in Verbindung mit einem saccharosehaltigen Puffer per Dichtegradienten.
Diese Methode wurde von WRAGE (2002) modifiziert und zur Präparation von equinem
Fettgewebe angewendet. Ausgehend von dieser Studie wurde in Vorversuchen zu der
vorliegenden Arbeit zunächst das Fettgewebe in gleicher Weise bearbeitet. Allerdings war die
Ausbeute an Adipozytenplasmamembran zu gering, um hiermit in ausreichendem Maße ein
Radioassay zur Bestimmung der α-adrenergen Rezeptoren durchführen zu können.
In weiteren eigenen Versuchen zur Plasmamembranpräparation wurden die
Zentrifugationsschritte adaptiert und die Ausbeute an Zellmembranen und deren Reinheit
mittels Markerenzymen überprüft. Schließlich wurde auf den Percollgradienten verzichtet, da
dieser in der weiteren Aufarbeitung einen relativ großen Verlust an Membranprotein mit sich
brachte, sodass die Menge des isolierten Plasmamembranproteins zur Rezeptorenbestimmung
bei weitem nicht ausreichte. Obwohl eine größere Reinheit durch diesen Gradienten erzielt
werden kann, genügte die durch Variation der Zentrifugation ohne Percoll erhaltene Qualität
der Adipozytenplasmamembran in vollem Umfang zur Messung der α-Adrenozeptoren. Die
Reinheitskontrolle des gewonnenen Membranproteins erfolgte, entsprechend der Arbeit von
WRAGE (2002), mittels Aktivitätsmessung der Markerenzyme von Plasmamembran und
Mitochondrien.
Eine Störung der Untersuchung durch evtl. verbliebene Reste an Mitochondrien war nicht
festzustellen.
Um eine Verunreinigung des Probenmaterials mit Bindegewebszellen so weit wie möglich
auszuschließen, wurden bereits bei der Vorbereitung zur Lagerung des intakten Fettgewebes
die adspektorisch sichtbaren Anteile an Faszienresten, großen Gefäßen und sonstigen
bindegewebigen Strukturen entfernt. Bei der Plasmamembranpräparation wurde schließlich
41

5. DISKUSSION
durch mehrfache Filtration des Gewebehomogenates eine Entfernung noch verbliebener
Bindegewebsreste gewährleistet. Ein weiterer Faktor, um eine größtmögliche Reinheit bzw.
Einheitlichkeit bezüglich des Bindegewebsanteils zu erreichen, ist die stets an der gleichen
Körperstelle erfolgte Probenentnahme.
5.1.2.1 Aufarbeitungsergiebigkeit der Plasmamembranpräparation
In der vorliegenden Arbeit konnte ein Proteingehalt von 1,16% (± 0,40) in der Pferdegruppe
bzw. 0,85% bei den Ponys erzielt werden. Im Gegensatz dazu konnte WRAGE (2002) eine
Aufarbeitungsergiebigkeit von 2,75% (± 0,67) bei den Pferden bzw. 1,88% (± 0,38) in der
Ponygruppe erreichen. Um zu eruieren, welcher Anteil des Gesamtproteins in der
Plasmamembranfraktion tatsächlich dem Plasmamembranprotein zuzuordnen, bzw. wie groß
der Fremdproteinanteil ist, wurden im Folgenden Messungen der 5’-Nucleotidase
durchgeführt (siehe 5.1.2.2.).
5.1.2.2 Reinheit der Plasmamembranfraktion
Die Reinheit der Plasmamembranfraktion wurde mittels Aktivitätsmessung der
Markerenzyme 5’Nucleotidase und Cytochrom-C-Oxidase überprüft.
Wie schon AVRUCH und WALLACH (1971) sowie NEWBY (1975) zeigten, stellt die
5’Nucleotidase ein geeignetes Markerenzym für die Plasmamembran im Fettgewebe dar.
In der Literatur sind Anreicherungen in den Größenordnungen von über 10-fach bei
Rattenadipocyten (BELSHAM et al. 1980) bis 25-fach bei porcinen Fettzellen (NICOLAS et
al. 1990) beschrieben. Zum direkten Vergleich der Aufreinigung im equinen Fettgewebe
stehen lediglich die Daten von WRAGE (2002) zur Verfügung. Hier ergab sich eine 2,23-
fache (± 0,44) Anreicherung beim Pferd und ein Wert von 2,43-fach (± 0,73) für die
Ponygruppe.
Die Aufreinigungsfaktoren in der vorliegenden Studie liegen mit 6,5 (± 2,9) in der
Pferdegruppe und 7,9 (± 4,1) bei den Ponys deutlich höher, so dass hier von einer größeren
Ausbeute an Plasmamembranprotein ausgegangen werden kann und bei WRAGE der
Fremdproteinanteil entsprechend höher liegt.
42

5. DISKUSSION
Zur Überprüfung der Reinheit der einzelnen Aufarbeitungsfraktionen wurde, zusätzlich zur
5’Nucleotidase, die Aktivität der Cytochrom-C-Oxidase als Markerenzym für die
Mitochondrien bestimmt. Die höchste CCO-Aktivität konnte in der Mitochondrienfraktion
(P14) gemessen werden. Es wurde eine durchschnittliche Anreicherung vom Homogenat zur
P14 – Fraktion von 2,6-fach (± 1,4; Pferde) bzw. 3,8-fach (± 1,7; Ponys) erreicht, womit in
dieser Fraktion der höchste Mitochondriengehalt festzustellen war.
In der Plasmamembranfraktion konnte keine absolute Mitochondrienfreiheit erzielt werden,
dennoch erfolgte hier in Bezug zu P14 eine deutliche Abreicherung. Die
Aufreinigungsfaktoren betragen für die Pferde 1,5 (± 0,6) bzw. 1,8 (± 0,9) Ponygruppe.
Demgegenüber konnte WRAGE (2002) mit einer durchschnittlich 7,8-fachen (± 1,61)
Enzymaktivität eine deutlich größere Anreicherung an Mitochondrien erreichen. In der
Plasmamembranfraktion wurden hier Aufreinigungsfaktoren von durchschnittlich 2,48 (± 1,1)
erzielt.
BELSHAM et al. (1980) dagegen ermittelten für die Mitochondrienfraktion ebenso wie
WRAGE Werte >7, wobei sie statt der CCO die Enzyme Succinatdehydrogenase und
Citratsynthase als Mitochondrienmarker verwendeten. In der Plasmamembanfraktion wurde
von BELSHAM et al eine 1,3-fache Enzymaktivität gegenüber dem Homogenat gemessen,
was sich wiederum mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit deckt.
Diese Differenz der Messwerte könnte in der unterschiedlichen Präparationsmethodik,
insbesondere dem Fehlen des Percollgradienten begründet sein.
5.2 Radioassay zur Bestimmung der α-adrenergen Rezeptoren
Grundlage der Messmethodik in dieser Arbeit war die Studie von RE et al. (2001) bezüglich
α-adrenerger Rezeptoren in der glatten Muskulatur des equinen Ileums. Die Autoren
verwendeten zur Detektion der α1-Rezeptoren das selektive α1-Adrenolytikum [ 3 H]Prazosin.
Für die Untersuchung der α2-Rezeptoren ist der selektive α2-Antagonist [ 3 H]Rauwolszin
etabliert und wurde neben der o. g. Studie z.B. in Rezeptorenmessungen an humanen
Adipozyten (LAFONTAN und BERLAN 1995) oder im weißen Fettgewebe der Ratte
(KOBATAKE et al. 1991) eingesetzt. Das nichtselektive α-Adrenolytikum Phentolamin
43

5. DISKUSSION
diente zur Bestimmung der Nichtspezifischen Bindung. Zur Untersuchung der
α1-Adrenozeptoren verwendeten KOBATAKE et al. Bunazosin anstelle von Prazosin,
ebenfalls ein Quinazolinderivat, welches hydrophiler ist als Prazosin. Diese Eigenschaft stellt
für besagte Arbeitsgruppe eine Erklärung für das bisherige Fehlen von
α1-Rezeptornachweisen per direkter Radioligandenbindung in weißem Fettgewebe der Ratte
dar. Diese Beobachtung deckt sich nicht mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit
bezüglich des equinen Fettgewebes. In dieser Studie konnten sowohl α1- als auch α2-
Rezeptoren an den Adipozyten nachgewiesen werden. Da bislang keine Untersuchungen
hinsichtlich des α-Adrenozeptorenbesatzes im equinen Fettgewebe beschrieben wurden,
fehlen jedoch Referenzdaten.
5.3 Adipozytenmorphologie
Aus in flüssigem Stickstoff gelagerten Proben des Abdominal- sowie Inguinalfettgewebes der
beprobten Pferde und Ponys wurden Gefrierschnitte angefertigt, um eventuelle Unterschiede
in der Größe der Adipozyten zu eruieren. Ausgehend von der Methode nach HAUSMAN
(1981) wurden die Schnitte entsprechend der Modifikation nach WRAGE (2002) hergestellt,
um eine Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten zu gewährleisten. Auch hier wurden aus dem
tiefgefrorenen Gewebe Nativpräparate hergestellt, die sofort unfixiert und ungefärbt
fotografiert wurden. Auf eine Fixation und Färbung wurde verzichtet, um eine hierdurch
mögliche Veränderung der Zellgröße zu verhindern.
Die in der Literatur angegebenen optimalen Schichtdicken von Ratten- und
Schweinefettgewebe liegen bei 24 – 30 µm, laut WRAGE (2002) liegt die untere Grenze der
Schnittdicke für equines Fettgewebe bei 75 µm, ohne dass größere Artefakte entstehen. In
dieser Arbeit konnte eine Schichtdicke der Kryoschnitte von ca. 60 µm erreicht werden,
allerdings war aufgrund der Fettbeschaffenheit ein Unterschreiten dieses Maßes nicht
möglich, ohne dass das Gewebe verschoben oder zerrissen wurde. Auch hier war nicht zu
vermeiden, dass mehrere Zelllagen erfasst wurden. Bei der Auswertung konnte durch
fokussieren eine deutliche Trennung der Gewebeschichten erreicht werden, so dass die
Zellgrenzen manuell erfasst und schließlich die Zellfläche entsprechend berechnet werden
konnte.
44

5. DISKUSSION
Die Zellgröße im Fettgewebe ist von verschiedenen Parametern abhängig und muss daher
differenziert betrachtet werden. Einflussnehmende Faktoren sind neben der Spezies auch
Alter, Geschlecht, Umweltbedingungen, Ernährungszustand oder Lokalisation der
Fettgewebsprobe (MERSMANN und MAC NEIL 1986; BIANCHI 1989). Da die beprobten
Tiere naturgemäß keine homogene Population darstellen und nicht unter gleichen
Bedingungen gehalten werden konnten, waren Umwelteinflüsse ein nicht bewertbarer Faktor.
Das Alter scheint bei den Equiden hinsichtlich der Adipozytengröße keine Rolle zu spielen,
da sich in dieser Arbeit im Gegensatz zu den Beobachtungen an Schafen von LEE et al.
(2000) keine größeren Fettzellen mit zunehmendem Alter zeigten. Ein signifikanter Einfluss
des Geschlechts ist bei den ermittelten Daten ebenfalls nicht zu erkennen. Dem
Ernährungszustand hingegen ist eine größere Bedeutung zuzumessen. Die Pferde und Ponys,
die zur Beprobung herangezogen wurden, sind zwar in der Gesamtheit mindestens in gutem
bis sehr gutem (adipösen) Ernährungszustand, dennoch sind tendenziell bei den fetten Tieren
größere inguinale ebenso wie abdominale Adipozyten zu finden. Dies gilt sowohl für die
Pferde- wie auch für die Ponygruppe, wobei die gut genährten Ponys signifikant größere
Inguinalfettzellen haben als die Pferde in gutem Ernährungszustand. Bei den adipösen Tieren
ist diese Signifikanz nicht gegeben, im Abdominalfett konnte ebenfalls keine statistische
Absicherung der Zellgrößenunterschiede zwischen Pony und Pferd erzielt werden. Durch eine
größere Probandenzahl wären diese Ergebnisse noch zu verifizieren.
Die Gewebelokalisation spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle hinsichtlich der
Zellgrößenvariation. Während die Adipozyten im Baufett, wie z.B. in der Fossa
supraorbitalis, verhältnismäßig klein mit geringem Variationsgrad sind, finden sich im
Depotfett, wie z. B. subseröses Abdominalfett, die größten Zellen mit deutlich größerer
Variationsbreite (BIANCHI 1989). In der vorliegenden Arbeit wurden die Zellgrößen aus
zwei definierten Regionen des Depotfettes ermittelt.
Bezogen auf 100 Adipozyten ergab sich für die Ponys eine durchschnittliche Zellfläche im
Abdominalfett von 1,23 (± 0,52) mm²/100 Zellen. Die Zellfläche des Inguinalfetts betrug 1,11
(± 0,41) mm²/100 Zellen. Für die Pferdegruppe konnten im Abdominalfett durchschnittlich
0,84 (± 0,26) mm²/100 Zellen und im Inguinalbereich 0,62 (± 0,11) mm²/100 Zellen gemessen
werden.
45

5. DISKUSSION
Signifikante Unterschiede der Adipozytengrößen konnten lediglich im Vergleich des
Abdominalfetts mit dem Inguinalfettgewebe des Pferdes festgestellt werden, d. h. beim Pferd
sind die Zellen des Bauchfetts signifikant größer als die des Inguinalfetts. In der Ponygruppe
zeigte sich eine entsprechende Tendenz zu größeren Abdominalfettzellen, welche aber nicht
statistisch abgesichert werden konnte. Im Speziesvergleich zeigten sich die Inguinalfettzellen
der Ponys signifikant größer als die der Pferde, während sich im Abdominalfett lediglich eine
statistisch nicht abgesicherte Tendenz zu größeren Ponyadipozyten ergab.
Diese Ergebnisse decken sich nur zum Teil mit denen von WRAGE (2002). Während für das
Abdominalfett der Ponys fast identische Werte ermittelt werden konnten, waren die
Messwerte der Pferdegruppe in dieser Studie etwa doppelt so hoch wie in o. g. Arbeit.
Messwerte für das Inguinalfett wurden nicht ermittelt, insofern ist ein Datenvergleich hierfür
nicht möglich. In der Literatur sind für equines Fettgewebe bisher keine Referenzwerte auf
der Basis der Zellfläche im Fettgewebe zu finden, da die meisten Autoren die Zellgröße von
isolierten Fettzellen gemessen haben. Ein direkter Vergleich, bzw. die Umrechnung vom
Zelldurchmesser eines isolierten Adipozyten zur Zellfläche im Gewebeverband erscheint
daher nicht möglich.
5.4 Bedeutung der eigenen Ergebnisse im Hinblick auf das Hyperlipämie-
Syndrom
5.4.1 Ätiologie der equinen Hyperlipämie
Das Hyperlipämie-Syndrom bezeichnet eine Fettstoffwechselstörung, die vor allem bei
adipösen Ponys kleiner Rassen in Stresssituationen mit einer Inzidenz von ca. 5% (WATSON
u. LOVE 1994) auftritt. Die Rassedisposition betrifft insbesondere Shetlandponys
(JEFFCOTT u. FIELD 1985), Miniponys und Esel (FORHEAD et al. 1994; WATSON u.
LOVE 1994; MOORE et al. 1994; TARRANT et al. 1998). Es können aber auch andere
Ponyrassen, Isländer und Fjordpferde (DIETZ 1999), Großpferde dagegen nur sehr selten
betroffen sein (NAYLOR et al. 1980, DUNKEL u. McKENZIE 2003).
Zumeist erkranken Stuten in der Hochträchtigkeit oder Laktation, was auf eine hormonelle
Beeinflussung des Fettstoffwechsels zurückzuführen ist (GAY et al. 1978; FÜRLL u.
46

5. DISKUSSION
SCHÄFER 1992; JEFFCOTT u. FIELD 1985). Hengste und Wallache dagegen sind weniger
gefährdet (WATSON et al. 1992).
Obwohl in der Literatur einzelne Fälle bei Fohlen bzw. Jungtieren beschrieben wurden
(MOORE et al. 1994; HUGHES et al. 2002), tritt die Hyperlipämie bei Equiden in erster
Linie bei adulten Tieren in Erscheinung (WATSON u. LOVE 1994).
Es handelt sich bei dem equinen Hyperlipämie-Syndrom nicht um eine Primärerkrankung,
vielmehr tritt es in der Folge verschiedener Vorerkrankungen auf (FÜRLL u. SCHÄFER
1992; DIETZ 1999). Hier sind als prädisponierende Faktoren sämtliche Stresssituationen zu
nennen, die einerseits mit einem katabolen Stoffwechsel, insbesondere einer gesteigerten
Lipolyse einhergehen, wie z. B. plötzliche Hungerphasen bei einer guten bis adipösen
Körperkondition, Trächtigkeit, Laktation oder Parasitenbefall. Andererseits spielen
hormonelle Imbalancen, z. B. durch endogene ACTH-, Katecholamin- und
Cortisolausschüttungen wie bei Kolik, Hufrehe oder dem equinen Hypophysenadenom
(Morbus Cushing) eine nicht unwesentliche Rolle bei der Entstehung der Hyperlipämie.
Cortisol vermindert die Effektivität von Insulin, welches u. a. bei der Lipogenese regulierend
wirkt. Die Folge ist eine herabgesetzte Lipogenese und eine gesteigerte Mobilisation von
Triglyceriden, woraus sich eine Erhöhung von VLDL, TGL und FFS im Blutplasma ergibt
(JEFFCOTT u. FIELD 1985; WATSON u. LOVE 1994; NAYLOR 1982).
Trotz umfangreicher Studien auf diesem Gebiet ist es bislang noch nicht gelungen, die
Ätiopathogenese des Hyperlipämie-Syndroms beim Pony auf molekularer Ebene vollständig
aufzuklären.
5.4.2 Klinische Symptomatik, Diagnose und Prognose
Equiden, die am Hyperlipämie-Syndrom erkrankt sind, fallen klinisch zunächst durch eine
gering- bis hochgradige Apathie und Inappetenz bei meist gutem bis sehr gutem
Ernährungszustand auf. Häufig sind (Unterbauch-) Ödeme, gelegentlich Schwäche,
Muskelzittern und Ataxie bis hin zum Festliegen und Tod des Tieres zu beobachten (GAY et
al. 1978; JEFFCOTT u. FIELD 1985; WATSON u. LOVE 1994). Ikterische Schleimhäute
zeigen sich im Krankheitsverlauf durch die gestörte Leber- und Nierenfunktion, resultierend
47

5. DISKUSSION
aus der massiven Fetteinlagerung in die Organe. Die Körpertemperatur kann bei einer
fieberhaften Primärerkrankung erhöht sein, im weiteren Verlauf kommt es aber zum Absinken
der Körperinnentemperatur auf subfebrile Werte. Verringerte Darmgeräusche,
Koliksymptomatik oder Diarrhoe sind beschrieben (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969;
GAY et al. 1978) Bei fortschreitender Krankheitsdauer sinkt der pH-Wert des Blutes und es
entsteht eine metabolische Azidose. Eine verlängerte kapilläre Rückfüllungszeit, sowie
Veränderungen im EKG im Sinne einer energetisch-dynamischen Herzinsuffizienz zeigen
sich im Rahmen des Hegglin-Syndroms (SCHOTMANN u. KRONEMANN 1969; DEEGEN
1972).
Eine klinische Verdachtsdiagnose kann neben der o. a. Symptomatik durch die adspektorische
Untersuchung einer Blutprobe gestellt werden. Das Blutserum hyperlipämischer Tiere
erscheint milchig-hellbraun bis leicht bläulich opaleszierend aufgrund der erhöhten Gehalte
an VLDL, TGL, FFS und Cholesterol (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969; NAYLOR
1982; DIETZ 1999). Physiologischerweise liegen die TGL-Werte im Blutplasma bzw. Serum
bei 6 – 78 mg/dl, von einer Hyperlipämie ist bei Werten > 500 mg/dl zu sprechen. (NAYLOR
et al. 1982), bei hochtragenden Ponystuten können die TGL bis auf 250 mg/dl, bei Eseln
sogar bis 290 mg/dl ansteigen, ohne Krankheitserscheinungen hervorzurufen (WATSON et al.
1993). Zur Absicherung der klinischen Verdachtsdiagnose ist eine laborchemische
Blutuntersuchung zu empfehlen, da bei milderem Krankeitsverlauf die augenscheinlichen
Veränderungen des Serums geringer ausfallen bzw. fehlen können (FÜRLL u. SCHÄFER
1992). Ausgehend von einer fettigen Degeneration v. a. von Leber und Niere, sind die
organspezifischen Serumenzyme GGT, AP, LDH, SDH, BUN und CREA erhöht (WATSON
u. LOVE 1994; NAYLOR et al. 1980). Initial kann eine Hypoglykämie auftreten, die v. a. bei
Cushing-Patienten in eine Hyperglykämie umschlägt (GAY et al. 1978; NAYLOR 1982,
DIETZ 1999).
ERIKSEN u. SIMESEN (1970) und FÜRLL u. SCHÄFER (1992) berichten von einer
verminderten Synthese der Gerinnungsfaktoren und damit einer erhöhten Blutungsneigung
bei Tieren mit Hyperlipämie-Syndrom. Dagegen ist bei DIETZ (1999) zu lesen, dass Ponys
meist eine beschleunigte Blutgerinnung zeigen.
48

5. DISKUSSION
Die Mortalität des Hyperlipämie-Syndroms liegt mit 57 – 80% relativ hoch (JEFFCOTT u.
FIELD 1985), sie kann allerdings bei Eseln bis 95% betragen (TARRANT et al. 1998). Es
scheint, als seien Miniaturrassen prognostisch besser gestellt. Im Gegensatz zu größeren
Ponys bzw. Pferden mit einer Mortalität von mindestens ca. 60% (s. o.) wird bei
Miniaturrassen von einer Mortalitätsrate von 22 - 50% berichtet (RUSH MOORE et al. 1994;
MOGG u. PALMER 1995). Je früher die Primärerkrankung erkannt und gezielt therapiert
werden kann, desto günstiger ist die Prognose. Angesichts der bislang nur unvollständig
geklärten Pathogenese kann die equine Hyperlipämie z. Zt. nur symptomatisch behandelt
werden. Spricht das erkrankte Tier aber innerhalb von 3 – 10 Tagen auf die eingeleitete
Therapie an, d. h. die TGL-Werte normalisieren sich, kann die Prognose als günstig beurteilt
werden.
5.4.3 Prärezeptale Faktoren der Lipolyse
Wie bereits beschrieben, kommt es bei dem Hyperlipämie-Syndrom zu einer massiv
gesteigerten Lipolyse. Ausgelöst wird dies durch ein primäres oder sekundäres Energiedefizit,
was eine insgesamt katabole Stoffwechselsituation bedeutet. Die erhöhte Lipolyserate dient
zunächst zur Bereitstellung von Energieäquivalenten in Form von freien langkettigen
Fettsäuren (FFS).
Hier handelt es sich aber um eine unphysiologisch hohe Lipolyserate bei den erkrankten
Tieren, die in einer Erhöhung der Plasmakonzentrationen von TGL, VLDL und FFS resultiert
(WATSON et al. 1992), da die im Überschuss freigesetzten FFS nicht in entsprechendem
Maße im Gewebe oxidiert werden kann.
Der Lipidmetabolismus unterliegt einem komplexen Regelkreis, der physiologischerweise ein
organspezifisches Gleichgewicht zwischen Lipogenese und Lipolyse bildet. Ein
Schlüsselenzym der Lipidspaltung ist die an der luminalen Seite des Endothels lokalisierte
Lipoproteinlipase, die die hydrolytische Spaltung der in den Chylomikronen und VLDLs
enthaltenen TGL in Glycerin und FFS katalysiert. Dabei ist das Enzym des Fettgewebes
insulinreguliert und aktiv bei geregelter Energieversorgung des Organismus (Speicherung von
Lipiden in den Depotfetten). Die LPL des Muskelgewebes arbeitet besonders intensiv im
Energiedefizit und versorgt dabei das arbeitende Gewebe mit Energie aus lipolytisch
49

5. DISKUSSION
freigesetzten FFS (FANELLI et al. 1992; SUGDEN et al. 1993; REHNER u. DANIEL 1999;
IANKOVA et al. 2008). Bei hyperlipämischen Tieren liegt eine Überaktivität der LPL vor
(WATSON et al. 1992b), was in einer übermäßigen Freisetzung von FFS resultiert
(BREIDENBACH 1996; RIEBANDT 2005). Die LPL-Aktivität im Fettgewebe wird durch
Insulin stimuliert (s.o.), welches wiederum durch das Inkretin GIP (Glucose-abhängiges
Insulinotropes Polypeptid) als Aktivator verstärkt wird. (DÜHLMEIER 1998). Welche
Mechanismen im Einzelnen der beschriebenen verstärkten LPL-Aktivität zugrunde liegen, ist
bislang nicht hinreichend geklärt.
Bereits JEFFCOTT und FIELD (1986) postulierten eine generelle Insulinresistenz bei Ponys,
die besonders bei adipösen bzw. an Hufrehe erkrankten Individuen ausgeprägt ist und die
extrem hohen Blutfettwerte erklären kann. Im Vergleich zu Großpferden tritt sie entscheidend
häufiger auf und es lässt sich eine Häufung bei einzelnen Ponyrassen feststellen (FIELD u.
JEFFCOTT 1989; FREESTONE et al. 1992).
Bei Insulinresistenz besteht eine Verminderung der Zellempfindlichkeit bezüglich dieses
Hormons, d.h. dass für eine normale biologische Reaktion eine höhere Hormonkonzentration
benötigt wird. Da Insulin physiologischerweise über einen eigenen Rezeptor im Adipozyten
eine antilipolytische Wirkung per Aktivitätssenkung der HSL entfaltet und BREIDENBACH
(1996) eine unvollständige Inhibition der Lipolyse durch Insulin nachweisen konnte, wäre
dies ein Ansatz zur Erklärung der Prädisposition von Ponys zur Hyperlipämie. Inzwischen ist
bei verschiedenen Autoren von einem Zusammenhang zwischen Insulinresistenz und der
Pathogenese des Hyperlipämiesyndroms zu lesen (HUGHES et al. 2004; KRONFELD et al.
2005; OIKAWA et al. 2005).
In einer Studie von VON EYNATTEN (2004) wurde eine positive Korrelation von LPL-
Aktivität und Adiponektin beim Menschen nachgewiesen. Adiponektin wird ausschließlich
von reifen Adipozyten sezerniert. Dies lässt vermuten, dass eine übermäßige Adiponektin-
Sensibilität der LPL oder eine gesteigerte Konzentration des Hormons im Zusammenhang mit
der Ätiopathogenese der Hyperlipämie stehen könnte. Beim Menschen ist eine deutlich
verringerte Adiponektin-Plasmakonzentration bei übergewichtigen Individuen bzw.
Insulinresistenz bei Übergewicht beschrieben (PANNACCIULLI et al. 2006; RABE et al.
2008). Im equinen Fettgewebe wurde ein umgekehrt proportionales Verhältnis von
50

5. DISKUSSION
Adiponektinkonzetration und Fettmasse beschrieben (KEARNS et al. 2006), was der
Hypothese der gesteigerten Lipolyse aufgrund einer Adiponektininteraktion bei den v. a.
adipösen erkrankten Tieren widerspricht. Desweiteren berichten KADOWAKI et al. (2006)
von transgenen Mäusen mit Adiponektindefizienz, die Insulinresistenz, Hyperlipidämie und
Hypertension entwickelten. Weiterhin bewirkt Adiponektin eine Sensibilisierung des
Gewebes für Insulin bzw. eine Stimulation der Insulinsekretion des Pankreas und wird somit
als therapeutische Strategie bei Insulinresistenz und anderen übergewicht-assoziierten
Erkrankungen (Diabetes mellitus Typ 2, Metabolisches Syndrom) diskutiert (KADOWAKI et
al. 2006; AHIMA et al. 2008; OKAMOTO et al. 2008; RABE et al. 2008). Inwieweit dies auf
Equiden übertragbar ist, muss durch weiterführende Untersuchungen abgeklärt werden.
In Studien am menschlichen Fettgewebe konnte eine Abhängigkeit der LPL-Aktivität
einerseits von der Lokalisation, vor allem aber von der Größe der Adipozyten festgestellt
werden. Bei adipösen Patienten zeigte sich eine signifikant höhere LPL-Aktivität, wobei
viszerales Fettgewebe lipolytisch aktiver ist als subkutane Fettdepots (KLÖTING et al. 2007).
Zum Einfluss der Lokalisation gibt es in der Literatur bereits verschiedene Untersuchungen an
unterschiedlichen Spezies, die sich mit der o. g. decken (SZTALRYD u. KRAEMER 1994;
TAVERNIER et al. 1995; BOUSQUET-MELOU et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit
konnte im Vergleich der Adipozytengröße bei Ponys und Pferden festgestellt werden, dass
adipöse Ponys tendenziell größere Adipozyten als Pferde gleichen Ernährungszustandes
aufwiesen. Dies bezieht sich sowohl auf subkutanes Inguinalfett als auch auf das Bauchfett.
Weniger gut genährte Tiere zeigten entsprechend kleinere Fettzellen, wobei auch hier die
Ponys tendenziell größere Zellen haben. Somit könnte die Adipozytengröße ein Hinweis auf
die gesteigerte Lipolyseempfindlichkeit bei Ponys sein, weitere Untersuchungen wären hier
nötig. Es sei allerdings an dieser Stelle angemerkt, dass bei Pferden keine direkte Korrelation
von Zellgröße und Ernährungszustand nachgewiesen werden konnte.
5.4.4 Katecholaminrezeptoren
Im Fettmetabolismus regulieren unter anderem auch die Katecholamine Adrenalin und
Noradrenalin die Lipolyserate über ihre Interaktion mit den Katecholaminrezeptoren an der
Fettzelle. Es finden sich an der Adipozytenmembran prinzipiell 5 Adrenozeptorentypen, deren
Vorkommen aber speziesabhängige Unterschiede zeigen. Die Arbeit von WRAGE (2002)
51

5. DISKUSSION
untersuchte equines Fettgewebe bezüglich des ß-Rezeptorenbesatzes und deren
Subtypenverteilung. Sie ergab eine deutlich geringere Gesamtrezeptorenzahl der
lipolysestimulierenden ß-Adrenozeptoren auf der Fettzellmembran der Ponys im Vergleich zu
Großpferden. Diese Verteilung war im Hinblick auf die gesteigerte Lipolyse bei der
Hyperlipämie erstaunlich, da entsprechend bei den Ponys eine deutlich höhere Zahl an
ß-Rezeptoren erwartet werden konnte.
Nun sollte in der vorliegenden Studie die Bindungsstellenzahl der α-adrenergen Rezeptoren
an der equinen Fettzellmembran im Rassevergleich untersucht werden. Da die
α-Adrenozeptoren als Gegenspieler der ß-Rezeptoren antilipolytische Wirkungen vermitteln,
wäre bei den Ponys eine geringere α-Rezeptorenanzahl als in der Pferdegruppe zu erwarten.
Diese Hypothese konnte nicht erhärtet werden. Es konnte bezüglich des
α-Adrenozeptorenbesatzes kein signifikanter Unterschied zwischen Pferde- und Ponyfett
ermittelt werden, so dass die Ursache einer gesteigerten Lipolyserate beim (hyperlipämischen)
Pony offenbar nicht in der Anzahl der Katecholaminrezeptoren begründet ist.
Weiterhin bleibt nun die Frage offen, wie der Unterschied bezüglich der Lipolyseaktivität
zwischen Pferd und Pony erklärt werden kann.
Da die adrenerge Regulation des Fettstoffwechsels sowohl über die ß-Rezeptoren, im equinen
Fettgewebe insbesondere ß2+3, als auch über α(2)-Rezeptoren reguliert wird, wäre ein
Ansatzpunkt die α2/ß Balance. Um die aktivere Fettstoffwechselsituation des Ponys anhand
der Rezeptoren nachzuvollziehen, müsste hier ein größerer ß- bzw. geringerer α-Adrenozepto-
renbesatz vorliegen. Allerdings ergab die Studie von WRAGE (2002) beim Pony einen
signifikant geringeren Besatz der Fettzellmembran mit ß-Rezeptoren, die eigene Arbeit zeigte
hingegen keinen statistisch absicherbaren Unterschied zwischen Pony und Pferd bezüglich der
α-Rezeptorendichte an der Adipozytenplasmamembran. Die Bindungsstellen der
α2-Rezeptoren sind mit durchschnittlich 110,5 fmol/mg Protein beim Pony stärker vertreten
als die der ß-Rezeptoren (83,7 fmol/mg Protein). Beim Pferd findet sich erstaunlicherweise
ein mit durchschnittlich 299,5 fmol/mg Protein deutlich höherer Besatz an ß-Rezeptoren im
Vergleich zu den α2-Rezeptoren (102,4 fmol/mg Protein). Diese Ergebnisse würden eher für
eine gesteigerte Lipolyse beim Pferd sprechen. Da dies allerdings klinisch nicht der Fall ist,
52

5. DISKUSSION
sind weitere Untersuchungen der verschiedenen Regelmechanismen im Fettmetabolismus
nötig.
In der Literatur wird eine sich deutlich unterscheidende Affinität der verschiedenen
Adrenozeptoren (-Subtypen) bzgl. der Katecholamine, Adrenalin und v. a. Noradrenalin,
beschrieben (LAFONTAN et al. 1985; LAFONTAN et al. 1997; LANGIN et al. 2000).
Demnach zeigt der antilipolytisch wirkende α2-Rezeptor die höchste Affinität, gefolgt von ß1-,
ß2- und schließlich dem ß3-Adrenozeptor. Allerdings spricht diese Eigenschaft auch eher
gegen die gesteigerte Lipolyseempfindlichkeit des Ponys bzw. der Entstehung der
Hyperlipämie im Zusammenhang mit Stress bzw. diversen Vorerkrankungen, die mit einem z.
T. längerfristig erhöhten Katecholaminspiegel einhergeht.
Beim adipösen Hund konnte ein erhöhter α2-Adrenozezeptorbesatz und eine verminderte
ß-Rezeptorenzahl an Adipozyten ermittelt werden. Diese Überzahl an α-Rezptoren bei
übergewichtigen Tieren bewirkt eine verminderte Effizienz der katecholamininduzierten
Lipolyse. Ebenso wurde ein Ansteigen von hochaffinen lipoysestimulierenden
ß-Adrenozeptoren z. B. in Hungerphasen adipöser Hunde festgestellt (TAOSIS et al. 1989).
Dies lässt vermuten, dass das Gleichgewicht zwischen den α2- und ß-Rezeptoren im
Fettgewebe keine statische Größe ist, sondern abhängig von der jeweiligen
Stoffwechselsituation modifiziert wird. Vergleichende Daten hierzu liegen bislang noch nicht
vor, da in dieser Studie gezielt der Rezeptorenbesatz im Fettgewebe von gut genährten bis
adipösen Ponys und Pferden untersucht wurde. Inwieweit sich das Rezeptorenverhältnis in
extremen metabolischen Stresssituationen umkehrt, wäre in weiteren Arbeiten zu eruieren.
Ein weiterer Faktor im Hinblick auf die lipolytische Aktivität bzw. die Ansprechbarkeit der
Adipozyten durch Katecholamine ist das Alter der Tiere. Mit steigendem Alter sinkt
physiologischerweise die durch Adrenalin/Noradrenalin vermittelte Lipolyseaktivität, was mit
einer verminderten ß-Adrenozeptorendichte an der Fettzelle in Zusammenhang gebracht wird.
Parallel dazu ist im Fettgewebe von Kaninchen, Hamstern und Hunden mit zunehmendem
Alter der Tiere eine steigende Ansprechbarkeit von α2-Adrenozeptoren gefunden worden.
Offenbar besteht auch ein Zusammenhang zwischen der Fettzellgröße und dem Besatz an
adrenergen Rezeptoren (CARPENE et al. 1983; TAOUIS et al. 1987; BOUSQET-MELOU et
al. 1999). So geht die Reduktion der Adipozytengröße während einer katabolen
53

5. DISKUSSION
Stoffwechsellage beim Hamster mit einem Schwund der α2-Rezeptorenbindungsstellen an der
Fettzelle einher (CARPENE et al. 1983; SAULNIER-BLACHE et al. 1990).
Diese Erkenntnisse decken sich allerdings nicht mit denen von WRAGE (2002) und der
vorliegenden Arbeit im equinen Fettgewebe. Hier konnte weder eine Abhängigkeit der
Zellgröße vom Alter der Tiere, noch eine Korrelation von Adipozytengröße und
Rezeptorenbesatz nachgewiesen werden. Des Weiteren kollidiert eine verminderte
Lipolyseaktivität in fortschreitendem Alter mit der Prädisposition adulter Ponys zur
Entwicklung des Hyperlipämie-Syndroms.
5.4.5 Postrezeptale Faktoren der Lipolyse
Die Katecholaminrezeptoren bilden in der Fettzellmembran eine funktionelle Einheit mit
heterotrimeren G-Proteinen (Guanosin-sensitives Bindungsprotein), welche im Falle der
α-Adrenozeptoren inhibierend, im Komplex mit ß-Rezeptoren stimulierend wirkt. Der
aktivierte Rezeptor stimuliert das jeweilige G-Protein, welches dann die Adenylatcyclase
inhibiert bzw. stimuliert. Die Aktivität des G-Proteins wird wiederum durch RGS-Protein
(Regulator of G-protein signaling) beeinflusst. Hier wäre ein weiterer Ansatzpunkt zur
Klärung der gesteigerten Lipolyseaktivität beim Pony zu suchen.
IANKOVA et al. (2008) fanden bei Mäusen mit einem RGS-4-Mangel erhöhte Katecholamin-
und FFS-Konzentrationen im Serum. Ein Mangel bzw. Defekt an RGS beim Pony wäre zu
überprüfen.
Die durch die entsprechenden G-Proteine vermittelten Signale an die Adenylatcyclase führen
zur Erhöhung bzw. Verminderung des cAMP-Spiegels, was wiederum die Proteinkinase A
(PKA) beeinflusst. Die PKA vermittelt die Phosphorylierung und damit die Aktivierung der
Hormonsensitiven Lipase, dem Schlüsselenzym der Lipolyse. In der Arbeit zur
Stimulierbarkeit der HSL von RIEBANDT (2005) zeigte sich eine auffallend höhere Lipolyse
in den Ponyadipozyten nach Katecholaminstimulation im Vergleich zum Pferd. Eine
Inkubation von Adipozyten mit DBcAMP führte wider Erwarten nicht zur vermehrten
FFS-Freisetzung beim Pony im Gegensatz zum Pferd. Somit konnte eine verstärkte
Empfindlichkeit der HSL beim Pony als Ursache der Hyperlipämie nicht bestätigt werden.
54

5. DISKUSSION
Ein zweites Enzym in der Regulation der Lipolyse stellt neben der HSL die Adipose
Triglyceride Lipase (ATGL) dar. Sie kommt sehr stark im Fettgewebe von Maus und Mensch
vor und bewirkt durch ihre Hemmung eine verminderte Aktivität der Adipose Acyl-Hydrolase
(ZIMMERMANN et al. 2004). Zum Vorkommen der ATGL im equinen Fettgewebe ist
bislang noch nichts bekannt.
Welche Rolle Insulin als antilipolytisches Hormon bei der Ätiopathogenese des
Hyperlipämie-Syndroms spielt, ist ebenfalls noch unklar. Insulin bewirkt über eigene
Rezeptoren eine Abnahme der cAMP-Konzentration und folglich eine verminderte
HSL-Aktivität (BREIDENBACH et al. 1999). Obwohl in der Literatur mittlerweile die These
einer Insulinresistenz bei (adipösen) prädisponierten Ponys etabliert ist, konnten
FREESTONE et al. (1991) sowohl bei insulinresistenten Ponys als auch bei Tieren mit
normaler Insulinsensitivität eine Hyperlipämie auslösen.
5.5 Schlussfolgerung
In dieser Arbeit wurde der Besatz der Adipozytenplasmamembran mit α-adrenergen
Rezeptoren in equinem Fettgewebe untersucht. Nachdem die Messung der ß-Adrenozeptoren
keine Erklärung im Hinblick auf die Ätiologie des Hyperlipämie-Syndroms beim Pony liefern
konnte, sollten eventuelle Unterschiede in der α-Rezeptorendichte an Fettzellen von Ponys
und Pferden eruiert werden.
Die Bestimmung der Rezeptorenbindungsstellen in der vorliegenden Studie ergab eine
signifikant höhere Zahl der α2-Rezeptoren im Vergleich zu den α1-Rezeptoren sowohl bei
Ponys als auch bei Pferden.
Unterschiede hinsichtlich der Katecholaminrezeptoren im Fettgewebe zwischen Ponys und
Pferden konnten nicht statistisch abgesichert werden.
Welche Strukturen bzw. Regelmechanismen der erhöhten Lipolyseempfindlichkeit beim Pony
zu Grunde liegen bleibt somit weiterhin unklar und bedarf weiterführender Untersuchungen,
die sich dann vor allem mit den postrezeptalen Faktoren wie die G-Proteine und die
Adenylatcyclaseaktivitäten befassen müssen.
55

6 Zusammenfassung
Britta Zahn
6. ZUSAMMENFASSUNG
Alpha-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre Bedeutung im Hinblick
auf das Hyperlipämie-Syndrom des Ponys
Ziel dieser Studie war es, das Vorkommen und die Verteilung von α-adrenergen
Rezeptorensubtypen (Katecholaminrezeptoren) im Fettgewebe von Pferden und Ponys
vergleichend zu untersuchen, um eventuelle rassespezifische Unterschiede zu ermitteln. Die
Katecholaminrezeptoren (α und ß) vermitteln über ein Second-messenger System die Lipolyse
in den Adipozyten, welche bei Ponys, insbesondere bei hyperlipämischen Tieren, um ein
Vielfaches gesteigert ist. Nachdem Untersuchungen zum ß-Rezeptorenbesatz im equinen
Fettgewebe (WRAGE 2002) keinen Hinweis auf die Ursache der gesteigerten
Lipolyseempfindlichkeit beim Pony ergaben, sollten nun in der vorliegenden Arbeit erstmals
die α-Adrenozeptoren an Adipozyten von Pferden und Ponys ermittelt werden. Damit sollte
ein weiterer Beitrag zur Klärung der Ätiologie des Hyperlipämie-Syndroms geleistet werden.
Als Probenmaterial kam Bauchhöhlen- bzw. Inguinalfett von ausgeweideten Schlachttieren
zur Anwendung. Zunächst musste aus dem intakten Gewebeverband die
Adipozytenplasmamembran isoliert werden, in der die Adrenozeptoren als
Transmembranproteine gebunden vorliegen. Die Gewinnung der Plasmamembranfraktion
durch verschiedene Homogenisationsschritte und differenzielle Zentrifugation wurde durch
die Messung spezieller Markerenzyme kontrolliert. Da aus dem inguinalen Fettgewebe nicht
genügend Plasmamembranprotein isoliert werden konnte, beschränkte sich die
Rezeptorenmessung auf das Bauchhöhlenfett. Die Messung der α-Rezeporenbindungsstellen
erfolgte über ein Radioassay in Anlehnung an die Methode von RE et al. (2001) zur
Untersuchung von α-Adrenozeptoren in der glatten Muskulatur des equinen Ileums.
Es ergaben sich für die α1-Rezeptorenbindungsstellen im Ponyfett durchschnittlich 34,67 (±
15,21) fmol/mg Protein, beim Pferd wurden durchschnittlich 43,5 (± 17,26) fmol/mg Protein
gemessen. Demnach konnten keine signifikanten Unterschiede der
α1-Rezeptorenbindungsstellen zwischen den Rassen ermittelt werden.
56

6. ZUSAMMENFASSUNG
Auch bei dem Besatz mit α2-Adrenozeptoren konnte kein Unterschied zwischen Pony und
Pferd statistisch abgesichert werden. Die Ponys wiesen im Durchschnitt 110,5 (± 41,2)
fmol/mg Protein auf, während in der Pferdegruppe eine durchschnittliche Bindungsstellenzahl
von 102,4 (± 44,6) fmol/mg Protein gemessen wurde.
Im Vergleich der Adrenozeptorensubtypen zeigte sich sowohl beim Pony als auch beim Pferd
ein signifikant höherer Besatz der Fettzellmembran mit α2- im Gegensatz zu α1-Rezeptoren.
Die Messung der Adipozytengröße über die Ermittlung der Fläche, die 100 Zellen einnehmen,
ergab sich in der Ponygruppe eine durchschnittliche Zellfläche von 1,23 (± 0,52) mm 2 /100
Zellen für das Bauchfett, im Inguinalfett wurden im Durchschnitt 1,11 (± 0,41) mm 2 /100
Zellen gemessen. Zwischen den beiden Lokalisationen findet sich somit kein statistisch
signifikanter Unterschied in der Zellgröße.
Im Gegensatz zu den Ponys konnte bei den Pferden eine größere Zellfläche im Bauchfett im
Vergleich zum Inguinalfett statistisch abgesichert werden. Hier wurden folgende Werte
gemessen: 0,84 (± 0,26) mm 2 /100 Zellen im Bauchfett, im Inguinalfett benötigen 100 Zellen
durchschnittlich 0,62 (± 0,11) mm 2 .
Im Rassevergleich zeigten sich bei den Ponys signifikant größere Inguinalfettzellen als bei
den Pferden, wogegen die Adipozyten des Bauchfetts beim Pony zwar tendenziell größer
sind, dies aber nicht statistisch abgesichert werden konnte. Hier wären noch weitere
Untersuchungen nötig.
Hinsichtlich der Ätiopathogenese des Hyperlipämie-Syndroms bei Ponys konnte die
Ermittlung der α-Adrenozeptorenbindungsstellen keine Klärung liefern. Die gesteigerte
Lipolyserate lässt sich folglich nicht durch eine verminderte α-Rezeptorendichte an
Ponyadipozyten und damit einer geringeren Hemmung der Lipolyse erklären.
Weiterhin bleibt zu prüfen, welche Aspekte der Signalkaskade in der Lipolyse zur
Prädisposition des Ponys zur Hyperlipämie führen. Es wäre zu untersuchen, inwieweit z. B.
den stimulierenden und inhibierenden G-Proteine oder den die HSL regulierenden Enzymen
Adenylatcyclase, PKA oder ATGL eine Rolle hinsichtlich des Hyperlipämie-Syndroms
zuzuordnen ist.
57

7 Summary
Britta Zahn
7. SUMMARY
Alpha adrenergic receptors in equine adipose tissue with regard to the hyperlipemia
syndrome of the pony.
This study was aming at the investigation of race specific differences between horses and
ponies depending on the occurrence and the allocation of α-adrenergic receptors
(catecholamine receptors) in the adipose tissue. Lipolysis is mediated by a second messenger
system from the α- and β-receptors which is raised enormously in hyperlipemic ponies. As
former investigations of β-receptors in equine adipose tissue (WRAGE 2002) didn’t show a
reason for the increased sensitivity for lipolysis in ponies we analyzed the α-adrenergic
receptors at the adipocytes of horses and ponies by this study for the first time. This should be
a step forward in the explanation of the hyperlipemia syndrome.
The tests were done on inguinal and visceral adipose tissue of eviscerated horses and ponies.
At first we had to divide up the intact tissue to get the fat cell plasma membrane with the
adrenoceptors which are transmembrane proteins. Special marker enzymes were used to
control the extraction of the plasma membrane fraction by different homogenizations and
differential centrifugation. As there was not enough plasma membrane protein in the inguinal
adipose tissue there could only be achieved a survey of the receptors in the visceral fat. The
measurement of the α-receptor binding site was done by an radioimmunoassay comparing the
methods of RE et al. (2001) to analyze the α-adrenoceptors in the unstriated muscle of the
equine ileum.
There was an average of 34,67 (± 15,21) fmol/mg protein for the α1 receptor binding sites in
pony fat and 43,5 (± 17,26) fmol/mg protein in adipocytes of the horse. That means there was
no significant difference between both races with respect to the α1-receptor binding sites.
Even the amount of α2 adrenoceptors showed no statistically significant difference between
ponies and horses. The ponies had an average of 110,5 (± 41,2) fmol/mg protein while the
horses had an average binding site of 102,4 (± 44,6) fmol/mg protein.
58

7. SUMMARY
The comparison of the adrenergic receptor subtypes showed a significant higher amount of α2
-receptors than α1-receptors in ponies as well as in horses.
The size of the adipocytes was found out by measuring the plain surface of 100 cells. In the
pony group there was an average cell surface of 1,23 (± 0,52) mm 2 /100 cells in the visceral fat
and an average of 1,11 (± 0,41) mm 2 /100 cells in the inguinal aipose tissue. There were no
statistically significant differences between both localizations concerning the cell size.
In opposite to the ponies there was a statistic significant larger cell surface in the visceral
compared to the inguinal fat in horses. There were 0,84 (± 0,26) mm 2 /100 cells in the visceral
compared to an average of 0,62 (± 0,11) mm 2 /100 cells in the inguinal fat.
Comparing the races there were significant larger inguinal adipocytes in ponies than in horses
while there was a trend for the adipocytes of the visceral fat of ponies to be larger with no
statistic evidence. Therefore further investigations are necessary.
The investigation on the α-adrenergic receptor binding sites could not help to explain the
aetiopathogenesis of the hyperlipemia syndrome of the pony. The raised amount of lipolysis
can not be explained by a reduced density of α-receptors in adipocytes in ponies belonging to
a reduced suppression of the lipolysis.
Further investigations have to check out which parts of the signal cascade of the lipolysis
predispose ponies for hyperlipemia. We suggest to look after the stimulating and inhibiting G
proteins or the enzymes Adenylatcyclase, PKA and ATGL which regulate the HSL and their
importance for the hyperlipemia syndrome.
59

8 Literaturverzeichnis
AHIMA, R. S., M. A. LAZAR (2008):
8. LITERATURVERZEICHNIS
Adipokines and the peripheral and neural control of energy balance.
Mol. Endocronol. 22(5), 1023-1031
ARNER, P. (1992):
Adrenergic function in fat cells.
Am. J. Clin. Nutr. 55, 228-236
ARNER, P. (2005):
Human fat cell lipolysis: Biochemistry, regulation and clinical role.
Best Pact. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 19 (4), 471-482
AUSSCHUSS FÜR BEDARFSNORMEN DER GESELLSCHAFT FÜR
ERNÄHRUNGSPHYSIOLOGIE DER HAUSTIERE (1994):
Empfehlungen zur Energie- und Nährstoffversorgung der Pferde.
DLG-Verlag, Frankfurt (Main)
BELSHAM, G. J., R. M. DENTON u. M. J. TANNER (1980):
Use of a novel rapid preparation of fat-cell plasma membranes employing Percoll to
investigate the effects of insulin and adrenaline on membran protein phosphorylation within
intact fat-cells.
Biochem. J. 192, 457-467
BIANCHI, M. (1989):
Fat cell size in various body region. A statistical analysis in Equus caballus.
Anat. Anz. 169, 351-366
BOSCHMANN, M., G. KRUPP, F. C. LUFT, S. KLAUS u. J. JORDAN (2002):
In vivo response to α1- adrenoceptor stimulation in human white adipose tissue.
Obes. Res. 10 (6), 555-558
60

8. LITERATURVERZEICHNIS
BOUSQUET-MELOU, A., C. MUNOZ, J. GALITZKY, M. BERLAN, u. M. LAFONTAN
(1999):
Pregnancy modifies the α2-ß-adrenergic receptor functional balance in rabbit fat cells.
J. Lipid Res. 40, 267-274
BREIDENBACH, A., H. FUHRMANN, E. DEEGEN, A. LINDHOLM, u. H.-P.
SALLMANN (1999):
Studies on Equine Lipid Metabolism 2. Lipolytic Activities of Plasma and Tissue Lipases in
Large Horses and Ponies.
J. Vet. Med. A 46, 39-48
CAREY, G. B. (1998):
Mechanisms regulating adipocyte lipolysis.
Adv. Exper. Med. Biol. 441, 157-170
CARPENE, C., M. BERLAN u. M. LAFONTAN (1983):
Influence of development and reduction of fat stores on the antilipolytic α2-adrenoceptor in
hamster adipocytes: comparison with adenosine and ß-adrenergic lipolytic responses.
J. Lipid Res. 24, 766-774
CHENG, J. T., I. M. LIU, S. T. YENu. P. C. CHEN (2000):
Role of alpha1A-adrenoceptor in the regulation of glucose uptake into white adipocyte of rats
in vitro.
Auton. Neurosci. 84 (3), 140-146
COUTINHO, L. L., W. G. BERGEN, D. R. ROMSOS u. R. A. MERKEL (1993):
Alpha-2 adrenergic receptor activity in porcine adipocytes is androgen and age/cell size
dependent.
Comp.Biochem. Physiol. 105A (2), 333-339
61

DEEGEN, E. (1972):
8. LITERATURVERZEICHNIS
Die prognostische Bedeutung des “Hegglin-Syndroms“ bei der Hyperlipämie der Ponys.
Dtsch. Tierärtzl. Wochenschr. 79 (12), 297-301
DIETZ, O. (1999):
Hyperlipämie (Hyperlipoproteinämie ) der Ponys.
In: O. DIETZ u. B. HUSKAMP (Hrsg): Handbuch Pferdepraxis
Enke Verlag, Stuttgart, S. 305-306
DONALDSON, M. T., D. Mc FARLANE, A. J. JORGENSEN u. J. BEECH (2004):
Correlation between plasma – melanocyte - stimulating hormone concentration and body
mass index in healthy horses.
Am. J. Vet. Res. 65 (11), 1469-1473
DÜHLMEIER, R. (1998):
Untersuchungen zur Enteroinsularen Achse bei Equiden.
Adaptation eines heterologen Radioimmunassays zur Bestimmung der equinen
Plasmakonzentration des Glucose – abhängigen Insulinotropen Polypeptids (GIP).
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
DUNKEL, B., u. H. C. McKENZIE (2003):
Severe hypertriglyceridemia in clinically ill horses: diagnosis, treatment and outcome.
Equine Vet. J. 35 (6), 590-595
EYNATTEN VON, M. H. (2004):
Lipoprotein Lipase als mögliches Bindeglied zwischen Adiponektin, Dyslipämie und
Arteriosklerose.
Heidelberg, Univ., Diss.
FAIN, J. N. u. A. GARCIA-SAINZ (1983):
Adrenergic regulation of adipocyte metabolism.
J. Lipid Res. 24, 945-966
62

FAINTRENIE, G. u. A. GÉLOËN (1996) :
8. LITERATURVERZEICHNIS
Alpha-1-adrenergic regulation of lactate production of white adipocytes.
J. Pharmacol. Exp. Ther. 277, 235-238
FANELLI, C. G., P. DE FEO, F. PORCELLATI, G. PERRIELLO, E. TORIONE, F.
SANTEUSANIO, P. BRUNETTI u. G. B. BOLLI (1992):
Adrenergic Mechanisms contribute to the late phase of hypoglycaemic glucose
counterregulation in humans by stimulating lipolysis.
J. Clin. Invest. 89, 2005-2013
FIELD, J. R. (1988):
Hyperlipemia in a Quarter Horse.
Comp. Contin. Educ. Pract. Vet. 10 (2), 218-221
FIELD, J. R. u. L. B. JEFFCOTT (1989):
Equine laminitis – another hypothesis for pathogenesis.
Med. Hypotheses 30, 203-210
FORHEAD, A. J., J. FRENCH, P. IKIN, J. N. FOWLER u. H. DOBSON (1994):
Relationship between plasma insulin and triglyceride concentrations in hypertriglyceridaemic
donkeys.
Res. Ver. Sci. 56, 389-392
FREESTONE, J. F., K. J. WOLFSHEIMER, R. B. FORD, G. CHURCH u. R. BESSIN
(1991):
Triglyceride, Insulin, and cortisol responses of ponies to fasting and dexamethasone
administration.
J. Vet. Intern. Med. 5 (1), 15-22
63

8. LITERATURVERZEICHNIS
FREESTONE, J. F., R. BEADLE, K. SCHOEMAKER et al. (1992):
Improved insulin sensitivity in hyperinsulinemic ponies through physical conditioning and
controlled feed intake.
Eq. Vet. J. 24, 187-190
FÜRLL, M., u. M. SCHÄFER (1992):
Vorkommen und Verlauf der Hyperlipidämie bei Ponys.
in: 12. Arbeitstagung der Fachgruppe Pferdekrankheiten,
Wiesbaden, 09./10. April 1992, S. 239-254
GAY, C. C., N. D. SULLIVAN, J. S. WILKINSON, J. D. McLEAN u. D. C. BLOOD (1978):
Hyperlipaemia in ponies.
Aust. Vet. J. 54 (10), 459-462
GESTA, S., J. HEJNOVA, M. BERLAN, D. DAVIAUD, F. CRAMPES, V. STICH, P.
VALET u. J.-S. SAULNIER-BLACHE (2001):
In vitro and in vivo impairment of α2-adrenergic receptor-dependent antilipolysis by fatty
acids in human aipose tissue.
Horm. Metab. Res. 33, 701-707
HAUSMANN, G. J. (1981):
Techniques for studying adipocytes.
Stain. Technol. 56, 149-154
HUGHES, K. J., D. R. HODGSON u. A. J. DART (2004):
Equine Hyperlipaemia: a review.
Austr. Vet. J. 82, 3, 136-142
IANKOVA, I., C. CHAVEY, C. CLAPÉ, C. COLOMER, N. C. GUÉRINEAU, N.
GRILLET, J.-F. BRUNET, J.-S. ANNICOTTE u. L. FAJAS (2008):
Regulator of G-protein signalling-4 controls fatty acid and glucose homeostasis.
Endocrinology 149(11), 5706-5712
64

JEFFCOTT, L. B., u. J. R. FIELD (1985):
8. LITERATURVERZEICHNIS
Epidemiological aspects of hyperlipaemia in ponies in south eastern Australia.
Austr. Vet. J. 62, 140-141
JEFFCOTT, L. B. u. J. R. FIELD (1986):
Glucose tolerance and insulin sensitivity in ponies and Standardbred Horses.
Eq. Vet. J. 18, 97-101
KADOWAKI, T., T. YAMAUCHI, N. KUBOTA, K. HARA, K. UEKI u. K. TOBE (2006):
Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes and the metabolic
syndrome.
J.of Clin Invest. 116, 1784-1792
KEARNS, C. F., K. H. McKEEVER, V. ROEGNER, S. M. BRADY u. K. MALINOWSKI
(2006):
Adiponectin and Leptin are related to fat mass in horses.
Vet. J. 172(3), 460-465
KLÖTING, N., M. STURMVOLL u. M. BLÜHER (2007):
Biologie des viszeralen Fetts.
Internist 48, 126-133
KOBATAKE, T., Y. WATANABE, Y. MATSUZAWA, K. TOKUNAGA, S. FUJIOKA, T.
KAWAMOTO, Y. KENO, S. TARUI u. H. YOSHIDA (1991):
Age-related changes in adrenergic α1, α2, and ß receptors of rat white fat cell membranes: an
analysis using 3 Hbunazosin as a novel ligand for the α1 adrenoceptor.
J. Lipid Res. 32, 191-196
KRONFELD, D. S., K. H. TREIBER, T. M. HESS u. R. C. BOSTON (2005):
Insulin resistance in the horse: Definition, detection, and dietetics.
J. Anim. Sci. 83, E22-E31
65

8. LITERATURVERZEICHNIS
LAFONTAN, M., M. BERLAN und C. CARPENE (1985):
Fat cell adrenoceptors: inter- and intraspecific differences and hormone regulation.
Int. J. Obes. 9(1), 117-127
LAFONTAN, M. u. M. BERLAN (1993):
Fat cell adrenergic receptors and the control of white and brown fat cell function.
J. Lipid Res. 34, 1057-1091
LAFONTAN, M. u. M. BERLAN (1995):
Fat cell α2-adrenoceptors: The regulation of fat cell function and lipolysis.
Endocrine Reviews 16 (6), 716-732
LAFONTAN, M., P. BARBE, J. GALITZKY, G. TAVERNIER, D. LANGIN, C. CARPENE,
A. BOUSQUET-MELOU u. M. BERLAN (1997):
Adrenergic regulation of adipocyte metabolism.
Hum. Reprod. 12(1), 6-20
LANGIN, D., S. LUCAS u. M. LAFONTAN (2000):
Millenium fat-cell lipolysis reveals unsuspected novel tracks.
Horm. Metab. Res. 32(11-12), 443-452
LEE, H. J., S. C. LEE, D. W. KIM, J. G. PARK u. I. K. HAN (2000):
Cellularity of adipose tissue obtained from different sex and growth stages of Hanwoo cattle
and sheep.
Asian - Australasien J. Anim. Sci. 13, 155-160
LAWRENCE Jr, J.C. u. J. LARNER (1977):
Evidence for alpha-adrenergic activation of phosphorylase and inactivation of glycogen
synthase in rat adipocytes: effects of alpha and beta-adrenergic agonists and antagonists on
glycogen synthase and phosphorylase.
Mol. Pharmacol. 13, 1060-1075
66

8. LITERATURVERZEICHNIS
MERSMANN, H. J. u. M. D. MAC NEIL (1986):
Variables in estimation of adipocyte size and number with a particle counter.
J. Anim. Sci. 62, 980-991
MOGG, T. D. u. J. E. PALMER (1995):
Hyperlipidemia, hyperlipemia and hepatic lipidosis in American miniature horses: 23 cases
(1990 - 1994):
J. Am. Vet. Med. Assoc. 207, 604-607
MOORE, B. R., S. K. ABOOD u. K. W. HINCHCLIFF (1994):
Hyperlipoproteinaemia in 9 Miniature Horses and Miniature Donkeys.
J. Vet. Int. Med. 8 (5), 376-381
NAYLOR, J. M., D. S. KRONFELD u. H. ACLAND (1980):
Hyperlipemia in Horses: Effects of Undernutrition and Disease.
Am. J. Vet. Res. 41 (6), 899-905
NAYLOR, J. M. (1982):
Treatment and diagnosis of hyperlipemia and hyperlipidemia.
Proc. Am. Assoc. Eq. Pract. 27, 323-329
NELSON, D. L. u. M. M. COX (2001):
Protein-Ligand-Wechselwirkungen können quantitativ beschrieben werden.
In: LEHNINGER BIOCHEMIE
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, S. 216-219
NICOLAS, C., Y. DEMARNE, M. J. LECOURTIER u. C. LHUILLERY (1990):
Dependence between 5’-nucleotidase activity and phosphatidylcholine content in pig
adipocyte plasma membrane. Absence of relationship with membrane physical state.
Comp. Biochem. Physiol. B 96, 195-199
67

8. LITERATURVERZEICHNIS
NOBLES, M., A. BENIANS u. A. TINKER (2005):
Heterotrimeric G proteins precouple with G protein-coupled receptors in living cells.
PNAS. 102(51), 18706-18711
OIKAWA, S., S. McGUIRK, K. NISHIBE, T. HIGUCHI, T. KUROSAWA, M.
WATANUKI u. H. SATOH (2005):
Changes of Bloodchemical Values in Ponies Recovering from Hyperlipemia in Japan.
J. Vet. Med. Sci. 68 (4), 353-359
PANNACCIULLI, N., J. C. BUNT, E. ORTEGA, T. FUNAHASHI, A. D. SALBE, C.
BOGARDUS u J. KRAKOFF (2006):
Lower total fasting plasma adiponedtin concentrations are associated with higher metabolic
rates.
J. Clin. Endocrinol. Metab. 91(4), 1600-1603
PECQUERY, R., M.-C. LENEVEU u. Y. GIUDICELLI (1988):
Influence of androgenic status on the α2/ß-adrenergic control of lipolysis in white fat cells:
Predominant α2-antilipolytic response in testosterone-treated-castrated hamsters.
Endocrinology 122 (6), 2590-2596
RABE, K., M. LEHRKE, K. G. PARHOFER u. U. C. BROEDL (2008):
Adipokines and insulin resistance.
Mol. Med. 14/11-12), 741-751
RE, G., P. BADINO, R. ODORE, D. GALAVERNA u. C. GIRARDI (2001):
Characterization of alpha - adrenoceptor subtypes in smooth muscle of equine ileum.
Am. J. Vet. Res. 62 (9), 1370-1374
REHNER, G. u. H. DANIEL (1999):
Das Fettgewebe als Energiespeicher und Drehscheibe des Lipidstoffwechsels.
In: Biochemie der Ernährung, 449-477
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin
68

RIEBANDT, N. (2005):
8. LITERATURVERZEICHNIS
Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase bei Großpferd und Pony im Hinblick auf das
Hyperlipämie-Syndrom.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
RODBELL, M. (1964):
Metabolism of isolated fat cells I. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis.
J. Biol. Chem. 239, 375-380
SAULNIER-BLACHE, J. S., C. ATGIE, C. CARPENE, N. QUIDEAU u. M. LAFONTAN
(1990):
Hamster adipocyte alpha2-adrenoceptor changes during fat mass modifications are not
directly dependent on adipose tissue norepinephrine content.
Endocrinology 126 (5), 2425-2434
SCHOTMAN, A. J. H. u. J. KRONEMANN (1969):
Hyperlipemia in ponies.
Neth. J. Vet. Sci. 2 (1), 60-64
SCHOTMAN, A. J. H., u. G. WAGENAAR (1969):
Hyperlipemia in ponies.
Zbl. Vet. Med. A 16 (1), 1-7
STORRIE, B. (1990):
Isolation of subcellular organelles.
in: DEUTSCHER, M.P. (Hrsg.) Methods in Enzymology.
Academic Press, San Diego, 214
STRALFORS, P. u. R. C. HONNOR (1989):
Insulin-induced dephosphorylation of hormone-sensitive lipase. Correlation with lipolysis and
cAMP-dependent protein kinase activity.
Eur. J. Biochem. 182, 379-385
69

8. LITERATURVERZEICHNIS
SUGDEN, M. C., M. J. HOLNESS u. R. M. HOWARD (1993):
Changes in lipoprotein lipase activities in adipose tissue, heart and skeletal muscle during
continuous or interrupted feeding.
Biochem. J. 292(1), 113-119
SZTALRYD, C. u. F. B. KRAEMER (1994):
Differences in hormone-sensitive lipase expression in white adipose tissue from various
anatomic locations of the rat.
Metabolism 43, 241-247
TAOIS, M., M. BERLAN, P. MONTASTRUC u. M. LAFONTAN (1987):
Characterization of dog fat cell adrenoceptors: variations in alpha 2 and beta adrenergic
receptors distribution according to the extend of the fat deposits and the anatomical location.
Am. Soc. Pharm. Exper. Therap. 242 (3), 1041-1049
TAOIS, M., P. VALET, L. ESTAN, M. LAFONTAN, P. MONTASTRUC u. M. BERLAN
(1989):
Obesity modifies the adrenergic status of dog adipose tissue.
Am. Soc. Pharm. Exper. Therap. 250 (3), 1061-1066
TARRANT, J. M., T. M. CAMPBELL u. B. W. PERRY (1998):
Hyperlipaemia in a donkey.
Aust. Vet. J. 76 (7), 466-469
TAVERNIER, G., J. GALITZKY, P. VALET, A. REMAURY, A. BOULOUMIE, M.
LAFONTAN u. D. LANGIN (1995) :
Molecular mechanisms underlying regional variations of catecholamine – induced lipolysis in
rat adipocytes.
Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 268, E1135-E1142
70

8. LITERATURVERZEICHNIS
THILSTEDT, J. P., J. DiPIETRO, J. R. SZABO, R. W. ELY u. G. M. MESFIN (1982):
Hyperlipemia in pony mares
Mod. Vet. Pract. 63, 467-450
WATSON, T. D. G., D. MURPHY u. S. LOVE (1992):
Equine hyperlipemia in the United Kingdom: Clinical features and blood chemistry of 18
cases.
Vet. Rec. 131, 48-51
WATSON, T. D. G., L. BURNS, C. J. PACKARD u. J. SHEPHERD (1992b):
Plasma lipids, lipoproteins and post – heparin lipases in ponies with hyperlipemia.
Equine Vet. J. 24, 341-346
WATSON, T. D. G., L. BURNS, C. J. PACKARD u. J. SHEPHERD (1993):
Effects of pregnancy an lactation on plasma lipid and lipoprotein concentration, lipoprotein
composition and post – heparin lipase activities in Shetland pony mares.
Journal of Reproduction and Fertility 97, 563-568
WATSON, T. D. G., u. S. LOVE (1994):
Equine Hyperlipidemia.
Comp. Cont. Educ. Pract. Vet. 16 (1), 89-98
WRAGE, S. (2002):
Beta-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre Bedeutung im Hinblick auf das
Hyperlipämie-Syndrom des Ponies.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
ZIMMERMANN, R., J. G. STRAUSS, G. HAEMMERLE, G. SCHOISWOHL, R. BIRNER-
GRUENBERGER, M. RIEDERER, A. LASS, G. NEUBERGER, F. EISENHABER, A.
HERMETTER u. R. ZECHNER (2004):
Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase.
Science 306 (5700), 1383-1386
71

9 Anhang
9.1 Bezugsquellen
9.1.1 Verwendete Geräte / Software
9. ANHANG
ß-Counter Tricarb 1600 TR Liquid
Szintillation Analyser
72
Packard, Groningen
Kamera Color View I Soft Imaging System, Münster
Kryotom Kryostat Mikrom Heidelberg Laborgeräte GmbH,
Waldorf
Mikroskop Axiophot Carl Zeiss, Jena
Nylon-Gaze Maschenweite 250 µm Eckert, Waldkirch / Brsg.
Photometer Pharmacia LKB, Ultrospec III Pharmacia, Cambridge
SLT Spectra Rainbow SLT Labinstruments, Crailsheim
Rotor Sorvall Typ SS-34 Du Pont, Hamburg
Software analySIS Soft Imaging System, Münster
SigmaStat 3.0
Sigma Plot 8.0
Ultra Turrax Typ T45 Janke & Kunkel, Staufen
Vielfach-
Filtrationsgerät 25 mm Scheibenfilter Millipore, Eschborn
Zentrifuge Sorvall RC–5B Kühlzentrifuge Du Pont, Hamburg
Eppendorftischzentrifuge Eppendorf, Hamburg

9.1.2 Reagenzien
9. ANHANG
Alle Reagenzien hatten den Reinheitsgrad pro analysi.
Adenosin 5-Monophosphat Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Bovines Serumalbumin Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
CuSO4 * 5 H2O Merck, Darmstadt
L(+)-Ascorbinsäure Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Cytochrom C aus Pferdeherz Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-tetraacetat Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Folin-Ciocalteus Phenolreagenz Merck, Darmstadt
HCl Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
K-Na-Tartrat * 4 H2O Merck, Darmstadt
K2HPO4 * 3 H2O Merck, Darmstadt
KH2PO4
73
Merck, Darmstadt
Lubrol ICN Biomedicals, Ohio
Malachitgrün Serva Feinbiochemica, Heidelberg
MgCl2 * 6 H2O Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
NaCl Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Na2CO3
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
NaH2PO4 * H2O Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Na-dithionit Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Na-Molybdat Merck, Darmstadt
NaOH Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Phentolamin Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
[7-Methoxy- 3 H]-Prazosin Perkin Elmer, Boston
[Methyl- 3 H]-Rauwolszin Perkin Elmer, Boston
D(+)-Saccharose Appli Chem GmbH, Darmstadt
Trichloressigsäure Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Tris Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe

9. ANHANG
9.2 Zusammensetzungen der Pufferlösungen
9.2.1 Pufferlösungen zur Adipozytenplasmamembranpräparation
Saccharose-Extraktionsmedium
0,25 M Saccharose
10 mM Tris
2 mM EGTA pH 7,4
Gepufferte Kochsalzlösung
0,15 M NaCl
10 mM Tris
1 mM EGTA pH 7,4
9.2.2 Pufferlösungen zur Bestimmung der Enzymaktivitäten
9.2.2.1 Lösungen zur Messung der CCO-Aktivität
KPO4-Puffer
0,6 mM K2HPO4
3,4 mM KH2PO4
122 mg Lubrol pH 6,2
Cytochrom C
0,55 mM Cytochrom C werden in 2,5 ml KPO4-Puffer gelöst
Na-dithionit
Direkt vor der Messung werden 10 mg Na-dithionit in 1 ml Reinstwasser gelöst, sofort
zum gelösten Cytochrom C zugegeben (0,06 mM) und gemischt.
74

9. ANHANG
9.2.2.2 Lösungen zur Messung der 5’NT-Aktivität
0,5 M TrisHCl pH 8
1,8 mM MgCl2 * 6 H2O
10 mM AMP (stets frisch)
Na-Molybdat 650 mg/25 ml
2,5 M HCl
Malachitgrün 32 mg/25 ml
PO4-Standard
Als Stammlösung werden 13,8 mg NaH2PO4 * H2O /100 ml Reinstwasser eingewogen
(1mmol/l), woraus verschiedene Verdünnungen hergestellt werden, die schließlich als
Standard dienen (50, 100, 200 µM).
9.2.3 Pufferlösungen zur Rezeptorenmessung
Tris-Mg-Puffer
50 nM Tris
10 nM MgCl2 * 6 H2O pH 7,4
Inkubationspuffer
50 nM Tris
10 nM MgCl2 * 6 H2O
0,4 % Ascorbinsäure
0,4 % BSA pH 7,4
Stop-Puffer
154 mM NaCl
50 mM Tris pH 7,4
75

9.3 Tabellen
Tab. 2. Daten der Probentiere (Ponys)
Tiernummer Geschlecht Alter
(Jahre)
9. ANHANG
Größe (m) Gewicht
(kg)
76
BMI Ernährungszustand
1 Stute 11 1,3 380 224,9 adipös
2 Stute 15 1,33 396 223,9 adipös
3 Hengst 2 1,19 188 132,8 gut
4 Stute 26 0,99 170 173,5 gut
5 Wallach 15 1,43 430 210,3 gut
6 Stute 21 1,33 370 209,2 gut
7 Stute 7 0,96 190 206,2 gut
8 Wallach 19 1,06 260 231,4 adipös
9 Stute 9 0,98 137 142,6 gut
10 Stute 16 0,99 142 144,9 gut
11 Hengst 11 1,0 203 203 adipös
BMI = Body Mass Index

Tab. 3. Daten der Probentiere (Pferde)
Tiernummer Geschlecht Alter
(Jahre)
9. ANHANG
Größe (m) Gewicht
(kg)
12 Wallach 5 1,7 550 190,3 gut
77
BMI Ernährungszustand
13 Wallach 11 1,68 660 233,8 Adipös
14 Wallach 23 1,68 630 223,2 Adipös
15 Wallach 13 1,67 540 193,6 Gut
16 Stute 8 1,64 630 234,2 Adipös
17 Stute 14 1,68 580 205,5 Gut
18 Stute 15 1,76 640 206,6 Gut
19 Stute 3 1,64 510 189,6 Gut
20 Wallach 16 1,76 720 232,4 Adipös
21 Wallach 18 1,75 710 231,8 Adipös
22 Wallach 18 1,74 683 224,6 Adipös
BMI = Body Mass Index

9. ANHANG
Tab. 4. Aufreinigungsfaktoren der 5’NT in den verschiedenen Aufarbeitungsfraktionen
beim Pony
Pony H Ü14 P14 Ü39 P39 M PM
1 1,0 0,9 3,5 0,3 8,5 7,8 9,9
2 1,0 0,4 4,9 u.d.N. 13,2 5,2 15,5
3 1,0 0,9 3,6 0,2 12,2 7,6 8,3
4 1,0 0,7 2,5 0,4 4,3 3,4 4,9
5 1,0 0,4 1,6 0,3 4,2 4,1 5,4
6 1,0 0,5 2,6 0,3 5,9 4,1 5,2
7 1,0 0,2 2,9 u.d.N. 6,1 3,9 4,3
8 1,0 0,4 5,8 u.d.N. 9,9 6,1 13,1
9 1,0 0,4 3,2 u.d.N. 5,2 4,4 7,6
10 1,0 0,6 2,9 0,2 5,5 5,1 5,2
11 1,0 0,4 4,7 u.d.N. 8,6 3,9 6,9
MW 1,0 0,51 3,5 0,3 7,6 5,0 7,9
±SD 0,23 1,2 0,1 3,1 1,5 4,1
H = Homogenat, Ü 14 = Überstand14, P14 = Pellet14, Ü 39 = Überstand39, P39 = Pellet39,
M = Mitochondrien, PM = Plasmamembran
78

9. ANHANG
Tab. 5. Aufreinigungsfaktoren der 5’NT in den verschiedenen Aufarbeitungsfraktionen
beim Pferd.
Pferd H Ü14 P14 Ü39 P39 M PM
12 1,0 1,4 4 0,8 7,7 6,5 8,2
13 1,0 1,0 4,3 0,5 4,8 4,9 5,8
14 1,0 0,2 4,9 u.d.N. 12,4 11,5 13,1
15 1,0 u.d.N. 2,0 u.d.N. 8,2 3,9 6,0
16 1,0 0,5 2,0 0 4,0 4,1 4,9
17 1,0 0,5 2,7 0,1 7,6 5,4 5,3
18 1,0 0,6 4,1 0,2 8,1 4,6 9,8
19 1,0 0,7 1,6 0,2 5,1 3,5 4,5
20 1,0 0,7 2,3 0,4 4,5 3,5 4,9
21 1,0 0,4 2,4 u.d.N. 6,7 5 5,5
22 1,0 0,7 2,5 0,1 8,7 3,3 5,6
MW 1,0 0,7 3,0 0,3 7,0 5,1 6,5
±SD 0,3 1,1 0,3 2,4 2,3 2,9
H = Homogenat, Ü 14 = Überstand14, P14 = Pellet14, Ü 39 = Überstand39, P39 = Pellet39,
M = Mitochondrien, PM = Plasmamembran
79

9. ANHANG
Tab. 6. Aufreinigungsfaktoren der CCO in den verschiedenen Aufarbeitungsfraktionen beim
Pony
Pony H Ü14 P14 Ü39 P39 M PM
1 1 0,1 2 0,1 0,7 0,9 1,4
2 1 0,2 3,3 0,1 1,5 2,2 1,6
3 1 0,1 2,6 0,1 0,9 0,9 0,9
4 1 0,1 4,1 0,2 2,1 0,1 1,6
5 1 0,4 6,1 0,3 3,2 3,5 4,1
6 1 0,2 3,4 0,2 1,7 1,9 1,7
7 1 0,3 7,9 0,2 2,5 3,6 2,5
8 1 0,1 3,1 0,1 1,6 2,2 1,9
9 1 0,1 2,7 0,1 0,7 1,1 1,3
10 1 0,1 3,2 0,2 1,2 1,5 0,8
11 1 0,1 3,6 0,1 1,4 2,1 2,5
MW 1 0,2 3,8 0,2 1,6 1,8 1,8
±SD 0,1 1,7 0,1 0,8 1,1 0,9
H = Homogenat, Ü 14 = Überstand14, P14 = Pellet14, Ü 39 = Überstand39, P39 = Pellet39,
M = Mitochondrien, PM = Plasmamembran
80

9. ANHANG
Tab. 7. Aufreinigungsfaktoren der CCO in den verschiedenen Aufarbeitungsfraktionen beim
Pferd.
Pferd H Ü14 P14 Ü39 P39 M PM
12 1 0,1 1,7 0,1 0,6 1,4 0,7
13 1 0,4 3,7 0,1 0,9 3,4 2,3
14 1 0,2 1,5 0,1 1,1 0,9 1,3
15 1 0,3 4,0 0,2 2,2 2,9 2,2
16 1 0,1 3,2 0,1 1,5 1,7 1,7
17 1 0,2 2,9 0,2 1,6 2,1 1,6
18 1 0,1 3,4 0,1 1,7 2,5 1,7
19 1 0,1 1,4 0,1 0,8 1,0 0,8
20 1 0,2 0,5 0,1 0,2 0,3 0,4
21 1 0,2 3,4 0,2 1,4 2,1 1,8
22 1 0,2 3,2 0,2 2,5 1,9 2,0
MW 1 0,2 2,6 0,1 1,3 1,8 1,5
±SD 0,1 1,1 0,1 0,7 0,9 0,6
H = Homogenat, Ü 14 = Überstand14, P14 = Pellet14, Ü 39 = Überstand39, P39 = Pellet39,
M = Mitochondrien, PM = Plasmamembran
81

Herrn Prof. Dr. Dr. H.-P. Sallmann danke ich herzlich für die Überlassung dieses
interessanten Themas. Seine freundliche und offene Art, die es jederzeit erlaubte, sämtliche
Probleme zu diskutieren wird mir ebenso wie das angenehme Arbeitsklima in seiner
Arbeitsgruppe in dankbarer Erinnerung bleiben.
Dem gesamten Mitarbeiterteam des Instituts für Physiologische
Chemie gilt mein Dank für
die warmherzige Aufnahme, das freundliche Arbeitsklima und die uneingeschränkt gebotene
Unterstützung. Insbesondere danke ich Herrn Uwe Glockenthör für die angenehme
Arbeitssituation im Labor und seine allzeit gewährte Offenheit, Probleme zu lösen. Herrn
Arndt Rohwedder danke ich für die geduldige Unterstützung bezüglich der statistischen
Auswertung.
In herausragendem Maße sei Andrea Widdel-Bigdely gedankt, ohne deren optimistischen
Tatendrang, kreativer Kompetenz und freundlicher Hilfestellung diese Arbeit in dieser Form
sicherlich nicht hätte gelingen können.
Herrn Prof. Dr. W. Baumgärtner danke ich für die unkomplizierte Genehmigung, in dem
Institut für Pathologie Gewebeschnitte herzustellen und auszuwerten. Frau Petra Grünig aus
dem Institut für Pathologie danke ich für die Anfertigung der Kryoschnitte.
Meinen MitdoktorandInnen sei für den Spaß bei der Arbeit und die mehr oder weniger
fruchtbaren „interdisziplinären Kolloquien“ gedankt.
Der Rossschlachterei Knoche und Sohn, Helmstedt, danke ich für die äußerst kooperative
Bereitstellung von Probenmaterial. Die freundliche und sehr hilfsbereite Art der Mitarbeiter
vermittelte das Gefühl, willkommen zu sein und ermöglichte letztlich diese Arbeit.
Meiner Kollegin Julia gebührt ein herzlicher Dank für die unverzichtbare Hilfe bei den
Tücken der Technik hinsichtlich der Formatierung der Arbeit.
Ein großes Dankeschön meinen Freunden Christine und Klaus für die Unterstützung bei der
Summary.
Nicht zuletzt danke ich meinen Eltern und meiner Tochter Lena, ohne deren tatkräftige
Unterstützung ich weder das Studium noch die Dissertation hätte erfolgreich beenden können.

Sie gaben und geben mir in allen (un)möglichen Lebenslagen den nötigen Halt und die
Energie, durchzuhalten. DANKE!